Cuantificación de transmigración de monocitos y formación de la célula de la espuma de individuos con enfermedades inflamatorias crónicas

Resumen

Se describe un protocolo para medir la transmigración por monocitos a través de monocapas endoteliales humanas y su posterior maduración en células espumosas. Esto proporciona un método versátil para evaluar las propiedades aterogénicas de monocitos aislados de personas con diferentes enfermedades y evaluar factores en sangre que puede aumentar esta propensión.

Resumen

Arteriopatía coronaria (CAD) es una causa importante de morbilidad y mortalidad en todo el mundo. Ateroesclerosis, una de las principales causa de CAD, es iniciado por la transmigración de monocitos inmunes innatas a sitios inflamatorios de lípidos depositados llamados estrías grasas, que están presentes en las paredes arteriales de mediano a grandes arterias. La característica clave de patógena de lesiones en esta etapa temprana de la aterosclerosis es la maduración de monocitos que emigran a las arterias para formar células espumosas o macrófagos cargados de lípidos. Considerable evidencia apoya la hipótesis de que aumenta el riesgo de la aterosclerosis por condiciones inflamatorias crónicas que acompaña a enfermedades como la artritis reumatoide y VIH, como envejecimiento general, y que este riesgo es predicho por monocitos activación. Mientras que los modelos de ratón proporcionan una buena plataforma para investigar el papel de monocitos en aterogénesis en vivo, requieren la alteración genética del metabolismo del colesterol natural y alteración drástica de la dieta normal del ratón y tienen una limitada aptitud para el estudio de influencias aterogénicos de enfermedades concomitantes humana. Esto nos motivó a desarrollar un modelo humano en vitro para medir el potencial aterogénico de los monocitos aislados de individuos con enfermedades definidas. Actualmente, los modelos humanos en vitro limitan en que evalúan la formación de monocitos transmigración y la espuma de la célula en aislamiento. Aquí se describe un protocolo que monocitos aislados de sangre paciente transmigrada en células endoteliales humanas en una matriz de colágeno tipo 1, y se mide su propensión a madurar en células espumosas en la presencia o ausencia de lípidos exógenos. El protocolo ha sido validado para el uso de monocitos humanos purificados de individuos con infección por VIH y ancianos no infectado de VIH. Este modelo es versátil y permite la formación de monocitos transmigración y espuma de la célula evaluarse usando cualquiera microscopia o citometría de flujo, así como permitiendo la evaluación de los factores aterogénicos presentes en suero o plasma.

Introducción

Transmigración de monocitos es un paso crucial en el desarrollo de placas ateroscleróticas que pueden conducir a la trombosis, derrame cerebral e infarto de miocardio. Placas ateroscleróticas desarrollan de rayas grasas, generalmente presentes en los sitios de baja circulación oscilatoria en medio a grandes arterias, donde deposita lípidos contribuyen a la activación endotelial y localizan de inflamación¹. Monocitos son reclutados a las células endoteliales en rayas grasas por proteínas quimiotáctica de monocitos (como CCL2) y transmigrada en la intima². Después de la transmigración, monocitos pueden formar macrófagos at....

Protocolo

Nota: todos los experimentos con muestras biológicas humanas fueron realizados con la aprobación ética del Comité de ética humana de Alfred Hospital, Melbourne. Todos los experimentos fueron realizados en gabinetes de bioseguridad de clase II, salvo que se especifique. " Prewarmed " se refiere a los reactivos a 37 ° C en un baño de agua.

1. preparación de tipo I geles de colágeno fibroso: día 1

1. preparar polimerizado geles de colágeno secuencialmente agregando y mezclando 35,7 mM NaOH, 0.71 x M199, ácido acético de 4,58 mM y 1,71 mg/mL tipo I colágeno fibroso en un poliestireno de 5 mL tubo según la tabla 1.
   ....

Resultados

Cuantificación de la transmigración de monocitos

Monocitos se agregan al modelo como se describe en la figura 1, y seis geles están dispuestos para cada condición. Monocitos de 6 geles por donante (es decir, 5.0 x 10⁴ monocitos por geles gel 6 = 3.0 x 10⁵ monocitos por donante) se resuspendió en un volumen final de 600 μl de medio M199 que contiene los.......

Discusión

El protocolo aquí descrito ofrece un método versátil y fisiológicamente relevante para evaluar la atherogenicity de monocitos de cohortes clínicos humanos, combinando transmigración de monocitos y formación de espuma de la célula. Este modelo ofrece ventajas sobre otros métodos de formación de la espuma de la célula ya que toma en cuenta el efecto de la transmigración de monocitos en la formación de espuma de la célula y permite la medición de transmigración inversa⁶ además de los inherentes prope.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
preparación en gel
NaOH	Sigma-Aldrich	221465-500G	0,1 M NaOH diluido en H20
10x M199	Sigma-Aldrich	M0650
AcCOOH	Sigma-Aldrich	695092-100ML	20 mM Ácido acético diluido en H20
Colágeno bovino Cultrex I	R& D Systems	3442-050-01	Colágeno fibroso tipo I
Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Cultivo celular
M199	Life Technologies	11150-059	Medios M199 que contienen sales de Earle, L-glutamina y 2,2 g/L de bicarbonato de sodio. medios suplementados con 100 µ g/mL de L-glutamina  y 100 U/mL de penicilina/estreptomicina
M20			Suplementado M199 que contiene un 20% de suero combinado o donante inactivado por calor. Se pueden agregar especies lipídicas individuales como LDL a M199.
Las			células endoteliales primarias del cordón umbilical humano (HUVEC) pueden aislarse de cordones umbilicales donados con el consentimiento informado y la aprobación ética. El HUVEC aislado también se puede comprar comercialmente.
		endoteliales de las arterias coronarias humanas	Las células endoteliales primarias de las arterias coronarias humanas pueden aislarse de las arterias donadas con el consentimiento informado y la aprobación ética. Las células aisladas también se pueden comprar comercialmente.
EDTA	BDH Merck	10093.5V	Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) - 0,5 M, pH 8,0
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889-500G	Etilenglicol-bis(β-aminoetílico éter)-N,N,N',N'-ácido tetraacético (EGTA) - 1 mM, pH 8,0
0,05% tripsina EDTA	Gibco	25300-054	0,05% tripsina/0,53 EDTA (1X)
L-glutamina	Gibco	25030-081	L-glutamina (200 mM)
Penicilina/estreptomicina	Gibco	15140-122	Penicilina/estreptomicina (10.000 unidades/mL de penicilina y 10.000 µ g/mL Estreptomicina)
Suero para terneros recién nacidos	Gibco	16010-142	Suero para terneros recién nacidos: Fibronectina de origen neozelandés
	Sigma-Aldrich	F1056-1MG	Fibronectina - 50 µ g/mL alícuotas preparadas y almacenadas
PBS (1x)	Gibco	14200-075	Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (10x): Diluir a 1x con H20 estéril
TNF al 0,1%	Gibco	PHC3015	TNF humano recombinante - Reconstituido en H20 y almacenado en 10 µ g/mL alícuotas
Lipoproteína de baja densidad	Merck Millipore	LP2-2MG	Lipoproteína de baja densidad (LDL)
Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
>Microscopía
1 o formaldehído	al 2%Polysciences	4018	1 o 2% de formaldehído diluido con H20 estéril
metanol al 50% y al 78%	Ajax Finechem	318-2.5L GL	50% o 78% v/v metanol, diluido con H20
Aceite Red O tinción	Sigma-Aldrich	O0625-25G	Diluir a 2 mg/mL en 22% 1M NaOH y 78% (v/v)
Portaobjetos de microscopio	Mikro-Glass	S41104AMK	Portaobjetos de microscopio gemelos esmerilados de 45 grados (25 X 76 mm)
Cubreobjetos	Menzel-Glä Ser	MENCS224015GP	22 x 40 mm Cubreobjetos de vidrio de tamaño #1.5
Cinta adhesiva de doble cara	3M Scotch	4011	Cinta de montaje exterior de alta resistencia (25,4 mm x 1,51 m)
Tinte Giemsa	Merck Millipore	1.09204.0500	Solución de azul de metileno con eosina azul de Giemsa (material diluido 1:10 en H20)
Perforadora			Perforadora manual de un solo orificio (punzón de 6,35 mm)
Name	Company	Número de catálogo	Comments
Citometría de flujo
Colagenasa D	Roche Diagnostics		11088858001 colagenasa D diluida en medios M199 a 1 mg/mL
35 y micro; m malla de nylon poliestireno recubierta tubos FACS	BD Biosciences	352235	35 µ m malla de nylon poliestireno recubierto de poliestireno Tubos FACS Vivo/
Muerto Mancha de células muertas amarillas reparables	Life Technologies	L34959	Vivo/Muerto Mancha de células muertas amarillas fijables
FACS lavado			FACS Prepare mezclando 1 X PBS-, 2 mM de EDTA y 1% Suero de ternero recién nacido
Nombre	>Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Plasticware
			Delta de fondo plano de superficie de 96 pocillos
Placa de Petri de 10 cm	TPP	93100	Estéril Placa de Petri de 10 cm 1,5
mL Tubos Eppendorf	Eppendorf	0030 125.150	Tubos Eppendorf
Transferencia pipeta	Samco Scientific	222-20S	Pipeta de transferencia estéril (1 mL, bulbo grande)

Células metanol 96 placa de pocillos Nunclon 167008