Summary
Vi beskriver en protokol for at måle transmigration af monocytter på tværs af menneskelige endotel monolag og deres efterfølgende modning i skum celler. Dette giver en alsidig metode at vurdere egenskaberne atherogene af monocytter isoleret fra folk med forskellige sygdomstilstande og evaluere faktorer i blodet, som kan forbedre denne tilbøjelighed.
Abstract
Koronararteriesygdom (CAD) er en førende årsag til sygelighed og dødelighed på verdensplan. Åreforkalkning, en førende årsag til CAD, er initieret af transmigration af medfødte immun monocytter til inflammatoriske websteder af deponerede lipid kaldet fede striber, som er til stede i arteriel vægge af medium til store arterier. Patogene hovedaksen i læsioner på dette tidlige stadium af åreforkalkning er en modning af monocytter, som vandrer ind i arterierne til at danne skum celler eller lipid-laden makrofager. Betydelige beviser støtter den hypotese, at risikoen for åreforkalkning er steget med kroniske betændelsestilstande ledsagende sygdomme som leddegigt og HIV, samt generel aldring, og at denne risiko er forudsagt af monocyt aktivering. Mens musen modeller giver en god platform for at undersøge rollen af monocytter i atherogenesis i vivo, de kræver genetisk ændring af naturlige kolesterol metabolisme og drastiske ændring af normal mus kost, og har begrænset anvendelsesegnethed undersøgelse af atherogene påvirkninger af menneskers komorbide sygdomme. Dette motiverede os til at udvikle en menneskelig in vitro- model for at måle den atherogene potentiale af monocytter isoleret fra personer med definerede sygdomstilstande. I øjeblikket begrænser menneskelige in vitro- modeller i at de vurdere monocyt transmigration og skum celle dannelse i isolation. Her beskriver vi en protokol som monocytter isoleret fra patientens blod transmigrate i endothelial celler ind i en type 1 kollagen matrix, og deres tilbøjelighed til at modnes i skum celler i tilstedeværelse eller fravær af eksogene lipid måles. Protokollen er blevet valideret for brugen af humane monocytter renset fra personer med HIV-infektion og ældre HIV inficerede individer. Denne model er alsidig og giver mulighed for monocyt transmigration og skum celle dannelse skal vurderes ved hjælp af enten mikroskopi eller flowcytometri samt giver mulighed for vurdering af atherogene faktorer til stede i serum eller plasma.
Introduction
Monocyt transmigration er et afgørende skridt i udviklingen af aterosklerotiske plak, der kan føre til blodpropper, slagtilfælde og myokardieinfarkt. Aterosklerotiske plaques udvikle fra fede striber, generelt findes på lokaliteter af lav oscillerende blodgennemstrømningen i medium til store arterier, hvor deponerede lipid bidrager til endotel aktivering og lokaliseret betændelse1. Monocytter rekrutteres i endothelial celler i fede striber via monocyt kemotaktisk proteiner (f.eks CCL2) og transmigrate i intima2. Efter transmigration, kan monocytter danne atherogene, lipid-laden makrofager kaldet skum celler som følge af lipid optagelse, lipid syntese, ned-regulering af cholesterol efflux eller en kombination af de ovennævnte faktorer. Monocytter kan også ophobes lipider i omløb og har en 'skummende' fænotype, eventuelt disponerende celler for skum celle dannelse3,4. Skum celler er den definerende funktion af fede striber og tidlige aterosklerotiske plaques og deres dannelse er påvirket af både lipid og inflammatoriske mediatorer5. Alternativt, monocytter har evnen til at vende transmigrate fra arterie i blodbanen6, derved fjerne lipid fra intima og handler for at bevare sundheden af arterie.
Bestemmelse af tilbøjelighed af monocytter til transmigrate på tværs af arteriel endothelium og danne skum celler i intima, eller at vende transmigrate og bære lipid ud af plak, er en afgørende forudsætning for forståelse af monocyt aktivering i stigende rolle aterosklerotisk risiko. Musemodeller af CADs som åreforkalkning er vigtige i belyse real-time i vivo oplysninger på fede streak/aterosklerotisk plaque udvikling. Disse modeller kræver imidlertid en genetisk ændring af naturlige kolesterol forarbejdning evner af disse dyr, som regel kombineret med drastiske ændringer i kost (såsom ApoE-/-Western-type diæt model)7,8, dermed, inducerende ikke-fysiologisk ophobning af cirkulerende lipid niveauer som drev plaque udvikling. Disse modeller kan have begrænset relevans for kroniske inflammatoriske menneskelige lidelser såsom HIV-infektion som ikke er forbundet med øget cirkulerer kolesterol eller low-density lipoprotein (LDL) niveauer. Desuden forskelle i monocyt biologi mellem mennesker og mus gør testning af immunologiske spørgsmål om relevansen af delpopulationer af monocytter (såsom mellemliggende monocytter (CD14++CD16+))9 vanskeligt. Dette er vigtigt, når man studerer de mekanismer, der er drivkraften bag hjerte-kar-sygdom som mellemliggende monocyt tæller forudsige uafhængigt kardiovaskulære hændelser10,11. Mens assays eksisterer for at sekventielt måle enten monocyt transmigration eller skum celle dannelse i isolation, er ingen i vitro assay blevet valideret for kvantificering af begge aspekter af tidlig atherogenesis ved hjælp af de samme celler fra kliniske kohorter. Transwell modeller udnytte en modificeret Boyden to-kammer system, hvorved cellerne er indlæst i det øverste kammer og transmigrate på tværs af en porøs plastbarriere eller celle éncellelag til et andetkammer, der typisk indeholder medier med chemoattractant12 , 13. mens almindeligt anvendt til at analysere leukocyt transmigration, disse modeller ikke generelt optage et lag, der repræsenterer intima, hvilket resulterer i transmigrated celler migrerer til løsning, og tillader ikke for måling af skum celle dannelse eller omvendt transmigration af de samme celler. Omvendt, modeller af skum celle dannelse ikke højde for eventuelle transmigratory-induceret ændringer monocytter eller effekter i endothelial aktivering, som er kendt for at bidrage til at skum celle dannelse14. Desuden, disse systemer fremkalde skum celle dannelse af makrofager levet op til celle kultur plader ved tilsætning af mætte koncentrationer af eksogene oxideret low-density lipoprotein (oxLDL)15,16, en nøgle inducer af skum celle dannelse. LDL anvendes i disse modeller er ofte oxideres af ikke-fysiologisk-relevante processer såsom CuSO4 behandling17, derfor sætter spørgsmålstegn ved den fysiologiske betydning af studier ved hjælp af disse modeller.
Her beskriver vi en analyse, der kvantificerer monocyt transmigration og skum celle dannelse af de samme celler som ingen kræver tilføjelsen af eksogene oxLDL, dermed bedre modellering af monocytter i skum celle formation rolle. Denne model blev oprindeligt udviklet af Professor William Muller (Northwestern University, Chicago)18, og har været yderligere raffineres i vores laboratorium for at vurdere ex vivo atherogenicity af monocytter isoleret under ikke-aktivering forhold fra enkeltpersoner med underliggende betændelsestilstande ledsagende sygdomme såsom HIV infektion19 samt aldring20, der er forbundet med en øget risiko for åreforkalkning. Denne model giver også en platform for at besvare grundlæggende biologiske spørgsmål vedrørende tilbøjelighed af forskellige monocyt delmængder form skum celler20, indflydelse i endothelial aktivering af cytokiner såsom TNF på skum celle dannelse14 , og de vandrende egenskaber af monocytter som dybden og hastighed af transmigration i geler19. Derudover monocyt transmigration og skum celle dannelse kan kvantificeres ved hjælp af standard mikroskopi, live celle imaging, flow flowcytometri og imaging flowcytometri, derfor giver en alsidig metode til at vurdere rollen af monocytter i atherogenesis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bemærk: alle eksperimenter ved hjælp af menneskelige biologiske prøver blev udført med etik godkendelse fra den Alfred Hospital menneskelige etiske komité, Melbourne. Alle eksperimenter blev udført i klasse II biosikkerhed kabinetter, medmindre angivet. " Prewarmed " refererer til reagenser opvarmet til 37 ° C i et vandbad.
1. forberedelse af Type I fibrøst kollagen geler: dag 1
- Forbered polymeriserede kollagen geler af sekventielt tilføjelse og blande 35,7 mM NaOH, 0,71 x M199, 4,58 mM eddikesyre og 1.71 mg/mL skriver jeg fibrøst kollagen i en 5 mL polystyren rør pr. tabel 1.
Bemærk: Sikre, at kollagen er godt blandet ved forsigtigt pipettering op og ned 5 gange for at stoppe dannelse af kollagen ' lommer ' i gel-blanding. Forbered 4-6 geler pr. test betingelse for mikroskopi eller 15 geler pr. test betingelse for flowcytometri. - Når godt blandet, alikvot 50 µL af kollagen gel blandingen i hver brønd med en steril fladbundede 96-brønd vævskultur plade. Brug ikke uden for rækker og kolonner, men fylde disse med 200 µL af 1 x Dubecco ' s fosfatbufferet saltopløsning (PBS) til at beskytte geler fra udtørring. Inkuber plader på 37 °C/5% CO 2 for 2 h at tillade kollagen at polymerisere.
Bemærk: Placer plader direkte på ren metal stativer i inkubator selv varme fordeling. - Efter inkubation, overlay geler med 150 µL 1 x suppleres med M199 (Se Tabel af materialer) og der inkuberes i 5 dage indtil brug.
2. Udvidelse af lagrede HUVEC: dag 1
- etiket og frakke en 10 cm diameter petriskål med 1 mL 50 µg/mL fibronektin fortyndet i 1 x PBS og inkuberes ved stuetemperatur i 10 min.
- Tø delprøver af kryopræserverede primære menneskelige umbilical vene endotelceller (HUVEC, 1,0 x 10 6 celler) i 10 mL M20.
Bemærk: HUVEC skal forberedes som tidligere beskrevet 21 og anvendes på en lav passage antallet (< passage 4). HUVEC kan erstattes med menneskelige koronararterie endotelceller her. - Resuspend HUVEC i 10 mL M20 og tilføje til fibronektin belagte fad, sugning overskydende fibronektin før tilsætning af celler og kultur til sammenløbet (ca. 5 dage), udskiftning af mediet på dag 3.
3. Dyrkning HUVEC éncellelag på kollagen geler: dag 5
- på dag 5, frigør HUVEC ved sugning kultur supernatanten fra petriskålen og vask væk serum-holdige medier med 10 mL serum-fri M199.
- Tilføje 5 mL 0,05% trypsin/0,53 EDTA i M199 til HUVEC og inkuberes i 1-2 min. ved stuetemperatur, ryster forsigtigt, indtil cellerne løsrive.
- Når parcelhus, hurtigt skylle petriskål med 5 mL M20 og overføre de medier, der indeholder celler til en 10 mL tube.
- Centrifuge prøver på 300 x g i 5 min ved stuetemperatur, Aspirér supernatanten, resuspend celler i 200 µL af M20 og tælle celler ved hjælp af en hemocytometer.
- Resuspend celler at 2.0 x 10 5 celler/mL i M20, Aspirér M199 på geler fra 96-brønd plade (trin 1.3) og tilsæt 100 µL af resuspenderede HUVEC (2.0 x 10 4 celler) til hver kollagen gel forberedt ovenfor (trin 1.2). Kultur plader for yderligere 3 dage på 37 °C/5% CO 2.
Bemærk: Integriteten af HUVEC éncellelag kan bekræftes efter 3 dage af sølvnitrat farvning 22 eller Immunhistokemi for tight junction proteiner 23 på dette stadium. Yderligere geler skal være forberedt til dette formål.
4. Aktivering af HUVEC éncellelag og Isolation/aktivering af monocytter for Transmigration: dag 8
- på dag 8, aktivere hver HUVEC éncellelag før tilsætning af monocytter ved sugning M20 media overliggende geler og tilføjer 100 µL af 10 ng/mL menneskelige TNFα i M20 pr. gel. Der inkuberes ved 37 °C/5% CO 2 til 4 h.
Bemærk: Ingen-aktiveret HUVEC betingelser kan også medtages, hvis kræves som kontrolelementer. - Under 4 h HUVEC aktivisering skridt, isoleres monocytter fra PBMC ved hjælp af magnetisk bead teknikker negativt vælge for celler som pr fabrikantens ' s instruktioner. Mindst 6,5 x 10 6 PBMC bør anvendes på dette trin for at pålideligt genoprette 3.0 x 10 5 monocytter kræves for én betingelse, nemlig monocytter typisk tegner sig for ca. 10-15% af PBMC.
Bemærk: For at evaluere effekten af monocyt aktivering inden monocyt transmigration og skum celle dannelse, monocytter kan aktiveres på dette stadium. Monocytter kan isoleres fra optøede PBMC hvis påkrævet (dvs. lagrede patientprøver). Monocyt delmængder isoleret af FACS sortering kan forberedes til tilføjelse til geler (figur 1).
5. Transmigration af primære humane monocytter: dag 8
- til at måle monocyt transmigration, fjerne TNFα-holdige medier og vaske geler to gange med 100 µL M199 ved at tilføje og fjerne medier. Efter vask, tilføje 2.0 x 10 5 frisk isoleret eller optøet og vasket befrugtede PBMC eller 5,0 x 10 4 frisk isoleret monocytter eller renset monocyt undersæt til HUVEC encellelag i 100 µL M20. Inkuber i 1 timer ved 37 ° C og 5% CO 2 til at tillade den fremad transmigration af monocytter i gelen. Det er bedst at tillade 6 wells for hver eksperimentelle tilstand undersøgt.
Bemærk: For at evaluere effekten af autolog serum på transmigration og skum celle dannelse, inkuberes celler med M20, der indeholder den ønskede koncentration af varme-inaktiverede donor serum og sammenligne vilkår med en samlet humant serumkontrol. Leukocytter end monocytter kan tilføjes på nuværende tidspunkt. Hvis undersøge virkningen af specifikke lipider/lipid arter (f.eks HDL, oxHDL), udføre alle følgende trin med serumfrit medier indeholdende 20-50 µg/mL lipider. - Efter 1 h af fremad transmigration, indsamle de ikke-transmigrated celler ved at vaske gel to gange med 100 µL forvarmet 1 mm EGTA i 1 x PBS, og en gang med 100 µL M199 (samme centrifugeres betingelser), samle analysere fra hver brønd af samme eksperimentelle tilstand (normalt 6 wells) ind i en 1,5 mL microcentrifuge rør på is. Centrifugeres de ikke-transmigrated celler ved 4 ° C, 300 x g i 5 min og resuspend i 30 µL 1 x PBS.
- Tælle de celler, der opsamlet i supernatanten til at bestemme antallet af frem transmigrated celler.
- Procentdelen af frem transmigrated celler bestemmes som følger:
- dække den vasket geler med transmigrated celler med 100 µL M20 og inkuberes i en yderligere 48 h.
- Efter 48 h, indsamle supernatanten og vask ikke transmigrated celler to gange med 100 µL forvarmet 1 mM EGTA/PBS, indsamle og udligning af supernatanten fra hver tilstand som i trin 5.2.
Bemærk: Fænotypen af reverse transmigrated celler kan afprøves på disse celler following standard flowcytometri farvning protokoller. - Centrifugeres celler ved 4 ° C, 300 x g i 5 min og resuspend celler i 30 µL 1 x PBS. Tælle celler og bestemme levedygtighed via trypan blå farvning.
- Bestemme procentdelen af reverse transmigrated celler ved hjælp af følgende ligning:
Bemærk: regnskab for det samlede antal forward transmigrated celler giver en mere præcis angivelse af reverse transmigration da det er usandsynligt fremad transmigration bliver 100%. - For analyse af mikroskopi, fastsætte geler ved at tilføje 100 µL 2% formaldehyd (endelig koncentration) til hver brønd, dække plader i aluminium folie og opbevares ved 4 ° C indtil analyse. Til flowcytometri, lave ikke lave cellerne på nuværende tidspunkt. Se protokollerne nedenfor for Mikroskopi (afsnit 6) eller flowcytometri (afsnit 7) analysen af handelsstrømmen.
Forsigtig: Formaldehyd er giftige og ætsende; bruge personlige værnemidler (PPE). Omhu bør tages, når du tilføjer formaldehyd, men dette skridt ikke skal udføres i et stinkskab på grund af den lave koncentration til.
6. Kvantitering af skum celler og makrofager ved mikroskopi (olie-røde O pletten)
- fjerne formaldehyd og vaske gel med 100 µL af 50% (v/v) metanol i 5 min og derefter 100 µL 78% (v/v) metanol i 15 min.
Bemærk: Farvning trin kan udføres på laboratoriebænk og ikke i en klasse II Biohazard kabinet. - Pletten for lipid dråber af tilføjer 100 µL af frisklavede 0,2% (w/v) olie-røde O (Se Tabel af materialer for detaljer) i 1 time ved stuetemperatur.
- Fjern overskydende pletten ved at vaske gel 4 gange med 100 µL af 78% (v/v) metanol, sugning og kassere supernatanten efter hver Wash
- Kontrastfarve for 15 min ved stuetemperatur med 100 µL af Giemsa, fortyndet 1:10 med destilleret vand.
- Opsug Giemsa pletten og vaske geler engang med vand.
- For at frigøre geler fra pladen, fælg brønde ved hjælp af en 21 G kanyle med facet udad rundt i kanten af gelen.
- Til at montere geler på et objektglas, punch to huller (6,35 mm i diameter) i en 2,54 cm x 1,5 cm stribe dobbeltklæbende tape. Fix tape til en standard mikroskop side og fjern den beskyttende belægning fra toppen.
- Tilføj en dråbe vand til hullerne i båndet ved hjælp af en overførsel pipette. Brug pincet, forsigtigt overførsel geler til huller i tape og dæksel med en størrelse 1,5 glas coverslip. Tryk forsigtigt på coverslip til at overholde det til båndet.
- Undersøge med differential interferens kontrast-lysfelt mikroskopi bruger 40 X mål på en inverteret mikroskop.
- Bring HUVEC éncellelag fokus på 40 X Forstørrelse og rulle ' i ' gel, tælle makrofager skumplast celler i hele den hele dybde af gelen. Gentag for tre forskellige felter i lyset beliggende på lignende afstande fra kanten af gel for at minimere mulige kant effekter. Dette vil sikre gel dybde er overensstemmelse mellem tælle områder.
Bemærk: Score celler i gelen som enten skum celler (defineret som celler, der indeholder > 1/3 af deres cytoplasma som olie-røde O farves lipid dråber) eller makrofager inden for 2 h montering dias ( figur 2). Skum celle dannelse er udtrykt som procentdelen af skum celler i forhold til det samlede antal overførte celler og er udtrykt som de mediane tæller i 3 felter undersøges for 6 geler pr. betingelse, derfor en median 18 målinger pr. betingelse. Et eksempel på rå celletal fra et typisk forsøg er vist i tabel 2.
Bemærk: Klassificere en celle som en skum celle vs makrofag ved mikroskopi er subjektive og kan derfor investigator-afhængige. I kliniske undersøgelser, hvor eksperimenter er udført over en længere periode, er det vigtigt for alle tælle udføres blindet af en enkelt investigator. Eksempler på skum celler og makrofager i geler er angivet i figur 2.
- Bring HUVEC éncellelag fokus på 40 X Forstørrelse og rulle ' i ' gel, tælle makrofager skumplast celler i hele den hele dybde af gelen. Gentag for tre forskellige felter i lyset beliggende på lignende afstande fra kanten af gel for at minimere mulige kant effekter. Dette vil sikre gel dybde er overensstemmelse mellem tælle områder.
7. Analyse af Transmigrated celler ved Flow flowcytometri
- til fænotype karakterisere skum celler og makrofager efter transendothelial migration, fordøje geler ved at tilføje 100 µL af 37 ° C forvarmet 1 mg/mL collagenase D fortyndet i M199 til hver godt og Inkuber i 20 min. ved 37 °C/5% CO 2.
Bemærk: Placer 96-brønd plader direkte på ren metal stativer i inkubator selv varme fordeling. - Efter inkubation, udblødte geler ved hjælp af en 200 µL pipette tip og inkuberes i en yderligere 20 min. på 37 °C/5% CO 2.
- Én gang fuldt fordøjet, filter og pool de fordøjede Repliker geler gennem 35 µm nylon mesh udjævnede FACS rør placeret på isen, og vask en gang med FACS vask (Se tabel over materialer) ved 4 ° C, 300 x g. Resuspend celler i 100 µL af FACS Wash
- Ruger de resulterende celler med fluorophore-konjugerede antistoffer specifikke for CD45, en live/døde celle markør og overflade/intracellulære fænotypiske eller funktionelle markører af interesse ved hjælp af standard flow flowcytometri protokoller.
Bemærk: Forberede kontrol rør til kompensation ved hjælp af passende fluorophores og Ig kompensation perler. Udtrukne celler kan også afhentes på glas dias til immunofluorescens mikroskopi af cytospinning. Alternativt har vi med succes indsamlet celler ved hjælp af denne protokol for vurdering via imaging flowcytometri. - Erhverve celler ved hjælp af en flow forskellige, og udføre kompensation som krævet.
Bemærk: Som skum celler/makrofager ikke kan danne enkelte befolkningsgrupper benytter lysspredningen egenskaber og kan variere betydeligt i størrelse og form, indstille liberale forward scatter (FSC) og side scatter (SSC) porte for at fange alle overflyttede celler som vist i < stærk class = "xfig" > figur 3A. - Efter erhvervelse, udføre dataanalyse ved hjælp af flow flowcytometri software. For at identificere overflyttede celler, skal du først markere celler som negative for live/døde markør som vist på figur 3B. Næste, udføre en enkelt celle forskelsbehandling ved at skabe en stram gate omkring cellerne vist på en SSC-området vs SSC-højde plot.
- Vælg CD45 + celler og gate den større befolkning af overflyttede celler i en FSC/SSC plot, da disse er cellerne, makrofager, skumplast.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kvantificere monocyt transmigration
Monocytter føjes til modellen som beskrevet i figur 1, og seks geler er forberedt for hver betingelse. Monocytter for 6 geler per donor (dvs., 5,0 x 104 monocytter pr. gel 6 geler = 3,0 x 105 monocytter per donor) er genopslemmes til en endelige mængden af 600 µL af M199 medier indeholdende de nødvendige serum/isoleret lipid. Celler (dvs, 100 µL pr. gel = 5,0 x 104 monocytter) er derefter aliquoted på geler og rugede som ovenfor for 1 h at lette monocyt transmigration. Efter transmigration tælles ikke transmigrated celler som ovenfor. I dette eksempel, blev 1.5 x 104 ikke transmigrated celler inddrevet. Procentdelen af fremad transmigration var bestemmes ved hjælp af formlerne beskrevet taktfast 5.4:
Efter 48 h inkubation, 3,6 x 104 reverse transmigrated celler blev inddrevet som ovenfor. Procentdelen af reverse transmigration blev bestemt ved hjælp af formlen i trin 5.8:
Frem og bak transmigration kan sammenlignes mellem tilstande ved hjælp af passende statistiske tests og monocytter forberedt fra flere uafhængige donorer til at bestemme, om monocyt transmigration evne er ændret mellem eksperimentelle betingelser.
Evaluering af skum celle dannelse
Brightfield mikroskopi
Oxideret lipoproteiner er kendt for at fremme monocyt-afledte skum celle formation in vitro- i forhold til uoxiderede lipider15. Her bekræfter vi, at behandlingen af monocytter med oxLDL, almindeligvis anvendes til at fremkalde skum celle dannelse i konventionelle skum celle induktion modeller, forbedrer monocyt-afledte skum celle dannelse i denne model af transendothelial migration og skum celle dannelse sammenlignet med indfødte LDL. Efter monocyt transmigration og skum celle dannelse i geler inkuberes med M199 indeholdende 50 µg/mL indfødte eller CuSO4-Oxideret LDL (Se trin 5.1, figur 1), celler blev analyseret ved mikroskopi. Eksempler på skum celler og makrofager observeret i repræsentative forsøg er vist i figur 2. Celler blev talt i tre forskellige felter pr. gel, ved at fokusere på HUVEC éncellelag og gradvis fokuserer dybere ind i gelen. Celletal registreres for hver donor, som vist i tabel 2 for en enkelt donor, at sammenligne procentdelen af skum celler dannet som svar på oxideret og indfødte LDL. Aggregere data fra n = 12 uafhængige tæller er vist i figur 4 at bekræfte, at inkubering af monocytter med oxLDL i denne model fremkalder mere skum celle dannelse end betingelser hvor monocytter inkuberes med indfødte LDL eller M199 media alene.
Flowcytometri
Bestem Fænotypen af overflyttede celler, er celler udvundet fra fordøjet geler og mærket ved hjælp af en standard flow flowcytometri panel. Celler var mærket med en live/døde celle markør og antistoffer specifikke for CD45 og andre overflade fænotype markører ved hjælp af standard flow flowcytometri protokoller. Kompensation kontrol skal forberedes også fuld kompensation pr. standard flow flowcytometri teknikker. Overflyttede celler er gated som vist i figur 3 i parceller repræsentant af 10 uafhængige forsøg. Levende celler er gated ved hjælp af live/døde celle levedygtighed assays (figur 3B) og dubletter ikke er omfattet af en enkelt celle analyse (figur 3 c). Celler er derefter låge som CD45+ for at udelukke HUVEC (som disse celler er CD45-, figur 3D). Den store befolkning er derefter gated af forward scatter/side scatter forskelsbehandling (figur 3E) og den gennemsnitlige fluorescens intensitet (MFI) receptorer af interesse bestemmes i forhold til enten fluorescens minus én (FMO) eller isotype kontrol) Figur 3F) for at bestemme udtryk (ΔMFI) eller procentdelen af positive celler.
Figur 1 : En in vitro- model med monocyt transmigration og skum celle dannelse. (A) PBMC, (B) samlede monocytter eller (C) FACS-sorteret monocyt delmængder er tilføjet til type I-fiber kollagen geler dannes i 96-brønd plader og belagt med en éncellelag af aktiverede primære menneskelige umbilical vene endotelceller (HUVEC), hvis integritet kan vurderes ved sølvfarvning ()D) og (E) transmigrate 1 h serum eller lipid indeholdende medier. Non-transmigrated celler tælles (F) og geler er inkuberes i en yderligere 48 timer med den samme serum/lipid indeholdende medier. Efter inkubationen (G) omvendt overflyttede celler tælles og procentdelen af skum celler vs makrofager i gelen bestemmes af (H) fase kontrast mikroskopi efter farvning med olie-røde O eller den Fænotypen af overflyttede celler bestemmes af (jeg) flowcytometri. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Eksempler på skum celler og makrofager i en in vitro- model med monocyt transmigration og skum celle dannelse. RepresentatIve eksempler på celler scorede som skum celler (hvide pile) og makrofager (sorte pile) efter Giemsa farvning for at visualisere celler og olie-røde O farvning at visualisere lipid dråber som fastsat af fase kontrast mikroskopi af uddraget geler ved hjælp af et omvendt mikroskop på 40 X forstørrelse. Skalalinjen = 20 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Gating strategi af transmigrated celler ved flowcytometri. Transmigrated celler er fænotype karakteriseret ved flowcytometri efter udvinding af celler fra geler. Celler er gated af (A) FSC/SSC, (B) levende celler, (C) enkelt celler, (D) CD45+, (E) FSC/SSC og (F) udtryk for receptor i forhold til isotype eller fluorescens minus én (FMO) kontrol. Udtryk for receptorer af interesse er defineret som betyder fluorescens intensitet (MFI) og givet udtryk for med hensyn til niveauer af isotype. ΔMFI = pletten (MFI) minus isotype/FMO kontrol (MFI). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Effekt af eksogent tilføjet oxLDL og LDL på monocyt-afledte skum celle dannelse. Skum celle dannelse bestemmes under forhold hvor monocytter fra en enkelt donor inkuberes med medier (M199) eller 50 µg/mL uoxiderede low-density lipoprotein (LDL) eller kobber (II) sulfat Oxideret LDL (oxLDL) tilføjet til geler efter transmigration. Vises licensantallet til 12 forskellige steder. Skum celler er udtrykt som procentdelen af samlede overflyttede celler. Medianen og interkvartil intervaller er vist i søjlediagrammer og sammenligningerne blev foretaget ved hjælp af ikke-parametrisk Mann-Whitney U test. p < 0,001, *** p < 0,0001. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Reagens | [Lager] | [Endelig] | Volumen for 60 geler (µL) |
| NaOH | 100 mM | 35,7 mM | 1071 |
| M199 | 10 x | 0.71 x | 213 |
| AcCOOH | 20 mM | 4,58 mM | 687 |
| Kollagen | 5 mg/mL | 1,71 mg/mL | 1029 |
| Samlede volumen | - | - | 3000 |
Tabel 1: Type I fibrøst kollagen gel forberedelse
| LDL | oxLDL | |||||||
| Gel | Grev | Skum celler1 | Overflyttede celler1 | Skum celler (%)2 | Skum celler1 | Overflyttede celler1 | Skum celler (%)2 | |
| 1 | 1 | 5 | 44 | 11.4 | 26 | 55 | 47.3 | |
| 2 | 5 | 27 | 18,5 | 10 | 23 | 43.5 | ||
| 3 | 11 | 52 | 21,2 | 19 | 39 | 48,7 | ||
| 2 | 1 | 5 | 34 | 14,7 | 9 | 31 | 29 | |
| 2 | 14 | 50 | 28 | 32 | 55 | 58.2 | ||
| 3 | 5 | 37 | 13.5 | 19 | 37 | 51,4 | ||
| 3 | 1 | 10 | 37 | 27 | 28 | 52 | 53,8 | |
| 2 | 7 | 33 | 21,2 | 11 | 31 | 35.5 | ||
| 3 | 7 | 38 | 18,4 | 28 | 53 | 52,8 | ||
| 4 | 1 | 9 | 44 | 20,5 | 14 | 33 | 42,4 | |
| 2 | 7 | 33 | 21,2 | 22 | 47 | 46.8 | ||
| 3 | 11 | 50 | 22 | 11 | 30 | 36.7 | ||
| Median skum celler (%) | 20,8 mio. | 47 | ||||||
| Gennemsnitlige skum celler (%) | 19,8 | 45,5 | ||||||
Tabel 2: rå celle tæller fra sammenligning af monocyt-afledte skum celler efter LDL vs oxLDL behandlinger. 1 Celle tæller pr. synsfelt i gel. 2 Procentdel af skum celler = skum celle tæller/total overflyttede celle tæller x 100. * Data er repræsentative for et eksperiment ved hjælp af monocytter fra en enkelt donor
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen beskrevet her tilbyder en alsidig og fysiologisk relevante metode for vurdering af atherogenicity af monocytter fra humane kliniske kohorter, ved at kombinere både monocyt transmigration og skum celle dannelse. Denne model tilbyder fordele i forhold til alternative metoder til skum celle dannelse som det tager højde for effekten af monocyt transmigration på skum celle dannelse og giver mulighed for måling af reverse transmigration6 ud over de iboende monocytter tilbøjelighed til at modnes i skum celler i tilstedeværelse eller fravær af eksogene faktorer. Endvidere, rolle i endothelial aktivisering er også taget hensyn som vi har vist at endotel aktivering upregulates oxidation af lipid arter, der er knyttet til skum celle dannelse14. Endelig kan Fænotypen af monocytter, der undergår egress (en egenskab i forbindelse med plaque regression) kvantificeres og karakteriseret ved mikroskopi og flow flowcytometri.
På grund af den tre-dimensionelle karakter af transmigration i geler, identificere og score de transmigrated celler som skum celler eller makrofager kan være svært som celler transmigrate på forskellige niveauer i gel19. Hjælp til identifikation af skum celler, skal frisk olie-røde O pletten altid anvendes. Det er også af Bemærk at forskellige ex vivo sygdomstilstande eller in vitro- betingelser kan ændre monocyt transmigration i gelen. Vi har brugt levende celle imaging til at identificere, monocytter fra HIV-inficerede individer har tendens til at transmigrate til lavvandede point i geler og ved forskellige hastigheder end dem fra ikke-inficerede individer19. Derudover skum celle dannelse er forbundet med mindre monocyt motilitet i gelen så celler har tendens til at gå i cirkler på en bestemt z-sektion i forhold til celler fra HIV-inficerede individer, som har tendens til at migrere i en relativt lige linje mod den bunden af gelen. Disse resultater øge muligheden for et lignende fænomen forekommer i eksperimenter ved hjælp af menneskelige patientprøver fra andre sygdomstilstande, der er forbundet med øget monocyt atherogenicity.
Når du udfører flow flowcytometri-baserede analyser er det almindeligt at observere en betydelig del af døde celler i den gendannede celle befolkning ved vurderingen af levedygtighed ved hjælp af live/døde celle markører (figur 4B). Disse celler er overvejende CD45- HUVEC, der er beskadiget under kollagen fordøjelse/maceration skridt skal udtrække monocyt-afledte celler fra kollagen matrix. Denne proces er særligt barske på HUVEC éncellelag, men er ikke skadelig for fænotyper de transmigrated celler.
Denne model adskiller sig fra andre ved at ingen kunstigt oxideret eksogene lipid er påkrævet i dyrkningsmedier til drev monocyt-afledte skum celle dannelse. I stedet, skum celle dannelse i denne analyse er påvirket af serum i dyrkningsmedier, giver mulighed for diskret virkningerne af opløselige faktorer fra kliniske prøver skal evalueres. Som sådan, har vi vist, at inkubering af kontrol monocytter med serum fra enten unge HIV-smittede19 eller ældre HIV-inficerede20 individer fremmer skum celle dannelse, der angiver, at opløselige faktorer uafhængigt kan fremme skum celle dannelse. Som analysen påvirkes af opløselige komponenter, skal en enkelt batch af poolede humant serum anvendes til eksperimenter med henblik på bestemmelse af den iboende forskel atherogene egenskaber af monocytter stammer fra forskellige personer for at standardisere kontrol betingelser. Denne analyse kan også bruges til at evaluere rollen specifikke lipid arter fra kliniske prøver (figur 3). For eksempel, har vi fundet at inkubation af monocytter med medier indeholdende isolerede lipid arter såsom high-density lipoprotein fra individer med kendte lipid dysfunktion24 også fremmer skum celle dannelse. I dette tilfælde kan monocytter fra en enkelt sund person eller gruppe af enkeltpersoner bruges i tilstedeværelsen af serum eller serum faktorer afledt af testpersoner. Derfor, denne model giver mulighed for specifikke spørgsmål vedrørende både opløselige og cellulære komponenter diskrete påvirkning skum celle dannelse.
Denne analyse udnytter HUVEC som en model af koronar arterie endotel på grund af den praktiske vanskelighed ved at opnå store antal lav passage nummer primære koronararterie celler. Vi har imidlertid sammenlignet resultaterne fra assays ved hjælp af både menneskelige koronararterie endotelceller eller HUVEC og observerede lidt forskel i monocyt transmigration eller skum celle dannelse (data ikke vist), der angiver, at brugen af HUVECs i dette system er en acceptabel erstatning. Manuel tælling af skum celler er en begrænsende faktor i denne model, da det kan indføre operatør bias. Derfor skal alle prøver monteret på dias blændet at operatøren for at fjerne muligheden for bias. Vi har imidlertid sammenlignet skum celle dannelse som målt ved manuel optælling og billedbehandling flowcytometri og fundet, at disse metoder giver tilsvarende resultater19. En afgørende begrænsning af denne model er, at monocyt vedhæftning og transmigration forekomme i fravær af shear kræfter tilknyttet fysiologiske blod flow i vivo. Vi hypotesen, at snitte flow overvejende vil påvirke monocyt transmigration og ikke efterfølgende skum celle dannelse inden for matrix; Dette skal dog overvejes, når fortolkning af resultater fra dette assay. Denne analyse også model ikke indflydelse af glatte muskelceller i monocyt-afledte skum celle formation, som er en fysiologisk begrænsning af systemet; men det er konsekvent i alle betingelser, som tillader den diskrete atherogene potentiale af monocytter sammenlignes mellem forskellige sygdomstilstande.
I Resumé giver denne model en alsidig og fysiologisk relevante metode til kvantificering af monocyt transmigration og skum celle dannelse fra menneskelige prøver i forskellige sygdom stater ex vivo. Denne model har yderligere programmer for evaluering af monocytter tilbøjelighed til at danne skum celler under forhold hvor monocyt atherogenicity er forbundet med øget risiko for CAD som fedme25, diabetes26 og kronisk nyre sygdom27. Derfor, denne model kan også være optimeret til brug i sygdomstilstande end åreforkalkning hvor cellulære transmigration kan påvirke sygdommen patogenese.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne parlamentsarbejdet Prof. William Muller og Dr. Clare Westhorpe arbejde for deres centrale rolle i udviklingen af tidligere gentagelser af denne model. Forfatterne vil også gerne takke AMREP Flow flowcytometri kerne for sortering af monocyt delmængder og Alfred Hospital smitsomme sygdom enhed klinisk forskning sygeplejersker til ansættelse af HIV + personer for nogle undersøgelser. Forfatterne parlamentsarbejdet bidrag til dette arbejde i den Victoria operationelle infrastruktur Support Program modtaget af Burnet Institute. TAA er understøttet af en RMIT University Vice-kansler postdoc stipendium. Dette arbejde blev støttet af NHMRC project grant 1108792 tildeles AJ og AH. TK er støttet af NIH tilskud NIH K08AI08272, NIH/NCATS Grant # UL1TR000124.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gel preparation reagents | |||
| NaOH | Sigma-Aldrich | 221465-500G | 0.1 M NaOH diluted in H20 |
| 10x M199 | Sigma-Aldrich | M0650 | |
| AcCOOH | Sigma-Aldrich | 695092-100ML | 20 mM Acetic acid diluted in H20 |
| Cultrex Bovine Collagen I | R&D Systems | 3442-050-01 | Type I Fibrous Collagen |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture | |||
| M199 | Life Technologies | 11150-059 | M199 media containing Earle's salts, L-glutamine and 2.2 g/L Sodium Bicarbonate. Media supplemented with 100 µg/mL L-glutamine and 100 U/mL penicillin/streptomycin |
| M20 | Supplemented M199 containing 20% heat-inactivated pooled or donor serum. Individual lipid species such as LDL can be added to M199. |
||
| HUVEC | Primary human umbilical cord endothelial cells (HUVEC) can be isolated from umbilical cords donated with informed consent and ethics approval. Isolated HUVEC may also be purchased commercially. | ||
| Human coronary artery endothelial cells | Primary human coronary artery endothelial cells can be isolated from arteries donated with informed consent and ethics approval. Isolated cells may also be purchased commercially. | ||
| EDTA | BDH Merck | 10093.5V | Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) - 0.5 M, pH 8.0 |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889-500G | Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) - 1 mM, pH 8.0 |
| 0.05% trypsin EDTA | Gibco | 25300-054 | 0.05% trypsin/0.53 EDTA (1X) |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | L-glutamine (200 mM) |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | Penicillin/streptomycin (10,000 units/mL Penicillin and 10,000 µg/mL Streptomycin) |
| New born calf serum | Gibco | 16010-142 | New born calf serum: New Zealand origin |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1056-1MG | Fibronectin - 50 µg/mL aliquots prepared and stored |
| PBS (1x) | Gibco | 14200-075 | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (10x): Dilute to 1x with sterile H20 |
| 0.1% TNF | Gibco | PHC3015 | Recombinant human TNF - Reconstituted in H20 and stored in 10 µg/mL aliquots |
| Low-density lipoprotein | Merck Millipore | LP2-2MG | Low-density lipoprotein (LDL) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopy | |||
| 1 or 2% formaldehyde | Polysciences | 4018 | 1 or 2% formaldehyde diluted with sterile H20 |
| 50% and 78% methanol | Ajax Finechem | 318-2.5L GL | 50% or 78% v/v methanol, diluted with H20 |
| Oil Red O stain | Sigma-Aldrich | O0625-25G | Dilute to 2 mg/mL in 22% 1M NaOH and 78% (v/v) methanol |
| Microscope slides | Mikro-Glass | S41104AMK | Twin frosted 45 degree ground edge microscope slides (25 X 76 mm) |
| Cover slips | Menzel-Gläser | MENCS224015GP | 22 x 40 mm #1.5 size glass cover slips |
| Double-sided tape | 3M Scotch | 4011 | Super strength exterior mounting tape (25.4 mm x 1.51 m) |
| Giemsa stain | Merck Millipore | 1.09204.0500 | Giemsa's azur eosin methylene blue solution (dilute stock 1:10 in H20) |
| Hole punch | Hand-held single hole punch (6.35 mm punch) | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flow cytometry | |||
| Collagenase D | Roche Diagnostics | 11088858001 | Collagenase D diluted in M199 media to 1 mg/mL |
| 35 µm nylon mesh capped polystyrene FACS tubes | BD Biosciences | 352235 | 35 µm nylon mesh capped polystyrene FACS tubes |
| Live/Dead Fixable Yellow Dead Cell stain | Life Technologies | L34959 | Live/Dead Fixable Yellow Dead Cell stain |
| FACS wash | Prepare by mixing 1 X PBS-, 2 mM EDTA and 1% New born calf serum | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasticware | |||
| 96 well plate | Nunclon | 167008 | Delta surface flat-bottomed 96 well plate |
| 10 cm Petri Dish | TPP | 93100 | Sterile 10 cm Petri dish |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | Eppendorf | 0030 125.150 | Eppendorf tubes |
| Transfer pipette | Samco Scientific | 222-20S | Sterile transfer pipette (1 mL, large bulb) |
References
- Napoli, C., et al. Fatty streak formation occurs in human fetal aortas and is greatly enhanced by maternal hypercholesterolemia. Intimal accumulation of low density lipoprotein and its oxidation precede monocyte recruitment into early atherosclerotic lesions. J Clin Invest. 100 (11), 2680-2690 (1997).
- Woollard, K. J., Geissmann, F. Monocytes in atherosclerosis: subsets and functions. Nat Rev Cardiol. 7 (2), 77-86 (2010).
- Xu, L., et al. Foamy Monocytes Form Early and Contribute to Nascent Atherosclerosis in Mice With Hypercholesterolemia. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 35 (8), 1787-1797 (2015).
- Jackson, W. D., Weinrich, T. W., Woollard, K. J. Very-low and low-density lipoproteins induce neutral lipid accumulation and impair migration in monocyte subsets. Scientific Reports. 6, 20038 (2016).
- Angelovich, T. A., Hearps, A. C., Jaworowski, A. Inflammation-induced foam cell formation in chronic inflammatory disease. Immunol. Cell. Biol. 93 (8), 683-693 (2015).
- Llodrá, J., et al. Emigration of monocyte-derived cells from atherosclerotic lesions characterizes regressive, but not progressive, plaques. Proc. Natl. Acad. Sci. 101 (32), 11779-11784 (2004).
- Getz, G. S., Reardon, C. A. Animal Models of Atherosclerosis. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 32 (5), 1104-1115 (2012).
- Meir, K. S., Leitersdorf, E. Atherosclerosis in the Apolipoprotein E-Deficient Mouse. A Decade of Progress. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 24 (6), 1006-1014 (2004).
- Hilgendorf, I., Swirski, F. K. Making a difference: Monocyte Heterogeneity in Cardiovascular Disease. Curr. Atheroscler. Rep. 14 (5), 450-459 (2012).
- Rogacev, K. S., et al. Lower Apo A-I and Lower HDL-C Levels Are Associated With Higher Intermediate CD14++CD16+ Monocyte Counts That Predict Cardiovascular Events in Chronic Kidney Disease. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 34 (9), 2120-2127 (2014).
- Rogacev, K. S., et al. CD14++CD16+ Monocytes Independently Predict Cardiovascular Events: A Cohort Study of 951 Patients Referred for Elective Coronary Angiography. J. Am. Coll. Cardiol. 60 (16), 1512-1520 (2012).
- Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro Cell Migration and Invasion Assays. J. Vis. Exp. (88), e51046 (2014).
- Boyden, S. The Chemotactic Effect Of Mixtures Of Antibody And Antigen On Polymorphonuclear Leucocytes. J. Exp. Med. 115 (3), 453-466 (1962).
- Westhorpe, C. L. V., et al. Endothelial cell activation promotes foam cell formation by monocytes following transendothelial migration in an in vitro model. Exp. Mol. Pathol. 93, 220-226 (2012).
- Quinn, M. T., Parthasarathy, S., Fong, L. G., Steinberg, D. Oxidatively modified low density lipoproteins: a potential role in recruitment and retention of monocyte/macrophages during atherogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. 84 (9), 2995-2998 (1987).
- Henriksen, T., Mahoney, E. M., Steinberg, D. Enhanced macrophage degradation of biologically modified low density lipoprotein. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 3 (2), 149-159 (1983).
- Parthasarathy, S., Raghavamenon, A., Garelnabi, M. O., Santanam, N. Oxidized Low-Density Lipoprotein. Methods Mol. Biol. 610, 403-417 (2010).
- Muller, W. A., Weigl, S. A. Monocyte-selective transendothelial migration: dissection of the binding and transmigration phases by an in vitro assay. J. Exp. Med. 176 (3), 819-828 (1992).
- Maisa, A., et al. Monocytes from HIV-infected individuals show impaired cholesterol efflux and increased foam cell formation after transendothelial migration. AIDS. 29 (12), 1445-1457 (2015).
- Angelovich, T. A., et al. Ex vivo foam cell formation is enhanced in monocytes from older individuals by both extrinsic and intrinsic mechanisms. Exp. Gerontol. 80, 17-26 (2016).
- Westhorpe, C. L. V., et al. Effects of HIV-1 infection in vitro on transendothelial migration by monocytes and monocyte-derived macrophages. J. Leukoc. Biol. 85 (6), 1027-1035 (2009).
- Furie, M. B., Cramer, E. B., Naprstek, B. L., Silverstein, S. C. Cultured endothelial cell monolayers that restrict the transendothelial passage of macromolecules and electrical current. J. Cell Biol. 98 (3), 1033-1041 (1984).
- Müller, A. M., et al. Expression of the Endothelial Markers PECAM-1, vWf, and CD34 in Vivo and in Vitro. Exp. Mol. Pathol. 72 (3), 221-229 (2002).
- Kelesidis, T., et al. Predictors of impaired HDL function in HIV-1 infected compared to uninfected individuals. J. Acquir. Immune Defic. Syndr. , (2017).
- Rogacev, K. S., et al. Monocyte heterogeneity in obesity and subclinical atherosclerosis. European Heart Journal. 31 (3), 369-376 (2010).
- Gacka, M., et al. Proinflammatory and atherogenic activity of monocytes in Type 2 diabetes. J. Diabetes Complications. 24 (1), 1-8 (2010).
- Rogacev, K. S., et al. CD14++CD16+ monocytes and cardiovascular outcome in patients with chronic kidney disease. Eur. Heart J. 32 (1), 84-92 (2011).
