In Vivo Tracking der menschlichen Fettgewebe mesenchymalen Stammzellen in einem Rattenmodell Knie Arthrose mit fluoreszierenden lipophile Membran Farbstoff

Summary

Dieses Protokoll beschreibt eine effiziente Möglichkeit zur Überwachung der Zelle Persistenz und Bioverteilung des menschlichen Fettgewebe mesenchymalen Stammzellen (HaMSCs) durch dunkelrote Fluoreszenz Kennzeichnung in einem Rattenmodell Knie Arthrose (KOA) durch intraartikuläre Injektion (IA).

Abstract

Um die klinische Anwendung der menschlichen Fettgewebe gewonnenen mesenchymalen Stammzellen (HaMSC) Therapie für Knie-Arthrose (KOA) zu unterstützen, haben wir die Wirksamkeit der Zelle Persistenz und Bioverteilung des HaMSCs in Tiermodellen untersucht. Wir zeigten eine Methode um die Zellmembran der HaMSCs mit lipophilen Fluoreszenzfarbstoff zu beschriften. Anschließend wurde intraartikuläre Injektion der markierten Zellen bei Ratten mit chirurgisch induzierten KOA dynamisch durch ein in-Vivo imaging-System überwacht. Wir beschäftigten die lipophilen Carbocyanines haben (DilC₁₈ (5)), eine dunkelrote fluoreszierende Dil (Dialkylcarbocyanines) Analog, die einen roten Laser zur Anregung der natürlichen grünen Autofluoreszenz vom umgebenden Gewebe zu vermeiden verwendet. Darüber hinaus rot-verschoben Emissionsspektren der zulässige tiefen Gewebe Bildgebung mit lebenden Tieren und die Kennzeichnung Verfahren keine zytotoxischen Effekte oder funktionellen Schaden HaMSCs verursacht. Dieser Ansatz hat sich gezeigt, um eine effiziente Überwachungsmethode für HaMSCs in einem Rattenmodell KOA werden. Die Anwendung dieser Methode könnte auch verwendet werden, um die optimale Verwaltung Weg und Dosierung von MSCs aus anderen Quellen in präklinischen Studien bestimmen.

Introduction

Knie-Arthrose (KOA) ist eine degenerative Erkrankung, die durch Verlust von Gelenkknorpel und fortschreitende Entzündung, die eine große chronische Erkrankung bei älteren Menschen rund um die Welt¹geworden ist. Aktuelle Therapien mit Anti-inflammatory Drogen, körperliche Ergänzungen und chirurgische Eingriffe können jedoch nur vorübergehende Linderung für symptomatische Schmerzen²vorsehen.

Menschlichen Fettgewebe mesenchymaler Stammzellen (HaMSCs) sind eine vielversprechende regenerative Heilmittel für Knie-Arthrose, aufgrund ihrer multipotenten Differenzierungspotenzial für Knorpelregeneration und immunmodulatorische Eigenschaften^{3geworden, 4}. Im Vergleich mit pharmakologischen Routen, Mechanismen der Aktion in Vivozu untersuchen, ist das tracking live HaMSCs in kleiner KOA Tiermodelle derzeit lehrreich, die Begründung und die Machbarkeit der HaMSC Therapie vor der klinischen Anwendung zu etablieren. Für präklinische Tests, destabilisiert mediale Meniscectomy (MM) die mechanische Belastung des Gelenks zu induzieren KOA in Ratten, bietet ein relativ machbar Modell mit konsistenten Reproduzierbarkeit⁵. Das Auftreten von KOA induziert durch MM ist älter als Durchtrennung des vorderen Kreuzbandes allein oder in Kombination mit partiellen medialen Meniscectomy⁶. Daher sind die langfristigen Wechselwirkungen zwischen eingespritzte HaMSCs mit der pathologischen Mikroumgebung von KOA oft bei Ratten induziert durch MM^7,8bewertet.

Obwohl die therapeutische Wirksamkeit des HaMSCs wurde ausführlich berichtet, relevante Kenntnisse auf ist die in-Vivo -Persistenz von implantierten HaMSCs durch intraartikuläre Injektion (IA) knapp^9,10. Daher sind verschiedene zelluläre Kennzeichnung Methoden entwickelt worden, einschließlich der Immunhistologie¹¹, Luciferase¹², grün fluoreszierendes Protein¹³ Transfektion Eisenoxid labeling für Magnetresonanz-Bildgebung (MRI)^14, , und zahlreiche fluoreszierende Zelle Farbstoffe^8,15,16. Verglichen mit arbeitsintensiven Histologie Analysen, beschäftigt in Vivo nicht-invasive Bildgebung optische Geräte, die Echtzeit-Verteilung und Dynamik der Zellen beschriftet mit fluoreszierenden Signale^10,17zu erkennen. Für funktionelle live Cell Imaging ist Cytocompatible fluoreszierenden Kennzeichnung eine anspruchsvolle radioaktiven kostenlose Tracking-Technik, um zelluläre Aktivitäten nach Stammzell-Transplantation¹⁸zu offenbaren. Darüber hinaus besitzen multicolor lipophile Fluoreszenzfarbstoffen Vorteile gegenüber amino-Reaktivfarbstoffe hydrophil oder fluoreszierende Proteine, einschließlich ihrer Zelle verbesserte Durchlässigkeit und verstärkten Fluoreszenz Quantum Erträge¹⁹.

So nutzen die Protokolle enthalten hier eine rote Laser beschriftet mit lipophilen Carbocyanines Zellen erregen haben (DilC₁₈(5)), ist eine dunkelrote fluoreszierende Dil (Dialkylcarbocyanines) analog²⁰. Die rot-verschoben Anregung und Emission Spektren von vermeidet Autofluorescent Störungen und tiefen Gewebe über einen langen Zeitraum hinweg in lebenden Tieren⁸Bildgebung ermöglicht. Diese Methode des Trackings Zellen in Vivo mit beschriftet habe ist gültig für die Überwachung der transplantierten Stammzellen, wie HaMSCs, in Tiermodellen, das zum Verständnis und zur Verbesserung der aktuellen regenerative Stammzelltherapie wesentlich ist.

Protocol

Verfahren im Zusammenhang mit tierischen Probanden wurden genehmigt durch die lokalen institutionellen Animal Care und Ethik-Kommission, mit dem Bemühen, das Leiden der Tiere zu minimieren. Das folgende Protokoll wurde von der institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) in Shanghai neunte People genehmigt ’ s Krankenhaus, Shanghai JiaoTong University School of Medicine mit dem Protokoll angegliedert Nummer [2017] 063. 1. Aufbau eines Surgically-Induced Ratte Knie Osteoart…

Representative Results

Um KOA Modell zu induzieren, erfolgte MM im rechten Kniegelenk von SD-Ratten (Abbildung 3). Acht Wochen nach der Operation Ratten wurden geopfert und Schnittserien der Kniegelenke wurden ausgewertet, mit beiden H & E und Safranin O/schnell grün Färbung (Abbildung 4). H & E Färbung, die Oberfläche des Gelenkknorpels ausgestellt rauere Grenzen in der Chirurgie Knie als das normale Gelenk ohne Operation. Für Safranin-O/…

Discussion

Sicherheitsstandards und Bioverteilung Studien der Stammzell-Therapie sind dringend notwendig, bevor wir regenerative Stammzell-Therapie für KOA von der Bank ans Bett zu bringen. Die pathologische Umfeld der Krankheit spielt jedoch eine wichtige Rolle in der Ausdauer und der Bioverteilung des transplantierten HaMSCs¹⁰. Unsere Fraktion nachweislich vor kurzem intraartikulären Injektion von HaMSCs mehr in einer pathologischen KOA Umgebung beibehalten, als Injektionen unter normalen Bedingungen<sup…

Materials

Matrx VMR animal anesthesia system	Midmark	VIP3000
4-0 suture	Shanghai Jinhuan	KC439
Razor	Pritech	LD-9987
Gentamicin	Zhejiang Jindakang Animal Health Product Co., Ltd.	None
0.9% Sodium chloride solution	Hunan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd.	H43020455
Penicillin	Shanghai Kangfu chemical pharmaceutical Co., Ltd.	None
Buprenorphine	Tianjin Pharmaceutical Research Institute Pharmaceutical Co., Ltd.	None
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	16005	Dilute to final concentration of 10% in PBS
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884	Dilute to final concentration of 20% in PBS
0.1% Hematoxylin Solution, Mayer’s	Sigma-Aldrich	MHS16
0.5% Eosin Y solution, alcoholic	Sigma-Aldrich	HT110116
Safranin O	Sigma-Aldrich	S8884
Fast Green	Sigma-Aldrich	F7258
Shandon Excelsior ESTM Tissue Processor	Thermo Fisher	A78400006
Shandon Histocentre™ 3 Tissue Embedding Center	Thermo Fisher	B64100010
Fully Automated Rotary Microtome	Leica	RM2255
DiD	Molecular Probes, Life Technologies	V-22887
D-MEM High Glucose	Sigma-Aldrich	D5648
PBS	GIBCO, Life Technologies	14190-144
0.25% Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200-114
10 cm Petri Dish	Corning	V118877
Centrifuge	Beckman	Optima MAX-TL
Fluorescent microscope	Olympus	BX53
0.4% Trypan Blue solution	Sigma-Aldrich	93595
Titetamme	Virbac (Zoletil 50)	1000000188
Zolazepam	Virbac (Zoletil 50)	1000000188
Sterile hyposermic syringe for single use 26G	Shanghai Misawa Medical Industry	None
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System	PerkinElmer	124262
Living Imaging 4.0 software	PerkinElmer	None