Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine effiziente Möglichkeit zur Überwachung der Zelle Persistenz und Bioverteilung des menschlichen Fettgewebe mesenchymalen Stammzellen (HaMSCs) durch dunkelrote Fluoreszenz Kennzeichnung in einem Rattenmodell Knie Arthrose (KOA) durch intraartikuläre Injektion (IA).
Abstract
Um die klinische Anwendung der menschlichen Fettgewebe gewonnenen mesenchymalen Stammzellen (HaMSC) Therapie für Knie-Arthrose (KOA) zu unterstützen, haben wir die Wirksamkeit der Zelle Persistenz und Bioverteilung des HaMSCs in Tiermodellen untersucht. Wir zeigten eine Methode um die Zellmembran der HaMSCs mit lipophilen Fluoreszenzfarbstoff zu beschriften. Anschließend wurde intraartikuläre Injektion der markierten Zellen bei Ratten mit chirurgisch induzierten KOA dynamisch durch ein in-Vivo imaging-System überwacht. Wir beschäftigten die lipophilen Carbocyanines haben (DilC18 (5)), eine dunkelrote fluoreszierende Dil (Dialkylcarbocyanines) Analog, die einen roten Laser zur Anregung der natürlichen grünen Autofluoreszenz vom umgebenden Gewebe zu vermeiden verwendet. Darüber hinaus rot-verschoben Emissionsspektren der zulässige tiefen Gewebe Bildgebung mit lebenden Tieren und die Kennzeichnung Verfahren keine zytotoxischen Effekte oder funktionellen Schaden HaMSCs verursacht. Dieser Ansatz hat sich gezeigt, um eine effiziente Überwachungsmethode für HaMSCs in einem Rattenmodell KOA werden. Die Anwendung dieser Methode könnte auch verwendet werden, um die optimale Verwaltung Weg und Dosierung von MSCs aus anderen Quellen in präklinischen Studien bestimmen.
Introduction
Knie-Arthrose (KOA) ist eine degenerative Erkrankung, die durch Verlust von Gelenkknorpel und fortschreitende Entzündung, die eine große chronische Erkrankung bei älteren Menschen rund um die Welt1geworden ist. Aktuelle Therapien mit Anti-inflammatory Drogen, körperliche Ergänzungen und chirurgische Eingriffe können jedoch nur vorübergehende Linderung für symptomatische Schmerzen2vorsehen.
Menschlichen Fettgewebe mesenchymaler Stammzellen (HaMSCs) sind eine vielversprechende regenerative Heilmittel für Knie-Arthrose, aufgrund ihrer multipotenten Differenzierungspotenzial für Knorpelregeneration und immunmodulatorische Eigenschaften3geworden, 4. Im Vergleich mit pharmakologischen Routen, Mechanismen der Aktion in Vivozu untersuchen, ist das tracking live HaMSCs in kleiner KOA Tiermodelle derzeit lehrreich, die Begründung und die Machbarkeit der HaMSC Therapie vor der klinischen Anwendung zu etablieren. Für präklinische Tests, destabilisiert mediale Meniscectomy (MM) die mechanische Belastung des Gelenks zu induzieren KOA in Ratten, bietet ein relativ machbar Modell mit konsistenten Reproduzierbarkeit5. Das Auftreten von KOA induziert durch MM ist älter als Durchtrennung des vorderen Kreuzbandes allein oder in Kombination mit partiellen medialen Meniscectomy6. Daher sind die langfristigen Wechselwirkungen zwischen eingespritzte HaMSCs mit der pathologischen Mikroumgebung von KOA oft bei Ratten induziert durch MM7,8bewertet.
Obwohl die therapeutische Wirksamkeit des HaMSCs wurde ausführlich berichtet, relevante Kenntnisse auf ist die in-Vivo -Persistenz von implantierten HaMSCs durch intraartikuläre Injektion (IA) knapp9,10. Daher sind verschiedene zelluläre Kennzeichnung Methoden entwickelt worden, einschließlich der Immunhistologie11, Luciferase12, grün fluoreszierendes Protein13 Transfektion Eisenoxid labeling für Magnetresonanz-Bildgebung (MRI)14, , und zahlreiche fluoreszierende Zelle Farbstoffe8,15,16. Verglichen mit arbeitsintensiven Histologie Analysen, beschäftigt in Vivo nicht-invasive Bildgebung optische Geräte, die Echtzeit-Verteilung und Dynamik der Zellen beschriftet mit fluoreszierenden Signale10,17zu erkennen. Für funktionelle live Cell Imaging ist Cytocompatible fluoreszierenden Kennzeichnung eine anspruchsvolle radioaktiven kostenlose Tracking-Technik, um zelluläre Aktivitäten nach Stammzell-Transplantation18zu offenbaren. Darüber hinaus besitzen multicolor lipophile Fluoreszenzfarbstoffen Vorteile gegenüber amino-Reaktivfarbstoffe hydrophil oder fluoreszierende Proteine, einschließlich ihrer Zelle verbesserte Durchlässigkeit und verstärkten Fluoreszenz Quantum Erträge19.
So nutzen die Protokolle enthalten hier eine rote Laser beschriftet mit lipophilen Carbocyanines Zellen erregen haben (DilC18(5)), ist eine dunkelrote fluoreszierende Dil (Dialkylcarbocyanines) analog20. Die rot-verschoben Anregung und Emission Spektren von vermeidet Autofluorescent Störungen und tiefen Gewebe über einen langen Zeitraum hinweg in lebenden Tieren8Bildgebung ermöglicht. Diese Methode des Trackings Zellen in Vivo mit beschriftet habe ist gültig für die Überwachung der transplantierten Stammzellen, wie HaMSCs, in Tiermodellen, das zum Verständnis und zur Verbesserung der aktuellen regenerative Stammzelltherapie wesentlich ist.
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Protocol
Verfahren im Zusammenhang mit tierischen Probanden wurden genehmigt durch die lokalen institutionellen Animal Care und Ethik-Kommission, mit dem Bemühen, das Leiden der Tiere zu minimieren. Das folgende Protokoll wurde von der institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) in Shanghai neunte People genehmigt ’ s Krankenhaus, Shanghai JiaoTong University School of Medicine mit dem Protokoll angegliedert Nummer [2017] 063.
1. Aufbau eines Surgically-Induced Ratte Knie Osteoarthritis Modells
- für dieses chirurgische Verfahren, Verwendung 8-12 Wochen alten männlichen Sprague-Dawley (SD) Ratten mit einem Körpergewicht zwischen 250 und 300 g.
- Die Tiere mit 40 mg/kg Tiletamin und 40 mg/kg Zolazepam durch intramuskuläre Injektion zu betäuben.
- Legen Sie das Tier in einer linken seitlichen Position auf einer beheizten Bühne. Rasieren Sie das rechte Knie gründlich mit einem Rasiermesser. Desinfizieren Sie den OP-Bereich mit 10 % Providone-Jod-Lösung gefolgt von 70 % Ethanol, zwei weitere Male zu wiederholen und malen Sie dann mit 10 % Providone-Jod-Lösung und die nicht-chirurgische Fläche mit einem OP Pad.
- Mit einem chirurgischen Skalpell machen einen 2 cm Schnitt seitlich entlang der Patellasehne, setzen Sie die Jointcapsules.
- Verwenden ein chirurgisches Skalpell, um den medialen Seitenbandes Transekt. Reflektieren den Meniskus in Richtung Femur.
- Tropfen sterilen 0,9 % Natriumchlorid-Lösung auf der Oberfläche des Gelenkknorpels während des Betriebs zu verhindern, dass den Knorpel austrocknen.
- Der medialen Meniskus mit Zange greifen und Durchtrennung der Meniskus an der schmalsten Stelle aus der Tibia Beschäftigung mit einem Skalpell ( Abbildung 1A). Nicht zu verletzen, des Knorpels.
- Schließen die Gelenkkapsel mit einer resorbierbaren Naht 4: 0.
- Überwachen die chirurgische Ratten, bis sie wieder zu Bewusstsein kommen.
- Spritzen 20 mg/kg Gentamicin zur Vermeidung von Infektionen und 0,05 mg/kg Buprenorphin durch eine intramuskuläre Route zur Linderung von Schmerzen nach der Operation.
- Pflegen die Ratten in einer temperaturgesteuerten Tierhaus unter einem 12 h hell/dunkel-Zyklus für 3-8 Wochen zu Beginn KOA. Tiere weiterhin erhalten Schmerzmittel, einschließlich aber nicht beschränkt auf Buprenorphin (0,05 mg/kg, i.m.) und Gentamicin (20 mg/kg i.m.), wenn Symptome fortbestehen.
2. Histologie der Ratte KOA Bewertungsmodell
- Opfern, die Ratten mit übermäßigen CO 2 Inhalation (hinzufügen eine Füllrate von etwa 30 % des Kammervolumens pro Minute mit Kohlendioxid an die vorhandene Luft in der Kammer, um die tierischen Bewusstlosigkeit innerhalb von ca. 2-3 min. halten CO2-Fluss für ein Minimum von 1 min nach Atmung aufhört.) Zeitpunkten (Vertreter Ergebnisse werden angezeigt, nach 8 Wochen der KOA Induktion von 3 bis 8 Wochen) nach der Operation angegeben
- sezieren die Haut und Muskeln rund um die Kniegelenke und die Kniegelenke mit einem Skalpell abgeschnitten.
- Fix die Kniegelenke in 4 % Paraformaldehyd (PFA) für 3 Tage bei Raumtemperatur. Danach die Proben in 20 % Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA) für ca. 4 Wochen bei 4 ° C zu entkalken, und ändern Sie die EDTA alle 3 Tage.
Achtung: Paraformaldehyd ist giftig, tragen geeigneten persönlichen Schutzausrüstung (PSA), wie Handschuhe und Brille. - Entwässern die Proben unter Verwendung eines automatischen Gewebe-Prozessors. Menü zu einen bündigen Zyklus wie folgt starten: 70 % Ethanol für 1 h; dann 80 % Ethanol und 95 % igem Ethanol für 1 h; gefolgt von 2 Zyklen von 100 % Ethanol 1 h; Anschließend Xylol zweimal für 1 h jedes Mal und jedes Mal 3 Mal bei 58 ° C für 1 h paraffin.
Achtung: Xylol ist giftig, so tragen Sie geeignete PSA, wie Handschuhe und Brille.
Hinweis: Optional zur manuellen Entwässerung mit den gleichen Aufbau wie die automatische Gewebe-Prozessor verwenden Gläser Coplin. - Den medialen Aspekt der intakten gemeinsame Fläche ablegen und Binde sie in der Paraffinblock mit Gewebe eingebettet in das Zentrum.
Hinweis: Optional Zange verwenden, um die Proben in den Paraffinblock manuell einbinden. - 5 µm sagittale Abschnitte vom medialen Rand des Gelenks für 30 µm Intervalle mit 2 Schnittserien durch rotary Mikrotom schneiden beginnen.
- Abschnitte auf Glasobjektträger montieren und deparaffinize Folien in Xylol. Zwischen den 2 Schnittserien Fleck eine Folie mit Hämatoxylin & Eosin (H & E) Färbung: 0,1 % Hämatoxylin für 15 min, 1 % Essigsäure-Lösung für 10 s und 0,5 % Eosin für 10 Minuten. Und Flecken auf die anderen Folie mit Safranin O/schnell grün Färbung: 0,1 % Hämatoxylin für 15 min, 0,02 % schnell grün für 3 min, 1 % Essigsäure-Lösung für 10 s und 0,1 % Safranin O für 3 min.
Achtung: Xylol ist giftig, geeignete PSA, wie Handschuhe, Brillen zu tragen. - Ergebnis der gefärbten Folien mit Osteoarthritis Research Society International (OARSI) Histopathologie Bewertungssystem in Ratten 6.
3. Kennzeichnung des menschlichen mesenchymalen Stammzellen mit fluoreszierenden Farbstoff hat
- Tat bereiten Zelle Kennzeichnung Lösung in 100 % igem Ethanol bei einer Konzentration von 1 mM. Die Zelle-Kennzeichnung Lösung vor Licht schützen und bei Raumtemperatur für 6 Monate lagern.
- Wachsen HaMSCs mit Standardzellen Kultur Verfahren in Dulbecco ' s geändert Eagle ' s Medium (DMEM) ergänzt mit 1 % Penicillin und Streptomycin und 10 % fetalen Kälberserum (FCS) in einer Petrischale 10 cm.
- HaMSCs mit 2 mL 0,25 % Trypsin mit 1 mM EDTA vor rund 80 % Zusammenfluss lösen.
- Trypsin mit 4 mL Kulturmedium zu neutralisieren und die Zellen bei 800 X g für 3 min bei Raumtemperatur spin.
- Unterbrechen die Zellen bei einer Dichte von 1 x 10 6 Zellen/mL in 5 mL Serum-freien Kulturmedium.
- Kennzeichnen die Zellen durch Zugabe von 50 µL hat Zelle Kennzeichnung Lösung in 5 mL serumfreien Nährmedium bei 37 ° C 50 min.
- Drehen Sie die markierten Zellen 800 X g für 3 min.
- Waschen die Zellen zwei weitere Male mit 5 mL Phosphat Puffer Kochsalzlösung (PBS) bei 800 X g für 3 min.
- Überprüfen Sie die gekennzeichneten HaMSCs mit einem fluoreszierenden Mikroskop mit einem Filtersatz Cy5.
- Zählen die Zellen mit Trypan blau Färbung und 2,5 x 10 6 entwicklungsfähigen Zellen in 100 µL PBS zur Injektion erhalten.
4. In Vivo Fluoreszierende Imaging Track HaMSCs
- acht Wochen nach der Operation (Schritt 1), betäuben die KOA Ratten durch intramuskuläre Injektion von 25 mg/kg Tiletamin und 25 mg/kg Zolazepam.
- Das rechte Knie rasieren gründlich mit einem Rasiermesser, die Lötstelle verfügbar zu machen. Die Lötstelle mit 70 % Ethanol zu desinfizieren.
- Mit einer 26 G Spritzennadel Spritzen 2,5 x 10 6 Zellen ausgesetzt in 100 µL PBS in der Mitte des Bereichs Dreieck gekennzeichnet von der medialen Seite der Patella Ligament, die medialen femoralen Kondylus und medialen Tibia Kondylus (gebildet Abbildung 1 b).
- Öffnen Sie die Software zur Abbilderstellung und initialisieren die Biolumineszenz in Vivo imaging-System.
- Position Ratten in der Rückenlage in die zentrale Bühne das Abbildungssystem positionieren und schließen Sie die Tür der Kammer.
- Überprüfen die " fluoreszierenden " Kontrollkästchen und wählen Sie fluoreszierende Filter Sätze von 640 nm für Anregung und 680 nm für Emission ( Abbildung 2A).
- Select Sichtfeld, D. einstellen Pixel binning auf Medium (8), F/Stop 2 und Belichtung Zeit automatisch. Aufrechterhaltung der optimalen Belichtungszeit konsequent, um vergleichbare Ergebnisse zu erhalten über die gesamte Studie ( Abbildung 2A).
- Entfernen Sie das Tier von der Bühne und Monitor für die Wiederherstellung aus der Narkose.
Hinweis: Statt Tier auf ein Heizkissen mit 2-3 Schichten aus Frottee bedeckt. - Wählen Sie die Einheiten der strahlende Effizienz für die Messung der Fluoreszenz ( Abb. 2 b). Wählen Sie Bereiche von Interesse (ROI) für die Analyse und Quantifizierung fluoreszierende Signale aus jedem Bild ( Abbildung 2).
- Wiederholen Sie den Vorgang der in-Vivo Bildgebung für jede Ratte sequenziell, HaMSCs längs Aufbewahrung im Gelenk zu studieren.
Hinweis: Wir empfehlen die Tiere imaging ' fluoreszierenden Signale durch in-vivo imaging-System einmal alle zwei Tage für die erste Woche nach der Injektion und einmal pro Woche, bis das Signal nicht erkannt werden kann.
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Representative Results
Um KOA Modell zu induzieren, erfolgte MM im rechten Kniegelenk von SD-Ratten (Abbildung 3). Acht Wochen nach der Operation Ratten wurden geopfert und Schnittserien der Kniegelenke wurden ausgewertet, mit beiden H & E und Safranin O/schnell grün Färbung (Abbildung 4). H & E Färbung, die Oberfläche des Gelenkknorpels ausgestellt rauere Grenzen in der Chirurgie Knie als das normale Gelenk ohne Operation. Für Safranin-O/schnell grüne Färbung wir beobachteten verminderten Proteoglykan (rote Färbung) und erhöhte fibrillierten Kollagen (grüne Färbung) in der gemeinsamen Operation im Vergleich mit der normalen Version, die das Fortschreiten der degenerativen KOA Phänotypen angegeben induziert durch eine Operation. Um das Fortschreiten der menschlichen KOA ähneln, wurden Ratten geopfert, nach 3 Wochen, 6 Wochen und 8 Wochen nach MM zu beurteilen, Pathogenese und den Zeitpunkt der therapeutischen Interventionen bestimmen.
Mit der Bezeichnung HaMSCs wurde in KOA Rattenmodell durch eine optische in-Vivo imaging-System visualisiert. 1 h nach Kennzeichnung, ausgestellt Runde Formen in-vitro-HaMSCs beschriftet. Die Kennzeichnung Effizienz erreicht etwa 95 %. Nach 24 h, kultiviert hat beschriftete HaMSCs ausgestellt lange Spindel Formen, Angabe Tat Tat ändert nicht die Einhaltung der Fähigkeit der HaMSCs in Vitro (Abbildung 5). Acht Wochen nach der Operation wurden 2,5 x 106 haben-mit der Bezeichnung HaMSCs in Fugen mit KOA injiziert. Hier mit der Bezeichnung HaMSCs in der lokalen Verbindung von Tag 0 (8 Wochen nach der Operation) bis zum Tag 70 Post Injektion (18 Wochen nach der Operation) mithilfe einer in-Vivo imaging-System (Abbildung 6) beobachtet wurden.
Abbildung 1: Schematische OP-Feld für den MM-Chirurgie und Injektion für die Zelle Lieferung. (A) diese schematische Darstellung zeigt den OP-Bereich, die durch blaue Farbe markiert ist. (B) diese schematische Darstellung zeigt die Injektionsstelle innerhalb der rot eingekreisten Bereich. Akronym-Definitionen lauten wie folgt: MM, medialen Meniskus; MCL, medialen Seitenbandes; LM, lateralen Meniskus; LCL, laterale Kollateralband; PL, Patella Ligament. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Screenshots von in-vivo imaging-Software. (A) Schlüssel Einstellungen der Parameter für die fluoreszierenden Bildaufnahme werden mit roten Quadraten hervorgehoben. (B) strahlende Effizienz ist das Gerät für die Messung der Fluoreszenz gewählt. (C) In der Werkzeugpalette, Regionen von Interesse (ROI) sind für Fluoreszenz Effizienz Messungen eingekreist. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: die Verfahren der chirurgisch induzierten KOA. (A) Exposition von Knie Gelenkspalt. (B) die innere Struktur des Kniegelenks mit einem schwarzen Pfeil zeigt den medialen Meniskus. (C) die seziert medialen Meniskus. (D) der Gelenkspalt und Haut sind geschlossen.
Abbildung 4: repräsentative histologische Bilder von Kniegelenken und statistischen Analysen für OARSI-Score von KOA. (A) acht Wochen nach der Operation der MM bei Ratten, Schnittserien der Kniegelenke wurden ausgewertet, mit H & E und Safranin O/schnell grün färben. H & E Färbung zeigte, die Dicke des Knorpels im Knie Operation wurde reduziert. Safranin O/schnell grün Färbung zeigte Proteoglykan (rote Färbung) verringert und erhöht fibrillierten Kollagen (grüne Färbung) im Vergleich mit normalen Knie Chirurgie Knie. Maßstabsleiste = 500 µm. (B) statistische Auswertung für Score von Arthrose im normalen Joints und KOA Joints (n = 3). Die Daten werden als Mean±SEM. ausgedrückt * zeigt p < 0,05. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: Morphologie der haben-mit der Bezeichnung HaMSCs. Hellfeld, werden fluoreszierende und fusionierte Bilder von HaMSCs in 1 h nach Kennzeichnung im oberen Fensterbereich angezeigt. Hellfeld, fusionierte Fluorescentand Bilder von HaMSCs at24 h nach Kennzeichnung werden im unteren Bereich angezeigt. Maßstabsleiste = 50 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6: In-Vivo Bildgebung von hat-mit der Bezeichnung HaMSCs. Nach der Injektion von 2,5 x 106 haben-mit der Bezeichnung HaMSCs sind repräsentative Bilder von KOA Ratten gezeigt. Hat beschriftete HaMSCs wurden für bis zu 9 Wochen vor Ort in den Gelenken von KOA Ratten festgestellt. Diese Zahl wurde von der Veröffentlichung der Li M Et Al8wiedergegeben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Sicherheitsstandards und Bioverteilung Studien der Stammzell-Therapie sind dringend notwendig, bevor wir regenerative Stammzell-Therapie für KOA von der Bank ans Bett zu bringen. Die pathologische Umfeld der Krankheit spielt jedoch eine wichtige Rolle in der Ausdauer und der Bioverteilung des transplantierten HaMSCs10. Unsere Fraktion nachweislich vor kurzem intraartikulären Injektion von HaMSCs mehr in einer pathologischen KOA Umgebung beibehalten, als Injektionen unter normalen Bedingungen8Tat. Es ist möglich, dass die entzündlichen und degenerativen Mikroumgebung kann mesenchymalen Stammzellen zur Reparatur zu rekrutieren und anschließend der Beibehaltung der injizierten HaMSCs1,21 zugunsten. Darüber hinaus können die Sicherheit und Wirksamkeit Profile der HaMSCs durch den Zeitpunkt der Zelle Lieferung hinsichtlich der Schwere der KOA, beeinflusst werden, so dass Optimierung des Fortschreitens der KOA bei Labortieren wertvolle Daten liefern, für die Unterstützung von klinischer Studien. Mit dem Ziel der ähnlich leichten bis moderaten Schweregrad der menschlichen KOA dürfen Ratten induziert durch MM KOA von 3 bis 8 Wochen entwickeln. In dieser Studie wurde histopathologischen scoring 8 Wochen nach der Operation die morphologische Veränderung des Knorpels anhand bietet eine relativ machbare Modell mit ein gewisses Maß an KOA zu untersuchen, die Wirksamkeit und Sicherheit von HaMSCs8. Eine einfache und machbare Methode, um Label HaMSCs mit dunkelrote fluoreszierende lipophile Membran Farbstoff für langfristige Beurteilung der prä-klinischen Wirksamkeit, die wir hier demonstriert.
Die Nachteile dieser Technik sind, dass die abgebildete Gewebe nahe der Haut und eine erhebliche Menge an gekennzeichneten HaMSCs sind erforderlich für ausreichende Signalerfassung durch die bescheidene Quantum Erträge aus Tat. Obwohl eine in-Vivo imaging Optik nichtinvasive Längsschnittstudien ermöglicht von HaMSCs Bioverteilung im KOA Modelle, Trends in der Zellzahl und Lage kann nur im allgemeinen erkannt werden. Die Analyse der Stammzelle Schicksal, in bestimmten Zell-Proliferation und Differenzierung, wird durch die Verwendung auch Schicksal Mapping und hochauflösender Mikroskopie Bildgebung angesprochen werden.
Eine Vielzahl von Techniken Kennzeichnung stehen derzeit für in Vivo Stammzell-Tracking, einschließlich radioaktive Etiketten, Nanopartikeln und virale Transduktion von Reporter Gene22,23,24. Jedoch kann die radioaktive Markierung sowie virale Transduktion von Stammzellen mit den genetischen Eigenschaften von Zellen, stören die anschließend Stem Cell Proliferation und das Überleben in Vivo16beeinträchtigen können. Darüber hinaus kann Ablaufverfolgung Stammzellen mittels MRI durch Aufnahme von Nanopartikeln als Vertragsbediensteter verbesserten räumliche Auflösung über ein starkes Magnetfeld erfordert, die Bedenken über die Empfindlichkeit von dieser Technik25erhöhen. Fluoreszierende Zelle Farbstoffe, wie PKH26, CM-DiI und CFSE-unterschiedliche Grade der Zytotoxizität weisen und eine relativ begrenzte Dauer (bis zu 4 Wochen bieten) des Benennens Fettgewebe Zellen15abgeleitet. Im Gegensatz dazu schwache Fluoreszenz in wässrigen Lösungen aufweist. Einmal mit einer Lipidmembran aufgenommen, einheitlich innerhalb der Zellmembran und drücken stabiles dunkelrote Fluoreszenz19diffundiert. Haben Etiketten lebensfähige Zellen und nicht beeinflussen ihre Verbreitung und Funktion18. Noch wichtiger ist, übertragen die Farbstoffe nicht aus markierten Zellen auf unmarkierten Zellen, es sei denn es eine direkte Membran Interaktion zwischen diesen Zellen26 gibt. Die dunkelrote Anregung und Emission-Spektren von Autofluorescent Störungen durch umliegende Gewebe verhindert und bietet tiefen Gewebe Bildgebung mit lebenden Tieren. Diese Funktionen ermöglichen Tat Kennzeichnung als ideale langfristige Tracking-Technik, das Schicksal der implantierten HaMSCs Intra besonders zu studieren. Also, wir haben bewiesen, eine zuverlässige Methode zur Überwachung haben beschriftete HaMSCs über einen Zeitraum von 63 Tagen in eine Ratte Modell8.
Innerhalb des Protokolls für die Tat-mit der Bezeichnung HaMSCs Verfolgung in einem Rattenmodell KOA, die entscheidenden Schritte, zuverlässige und praktikable Ergebnisse zu erzielen sind, um sicherzustellen, dass: (1) der Meniskus in Richtung der Femur ist vollständig in jeder Rattenmodell für konsequente auftreten der KOA durchschneiden, (2) gibt es eine optimierte Verhältnis von 10 μL färben gegen 106 HaMSC Zellen für eine 50 min. Färbung, 3) die in Vivo Nachweisgrenze für haben-mit der Bezeichnung HaMSCs ist zwischen 104 und 105 Zellen, während über 106 Zellen empfohlen wird in diesem Protokoll.
Sobald diese Technik beherrscht wird, könnte die Anwendung dieser Methode zur Bestimmung der optimalen Route oder die Dosierung für die Verwaltung von MSCs in prä-klinischen Studien verwendet werden. Dieses Protokoll kann für die präklinische Langzeitauswertung der in Vivo Bioverteilung von mesenchymalen Stammzellen (MSCs) aus anderen Quellen, einschließlich Knochenmark und Nabelschnur Blut leicht angepasst werden. Im Hinblick auf die prospektive für Stammzell-Schicksal in Tiermodellen KOA kombinierbar Immunhistologie Studie von xenogene HaMSCs, wie z. B. Ki67 für Verbreitung8 und Kollagen II für Gelenkknorpel Differenzierung27, mit diesem Technik.
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Disclosures
Meng Li, Ming-Hao und Wang Wen sind aktuelle Mitarbeiter und Stock-Option-Inhaber von zellulären Biomedizin-Gruppe (Nasdaq: CBMG). Die anderen Autoren erklären keinen Interessenskonflikt.
Acknowledgments
Die aktuelle Studie wurde unterstützt durch Shanghai Innovationsförderung (1402 H 294300) gesponsert von der Wissenschaft und Technologie Kommission von Shanghai Gemeinde (CN), Dr. Wen Wang. Wir möchten danken Dr. Guangdong Zhou (National Tissue Engineering Center of China) für seine technische Unterstützung und wissenschaftliche Beratung für diese Handschrift. Wir auch möchte Herr Huitang Xia (Shanghai neunten Volks Krankenhaus) danken für seine Hilfe im Bereich des Tierschutzes.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matrx VMR animal anesthesia system | Midmark | VIP3000 | |
| 4-0 suture | Shanghai Jinhuan | KC439 | |
| Razor | Pritech | LD-9987 | |
| Gentamicin | Zhejiang Jindakang Animal Health Product Co., Ltd. | None | |
| 0.9% Sodium chloride solution | Hunan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd. | H43020455 | |
| Penicillin | Shanghai Kangfu chemical pharmaceutical Co., Ltd. | None | |
| Buprenorphine | Tianjin Pharmaceutical Research Institute Pharmaceutical Co., Ltd. | None | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 16005 | Dilute to final concentration of 10% in PBS |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | Dilute to final concentration of 20% in PBS |
| 0.1% Hematoxylin Solution, Mayer’s | Sigma-Aldrich | MHS16 | |
| 0.5% Eosin Y solution, alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110116 | |
| Safranin O | Sigma-Aldrich | S8884 | |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Shandon Excelsior ESTM Tissue Processor | Thermo Fisher | A78400006 | |
| Shandon Histocentre™ 3 Tissue Embedding Center | Thermo Fisher | B64100010 | |
| Fully Automated Rotary Microtome | Leica | RM2255 | |
| DiD | Molecular Probes, Life Technologies |
V-22887 | |
| D-MEM High Glucose | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| PBS | GIBCO, Life Technologies | 14190-144 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-114 | |
| 10 cm Petri Dish | Corning | V118877 | |
| Centrifuge | Beckman | Optima MAX-TL | |
| Fluorescent microscope | Olympus | BX53 | |
| 0.4% Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich | 93595 | |
| Titetamme | Virbac (Zoletil 50) | 1000000188 | |
| Zolazepam | Virbac (Zoletil 50) | 1000000188 | |
| Sterile hyposermic syringe for single use 26G | Shanghai Misawa Medical Industry | None | |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | PerkinElmer | 124262 | |
| Living Imaging 4.0 software | PerkinElmer | None |
References
- Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ. Arthritis Rheum. 64 (6), 1697-1707 (2012).
- Lane, N. E., Shidara, K., Wise, B. L. Osteoarthritis year in review 2016: clinical. Osteoarthritis Cartilage. 25 (2), 209-215 (2017).
- Wang, W., Cao, W. Treatment of osteoarthritis with mesenchymal stem cells. Sci China Life Sci. 57 (6), 586-595 (2014).
- Burke, J., et al. Therapeutic potential of mesenchymal stem cell based therapy for osteoarthritis. Clin Transl Med. 5 (1), 27 (2016).
- Bendele, A. M. Animal models of osteoarthritis. J Musculoskelet Neuronal Interact. 1 (4), 363-376 (2001).
- Gerwin, N., Bendele, A. M., Glasson, S., Carlson, C. S. The OARSI histopathology initiative - recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the rat. Osteoarthritis Cartilage. 18, Suppl 3. S24-S34 (2010).
- Janusz, M. J., et al. Induction of osteoarthritis in the rat by surgical tear of the meniscus: Inhibition of joint damage by a matrix metalloproteinase inhibitor. Osteoarthritis Cartilage. 10 (10), 785-791 (2002).
- Li, M., et al. In vivo human adipose-derived mesenchymal stem cell tracking after intra-articular delivery in a rat osteoarthritis model. Stem Cell Res Ther. 7 (1), 160 (2016).
- Zhou, B., et al. Administering human adipose-derived mesenchymal stem cells to prevent and treat experimental arthritis. Clin Immunol. 141 (3), 328-337 (2011).
- Desando, G., et al. Intra-articular delivery of adipose derived stromal cells attenuates osteoarthritis progression in an experimental rabbit model. Arthritis Res Ther. 15 (1), 22 (2013).
- Riester, S. M., et al. Safety Studies for Use of Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stromal/Stem Cells in a Rabbit Model for Osteoarthritis to Support a Phase I Clinical Trial. Stem Cells Transl Med. 6 (3), 910-922 (2017).
- Bai, X., et al. Tracking long-term survival of intramyocardially delivered human adipose tissue-derived stem cells using bioluminescence imaging. Mol Imaging Biol. 13 (4), 633-645 (2011).
- Wolbank, S., et al. Labelling of human adipose-derived stem cells for non-invasive in vivo cell tracking. Cell Tissue Bank. 8 (3), 163-177 (2007).
- Heymer, A., et al. Iron oxide labelling of human mesenchymal stem cells in collagen hydrogels for articular cartilage repair. Biomaterials. 29 (10), 1473-1483 (2008).
- Hemmrich, K., Meersch, M., von Heimburg, D., Pallua, N. Applicability of the dyes CFSE, CM-DiI and PKH26 for tracking of human preadipocytes to evaluate adipose tissue engineering. Cells Tissues Organs. 184 (3-4), 117-127 (2006).
- Shim, G., et al. Pharmacokinetics and in vivo fate of intra-articularly transplanted human bone marrow-derived clonal mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 24 (9), 1124-1132 (2015).
- Chen, B. K., et al. A safety study on intrathecal delivery of autologous mesenchymal stromal cells in rabbits directly supporting Phase I human trials. Transfusion. 55 (5), 1013-1020 (2015).
- Chan, M. M., Gray, B. D., Pak, K. Y., Fong, D. Non-invasive in vivo imaging of arthritis in a collagen-induced murine model with phosphatidylserine-binding near-infrared (NIR) dye. Arthritis Res Ther. 17, 50 (2015).
- Texier, I., et al. Cyanine-loaded lipid nanoparticles for improved in vivo fluorescence imaging. J Biomed Opt. 14 (5), 054005 (2009).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Fluorescent carbocyanine dyes allow living neurons of identified origin to be studied in long-term cultures. J Cell Biol. 103 (1), 171-187 (1986).
- Rahmati, M., Mobasheri, A., Mozafari, M. Inflammatory mediators in osteoarthritis: A critical review of the state-of-the-art, current prospects, and future challenges. Bone. 85, 81-90 (2016).
- Detante, O., et al. Intravenous administration of 99mTc-HMPAO-labeled human mesenchymal stem cells after stroke: in vivo imaging and biodistribution. Cell Transplant. 18 (12), 1369-1379 (2009).
- Hu, S. L., et al. In vivo magnetic resonance imaging tracking of SPIO-labeled human umbilical cord mesenchymal stem cells. J Cell Biochem. 113 (3), 1005-1012 (2012).
- Xia, Q., et al. Intra-articular transplantation of atsttrin-transduced mesenchymal stem cells ameliorate osteoarthritis development. Stem Cells Transl Med. 4 (5), 523-531 (2015).
- Jasmin,, et al. Optimized labeling of bone marrow mesenchymal cells with superparamagnetic iron oxide nanoparticles and in vivo visualization by magnetic resonance imaging. J Nanobiotechnology. 9, 4 (2011).
- Lehmann, T. P., et al. Coculture of human nucleus pulposus cells with multipotent mesenchymal stromal cells from human bone marrow reveals formation of tunnelling nanotubes. Mol Med Rep. 9 (2), 574-582 (2014).
- Wang, W., et al. Human adipose-derived mesenchymal progenitor cells engraft into rabbit articular cartilage. Int J Mol Sci. 16 (6), 12076-12091 (2015).
