Denne protokollen beskriver en effektiv måte å overvåke celle utholdenhet og biodistribution av menneskelig liggende under adipose-avledet mesenchymal stamceller (haMSCs) av langt rødt fluorescens merking i en rotte kneet slitasjegikt (KOA) modell via intra articular (IA) injeksjon.
For å støtte klinisk anvendelse av menneskelig liggende under adipose-avledet mesenchymal stamceller (haMSC) terapi for kneet slitasjegikt (KOA), undersøkte vi effekten av cellen utholdenhet og biodistribution av haMSCs i dyremodeller. Vi viste en metode for å merke cellen membran av haMSCs med lipofile fluorescerende farge. Deretter var intra articular injeksjon av merket cellene i rotter med kirurgisk indusert KOA overvåket dynamisk av en i vivo imaging system. Vi ansatt den lipofile carbocyanines gjorde (DilC18 (5)), en langt rødt fluorescerende Dil (dialkylcarbocyanines) analog, som benyttet en rød laser for å unngå magnetisering av naturlige grønne autofluorescence fra omkringliggende vev. Videre de rød-skiftet utslipp spektra av tillatt dype vev bildebehandling i levende dyr og merking prosedyren forårsaket ingen cytotoksiske effekter eller funksjonelle skade haMSCs. Denne tilnærmingen har vist seg å være en effektiv oppfølgingsmetode for haMSCs i en rotte KOA modell. Anvendelsen av denne metoden kan også brukes til å bestemme optimal administrasjon ruten og dosering av MSCs fra andre kilder i pre kliniske studier.
Kneet slitasjegikt (KOA) er en degenerativ lidelse som følge av articular brusk tap og progressiv betennelse, som har blitt en stor kronisk sykdom i eldre rundt verden1. Imidlertid kan gjeldende terapi bruker anti-inflammatoriske legemidler, fysisk kosttilskudd og kirurgiske prosedyrer bare gi midlertidig lindring for symptomatisk smerte2.
Menneskelige liggende under adipose-avledet mesenchymal stamceller (haMSCs) har blitt et lovende regenerativ middel for kneet slitasjegikt, på grunn av deres multipotent differensiering potensial for brusk regenerasjon og immunmodulerende egenskaper3, 4. Sammenlignet med farmakologiske ruter å undersøke mekanismer for handlingen vivo, er sporing live haMSCs i små KOA dyremodeller for tiden lærerikt å etablere begrunnelse for og gjennomførbarhet av haMSC terapi før klinisk anvendelse. For prekliniske testing, destabilizes mediale meniscectomy (MM) mekanisk belastningen av felles å indusere KOA i rotter, som gir en relativt mulig modell konsekvent reproduserbarhet5. Utbruddet av KOA indusert av MM er tidligere enn transection i fremre korsbånd alene eller kombinert med delvis mediale meniscectomy6. Derfor vurderes ofte langsiktige samspillet mellom injisert haMSCs med patologisk microenvironment av KOA i rotter indusert av MM7,8.
Selv om terapeutiske effekten av haMSCs har blitt mye rapportert, relevant kunnskap på er faste i vivo implantert haMSCs via intra articular (IA) injeksjon knappe9,10. Derfor har ulike mobilnettet merking metoder blitt utviklet, inkludert immunohistology11, luciferase12, grønne fluorescerende protein13 transfection, jernoksid merkingsteknikker for magnetisk resonans imaging (MRI)14 , og mange fluorescerende celle fargestoffer8,15,16. Sammenlignet med arbeidskrevende histology analyser, bruker i vivo ikke-invasiv bildebehandling optiske enheter å oppdage sanntid distribusjon og dynamikken i celler merket med fluorescerende signaler10,17. For funksjonelle levende celle bildebehandling er cytocompatible fluorescerende merking en sofistikert radioaktivt uten sporing teknikk for å avsløre mobilnettet aktiviteter etter stilk cellen transplantasjon18. Videre har multicolor fluorescerende lipofile fargestoffer fordeler over amino-reaktive hydrofile fargestoffer eller fluorescerende proteiner, inkludert forbedret celle permeabilitet og forbedret fluorescens quantum gir19.
Dermed protokollene inkludert her utnytte en rød laser å opphisse celler merket med lipofile carbocyanines gjorde (DilC18(5)), som er en langt rødt fluorescerende Dil (dialkylcarbocyanines) analoge20. De rød-skiftet eksitasjon og utslipp spektra av unngår autofluorescent forstyrrelser og gir dyp-vev imaging over en lang periode i levende dyr8. Denne metoden for sporing celler i vivo merket med gjorde er gyldig for overvåking transplantert stamceller, som haMSCs, i dyremodeller, som er avgjørende for å forstå og forbedre gjeldende stamcelleforskningen regenerativ therapy.
Standarder og biodistribution studier av stilk cellen terapi er presserende nødvendig før vi kan få regenerativ stilk cellen behandling for KOA fra benken til sengen. Men spiller patologisk miljøet av sykdom en viktig rolle i utholdenhet og biodistribution av transplantert haMSCs10. Nylig vist vår gruppe at intra articular injeksjon av haMSCs varte lenger i en patologisk KOA miljø enn injeksjoner under normale forhold8. Det er mulig at den inflammatoriske og degenerat…
The authors have nothing to disclose.
Denne studien ble støttet av Shanghai innovasjon finansiering (1402H 294300) sponset av vitenskap og teknologi provisjon av Shanghai kommune (CN) til Dr. Wen Wang. Vi vil gjerne takke Dr. Guangdong Zhou (National Tissue Engineering Center i Kina) for hans teknisk assistanse og vitenskapelige råd for dette manuskriptet. Vi ønsker også å takke Mr. Huitang Xia (Shanghai niende folks Hospital) for hans hjelp dyrevelferd.
Matrx VMR animal anesthesia system | Midmark | VIP3000 | |
4-0 suture | Shanghai Jinhuan | KC439 | |
Razor | Pritech | LD-9987 | |
Gentamicin | Zhejiang Jindakang Animal Health Product Co., Ltd. | None | |
0.9% Sodium chloride solution | Hunan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd. | H43020455 | |
Penicillin | Shanghai Kangfu chemical pharmaceutical Co., Ltd. | None | |
Buprenorphine | Tianjin Pharmaceutical Research Institute Pharmaceutical Co., Ltd. | None | |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 16005 | Dilute to final concentration of 10% in PBS |
EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | Dilute to final concentration of 20% in PBS |
0.1% Hematoxylin Solution, Mayer’s | Sigma-Aldrich | MHS16 | |
0.5% Eosin Y solution, alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110116 | |
Safranin O | Sigma-Aldrich | S8884 | |
Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258 | |
Shandon Excelsior ESTM Tissue Processor | Thermo Fisher | A78400006 | |
Shandon Histocentre™ 3 Tissue Embedding Center | Thermo Fisher | B64100010 | |
Fully Automated Rotary Microtome | Leica | RM2255 | |
DiD | Molecular Probes, Life Technologies |
V-22887 | |
D-MEM High Glucose | Sigma-Aldrich | D5648 | |
PBS | GIBCO, Life Technologies | 14190-144 | |
0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-114 | |
10 cm Petri Dish | Corning | V118877 | |
Centrifuge | Beckman | Optima MAX-TL | |
Fluorescent microscope | Olympus | BX53 | |
0.4% Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich | 93595 | |
Titetamme | Virbac (Zoletil 50) | 1000000188 | |
Zolazepam | Virbac (Zoletil 50) | 1000000188 | |
Sterile hyposermic syringe for single use 26G | Shanghai Misawa Medical Industry | None | |
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | PerkinElmer | 124262 | |
Living Imaging 4.0 software | PerkinElmer | None |