Summary

In Vivo Suivi des humains dérivés adipeux cellules souches mésenchymateuses dans un modèle de l’arthrose du genou de Rat avec un colorant Fluorescent Membrane lipophiles

Published: October 08, 2017
doi:

Summary

Ce protocole décrit un moyen efficace de contrôler la persistance de la cellule et la biodistribution des dérivés adipeux mésenchymateuses des cellules souches humaines (haMSCs) par fluorescence rouge sombre étiquetage dans un modèle de l’arthrose (KOA) de genou de rat par injection intra-articulaire de (IA).

Abstract

Afin de soutenir l’application clinique de thérapie dérivée adipeux mésenchymateuses cellules souches humaines (haMSC) pour l’arthrose du genou (KOA), nous avons examiné l’efficacité de la persistance de cellules et de biodistribution des haMSCs dans des modèles animaux. Nous avons démontré une méthode pour étiqueter la membrane cellulaire de haMSCs avec un colorant fluorescent lipophile. Par la suite, une injection intra-articulaire des cellules marquées chez les rats avec KOA induite chirurgicalement surveillait dynamiquement par un in vivo système d’imagerie. Nous avons utilisé les lipophiles carbocyanines (DilC18 (5)), un analogue de Dil (dialkylcarbocyanines) fluorescent rouge sombre, qui utilise un laser rouge pour éviter l’excitation de l’autofluorescence verte naturelle des tissus environnants. Par ailleurs, les spectres d’émission décalée vers le rouge d’autorisé imagerie profonde des tissus animaux vivants et la procédure d’étiquetage ne causé aucun effets cytotoxiques ou des dommages fonctionnel à haMSCs. Cette approche s’est avérée être une méthode de suivi efficace pour haMSCs dans un modèle de rat KOA. L’application de cette méthode pourrait également être utilisée pour déterminer l’itinéraire optimal d’administration et la posologie de MSCs provenant d’autres sources dans des études précliniques.

Introduction

L’arthrose du genou (KOA) est une affection dégénérative résultant de la perte du cartilage articulaire et de l’inflammation progressive, qui est devenu une maladie chronique importante chez les personnes âgées autour du monde1. Toutefois, les traitements actuels à l’aide d’anti-inflammatoires non stéroïdiens, les suppléments physiques et interventions chirurgicales ne peuvent fournir un soulagement temporaire pour douleur symptomatique2.

Dérivé d’adipeux mésenchymateuses des cellules souches humaines (haMSCs) sont devenus un remède prometteur régénératrice pour l’arthrose du genou, en raison de leur potentiel de régénération du cartilage et de propriétés immunomodulatrices3, la différenciation multipotente 4. Par rapport aux routes pharmacologiques pour étudier les mécanismes d’action, en vivo, suivi haMSCs vivants dans des modèles animaux de petit KOA est actuellement instructif d’établir la raison d’être et de la faisabilité du traitement haMSC avant l’application clinique. Pour les essais précliniques, méniscectomie interne (MM) déstabilise la charge mécanique de l’articulation pour induire KOA chez les rats, qui fournit un modèle relativement faisable avec reproductibilité conforme5. L’apparition de KOA induite par MM est antérieure à la résection du ligament seule ou combinée avec une méniscectomie interne partielle6. Par conséquent, les interactions à long terme entre haMSCs injecté avec le microenvironnement pathologique de KOA sont souvent évaluées chez les rats induits par MM7,8.

Bien que l’efficacité thérapeutique de haMSCs a été largement rapportés, les connaissances sur la persistance en vivo de haMSCs implantés par injection intra-articulaire de (IA) est rare9,10. Par conséquent, différentes méthodes de marquage cellulaires ont été développés, y compris l’immunohistologie11,12de la luciférase, transfection13 protéine fluorescente verte, oxyde de fer d’étiquetage pour l’imagerie par résonance magnétique (IRM)14 et de nombreuses cellules fluorescentes colorants8,15,16. Par rapport aux analyses histologiques à forte main-d’oeuvre, in vivo imagerie non invasive emploie des dispositifs optiques pour détecter la distribution en temps réel et la dynamique de cellules marquées avec signaux fluorescents10,17. Pour l’imagerie de cellules vivantes fonctionnelle, cytocompatible marquage fluorescent est une technique de suivi sophistiqué radioactifs exempt de révéler des activités cellulaires après transplantation de cellules souches18. En outre, multicolores fluorochromes lipophiles possèdent des avantages par rapport aux colorants hydrophiles amino-réactifs ou des protéines fluorescentes, y compris leur perméabilité cellulaire améliorée et la fluorescence accrue de rendements quantiques19.

Ainsi, les protocoles inclus ici utilisent un rouge laser pour exciter des cellules marquées avec carbocyanines lipophiles a fait (DilC18(5)), qui est un rouge sombre fluorescent Dil (dialkylcarbocyanines) analogique20. Les spectres d’excitation et d’émission décalée vers le rouge des évite les interférences auto-fluorescente et permet aux tissus profonds d’imagerie sur une longue période de temps dans les animaux vivants8. Cette méthode de suivi des cellules en vivo étiqueté avec est valide pour la surveillance des cellules souches transplantées, tels que haMSCs, dans des modèles animaux, qui est essentiel pour comprendre et améliorer l’actuel thérapie régénératrice des cellules souches.

Protocol

procédures portant sur des sujets animaux ont été approuvées par le Comité d’éthique et de locaux institutionnels animalier avec un effort pour minimiser les souffrances animales. Le protocole suivant a été approuvé par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) à Shanghai neuvième personnes ’ s hôpital affilié à Shanghai JiaoTong University School of Medicine avec le protocole numéro [2017] 063. 1. mise en place d’un modèle de l’arthrose du genou S…

Representative Results

Afin d’inciter le modèle KOA, MM a été réalisée dans l’articulation du genou droit de rats SD (Figure 3). Huit semaines après la chirurgie, des rats ont été sacrifiés et les coupes sériées de l’articulation du genou ont été évalués avec les deux H & E et safranine O/Fast Green coloration (Figure 4). H & E coloration, la surface du cartilage articulaire présentait des frontières plus rude dans les ge…

Discussion

Normes de sécurité et les études de biodistribution de thérapie de cellules souches sont urgent avant que nous pouvons apporter le traitement régénérateur des cellules souches pour KOA à l’audience au chevet du malade. Cependant, l’environnement pathologique de la maladie joue un rôle important dans la persistance et la biodistribution des transplantés haMSCs10. Récemment, notre groupe a démontré que les injections intra-articulaires de haMSCs a persisté plus dans un environnemen…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

L’étude actuelle a été soutenue par Shanghai Innovation financement (1402H 294300) parrainé par la Science et la technologie Commission de Shanghai municipalité (CN) à m. Wen Wang. Nous tenons à remercier m. Guangdong Zhou (National Tissue Engineering Centre de la Chine) pour son assistance technique et des conseils scientifiques pour ce manuscrit. Nous tenons également à remercier M. Huitang Xia (hôpital du peuple de Shanghai neuvième) pour son aide en matière de bien-être animal.

Materials

Matrx VMR animal anesthesia system Midmark VIP3000
4-0 suture Shanghai Jinhuan KC439
Razor Pritech LD-9987
Gentamicin Zhejiang Jindakang Animal Health Product Co., Ltd. None
0.9% Sodium chloride solution Hunan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd. H43020455
Penicillin Shanghai Kangfu chemical pharmaceutical Co., Ltd. None
Buprenorphine Tianjin Pharmaceutical Research Institute Pharmaceutical Co., Ltd. None
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 16005 Dilute to final concentration of 10% in PBS
EDTA Sigma-Aldrich E9884 Dilute to final concentration of 20% in PBS
0.1% Hematoxylin Solution, Mayer’s Sigma-Aldrich MHS16
0.5% Eosin Y solution, alcoholic Sigma-Aldrich HT110116
Safranin O Sigma-Aldrich S8884
Fast Green Sigma-Aldrich F7258
Shandon Excelsior ESTM Tissue Processor Thermo Fisher A78400006
Shandon Histocentre™ 3 Tissue Embedding Center Thermo Fisher B64100010
Fully Automated Rotary Microtome Leica RM2255
DiD Molecular Probes, Life
Technologies
V-22887
D-MEM High Glucose Sigma-Aldrich D5648
PBS GIBCO, Life Technologies 14190-144
0.25% Trypsin-EDTA Invitrogen 25200-114
10 cm Petri Dish Corning V118877
Centrifuge Beckman Optima MAX-TL
Fluorescent microscope Olympus BX53
0.4% Trypan Blue solution Sigma-Aldrich 93595
Titetamme Virbac (Zoletil 50) 1000000188
Zolazepam Virbac (Zoletil 50) 1000000188
Sterile hyposermic syringe for single use 26G Shanghai Misawa Medical Industry None
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System PerkinElmer 124262
Living Imaging 4.0 software PerkinElmer None

References

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Li, M., Hao, M., Jiang, D., Chen, Y., Wang, W. In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye. J. Vis. Exp. (128), e56273, doi:10.3791/56273 (2017).

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