Summary
이 프로토콜에는 빨강 형광 라벨 내부 관절 (IA) 주입을 통해 쥐 무릎 관절염 (KOA) 모델에 의해 셀 속성과 biodistribution 인간 지방 유래 중간 엽 줄기 세포 (haMSCs)의 모니터링 하는 효율적인 방법을 설명 합니다.
Abstract
무릎 관절염 (KOA)에 대 한 인간 지방 유래 간 엽 줄기 세포 (haMSC) 치료의 임상 적용을 지원 하기 위해 셀 지의 효능과 동물 모델에서 haMSCs의 biodistribution을 검사 합니다. 우리는 질 성 형광 염료와 haMSCs의 세포 막에 레이블을 하는 방법을 설명 했다. 그 후, 수술로 유도 KOA와 쥐에 있는 레이블된 셀의 내부 관절 주사는 vivo에서 이미징 시스템에서 동적으로 모니터링 했다. 우리는 질 성 고용 carbocyanines 않았다 (DilC18 (5)), 조직 주변에서 자연 녹색 autofluorescence의 자극을 피하기 위해 빨간색 레이저를 활용 하는 빨강 형광 Dil (dialkylcarbocyanines) 아날로그. 또한, 레드 이동 방출 스펙트럼의 살아있는 동물에서 깊은 조직의 이미징 및 레이블 프로시저 발생 세포 독성 효과 또는 haMSCs 기능 손상을 허용 했다. 이 접근은 쥐 KOA 모델에서 haMSCs에 대 한 효율적인 추적 방법으로 보였다. 이 방법의 응용 프로그램 또한 최적의 관리 경로 및 전 임상 연구에서 다른 소스에서 MSCs의 복용량을 결정 하기 위해 사용 될 수 있습니다.
Introduction
무릎 관절염 (KOA) 관절 연골 손실 및 진보적인 염증, 되 고 있다는 세계1주위 노인에서 주요 만성 질환 인 퇴행 성 질환 이다. 그러나, 항 염증 제 약물, 물리 보충, 및 수술 절차를 사용 하 여 현재 치료만 증상 통증2에 대 한 임시 구호를 제공할 수 있습니다.
무릎 관절염, 연골 재생, immunomodulatory 속성3, 잠재적인 multipotent 그들의 차별화 때문에 유망한 재생 치료 되 고 인간 지방 유래 중간 엽 줄기 세포 (haMSCs) 4. 약리학 노선 vivo에서행동의 메커니즘을 조사와 비교 하면, 현재 유익에 대 한 근거 및 임상 응용 프로그램 이전 haMSC 치료의 타당성을 확립 하는 작은 KOA 동물 모델에서 라이브 haMSCs를 추적. 전 임상 시험에 대 한 중간 meniscectomy (MM) destabilizes 일관 재현성5상대적으로 가능한 모델을 제공 합니다 쥐, KOA를 유도 하 관절의 기계적 부하. KOA m M에 의해 유도 된의 발병은 전방 십자 인 대 transection 혼자 또는 결합 부분 중간 meniscectomy6보다 이전. 따라서, KOA의 병 적인 microenvironment로 주입 된 haMSCs 간의 장기 상호 작용 종종 m M7,8에 의해 유도 된 쥐에 평가 됩니다.
비록 haMSCs의 치료 효능에 광범위 하 게 보고, 관련 지식이 하고있다 내 관절 (IA) 주입을 통해 이식된 haMSCs의 비보에 지 속성 부족9,10입니다. 따라서, 다양 한 세포 표시 방법은 개발 되었다, immunohistology11, luciferase12, 녹색 형광 단백질13 transfection, 자기 공명 영상 (MRI)14에 대 한 라벨 산화 철을 포함 하 여 , 그리고 수많은 형광 셀 염료8,,1516. 노동 집약적인 조직학 분석 비교, vivo에서 비 침략 적 영상 실시간 유통 및 형광 신호10,17으로 표시 하는 셀의 역학을 감지 하는 광학 장치를 사용 합니다. 기능 라이브 셀 이미징에 대 한 cytocompatible 형광 라벨 줄기 세포 이식18후 세포 활동을 공개 하는 정교한 무료 방사성 추적 기술입니다. 또한, 다 색 형광 닥터지 염료 친수성 아미노산 반응성 염료 나 형광 단백질, 그들의 향상 된 세포 침투성 등 향상 된 형광 양자 수율19이점을 있습니다.
따라서, 여기에 포함 된 프로토콜 활용 빨간색 레이저 질 성 carbocyanines로 표시 하는 세포를 자극 했다 (DilC18(5)), 빨강 형광 Dil (dialkylcarbocyanines) 아날로그20입니다. 빨간색 이동 여기 및 방출 스펙트럼 autofluorescent 간섭 방지 않았다 하 고 깊은 조직 동물8시간의 긴 기간 동안 이미징 있습니다. 추적의이 방법은 세포 vivo에서 표시 한은 이해 하 고 현재 줄기 세포 재생 치료 개선에 필수적인 동물 모델에서 haMSCs 같은 이식된 줄기 세포 모니터링에 적합.
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Protocol
동물 주제와 관련 된 절차 동물 고통 최소화 하는 노력으로 현지 기관 동물 관리 및 윤리 위원회에 의해 승인 했다. 다음 프로토콜 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 상해 9 사람들에 의해 승인 되었다 ’ 병원 프로토콜 상하이 교통 대학의과 대학에 가입 하는 s 번호 [2017] 063.
1. Surgically-Induced 쥐 무릎 관절염 모델의 설립
- 40 mg/kg tiletamine와 근육 주사를 통해 40 mg/kg zolazepam 동물 anesthetize.
- 열띤된 무대에서 왼쪽된 측면 위치에 동물을 배치합니다. 면도기와 함께 오른쪽 무릎 철저 하 게 면도. 외과 영역 10 %providone-요오드 솔루션 뒤에 70% 에탄올으로 소독, 두 번 더 반복 하 고 다음 10 %providone-요오드 솔루션 그리고 외과 패드 비 외과 영역을 커버.
- 는 jointcapsules를 노출 하는 슬 개 골 힘 줄을 따라 옆으로 2cm 절 개 하 게 수술 메스를 사용 하 여.
- 수술 메스를 사용 하 여 transect 중간 부수적인 인 대. 대 퇴 골 쪽으로 초승달 모양 반영.
- 연골 밖으로 건조 하지 않도록 하려면 작업 중에 관절 연골의 표면 살 균 0.9% 염화 나트륨 솔루션을 똑.
- 중간 초승달 모양 집게로 잡아와 메스 ( 그림 1A)와 tibial 첨부 파일에서 그것의 가장 좁은 지점에는 초승달을 극복. 연골 부상 방지.
- 공동 캡슐 4-0 흡수 봉합을 닫습니다.
- 그들은 식이 되 찾을 때까지 외과 쥐 모니터링.
- 주사 감염 및 수술 후 통증을 완화 하는 근육 경로 통해 0.05 mg/kg buprenorphine를 방지 하기 위해 20 mg/kg gentamicin.
- 발병 KOA 3-8 주 동안 12 h 명암 주기 아래 온도 제어 동물 시설에 쥐를 유지합니다. 동물 계속 진통제, 통증 증상이 계속 되 면 Buprenorphine (0.05 mg/kg, 인스턴트 메신저) 및 Gentamicin (20 mg/kg, 인스턴트 메신저), 하 되이 국한 되지 않음 등 수신.
2. 조직학 평가의 쥐 KOA 모델
- 희생 과도 한 CO 2 흡입 (추가 챔버에 기존 공기에 이산화탄소와 분당 챔버 볼륨의 약 30%의 채우기 비율이 동물 의식 있도록와 쥐 호흡 후 1 분의 2-3 분 최소 유지 CO2 흐름 내에서 정지 한다.) 에 나타난 시간 점 (대표 결과 KOA 유도 3에서 8 주까지 8 주에 표시 됩니다) 수술.
- 피부와 무릎 관절 주위 근육을 해 부하 고 메스와 무릎 관절을 잘라.
- 실 온에서 3 일 동안 4 %paraformaldehyde (PFA)에서 무릎 관절을 수정합니다. 이후에, 4 ° C에서 약 4 주 동안 20 %ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)에서 샘플을 알려줍니다 하 고 EDTA 3 일 마다 변경.
주의: Paraformaldehyde 독성, 적절 한 개인 보호 장비 (PPE), 장갑, 안경 등을 착용. - 탈수 자동 조직 프로세서를 사용 하 여 샘플. 플러시 주기를 다음과 같이 시작 메뉴 설정: 1 h;에 대 한 70% 에탄올 다음 80% 에탄올과 1 시간에 대 한 95% 에탄올 각각; 뒤에 1 h;에 대 한 100% 에탄올의 2 주기 그 후, 크 실 렌 1 시간에 두 번 각 시간과 각 시간 1 h 58 ° C에서 3 번 파라핀.
주의: 크 실 렌은 독성, 그래서 적절 한 보호구, 장갑, 안경 등을 착용.
참고: 필요에 따라 사용 Coplin 항아리 자동 조직 프로세서로 동일한 설정 수동 탈수. - 그대로 공동 얼굴의 중간 측면 내려 놓고 가운데에 포함 하는 조직 파라핀 블록에 포함.
참고: 필요에 따라 사용 하 여 집게 파라핀 블록으로 샘플을 수동으로 포함. - 로타리 톰 30 µ m 간격 2 직렬 섹션 5 µ m 화살 섹션 중간 마진에서 공동의 인하 시작.
- 유리 슬라이드에 섹션을 탑재 하 고 크 실 렌에 슬라이드를 deparaffinize. 2 직렬 섹션 사이 얼룩 되며 한 슬라이드 & 오신 (H & E) 얼룩: 0.1% 되며 15 분, 1 %10 s 및 0.5% 아세트산 해결책 오신 10 분. 그리고 다른 슬라이드 Safranin O/빠른 그린 얼룩과 얼룩: 0.1% 되며 15 분, 0.02% 빠른 그린 3 분, 1% 초 산 솔루션을 10 s와 0.1% Safranin O 3 분
주의: 크 실 렌은 독성, 장갑, 안경 등 적절 한 보호구를 착용. - 쥐 6 관절염 연구 학회 인터내셔널 (OARSI) Histopathology 평가 시스템을 사용 하 여 스테인드 슬라이드 점수.
3. 라벨의 인간 중간 엽 줄기 세포와 형광 염료 않았다
- 1 m m의 농도에서 100% 에탄올에 셀 라벨 솔루션 준비 했 어. 빛에서 셀 라벨링 솔루션을 보호 하 고 6 개월까지 실내 온도에 저장.
- 성장 Dulbecco에서 표준 세포 문화 절차와 haMSCs ' s 수정이 글 ' s 매체 (DMEM) 1% 페니실린 및 스와 10% 태아 종 아리 혈 청 (FCS) 10 cm 배양 접시에서 보충.
- 1 mM EDTA 합류 이전에 약 80%와 haMSCs 2 mL 0.25 %trypsin 분리.
- 4 mL 문화 매체와 트립 신을 중화 하 고 실내 온도에 3 분 동안 800 x g에서 셀 회전.
- 1 x 10 6 셀/mL 5 mL 혈 청 무료 문화 매체에서의 조밀도에 셀 중단.
- 50를 추가 하 여 셀 라벨 µ L 일 분 동안 37 ° C에 5 mL 혈 청 무료 문화 매체에서 셀 라벨링 솔루션
- 3 분에 대 한 800 x g에서 레이블이 지정 된 셀을 회전
- 5 mL 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)에서 3 분 동안 800 x g 2 셀 번 더 세척.
- 이라는 haMSCs Cy5 필터 세트 형광 현미경을 사용 하 여 확인 하십시오.
- Trypan 푸른 얼룩과 셀 고 주사에 대 한 100 µ L PBS에 10 6 가능한 셀 x 2.5.
4. Vivo에서 형광 트랙 haMSCs 이미징
- (1 단계), 수술 후 8 주 25 mg/kg tiletamine 및 25 mg/kg zolazepam의 근육 주사 하 여 KOA 쥐 anesthetize.
- 공동 영역을 노출 하는 면도기와 함께 오른쪽 무릎을 철저 하 게 면도. 70% 에탄올과 공동 지역 소독.
- 2.5 x 10을 주사 26 G 주사기 바늘을 사용 하 여 슬 개 골 인 대, 내측 대 퇴 관절 돌기, 그리고 중간 tibial 관절 돌기 (의 중간 측에 의해 형성 된 6 삼각형 지역의 센터에서 100 µ L PBS에 셀 표시 그림 1B).
- 이미징 소프트웨어를 열고 초기화는 vivo에서 생물 발광 이미징 시스템.
- 뒤로 눕은 위치 쥐 이미징 시스템의 중앙 무대에 놓고 챔버의 문을 닫습니다.
- 체크는 " 형광 " 확인란의 선택 형광 필터 세트 여기, 및 680 nm 방출 ( 그림 2A)에 대 한.
- 선택 필드 볼 디 설정 픽셀 binning 매체 (8), F를 / 2, 노출 중지는 자동 시간. 최적의 유지 전체 연구 ( 그림 2A)에서 유사한 결과 얻기 위해 일관 된 노출 시간.
- 무대 고 마 취에서 회복에 대 한 모니터에서 동물 제거.
참고: 장소 동물 난방 패드에 덮여 toweling의 2-3 층. - 형광 ( 그림 2B)의 측정에 대 한 복사 효율의 단위를 선택합니다. (ROI) 분석에 대 한 관심의 영역을 선택 하 고 각 이미지 ( 그림 2C) 형광 신호를 계량.
- Vivo에서 화상 진 찰 haMSCs 관절에 종 보존 연구를 순차적으로 각 쥐의 절차를 반복.
참고: 우리는 동물을 이미징 제안 ' 주입 후 첫 주에 대 한 일에 한 번 그리고 한 번 매주 마다 신호를 감지할 수 없을 때까지 vivo에서 이미징 시스템에 의해 형광 신호.
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Representative Results
KOA 모델을 유도 하기 위하여 m M SD 쥐 (그림 3)의 오른쪽 무릎 관절에 수행 되었다. 수술 후 8 주 쥐 희생 했다 고 무릎 관절의 직렬 섹션 두 H로 평가 했다 &와 Safranin O/빠른 그린 얼룩 (그림 4). H에 대 한 & 전자 얼룩, 관절 연골의 표면 전시 보다 수술을 하지 않고 정상적인 관절 수술 무릎에 거칠어 테두리. Safranin O/빠른 그린 얼룩, 우리는 감소 proteoglycan (붉은 얼룩)를 관찰 하 고 fibrillated 콜라겐 (녹색 얼룩) 수술 관절에 퇴행 성 KOA 고기의 진행 표시 정상적인 것에 비해 증가 수술에 의해 유도. 닮은 인간의 KOA의 진행, 쥐 3 주, 6 주, 8 주 m M 병 인을 평가 하 고 치료 개입의 시간 확인 후에 희생 되었다.
표시 한 haMSCs는 광학 vivo에서 이미징 시스템에 의해 KOA 쥐 모델에서 가시화 했다. 1 시간 후에, haMSCs 모양에 체 외에라운드 전시 표시 않았다. 라벨 효율 약 95%에 도달. 24 h, 후 경작 한 레이블된 haMSCs 전시 않았다 않았다 나타내는 긴 스핀 들 모양을 haMSCs에서 생체 외에서 (그림 5)의 준수 능력을 변경 하지. 수술 후 8 주 2.5 x 106 않았다 표시 된 haMSCs KOA와 관절에 주입 했다. 여기, 표시 한 haMSCs는 vivo에서 이미징 시스템 (그림 6)를 사용 하 여 하루 70 포스트 주입 (수술 후 18 주)까지 하루 0 (수술 후 8 주)에서 지역 공동에서 관찰 되었다.
그림 1: 셀 배달 M 수술 및 주사 영역에 대 한 도식 수술 필드. (A)이 회로도 파란색으로 강조 표시 됩니다 외과 영역을 보여 줍니다. (B)이 회로도 빨간 동그라미 영역 내에서 사출 사이트를 나타냅니다. 약어 정의 다음과 같습니다: m M, 중간 초승달 모양; MCL, 중간 부수적인 인 대; LM, 측면 초승달 모양; LCL, 측면 부수적인 인 대; PL, 슬 개 골 인 대 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 스크린 샷 vivo에서 화상 진 찰 소프트웨어의. (A) 형광 이미지 수집에 대 한 매개 변수 키 설정 빨간색 사각형으로 강조 표시 됩니다. (B) 빛 난 효율성은 형광의 측정 단위로 선택 됩니다. (C) 도구 팔레트, 관심 (ROI) 영역에서 형광 효율 측정 동그라미 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 수술 유도 KOA의 절차. 무릎 관절 공간의 노출은 (A) . (B) 무릎 중간 초승달 모양을 나타내는 검정색 화살표와 함께 공동의 내부 구조. (C) 해 부 중간 초승달 모양. (D) 공동 공간 및 피부 폐쇄 됩니다.
그림 4: 무릎 관절과 KOA의 OARSI 점수에 대 한 통계 분석의 대표적인 조직학 사진. (A) 8 주 쥐에 m M 수술, 무릎 관절의 직렬 섹션 H로 평가 했다 &와 Safranin O/빠른 그린 얼룩. H & 수술 무릎에 연골의 두께 감소 되었다 보여주었다 E 얼룩. Safranin O/빠른 그린 얼룩 보였다 proteoglycan (붉은 얼룩)를 감소 하 고 수술 무릎을 정상 무릎과 비교 (녹색 얼룩) fibrillated 콜라겐 증가. 눈금 막대 500 µ m. (B) 통계 분석 정상 관절과 KOA 관절에 관절염의 점수 = (n = 3). 로 mean±SEM. 데이터 표현 * p를 나타냅니다 < 0.05. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 않았다 표시 된 haMSCs의 형태. 밝은 필드 라벨링 후 1 시간에 haMSCs의 형광 및 병합 된 이미지 상단 패널에 표시 됩니다. 밝은 분야 fluorescentand haMSCs at24 h의 이미지 병합 후 라벨 하단 패널에 표시 됩니다. 눈금 막대 = 50 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: vivo에서 화상 진 찰 않았다 표시 된 haMSCs의. 2.5 x 106 않았다 표시 된 haMSCs의 주입, 후 KOA 쥐의 대표 이미지는 표시 됩니다. 한 이라는 haMSCs은 KOA 쥐의 관절에서 로컬로 최대 9 주 동안 발견 되었습니다. 이 그림 리 M 외8의 간행물에서 재현 되어 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
우리는 머리 맡에 벤치에서 코 아에 대 한 재생 줄기 세포 치료를 가져올 수 있는 전에 안전 표준 및 줄기 세포 치료의 biodistribution 연구 절실히 필요는 합니다. 그러나, 질병의 병 적인 환경 지 속성에 biodistribution 이식된 haMSCs10의 중요 한 역할을 재생합니다. 최근, 우리의 그룹 보다 정상적인 조건을8에서 주사 병 적인 KOA 환경 haMSCs의 내부 관절 주사 이상 유지는 설명 했다. 그것은 염증 및 퇴행 성 microenvironment 수리에 대 한 중간 엽 줄기 세포를 모집 하 고 이후 삽입 된 haMSCs1,21의 보존을 부탁 수 있습니다. 또한, haMSCs의 안전과 효능 프로필 최적화 실험실 동물에 KOA의 진행의 임상 시험을 지원 하기 위한 중요 한 데이터를 제공할 것입니다 그렇게 KOA, 심각도 대 한 셀 배달의 타이밍에 의해 좌우 될 수 있습니다. 목표와 닮은 인간의 KOA의 적당 한 심각도에 약한, m M에 의해 유도 된 쥐 개발 KOA 3에서 8 주까지 사용할 수 있습니다. 이 연구에서는 연골의 형태학 변화 haMSCs8의 안전과 효능을 조사 하는 KOA의 적당 한 정도를 상대적으로 가능한 모델을 제공 하는 수술 후 histopathological 점수 8 주에 의해 평가 했다. 우리 여기 장기 전 임상 효능 평가 위한 라벨 haMSCs 형광 빨강 질 성 막 염료와 간단 하 고 가능한 방법을 설명 했다.
이 기술의 결점은 군데 조직 피부 가까이 있어야 하 고 상당한 양의 이라는 haMSCs는 충분 한 신호 수집에서 겸손 한 양자 수율 때문에 필요한 어 요. vivo에서 광학 이미징 시스템을 통해 비-침략 적 경도 연구 haMSCs의 KOA에서 biodistribution 모델, 휴대폰 번호에 동향 및 위치 일반적 분별만 수 있습니다. 특정 세포 확산 및 감 별 법에 줄기 세포 운명의 분석 또한 운명 매핑 및 고해상도 현미경 이미지를 활용 하 여 해결 됩니다.
현재, 다양 한 기법을 라벨 방사성 레이블, 리포터 유전자22,23,24의 바이러스 성 변환, 나노 입자 등 줄기 세포 추적, vivo에서 사용할 수 있습니다. 그러나, 줄기 세포의 바이러스 성 변환 뿐만 아니라 방사성 라벨 방해할 수 있습니다 이후 줄기 세포 증식과 생존 vivo에서16에 영향을 미칠 수 있습니다 세포의 유전 속성. 또한, 계약 에이전트 필요로 강한 자기장을 통해 향상 된 공간 해상도 나노 입자에 의해 MRI를 사용 하 여 줄기 세포 추적는이 기술은25의 감도 대 한 우려 인상 수 있습니다. 형광 세포 염색와 같은 PKH26, CM DiI와 CFSE 전시 세포 독성의 정도의 지방 조직 라벨의 상대적으로 한정 된 기간 (최대 4 주) 파생 셀15제공. 반면, 수성 솔루션에 약한 형광을 전시 했다. 지질 막으로 통합, 일단 세포 막 및 익스프레스 안정적인 빨강 형광19내 균일 하 게 확산 했다. 레이블을 실행 가능한 세포 및 않습니다 하지 그들의 확산에 영향을 미칠 않았고18기능. 더 중요 한 것은, 염료 할 전송 하지 레이블이 지정 된 셀에서 레이블이 셀에 해당 셀26사이 직접 막 상호 작용 하지 않는 한. 빨강 여기 및 방출 스펙트럼의 주변 조직에서 autofluorescent 간섭 방지 했 고 살아있는 동물에서 깊은 조직 이미지를 제공 합니다. 이러한 기능 사용 intra-articularly 이식된 haMSCs의 운명을 공부 하는 이상적인 장기 추적 기법으로 라벨을 했다. 따라서, 우리는 신뢰할 수 있는 증명 모니터링 방법론 쥐 모델8에서 63 일 기간 동안 이라는 haMSCs를 않았다.
KOA 쥐 모델에서 않았다 표시 된 haMSCs 추적에 대 한 프로토콜을 안정적이 고 실현 가능한 결과 얻기 위해 중요 한 단계는 다는 것을 확인 하는: 1)는 초승달 모양의 대 퇴 골 쪽으로 완전히 KOA의 일관 된 발병에 대 한 각 쥐 모델에서 극복 된다, 2) 10 μ의 최적화 된 비율 50 분 얼룩, 3 106 haMSC 세포에 대 한 염색 했다) 않았다 표시 된 haMSCs에 대 한 vivo에서 검출 임계값은 10 사이4 및 105 셀 106 셀 이상 권장 이 프로토콜.
일단이 기술을 마스터,이 방법의 응용 프로그램 최적 경로 또는 전 임상 연구에서 MSCs의 관리에 대 한 복용량을 결정 하기 위해 사용 될 수 있습니다. 이 프로토콜은 골 수, 탯 줄 혈액을 포함 한 다른 소스 로부터 중간 엽 줄기 세포 (MSCs)의 biodistribution vivo에서 의 장기 전 임상 평가 대 한 쉽게 적용할 수 있습니다. 잠재 줄기 세포 운명에 대 한 KOA 동물 모델으로, 빛 확산8 및 콜라겐 II 관절 연골 분화27, Ki67 같은 xenogeneic haMSCs의 immunohistology 학문이 결합 될 수 있다 기술입니다.
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Disclosures
멩 리 밍 커, 원 왕은 현재 직원 및 셀룰러 의학 그룹의 스톡 옵션 보유자 (나스닥: CBMG). 다른 저자는 충돌의 관심을 선언합니다.
Acknowledgments
현재 연구는 상하이 혁신 자금 (1402 H 294300) 과학 및 기술 위원회의 상하이 시 (CN) 박사 원 왕 후원에 의해 지원 되었다. 우리는 그의 기술 지원 및이 원고에 대 한 과학적 조언에 대 한 광 저 우 박사 (조직 공학 센터의 중국 국가)를 감사 하 고 싶습니다. 우리 또한 싶습니다 씨 Huitang 쌰 (상해 9 사람들의 병원) 감사 하 고 동물 복지에 그의 도움에 대 한.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matrx VMR animal anesthesia system | Midmark | VIP3000 | |
| 4-0 suture | Shanghai Jinhuan | KC439 | |
| Razor | Pritech | LD-9987 | |
| Gentamicin | Zhejiang Jindakang Animal Health Product Co., Ltd. | None | |
| 0.9% Sodium chloride solution | Hunan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd. | H43020455 | |
| Penicillin | Shanghai Kangfu chemical pharmaceutical Co., Ltd. | None | |
| Buprenorphine | Tianjin Pharmaceutical Research Institute Pharmaceutical Co., Ltd. | None | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 16005 | Dilute to final concentration of 10% in PBS |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | Dilute to final concentration of 20% in PBS |
| 0.1% Hematoxylin Solution, Mayer’s | Sigma-Aldrich | MHS16 | |
| 0.5% Eosin Y solution, alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110116 | |
| Safranin O | Sigma-Aldrich | S8884 | |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Shandon Excelsior ESTM Tissue Processor | Thermo Fisher | A78400006 | |
| Shandon Histocentre™ 3 Tissue Embedding Center | Thermo Fisher | B64100010 | |
| Fully Automated Rotary Microtome | Leica | RM2255 | |
| DiD | Molecular Probes, Life Technologies |
V-22887 | |
| D-MEM High Glucose | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| PBS | GIBCO, Life Technologies | 14190-144 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-114 | |
| 10 cm Petri Dish | Corning | V118877 | |
| Centrifuge | Beckman | Optima MAX-TL | |
| Fluorescent microscope | Olympus | BX53 | |
| 0.4% Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich | 93595 | |
| Titetamme | Virbac (Zoletil 50) | 1000000188 | |
| Zolazepam | Virbac (Zoletil 50) | 1000000188 | |
| Sterile hyposermic syringe for single use 26G | Shanghai Misawa Medical Industry | None | |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | PerkinElmer | 124262 | |
| Living Imaging 4.0 software | PerkinElmer | None |
References
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