In Vivo Spårning av mänskliga Adipose-derived mesenkymala stamceller i en råtta knä artros modell med fluorescerande lipofila membran färgämne
Summary
Det här protokollet beskriver ett effektivt sätt att övervaka cell Persistens och biodistribution mänskliga adipose-derived mesenkymala stamceller (haMSCs) genom mån fluorescens märkning i en råtta knä artros (KOA) modell via intraartikulär (IA) injektion.
Abstract
För att stödja den kliniska tillämpningen av mänskliga adipose-derived mesenkymala stamceller (haMSC) terapi för knä artros (KOA), undersökte vi effekten av cell Persistens och biodistribution av haMSCs i djurmodeller. Vi visade en metod för att märka cellmembranet av haMSCs med lipofila fluorescerande färgämne. Intraartikulär injektion av märkta celler hos råttor med kirurgiskt inducerad KOA övervakades därefter dynamiskt av en in-vivo imaging system. Vi anställt den lipofila carbocyanines gjorde (DilC18 (5)), en mån fluorescerande Dil (dialkylcarbocyanines)-analog, som utnyttjade en röd laser för att undvika excitation av den naturliga gröna autofluorescens från omgivande vävnader. Dessutom röd-skiftat utsläpp spektra av tillåtna djup vävnad imaging i levande djur och märkning förfarandet orsakade inga cytotoxiska effekter eller funktionella skador på haMSCs. Denna strategi har visat sig vara en effektiv uppföljningsmetod för haMSCs i en råtta KOA modell. Tillämpningen av denna metod kan också användas för att fastställa optimalt administrationssätt och dosering av MSCs från andra källor i prekliniska studier.
Introduction
Knä artros (KOA) är en degenerativ sjukdom som följd av ledbrosk förlust och progressiv inflammation, vilket har blivit en stor kronisk sjukdom hos äldre runt om världen1. Nuvarande behandlingar med antiinflammatoriska läkemedel, fysiska kosttillskott och kirurgiska ingrepp kan dock bara ge tillfällig lättnad för symtomatisk smärta2.
Adipose-derived mesenkymala stamceller från mänskliga (haMSCs) har blivit ett lovande regenerativ botemedel mot knä artros, på grund av deras potential för brosk regenerering och immunmodulerande egenskaper3, multipotenta differentiering 4. Jämfört med farmakologisk rutter att undersöka mekanismer för åtgärder i vivo, är spåra levande haMSCs i små KOA djurmodeller för närvarande lärorikt att fastställa grunden för och genomförbarheten av haMSC behandling före klinisk tillämpning. För preklinisk testning, destabiliserar mediala meniscectomy (MM) den mekaniska belastningen av leden att inducera KOA hos råttor, vilket ger en relativt genomförbar modell med konsekvent reproducerbarhet5. Uppkomsten av KOA induceras av MM är tidigare än Främre korsband transection enskilt eller i kombination med partiell medial meniscectomy6. Långsiktig samverkan mellan injicerade haMSCs med den patologiska mikromiljö av KOA bedöms därför ofta i råttor inducerade av MM7,8.
Även om den terapeutiska effekten av haMSCs varit utförligt rapporterade, relevant kunskap på är i vivo ihållande implanterade haMSCs via intraartikulär (IA) injektion knappa9,10. Därför har olika cellulära märkning metoder utarbetats, inklusive immunohistology11, luciferas12, grönt fluorescerande protein13 transfection, järnoxid märkning för magnetisk resonanstomografi (MRT)14 , och många fluorescerande cell färgämnen8,15,16. I vivo noninvasiv imaging jämfört med arbetsintensiva histologi analyser, och sysselsätter optiska enheter att upptäcka realtid distribution och dynamiken i celler märkta med fluorescerande signaler10,17. För funktionella levande cell imaging är cytocompatible fluorescerande märkning en sofistikerad radioaktiva-free tracking teknik att avslöja cellulära aktiviteter efter stamceller transplantation18. Dessutom besitter multicolor fluorescerande fettlösliga färgämnen fördelar jämfört med amino-reaktivt hydrofil färgämnen eller fluorescerande proteiner, inklusive förbättrad cell permeabilitet och förbättrad fluorescens quantum avkastning19.
Således de protokoll som ingår här använder en röd laser för att excitera celler märkta med lipofila carbocyanines gjorde (DilC18(5)), som är en mån fluorescerande Dil (dialkylcarbocyanines) analog20. Röd-skiftat excitation och utsläpp spektra av undviker autofluorescent störningar och tillåter djup-vävnad imaging över en lång tidsperiod i levande djur8. Denna metod för spårning celler i vivo märkt med gjorde är giltig för övervakning transplanterade stamceller, som haMSCs, i djurmodeller, vilket är viktigt att förstå och förbättra nuvarande regenerativ terapi med stamceller.
Protocol
Representative Results
Discussion
Säkerhetsstandarder och biodistribution studier av stamcellsterapi behövs snarast innan vi kan väcka regenerativ stamceller behandling för KOA från bänken till sängkanten. Patologiska miljön av sjukdom spelar dock en viktig roll i Persistens och biodistribution transplanterade haMSCs10. Nyligen har visat vår grupp att intraartikulär injektion av haMSCs kvarstod längre i en patologisk KOA-miljö än gjorde injektioner under normala förhållanden8. Det är möjlig…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Den aktuella studien stöddes av Shanghai innovationsfinansiering (1402H 294300) sponsras av vetenskap och teknik kommissionen av Shanghai kommun (KN) till Dr. Wen Wang. Vi vill tacka Dr Guangdong Zhou (Tissue Engineering Center Kinas nationella) för hans tekniskt bistånd och vetenskapliga råd för detta manuskript. Vi vill också tacka Mr Huitang Xia (Shanghai nionde människors sjukhus) för hans hjälp i djurens välbefinnande.
Materials
| Matrx VMR animal anesthesia system | Midmark | VIP3000 | |
| 4-0 suture | Shanghai Jinhuan | KC439 | |
| Razor | Pritech | LD-9987 | |
| Gentamicin | Zhejiang Jindakang Animal Health Product Co., Ltd. | None | |
| 0.9% Sodium chloride solution | Hunan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd. | H43020455 | |
| Penicillin | Shanghai Kangfu chemical pharmaceutical Co., Ltd. | None | |
| Buprenorphine | Tianjin Pharmaceutical Research Institute Pharmaceutical Co., Ltd. | None | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 16005 | Dilute to final concentration of 10% in PBS |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | Dilute to final concentration of 20% in PBS |
| 0.1% Hematoxylin Solution, Mayer’s | Sigma-Aldrich | MHS16 | |
| 0.5% Eosin Y solution, alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110116 | |
| Safranin O | Sigma-Aldrich | S8884 | |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Shandon Excelsior ESTM Tissue Processor | Thermo Fisher | A78400006 | |
| Shandon Histocentre™ 3 Tissue Embedding Center | Thermo Fisher | B64100010 | |
| Fully Automated Rotary Microtome | Leica | RM2255 | |
| DiD | Molecular Probes, Life Technologies |
V-22887 | |
| D-MEM High Glucose | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| PBS | GIBCO, Life Technologies | 14190-144 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-114 | |
| 10 cm Petri Dish | Corning | V118877 | |
| Centrifuge | Beckman | Optima MAX-TL | |
| Fluorescent microscope | Olympus | BX53 | |
| 0.4% Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich | 93595 | |
| Titetamme | Virbac (Zoletil 50) | 1000000188 | |
| Zolazepam | Virbac (Zoletil 50) | 1000000188 | |
| Sterile hyposermic syringe for single use 26G | Shanghai Misawa Medical Industry | None | |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | PerkinElmer | 124262 | |
| Living Imaging 4.0 software | PerkinElmer | None |
References
- Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ. Arthritis Rheum. 64 (6), 1697-1707 (2012).
- Lane, N. E., Shidara, K., Wise, B. L. Osteoarthritis year in review 2016: clinical. Osteoarthritis Cartilage. 25 (2), 209-215 (2017).
- Wang, W., Cao, W. Treatment of osteoarthritis with mesenchymal stem cells. Sci China Life Sci. 57 (6), 586-595 (2014).
- Burke, J., et al. Therapeutic potential of mesenchymal stem cell based therapy for osteoarthritis. Clin Transl Med. 5 (1), 27 (2016).
- Bendele, A. M. Animal models of osteoarthritis. J Musculoskelet Neuronal Interact. 1 (4), 363-376 (2001).
- Gerwin, N., Bendele, A. M., Glasson, S., Carlson, C. S. The OARSI histopathology initiative – recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the rat. Osteoarthritis Cartilage. 18, S24-S34 (2010).
- Janusz, M. J., et al. Induction of osteoarthritis in the rat by surgical tear of the meniscus: Inhibition of joint damage by a matrix metalloproteinase inhibitor. Osteoarthritis Cartilage. 10 (10), 785-791 (2002).
- Li, M., et al. In vivo human adipose-derived mesenchymal stem cell tracking after intra-articular delivery in a rat osteoarthritis model. Stem Cell Res Ther. 7 (1), 160 (2016).
- Zhou, B., et al. Administering human adipose-derived mesenchymal stem cells to prevent and treat experimental arthritis. Clin Immunol. 141 (3), 328-337 (2011).
- Desando, G., et al. Intra-articular delivery of adipose derived stromal cells attenuates osteoarthritis progression in an experimental rabbit model. Arthritis Res Ther. 15 (1), 22 (2013).
- Riester, S. M., et al. Safety Studies for Use of Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stromal/Stem Cells in a Rabbit Model for Osteoarthritis to Support a Phase I Clinical Trial. Stem Cells Transl Med. 6 (3), 910-922 (2017).
- Bai, X., et al. Tracking long-term survival of intramyocardially delivered human adipose tissue-derived stem cells using bioluminescence imaging. Mol Imaging Biol. 13 (4), 633-645 (2011).
- Wolbank, S., et al. Labelling of human adipose-derived stem cells for non-invasive in vivo cell tracking. Cell Tissue Bank. 8 (3), 163-177 (2007).
- Heymer, A., et al. Iron oxide labelling of human mesenchymal stem cells in collagen hydrogels for articular cartilage repair. Biomaterials. 29 (10), 1473-1483 (2008).
- Hemmrich, K., Meersch, M., von Heimburg, D., Pallua, N. Applicability of the dyes CFSE, CM-DiI and PKH26 for tracking of human preadipocytes to evaluate adipose tissue engineering. Cells Tissues Organs. 184 (3-4), 117-127 (2006).
- Shim, G., et al. Pharmacokinetics and in vivo fate of intra-articularly transplanted human bone marrow-derived clonal mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 24 (9), 1124-1132 (2015).
- Chen, B. K., et al. A safety study on intrathecal delivery of autologous mesenchymal stromal cells in rabbits directly supporting Phase I human trials. Transfusion. 55 (5), 1013-1020 (2015).
- Chan, M. M., Gray, B. D., Pak, K. Y., Fong, D. Non-invasive in vivo imaging of arthritis in a collagen-induced murine model with phosphatidylserine-binding near-infrared (NIR) dye. Arthritis Res Ther. 17, 50 (2015).
- Texier, I., et al. Cyanine-loaded lipid nanoparticles for improved in vivo fluorescence imaging. J Biomed Opt. 14 (5), 054005 (2009).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Fluorescent carbocyanine dyes allow living neurons of identified origin to be studied in long-term cultures. J Cell Biol. 103 (1), 171-187 (1986).
- Rahmati, M., Mobasheri, A., Mozafari, M. Inflammatory mediators in osteoarthritis: A critical review of the state-of-the-art, current prospects, and future challenges. Bone. 85, 81-90 (2016).
- Detante, O., et al. Intravenous administration of 99mTc-HMPAO-labeled human mesenchymal stem cells after stroke: in vivo imaging and biodistribution. Cell Transplant. 18 (12), 1369-1379 (2009).
- Hu, S. L., et al. In vivo magnetic resonance imaging tracking of SPIO-labeled human umbilical cord mesenchymal stem cells. J Cell Biochem. 113 (3), 1005-1012 (2012).
- Xia, Q., et al. Intra-articular transplantation of atsttrin-transduced mesenchymal stem cells ameliorate osteoarthritis development. Stem Cells Transl Med. 4 (5), 523-531 (2015).
- Jasmin, , et al. Optimized labeling of bone marrow mesenchymal cells with superparamagnetic iron oxide nanoparticles and in vivo visualization by magnetic resonance imaging. J Nanobiotechnology. 9, 4 (2011).
- Lehmann, T. P., et al. Coculture of human nucleus pulposus cells with multipotent mesenchymal stromal cells from human bone marrow reveals formation of tunnelling nanotubes. Mol Med Rep. 9 (2), 574-582 (2014).
- Wang, W., et al. Human adipose-derived mesenchymal progenitor cells engraft into rabbit articular cartilage. Int J Mol Sci. 16 (6), 12076-12091 (2015).
