Summary
Se describe un protocolo para medir la transmigración por monocitos a través de monocapas endoteliales humanas y su posterior maduración en células espumosas. Esto proporciona un método versátil para evaluar las propiedades aterogénicas de monocitos aislados de personas con diferentes enfermedades y evaluar factores en sangre que puede aumentar esta propensión.
Abstract
Arteriopatía coronaria (CAD) es una causa importante de morbilidad y mortalidad en todo el mundo. Ateroesclerosis, una de las principales causa de CAD, es iniciado por la transmigración de monocitos inmunes innatas a sitios inflamatorios de lípidos depositados llamados estrías grasas, que están presentes en las paredes arteriales de mediano a grandes arterias. La característica clave de patógena de lesiones en esta etapa temprana de la aterosclerosis es la maduración de monocitos que emigran a las arterias para formar células espumosas o macrófagos cargados de lípidos. Considerable evidencia apoya la hipótesis de que aumenta el riesgo de la aterosclerosis por condiciones inflamatorias crónicas que acompaña a enfermedades como la artritis reumatoide y VIH, como envejecimiento general, y que este riesgo es predicho por monocitos activación. Mientras que los modelos de ratón proporcionan una buena plataforma para investigar el papel de monocitos en aterogénesis en vivo, requieren la alteración genética del metabolismo del colesterol natural y alteración drástica de la dieta normal del ratón y tienen una limitada aptitud para el estudio de influencias aterogénicos de enfermedades concomitantes humana. Esto nos motivó a desarrollar un modelo humano en vitro para medir el potencial aterogénico de los monocitos aislados de individuos con enfermedades definidas. Actualmente, los modelos humanos en vitro limitan en que evalúan la formación de monocitos transmigración y la espuma de la célula en aislamiento. Aquí se describe un protocolo que monocitos aislados de sangre paciente transmigrada en células endoteliales humanas en una matriz de colágeno tipo 1, y se mide su propensión a madurar en células espumosas en la presencia o ausencia de lípidos exógenos. El protocolo ha sido validado para el uso de monocitos humanos purificados de individuos con infección por VIH y ancianos no infectado de VIH. Este modelo es versátil y permite la formación de monocitos transmigración y espuma de la célula evaluarse usando cualquiera microscopia o citometría de flujo, así como permitiendo la evaluación de los factores aterogénicos presentes en suero o plasma.
Introduction
Transmigración de monocitos es un paso crucial en el desarrollo de placas ateroscleróticas que pueden conducir a la trombosis, derrame cerebral e infarto de miocardio. Placas ateroscleróticas desarrollan de rayas grasas, generalmente presentes en los sitios de baja circulación oscilatoria en medio a grandes arterias, donde deposita lípidos contribuyen a la activación endotelial y localizan de inflamación1. Monocitos son reclutados a las células endoteliales en rayas grasas por proteínas quimiotáctica de monocitos (como CCL2) y transmigrada en la intima2. Después de la transmigración, monocitos pueden formar macrófagos aterogénicos, cargados de lípidos, llamados células de la espuma como consecuencia de la absorción de lípidos, síntesis de lípidos, abajo-regulación del eflujo de colesterol o una combinación de los factores mencionados. Monocitos pueden también acumular lípidos en la circulación y tienen un fenotipo 'espumoso', posiblemente predispone las células de la espuma de la célula formación3,4. Células de la espuma son la característica definitoria de estrías grasas y placas ateroscleróticas de la temprano-etapa y su formación está influida por lípidos y mediadores inflamatorios5. Alternativamente, monocitos tienen la capacidad de revertir transmigrada desde la arteria a la circulación sanguínea6, eliminando lípidos de la intima y actuar para mantener la salud de la arteria.
Determinar la propensión de los monocitos a transmigrada en endotelio arterial y las células de la espuma de la forma en la íntima, o a la inversa transmigrada y llevan lipídico de la placa, es un requisito clave para entender el papel de la activación de monocitos en el aumento de riesgo aterosclerótico. Modelos de ratón de CADs como ateroesclerosis son importantes en la aclaración en tiempo real en vivo información sobre el desarrollo de placa racha graso, aterosclerótica. Sin embargo, estos modelos requieren una alteración genética del colesterol natural proceso habilidades de estos animales generalmente juntados con drásticas alteraciones en la dieta (como el modelo de dieta de ApoE-/-tipo occidental)7,8, de tal modo, inducir la acumulación no fisiológico de lípidos que circulan niveles cuyo desarrollo de placa de la unidad. Estos modelos pueden haber limitado relevancia a crónica humana las condiciones inflamatorias tales como la infección por VIH que no están asociados con mayor circulación colesterol o lipoproteína de baja densidad (LDL) los niveles. Además, las diferencias en la biología de monocitos entre humanos y ratones que las pruebas de inmunológicas preguntas sobre la relevancia de las subpoblaciones de monocitos (como monocitos intermedias (CD14++CD16+))9 difícil. Esto es importante al estudiar los mecanismos de conducción enfermedad cardiovascular como monocitos intermedio cuentas independientemente predicen eventos cardiovasculares10,11. Mientras que pruebas existen para medir secuencialmente o monocito transmigración o espuma de la formación de la célula en aislamiento, ningún ensayo en vitro ha sido validado para la cuantificación de ambos aspectos de la aterogénesis temprana utilizando las mismas células de cohortes clínicas. Transwell modelos utilizan un sistema de dos cámaras Boyden modificado mediante el cual las células se cargan en la cámara superior y transmigrada a través de una barrera de plástico poroso o monocapa de células en una cámara baja que normalmente contiene los medios de comunicación con chemoattractant12 , 13. ampliamente utilizado para el análisis de transmigración de leucocitos, estos modelos no incorporan generalmente una capa de la íntima, dando lugar a células transmigrated migrar en solución y no permiten la medición de la célula de la espuma formación o transmigración inversa de las células del mismo. Por el contrario, los modelos de formación de la espuma de la célula no cuenta cualquier cambio transmigratory inducida en monocitos o los efectos de la activación endotelial que se sabe que contribuyen a la espuma de célula formación14. Además, estos sistemas inducen espuma formación celular de macrófagos adheridos a las placas de cultivo celular mediante la adición de saturar la concentración de lipoproteína de baja densidad OXIDADA exógeno (oxLDL)15,16, un inductor clave de formación de la espuma de la célula. LDL en estos modelos es oxidado a menudo por procesos no fisiológicamente relevantes como CuSO4 tratamiento17, por lo tanto, cuestionar la importancia fisiológica de los estudios usando estos modelos.
Aquí se describe un ensayo que cuantifica transmigración de monocitos y formación de la célula de la espuma de las células del mismo que no requiere la adición de oxLDL exógena, así modelar mejor el papel de monocitos en la formación de espuma de la célula. Este modelo fue desarrollado originalmente por el profesor William Muller (Northwestern University, Chicago)18y ha sido perfeccionado en nuestro laboratorio para evaluar ex vivo del atherogenicity de monocitos aislados bajo no activar condiciones de individuos con las condiciones inflamatorias subyacentes que acompaña a enfermedades como el VIH infección19 , así como envejecimiento de20, están asociados con un mayor riesgo de aterosclerosis. Este modelo también proporciona una plataforma para responder a cuestiones biológicas básicas con respecto a la propensión de subconjuntos diferentes de monocito a forma espuma células20, la influencia de la activación endotelial por citoquinas como el TNF en la formación de la célula de la espuma14 y las características migratorias de los monocitos como la profundidad y velocidad de transmigración en geles19. Además, formación de monocitos transmigración y la espuma de la célula puede ser cuantificada usando microscopia estándar, proyección de imagen de celular en vivo, flujo cytometry y la proyección de imagen de citometría de flujo, por lo tanto, proporciona un método versátil para evaluar la función de monocitos en la aterogénesis.
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Protocol
Nota: todos los experimentos con muestras biológicas humanas fueron realizados con la aprobación ética del Comité de ética humana de Alfred Hospital, Melbourne. Todos los experimentos fueron realizados en gabinetes de bioseguridad de clase II, salvo que se especifique. " Prewarmed " se refiere a los reactivos a 37 ° C en un baño de agua.
1. preparación de tipo I geles de colágeno fibroso: día 1
- preparar polimerizado geles de colágeno secuencialmente agregando y mezclando 35,7 mM NaOH, 0.71 x M199, ácido acético de 4,58 mM y 1,71 mg/mL tipo I colágeno fibroso en un poliestireno de 5 mL tubo según la tabla 1.
Nota: Asegúrese de que el colágeno es bien mezclado transfiriendo suavemente arriba y abajo 5 veces para evitar la formación de colágeno ' bolsillos ' en la mezcla de gel. Preparar geles de 4-6 por la condición de prueba para microscopía o 15 geles por condición de prueba para citometría de flujo. - Una vez bien mezclado, alícuotas de 50 μl de mezcla de gel de colágeno en cada pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 96 pozos fondo plano estéril. No use las filas y las columnas externas, pero llenar con 200 μL de 1 x Dubecco ' fosfato s tampón salino (PBS) para proteger a los geles de desecación. Incube las placas a 37 °C/5% CO 2 h 2 permitir que el colágeno polimerizar.
Nota: Coloque las placas directamente sobre estantes de metal limpia en la incubadora para asegurar la distribución uniforme del calor. - Tras incubación, sobreponer los geles con 150 μL de 1 x M199 suplementado (véase Tabla de materiales) e incubar por 5 días hasta uso.
2. Expansión de almacenamiento HUVEC: día 1
- etiqueta capa de 10 cm de diámetro placa de Petri con 1 mL de 50 μg/mL fibronectina diluido en 1 x PBS e incubar a temperatura ambiente durante 10 min. Alícuotas de
- deshielo de cryopreserved umbilical humana primaria vena las células endoteliales (HUVEC, 1.0 x 10 6 células) en 10 mL M20.
Nota: HUVEC se preparara como descrito previamente 21 y se utiliza en un número de paso bajo (< paso 4). HUVEC puede ser reemplazada por las células endoteliales de la arteria coronaria humana aquí. - Suspender HUVEC en 10 mL M20 y añadir al plato revestido de fibronectina, aspirando fibronectina exceso antes de la adición de las células y la cultura a confluencia (aproximadamente 5 días), sustitución de los medios de comunicación el día 3.
3. Cultivo monocapa de HUVEC en geles de colágeno: día 5
- el día 5, separar HUVEC aspirando cultivo sobrenadante de la caja Petri y lavando los medios que contienen suero con 10 mL de suero M199.
- Añadir 5 mL 0.05% tripsina/0.53 EDTA en M199 a HUVEC e incubar durante 1-2 min a temperatura ambiente, agitando suavemente hasta que suelte las células.
- Una vez separado, rápidamente enjuague la placa de Petri con 5 mL M20 y transferir los medios de comunicación que contiene las células a un tubo de 10 mL.
- Muestras de centrifugar a 300 x g durante 5 min a temperatura ambiente, aspirar el sobrenadante, resuspender las células en 200 μL de M20 y contar las células usando un hemocitómetro.
- Resuspender las células a 2.0 x 10 5 células/mL en M20, Aspire el M199 en los geles de la placa de 96 pocillos (paso 1.3) y añadir 100 μl de HUVEC resuspendido (2.0 x 10 4 células) para cada gel de colágeno preparado anteriormente (paso 1.2). Las placas de la cultura para un 3 días más en 37 °C/5% CO 2.
Nota: Se puede confirmar la integridad de la monocapa HUVEC después de 3 días por nitrato de plata coloración 22 o inmunohistoquímica para ensambladura apretada proteínas 23 en esta etapa. Geles adicionales deben estar preparados para ello.
4. Activación de HUVEC monocapa y aislamiento/activación de monocitos para transmigración: día 8
- el día 8, activar cada monocapa HUVEC antes de la adición de monocitos aspirando la M20 medios superponer los geles y la adición de 100 μl de 10 ng/mL TNFα humano en M20 por gel. Incubar a 37 °C/5% CO 2 para 4 h.
Nota: Condiciones HUVEC desactivado también puede incluidas si es necesario como controles.
Técnicas para seleccionar negativamente para las células según el fabricante del grano de monocitos - durante las 4 h HUVEC activación paso, aislar del PBMCs con magnético ' instrucciones. Debe usarse un mínimo de 6.5 x 10 6 PBMCs en este paso para recuperar confiablemente 3.0 x 10 monocitos 5 requeridas de una condición, como monocitos por lo general representan aproximadamente 10-15% de PBMCs.
Nota: Para evaluar el efecto de la activación de monocitos antes de la formación de monocitos transmigración y la espuma de la célula, monocitos pueden activarse en esta etapa. Monocitos se puede aislados de PBMCs descongeladas si es necesario (es decir, las muestras de pacientes almacenadas). Subconjuntos de monocitos aislados por FACS clasificación pueden estar preparados para además de geles (figura 1).
5. Transmigración de monocitos humanos primarios: día 8
- medir transmigración de monocitos, eliminar los medios de comunicación que contiene el TNFα y lavar el gel dos veces con 100 μl M199 agregando y quitando los medios de comunicación. Después de lavar, añadir 2.0 x 10 5 recién aislado o descongelado y lavado cryopreserved PBMCs o 5.0 x 10 monocitos 4 recién aislado o purificado subconjuntos de monocitos a las monocapas de HUVEC en 100 μl M20. Incubar durante 1 h a 37 ° C y 5% CO 2 para permitir que la transmigración hacia adelante de los monocitos en el gel. Es mejor permitir que 6 pozos para cada condición experimental examinado.
Nota: Para evaluar el efecto del suero autólogo en formación de la célula de la transmigración y la espuma, incubar las células con M20 con la concentración de suero de donantes inactivado con calor y comparar condiciones con un control de suero humano. Leucocitos que no sean de monocitos pueden añadirse en este momento. Si investigar el impacto de las especies específicas de lípidos/lípidos (p. ej., HDL, oxHDL), realice los siguientes pasos con medios libres de suero que contienen lípidos de 20-50 μg/mL. - Después de 1 h de transmigración hacia adelante, recoger las células no transmigrated lavando dos veces con 100 μl de precalentado 1 mM EGTA en PBS 1 x y una vez con 100 μl de geles M199 (mismo centrifugar las condiciones), agrupación de los sobrenadantes de cada pozo de la misma condición experimental (generalmente de 6 pozos) en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL en hielo. Centrifugar las células no transmigrated a 4 ° C, 300 x g durante 5 min y resuspender en 30 μL 1 x PBS.
- Contar las células recogidas en el sobrenadante para determinar el número de células transmigrated adelantados.
- El porcentaje de células transmigrated hacia adelantados se determina como sigue:
- cubrir el lavado geles que contienen células transmigrated con 100 μl M20 e incubar una mayor 48 h.
- Después de 48 h, recoger el sobrenadante y las células no transmigrated lavado dos veces con 100 μl precalentado 1 mM EGTA/PBS, recolección y agrupación el sobrenadante de cada Estado como en el paso 5.2.
Nota: El fenotipo de células transmigrated inversas puede ser probado en estas células fCitometría de flujo estándar de uego protocolos de tinción. - Centrifugar las células a 4 ° C, 300 x g durante 5 minutos y resuspender las células en 30 μL 1 x PBS. Contar las células y determinar la viabilidad mediante tinción trypan azul.
- Determinar el porcentaje de células transmigrated inversas utilizando la siguiente ecuación:
Nota: contabilidad para el número total de células transmigrated adelantados da una indicación más precisa de transmigración inversa ya que es poco probable transmigración hacia adelante será 100%. - Para el análisis por microscopia, fijar los geles añadiendo 100 μl 2% formaldehído (concentración final) a cada pocillo, cubrir las placas de aluminio de la hoja y almacenar a 4 ° C hasta su análisis. Para citometría de flujo, no fijar las células en esta fase. Ver los protocolos por debajo para microscopía (sección 6) o análisis de flujo cytometry (sección 7).
PRECAUCIÓN: El formaldehído es tóxico y corrosivo; Utilice equipo de protección personal (EPP). Debe tenerse cuidado al agregar formaldehído, sin embargo, este paso no necesita llevarse a cabo en una campana de humos debido a la baja concentración de usa.
6. Cuantificación de células espumosas y macrófagos por microscopia (Oil Red O Stain)
- eliminar el formaldehído y lavar el gel con 100 μl de metanol 50% (v/v) durante 5 minutos y luego 100 μl 78% (v/v) de metanol durante 15 minutos
Nota: Los pasos de tinción se pueden realizar en el Banco de laboratorio y no en un gabinete clase II Biohazard. - Manchas de gotitas del lípido por agregar 100 μl de recién preparadas 0,2% (w/v) O aceite rojo (para detalles, véase Tabla de materiales) por 1 h a temperatura ambiente.
- Quitar exceso mancha lavando los geles 4 veces con 100 μl de metanol de 78% (v/v), aspirando y descartar el sobrenadante después de cada Washington
- Contratinción por 15 min a temperatura ambiente con 100 μl de Giemsa, diluido 1:10 en agua destilada.
- La tinción de Giemsa de aspirar y lavar los geles una vez con agua.
- Para separar el gel de la placa, borde de los pozos mediante una aguja de 21 G, con el bisel hacia el exterior, alrededor del borde del gel.
- Para montar los geles en un portaobjetos de microscopio, perfore dos agujeros (diámetro de 6,35 mm) en una tira de 2,54 cm x 1.5 cm de cinta de doble cara. Fijar la cinta hacia un microscopio estándar y retire la capa protectora de la parte superior.
- Agregar una gota de agua a los agujeros en la cinta utilizando una pipeta de transferencia. Suavemente con unas pinzas, transferencia de geles a los orificios de la cinta y cubrir con un cubreobjetos de vidrio 1.5 tamaño. Pulse suavemente el cubreobjetos para adherir a la cinta.
- Examinar con microscopía de campo brillante de contraste de interferencia diferencial usando un microscopio invertido objetivo 40 X.
- a la monocapa HUVEC en foco a 40 X de aumento y desplazamiento ' en ' el gel, contando las células macrófagos/espuma a lo largo de toda la profundidad del gel. Repita para tres distintos campos de visión a distancias similares desde el borde del gel para minimizar los posibles efectos de borde. Esto asegurará gel profundidad es constante entre el conteo de las regiones.
Nota: Marcar las células en el gel como células de la espuma (definido como las células que contienen > 1/3 de su citoplasma como aceite rojo O manchado de gotas de lípidos) o macrófagos dentro de 2 h de montaje en portaobjetos ( figura 2). Formación de espuma de la célula se expresa como el porcentaje de células de la espuma en relación con el número total de células migradas y se expresa como la cuenta mediana en 3 campos de vista habían examinado para 6 geles por condición, por lo tanto una mediana de 18 mediciones por condición. Un ejemplo de un recuento crudo de un experimento típico se muestra en la tabla 2.
Nota: Clasificar una célula como macrófago vs espuma celular por microscopia es subjetiva y por lo tanto puede ser dependiente del investigador. En estudios clínicos, donde los experimentos se llevan a cabo durante un período prolongado de tiempo, es importante para contar todo a realizar cegados por un solo investigador. Ejemplos de células espumosas y macrófagos en los geles se encuentran en la figura 2.
- a la monocapa HUVEC en foco a 40 X de aumento y desplazamiento ' en ' el gel, contando las células macrófagos/espuma a lo largo de toda la profundidad del gel. Repita para tres distintos campos de visión a distancias similares desde el borde del gel para minimizar los posibles efectos de borde. Esto asegurará gel profundidad es constante entre el conteo de las regiones.
7. Análisis de Transmigrated células por citometría de flujo
- fenotípicamente caracterizar células espumosas y macrófagos tras la migración transendothelial, digerir los geles añadiendo 100 μl de 37 º C precalentado 1 mg/mL colagenasa diluida en M199 a D cada bien e incubar por 20 min a 37 °C/5% CO 2.
Nota: Coloque las placas de 96 pocillos directamente en los estantes de metal limpia en la incubadora para asegurar la distribución uniforme del calor. - Tras incubación, macerar los geles utilizando una pipeta de 200 μL e incubar una más 20 min a 37 °C/5% CO 2.
- Una vez completamente digerido, filtro y piscina los geles replicados digeridos a través de 35 μm nylon malla tapado tubos de FACS a hielo y lavado una vez con FACS colada (véase tabla de materiales) a 4 ° C, 300 x g. resuspender las células en 100 μl de FACS Washington
- Incubar las células resultantes con anticuerpos conjugados fluoróforo específicos para CD45, un marcador de células muertas o en vivo y marcadores fenotípicos o funcionales superficie/intracelulares de interés utilizando protocolos de citometría de flujo estándar.
Nota: Preparar control de tubos de compensación utilizando el apropiado fluoróforos y cuentas de compensación de Ig. También se pueden recoger células extraídas en portaobjetos para microscopía de inmunofluorescencia por cytospinning. Por otra parte, hemos recogido con éxito células usando este protocolo para la evaluación por citometría de imagen. - Adquirir las células usando un citómetro de flujo y realizar la compensación según sea necesario.
Nota: Como las células de la espuma/macrófagos no puede formar poblaciones individuales utilizando propiedades de dispersión de la luz y puede variar considerablemente en tamaño y forma, ajuste liberal forward scatter (FSC) y lado scatter (SSC) puertas para capturar todas las células migradas como se muestra en < fuerte clase = "xfig" > Figura 3A. - Adquisición, realizar el análisis de datos utilizando el software de la citometría de flujo. Para identificar las células migradas, en primer lugar seleccionar las celdas como negativo el marcador en vivo/muerto como se muestra en la figura 3B. A continuación, realizar una sola celda la discriminación mediante la creación de una puerta firmemente alrededor de las células en una parcela de vs altura de SSC SSC-zona.
- Seleccione CD45 + de las células y la población mayor de células migradas presentes en una parcela FSC/SSC la puerta ya que son las células macrófagos espuma.
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Representative Results
Cuantificación de la transmigración de monocitos
Monocitos se agregan al modelo como se describe en la figura 1, y seis geles están dispuestos para cada condición. Monocitos de 6 geles por donante (es decir, 5.0 x 104 monocitos por geles gel 6 = 3.0 x 105 monocitos por donante) se resuspendió en un volumen final de 600 μl de medio M199 que contiene los lípidos requiere suero/aislado. Las células (es decir, 100 μl gel = 5.0 x 104 monocitos) son entonces alícuotas en geles y se incubó como arriba durante 1 hora facilitar la transmigración del monocito. Después de la transmigración, no transmigrated células se cuentan como arriba. En este ejemplo, 1.5 x 104 células de transmigrated no fueron recuperados. Se determinó el porcentaje de transmigración hacia adelante utilizando las fórmulas descritas en el paso 5.4:
Tras 48 h de incubación, 3.6 x 104 células de transmigrated inversa se recuperaron como arriba. Se determinó el porcentaje de transmigración inversa utilizando la fórmula en el paso 5.8:
Puede compararse con la transmigración hacia adelante y hacia atrás entre las condiciones con las pruebas estadísticas adecuadas y monocitos preparados de múltiples donantes independientes para determinar si se altera la capacidad de monocitos transmigración entre experimental condiciones.
Evaluar la formación de espuma de la célula
Microscopía de campo luminoso
Las lipoproteínas oxidadas son conocidas por promover la espuma derivados de monocitos células formación en vitro en comparación con inoxidable lípidos15. Aquí confirmamos que el tratamiento de los monocitos con oxLDL, que comúnmente se utiliza para inducir la formación de la célula de la espuma en modelos de inducción de células de espuma convencional, mejora la formación de la célula derivados de monocitos de la espuma en este modelo de formación de la célula de espuma y migración transendothelial en comparación con la LDL nativa. Tras la formación de monocitos transmigración y la espuma de la célula en geles incubaron con M199 que contienen 50 μg/mL nativo o CuSO4-LDL oxidada (vea el paso 5.1, figura 1), las células se analizaron por microscopia. Ejemplos de células espumosas y macrófagos observados en experimentos representativos se muestran en la figura 2. Las células fueron contadas en tres diferentes campos por gel, centrándose en la monocapa HUVEC y progresivamente centrándose más profundamente en el gel. El recuento se registra para cada donante, como se muestra en la tabla 2 para un donante individual, para comparar el porcentaje de células de la espuma formada en respuesta a oxidado y LDL nativa. Agregar datos de n = 12 cuentas independientes se muestran en la figura 4 para confirmar que la incubación de los monocitos con oxLDL en este modelo induce más formación de la célula de la espuma que las condiciones donde se incuban los monocitos nativo medio LDL o M199 solo.
Citometría de flujo
Para determinar el fenotipo de las células migradas, las células son extraídas de geles digeridos y etiquetadas usando un panel de citometría de flujo estándar. Las células fueron etiquetadas con un marcador en vivo/muerto de la célula y los anticuerpos específicas para CD45 y otros marcadores de fenotipo superficial utilizando protocolos de citometría de flujo estándar. Controles de compensación deben estar preparados también para la plena indemnización aplicando las técnicas de citometría de flujo estándar. Las células migradas son cerradas como se muestra en la figura 3 en parcelas representativas de 10 experimentos independientes. Células vivas son bloqueadas mediante estudios de viabilidad de células en vivo/muerto (figura 3B) y excluyen a los dobletes por análisis de la célula (figura 3). Las células son entonces cerradas como CD45+ para excluir HUVEC (ya que estas células son CD45-, figura 3D). La población mayor es entonces cerrada por la discriminación de dispersión dispersión hacia delante o lateral (figura 3E) y la intensidad de fluorescencia media (IFM) de los receptores de interés se determina en comparación con cualquier fluorescencia menos uno (FMO) o control de isotipo) Figura 3F) determinar la expresión (ΔMFI) o el porcentaje de células positivas.
Figura 1 : Un en vitro modelo de la formación de monocitos transmigración y espuma celular. (A) PBMC, (B) total monocitos o (C) los subconjuntos ordenados FACS monocito se agregan al tipo I colágeno fibroso geles formados en placas de 96 pocillos y superpuestas con una monocapa de umbilical humano primario activado las células endoteliales (HUVEC), cuya integridad puede ser evaluada por ()Dde tinción de plata de la vena) y (E) transmigrada por 1 h en presencia de suero o lípidos que contienen los medios de comunicación. Se cuentan las células transmigrated no (F) y geles se incuban durante un más 48 h con el mismo suero/lípidos que contienen los medios de comunicación. Después de la incubación (G) inversa las células migradas se cuentan y se determinó el porcentaje de células espumosas y macrófagos en el gel por microscopía de contraste de fase (H) después de coloración Oil Red o o fenotipo de las células migradas es determinado por () la citometría de flujo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Ejemplos de células espumosas y macrófagos en un en vitro modelo de la formación de monocitos transmigración y espuma celular. Comitéejemplos de Ive de células analizadas como espuma de células (flechas blancas) y macrófagos (flechas negras) después de Giemsa tinción para visualizar las células y tinción de Oil-Red O visualizar gotas lipídicas según lo determinado por microscopía de contraste de fase de geles extraídos utilizando un invertido microscopio con 40 aumentos. Barra de escala = 20 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Compuerta estrategia de transmigrated células por citometría de flujo. Transmigrated células fenotípicamente se caracterizan por citometría de flujo después de la extracción de células de gel. Las células son bloqueadas por FSC/SSC de (A), (B) células vivas, células (C), CD45 (D)+, FSC/SSC (E) y (F) la expresión del receptor frente a isotipo o fluorescencia menos uno control (FMO). Expresión de receptores de interés se define como intensidad de fluorescencia media (IFM) y expresado con respecto a los niveles de isotipo. ΔMFI = mancha (MFI) menos control de isotipo/FMO (MFI). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Efecto de oxLDL exógeno agregado y LDL sobre espuma derivados de monocitos células formación. Formación de la espuma de la célula se determina bajo condiciones donde monocitos de un solo donante se incuban con medios de comunicación (M199) o 50 μg/mL inoxidable lipoproteína de baja densidad (LDL) o sulfato de cobre (II) oxidado LDL (oxLDL) añadido a la transmigración de los geles. Cuentas de 12 sitios distintos se muestran. Células de la espuma se expresan como el porcentaje de células migradas total. Rangos intercuartil y mediana aparecen en gráficos de barras y se realizaron comparaciones utilizando pruebas no paramétricas U de Mann-Whitney. p < 0.001, *** p < 0.0001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Reactivo de | [Stock] | [Final] | Volumen de 60 geles (μL) |
| NaOH | 100 mM | 35,7 mM | 1071 |
| M199 | 10 x | x 0.71 | 213 |
| AcCOOH | 20 mM | 4,58 mM | 687 |
| Colágeno | 5 mg/mL | 1,71 mg/mL | 1029 |
| Volumen total | - | - | 3000 |
Tabla 1: Tipo I preparación del gel de colágeno fibroso
| LDL | oxLDL | |||||||
| Gel | Conde | Espuma de células1 | Las células migradas1 | Espuma de células (%)2 | Espuma de células1 | Las células migradas1 | Espuma de células (%)2 | |
| 1 | 1 | 5 | 44 | 11.4 | 26 | 55 | 47.3 | |
| 2 | 5 | 27 | 18.5 | 10 | 23 | 43.5 | ||
| 3 | 11 | 52 | 21.2 | 19 | 39 | 48.7 | ||
| 2 | 1 | 5 | 34 | 14.7 | 9 | 31 | 29 | |
| 2 | 14 | 50 | 28 | 32 | 55 | 58.2 | ||
| 3 | 5 | 37 | 13.5 | 19 | 37 | 51.4 | ||
| 3 | 1 | 10 | 37 | 27 | 28 | 52 | 53.8 | |
| 2 | 7 | 33 | 21.2 | 11 | 31 | 35.5 | ||
| 3 | 7 | 38 | 18.4 | 28 | 53 | 52,8 | ||
| 4 | 1 | 9 | 44 | 20.5 | 14 | 33 | 42.4 | |
| 2 | 7 | 33 | 21.2 | 22 | 47 | 46.8 | ||
| 3 | 11 | 50 | 22 | 11 | 30 | 36.7 | ||
| Células de la espuma mediana (%) | 20.8 | 47 | ||||||
| Células de la espuma promedio (%) | 19.8 | 45,5 | ||||||
Tabla 2: crudo recuento de comparación de las células de la espuma derivados de monocitos siguen tratamientos de oxLDL LDL vs. 1 Recuento por campo de visión en gel. 2 Porcentaje de células de la espuma = espuma x 100 migrado cuentas total del recuento de células. * Los datos son representativos de un experimento usando monocitos de un solo donante
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Discussion
El protocolo aquí descrito ofrece un método versátil y fisiológicamente relevante para evaluar la atherogenicity de monocitos de cohortes clínicos humanos, combinando transmigración de monocitos y formación de espuma de la célula. Este modelo ofrece ventajas sobre otros métodos de formación de la espuma de la célula ya que toma en cuenta el efecto de la transmigración de monocitos en la formación de espuma de la célula y permite la medición de transmigración inversa6 además de los inherentes propensión de los monocitos a madurar en células espumosas en la presencia o ausencia de factores exógenos. Además, el papel de la activación endotelial también se tiene en cuenta, como hemos demostrado eso oxidación de activación endotelial estimula de especies lípido asociado con espuma celular formación14. Finalmente, el fenotipo de monocitos que se someten a la salida (una propiedad asociada con la regresión de la placa) puede ser cuantificado y caracterizado por citometría de flujo y microscopía.
Debido a la naturaleza tridimensional de la transmigración en geles, identificar y anotar las células transmigrated macrófagos como células de la espuma pueden ser difíciles como células transmigrada a diferentes niveles en el gel19. Para ayudar a la identificación de células de la espuma, siempre debe utilizarse colorante Oil Red O fresco. También es de nota que los Estados de enfermedad diferentes ex vivo o en vitro condiciones pueden alterar transmigración de monocitos en el gel. Hemos utilizado imágenes de células vivas para identificar que los monocitos de las personas infectadas por el VIH tienden a transmigrada puntos menor en geles y a velocidades diferentes a los de individuos no infectados19. Además, formación de espuma de la célula se asocia con menos movilidad de monocitos en el gel por lo que las células tienden a moverse en círculos en una sección particular de z en comparación con las células de individuos no infectados VIH que tienden a migrar en una línea relativamente recta hacia el parte inferior del gel. Estos resultados plantean la posibilidad de un fenómeno similar que ocurre en experimentos con muestras de pacientes humanas procedentes de otros Estados de enfermedad asociadas con atherogenicity aumento monocitos.
Al realizar análisis de basados en citometría de flujo es común observar una proporción significativa de células muertas en la población celular recuperado al evaluar viabilidad utilizando marcadores del live/dead cell (Figura 4B). Estas células son predominantemente CD45– HUVEC que se dañan durante el paso de digestión/maceración de colágeno necesaria para extraer las células derivadas de monocitos de la matriz del colágeno. Este proceso es particularmente duro en la monocapa HUVEC, pero no es perjudicial para el fenotipado las células transmigrated.
Este modelo difiere de otros en que no artificialmente oxidado lípidos exógenos es necesaria en los medios de cultivo para formación de la célula de unidad espuma derivados de monocitos. En cambio, formación de la célula de la espuma en este ensayo está influenciada por el suero presente en los medios de cultivo, permitiendo que los discretos efectos de factores solubles de las muestras clínicas a evaluar. Como tal, hemos demostrado que la incubación de los monocitos del control con el suero de los jóvenes infectados por el VIH19 o ancianos los individuos no infectados VIH20 promueve formación de espuma de la célula, lo que indica que factores solubles independientemente pueden promover la espuma formación de la célula. Como el ensayo está influenciado por componentes solubles, un solo lote de suero humano combinado debe usarse para experimentos destinados a determinar la diferencia inherente de propiedades aterogénicos de monocitos derivados de diferentes individuos con el fin de estandarizar condiciones de control. Este ensayo también puede ser usado para evaluar el papel de las especies de lípidos específicos de muestras clínicas (figura 3). Por ejemplo, hemos encontrado incubación de monocitos con los medios que contienen lípidos aislados de especies tales como lipoproteínas de alta densidad de individuos con lípidos conocida disfunción24 también promueve la formación de espuma de la célula. En este caso, los monocitos de un individuo sano o grupo de individuos pueden utilizarse en presencia de suero o suero factores derivados de los temas de prueba. Por lo tanto, este modelo permite preguntas específicas sobre los efectos discretos de componentes solubles y celulares en la formación de espuma de la célula.
Este ensayo utiliza HUVEC como modelo del endotelio de la arteria coronaria debido a la dificultad práctica de obtener grandes cantidades de células de la arteria coronaria principal número de paso bajo. Sin embargo, hemos comparado los resultados de ensayos con las células endoteliales de la arteria coronaria humana o HUVEC y observa poca diferencia en el monocito transmigración o espuma de la formación de la célula (datos no mostrados), lo que indica que el uso de HUVECs en este sistema es una sustituto aceptable. Conteo manual de células de la espuma es un factor limitante en este modelo pueden introducir sesgos de operador. Por lo tanto, todas las muestras montadas en las diapositivas deben ser ciego al operador para eliminar el potencial de sesgo. Hemos, sin embargo, en comparación con la formación de células de espuma medida por conteo manual y por citometría de imagen y encuentran que estos métodos dan resultados similares19. Una limitación clave de este modelo es que transmigración y adherencia de monocitos se producen en ausencia de fuerzas de cizallamiento asociada fisiológico sangre flujo en vivo. Presumimos que flujo del esquileo se afectan predominante a transmigración de monocitos y formación de espuma no posterior de la célula dentro de la matriz; sin embargo, esto debe considerarse al interpretar los resultados de este ensayo. Este ensayo también no modelo de la influencia de las células musculares lisas en la formación de células de espuma derivados de monocitos que es una limitación fisiológica del sistema; sin embargo, esto es consistente en todas las condiciones que permiten el potencial aterogénico discreto de monocitos para compararse entre Estados diferentes de la enfermedad.
En Resumen, este modelo proporciona un método versátil y fisiológicamente relevante para la cuantificación de transmigración de monocitos y formación de la célula de la espuma de muestras humanas en Estados de enfermedad diferentes ex vivo. Este modelo tiene más aplicaciones para la evaluación de la propensión de los monocitos para formar células espumosas en condiciones donde atherogenicity monocitos se asocia con mayor riesgo de CAD como obesidad25,26 de la diabetes y renal crónica enfermedad27. Por lo tanto, este modelo también puede ser optimizado para su uso en Estados de enfermedad que no sea de ateroesclerosis donde transmigración celular puede influir en la patogénesis de la enfermedad.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores reconocen con gratitud el trabajo del Prof. William Muller y el Dr. Clare Westhorpe por su papel clave en el desarrollo de iteraciones anteriores de este modelo. Los autores también desean agradecer el núcleo de AMREP citometría de flujo para la clasificación de monocito a subconjuntos y el Alfred Hospital infeccioso enfermedad clínica enfermeras para el reclutamiento de individuos VIH + para algunos estudios de investigación. Los autores reconocen con gratitud la contribución a este trabajo la Victoria operacional infraestructura del programa de apoyo recibido por el Instituto de Burnet. TAA es apoyado por Beca Postdoctoral un RMIT Universidad del rector. Este trabajo fue apoyado por la subvención del proyecto NHMRC 1108792 otorgado a AJ y AH. TK es apoyado por subvenciones de NIH NIH K08AI08272, subvención del NIH/NCATS # UL1TR000124.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gel preparation reagents | |||
| NaOH | Sigma-Aldrich | 221465-500G | 0.1 M NaOH diluted in H20 |
| 10x M199 | Sigma-Aldrich | M0650 | |
| AcCOOH | Sigma-Aldrich | 695092-100ML | 20 mM Acetic acid diluted in H20 |
| Cultrex Bovine Collagen I | R&D Systems | 3442-050-01 | Type I Fibrous Collagen |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture | |||
| M199 | Life Technologies | 11150-059 | M199 media containing Earle's salts, L-glutamine and 2.2 g/L Sodium Bicarbonate. Media supplemented with 100 µg/mL L-glutamine and 100 U/mL penicillin/streptomycin |
| M20 | Supplemented M199 containing 20% heat-inactivated pooled or donor serum. Individual lipid species such as LDL can be added to M199. |
||
| HUVEC | Primary human umbilical cord endothelial cells (HUVEC) can be isolated from umbilical cords donated with informed consent and ethics approval. Isolated HUVEC may also be purchased commercially. | ||
| Human coronary artery endothelial cells | Primary human coronary artery endothelial cells can be isolated from arteries donated with informed consent and ethics approval. Isolated cells may also be purchased commercially. | ||
| EDTA | BDH Merck | 10093.5V | Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) - 0.5 M, pH 8.0 |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889-500G | Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) - 1 mM, pH 8.0 |
| 0.05% trypsin EDTA | Gibco | 25300-054 | 0.05% trypsin/0.53 EDTA (1X) |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | L-glutamine (200 mM) |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | Penicillin/streptomycin (10,000 units/mL Penicillin and 10,000 µg/mL Streptomycin) |
| New born calf serum | Gibco | 16010-142 | New born calf serum: New Zealand origin |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1056-1MG | Fibronectin - 50 µg/mL aliquots prepared and stored |
| PBS (1x) | Gibco | 14200-075 | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (10x): Dilute to 1x with sterile H20 |
| 0.1% TNF | Gibco | PHC3015 | Recombinant human TNF - Reconstituted in H20 and stored in 10 µg/mL aliquots |
| Low-density lipoprotein | Merck Millipore | LP2-2MG | Low-density lipoprotein (LDL) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopy | |||
| 1 or 2% formaldehyde | Polysciences | 4018 | 1 or 2% formaldehyde diluted with sterile H20 |
| 50% and 78% methanol | Ajax Finechem | 318-2.5L GL | 50% or 78% v/v methanol, diluted with H20 |
| Oil Red O stain | Sigma-Aldrich | O0625-25G | Dilute to 2 mg/mL in 22% 1M NaOH and 78% (v/v) methanol |
| Microscope slides | Mikro-Glass | S41104AMK | Twin frosted 45 degree ground edge microscope slides (25 X 76 mm) |
| Cover slips | Menzel-Gläser | MENCS224015GP | 22 x 40 mm #1.5 size glass cover slips |
| Double-sided tape | 3M Scotch | 4011 | Super strength exterior mounting tape (25.4 mm x 1.51 m) |
| Giemsa stain | Merck Millipore | 1.09204.0500 | Giemsa's azur eosin methylene blue solution (dilute stock 1:10 in H20) |
| Hole punch | Hand-held single hole punch (6.35 mm punch) | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flow cytometry | |||
| Collagenase D | Roche Diagnostics | 11088858001 | Collagenase D diluted in M199 media to 1 mg/mL |
| 35 µm nylon mesh capped polystyrene FACS tubes | BD Biosciences | 352235 | 35 µm nylon mesh capped polystyrene FACS tubes |
| Live/Dead Fixable Yellow Dead Cell stain | Life Technologies | L34959 | Live/Dead Fixable Yellow Dead Cell stain |
| FACS wash | Prepare by mixing 1 X PBS-, 2 mM EDTA and 1% New born calf serum | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasticware | |||
| 96 well plate | Nunclon | 167008 | Delta surface flat-bottomed 96 well plate |
| 10 cm Petri Dish | TPP | 93100 | Sterile 10 cm Petri dish |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | Eppendorf | 0030 125.150 | Eppendorf tubes |
| Transfer pipette | Samco Scientific | 222-20S | Sterile transfer pipette (1 mL, large bulb) |
References
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