Summary
우리 인간의 내 피 monolayers에 걸쳐 monocytes에 의해 환생 및 거품 세포로 그들의 후속 성숙 측정 프로토콜을 설명 합니다. 이 혈액이 경향이 향상 시킬 수 있는 요인을 평가 하 고 다른 질병 조건 가진 사람에서 격리 하는 monocytes의 atherogenic 속성을 평가 하기 위해 다양 한 메서드를 제공 합니다.
Abstract
관상 동맥 질환 (CAD)는 병 적 상태와 사망률 전세계의 주요 원인입니다. 동맥 경화, 선도적인 CAD의 원인, 예금 된 지질 이라는 큰 동맥에 동맥 벽의 중간에 있는 지방 줄무늬의 염증 성 사이트에 타고 난 면역 monocytes의 환생에 의해 시작 됩니다. 병 변은 동맥 경화 증의 초기 단계에서의 주요 병원 성 특징은 거품 세포 또는 세포 지질 라덴 형태로 동맥으로 마이그레이션하는 monocytes의 성숙 이다. 상당한 증거 지원 일반적인 노화 뿐 아니라 류 마티스 관절염 및 HIV, 질병을 동반 하는 만성 염증 성 조건에 의해 동맥 경화 증의 위험이 증가 하 고이 위험 monocyte에 의해 예측 가설 활성화입니다. 마우스 모델 vivo에서atherogenesis에 monocytes의 역할을 조사 하는 좋은 플랫폼을 제공, 그들은 자연 콜레스테롤 물질 대사의 유전 변경 및 일반 마우스 다이어트의 과감 한 변경 요구 및 적합성에 대 한 제한 인간의 comorbid 질병의 atherogenic 영향 연구. 이 모델을 인간의 생체 외에서 정의 된 질병 국가와 개인 으로부터 격리 하는 monocytes의 atherogenic 잠재력 측정을 개발 동기. 현재, 인간의 생체 외에서 모델은 격리에 monocyte 환생 및 거품 세포 형성 평가을 제한 하 고 있다. 여기 우리는 프로토콜 설명 monocytes 환자의 혈액에서 분리 된 1 형 콜라겐 매트릭스로 인간의 내 피 세포에서 transmigrate 그리고 그들의 성향 외 인 지질의 유무에 거품 세포로 성숙 하는 측정. 프로토콜에서 HIV 감염을 가진 개인 및 노인 HIV 감염 되지 않은 개인 정화 인간 monocytes의 사용에 대 한 확인 되었습니다. 이 모델은 다목적 monocyte 환생과 거품 세포 형성 중 현미경을 사용 하 여 계산 될 수 있습니다 또는 atherogenic 요인의 평가 허용 뿐만 아니라 cytometry 혈 청 또는 혈장에 존재.
Introduction
Monocyte 환생은 혈전 증, 뇌졸중과 심근 경색으로 이어질 수 있는 동맥 경 화성 플 라크의 개발에 중요 한 단계 이다. 동맥 경 화성 플 라크 지방 줄무늬, 일반적으로 현재의 낮은 진동 혈액 흐름의 사이트에서 중간에 큰 동맥, 예금 된 지질 내 피 활성화에 기여 하 고 염증1지역화에에서 개발. Monocytes는 monocyte 혈 단백질 (CCL2) 등을 통해 지방 줄무늬에 내 피 세포를 보충 하 고 intima2로 transmigrate. 환생, 다음 monocytes 지질 통풍 관, 지질 합성, 콜레스테롤 경과의 다운 레 귤 레이 션 또는 위 요인의 조합 결과로 거품 세포 라고 하는 atherogenic, 지질-라덴 세포 형성 수 있습니다. Monocytes 또한 순환에 있는 지질 축적 하 고 아마도 predisposing 세포 거품 세포 형성3,4에 대 한 '거품' 표현 형을가지고 수 있습니다. 거품 세포는 지방 줄무늬와 초기 단계의 동맥 경 화성 플 라크의 정의 기능 그리고 그들의 대형은 지질과 염증 성 중재자5에 의해 영향을. 또는, monocytes는 반대로 수 동맥에서 혈 류6, intima 동맥의 건강을 유지 하는 행동에서 지질 제거로 transmigrate.
하는 monocytes의 성향을 결정 동맥 내 피에 걸쳐 transmigrate 및 양식 폼 셀은 intima에 또는 반대로 transmigrate 그리고 플 라크에서 지질, 증가에 monocyte 활성화의 역할을 이해 하기 위한 주요 요구 사항 동맥 경 화성 위험입니다. 동맥 경화 증 마우스 모델 CADs의 지방 조 흔/동맥 경 화성 플 라크 개발에 대 한 정보 실시간 vivo에서 elucidating에 중요 하다. 그러나, 이러한 모델 (ApoE-/-서 부 타입 다이어트 모델) 등 다이어트7,8, 과감 한 변경와 일반적으로 결합 하는, 이러한 동물의 능력을 처리 하는 자연 콜레스테롤의 유전 변경 필요 어떤 드라이브 패 개발을 레벨 지질 순환의 비 생리 적 축적을 유도 합니다. 이러한 모델 만성 염증 성 인간의 조건 HIV 감염 등 콜레스테롤 저밀도 지단백 (LDL) 수치를 순환 증가와 연결 되지 않은 관련을 제한 수 있습니다. 또한, 차이 monocyte 생물학 인간과 쥐 monocytes의 부분 모집단의 관련성에 대 한 면역 질문 테스트 확인 (등 중간 monocytes (CD14+CD16 ++))9 어려운. 이 때 중요 한 심혈 관 질환으로 중간 monocyte 건의 심장 혈관 사건의10,11를 독립적으로 예측 운전 메커니즘을 공부. 분석 실험 순차적으로 격리에서 하거나 monocyte 환생 또는 거품 세포 형성을 측정 하기 위해 존재, 임상 동료에서 동일한 셀을 사용 하 여 초기 atherogenesis의 두 측면을 측정을 위한 생체 외에서 시험 검증 않았습니다. Transwell 모델에 의하여 셀 상단 챔버로 로드 되 고 다공성 플라스틱 방 벽 또는 셀 단층으로 일반적으로 chemoattractant12 미디어를 포함 하는 낮은 챔버 transmigrate 수정된 Boyden 2 챔버 시스템을 활용 , 13. 백혈구 환생의 분석을 위해 널리 이용 된다, 하는 동안 이러한 일반적으로 intima, 솔루션으로 마이그레이션 transmigrated 셀에 결과 나타내는 레이어를 포함 하지 않는 모델과 거품 세포의 측정에 대 한 허용 하지 않습니다 형성 또는 동일한 셀의 반전 환생입니다. 반대로, 거품 세포 형성의 모델 monocytes 또는 거품 세포 형성14을 알려져 있다 내 피 활성화의 효과를 유도 transmigratory 변경에 대 한 계정을 하지 않습니다. 또한, 이러한 시스템 유도 거품 세포 형성 세포에서 세포 배양 배지 exogenous 산화 저밀도 지 단백질 (oxLDL)15,16, 키 유도의 농도 포화의 추가 의해 준수 거품 세포 형성. LDL이이 모델에 사용 되는 종종 산화 CuSO4 치료17, 같은 비-순수-관련 프로세스에 따라서, 이러한 모델을 사용 하 여 연구의 생리 적인 중요성을 심문.
여기 우리가 따라서 거품 세포 형성에 monocytes의 역할을 잘 모델링 monocyte 환생과 외 인 oxLDL의 추가 요구 하지 않는 동일한 세포의 거품 세포 형성을 단정 하는 분석 결과 설명 합니다. 이 교수 윌리엄 뮬러 (노스웨스턴 대학교, 시카고)18에 의해 원래 개발 되었다 모델과 비보 전 비 활성화에서 격리 하는 monocytes의 atherogenicity 평가 하기 위해 우리의 실험실에 더 세련 된 개인 기본 염증 성 조건20노화 뿐만 아니라 HIV 감염19 질병을 동반, 그 조건은 동맥 경화 증의 위험 증가와 관련. 이 모델 또한 폼 거품 세포20, 거품 세포 형성14에 TNF 같은 cytokines에 의해 내 피 활성화의 영향을 다른 monocyte 하위 집합의 성향에 관한 기본적인 생물학 질문에 응답 하기 위한 플랫폼을 제공 합니다. , 깊이 등 monocytes의 철새 속성과 젤19에 환생의 속도 및. 또한, monocyte 환생 및 거품 세포 형성 표준 현미경을 사용 하 여 측정할 수 있습니다, 그리고 라이브 셀 이미징, flow cytometry 및 이미징 cytometry, 따라서, atherogenesis에 monocytes의 역할을 평가 하는 다양 한 방법을 제공.
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Protocol
참고: 인간의 생물 학적 샘플을 사용 하 여 모든 실험 윤리 승인 알프레드 병원 인간의 윤리 위원회, 멜버른에서에서 수행 되었습니다. 지정 하지 않으면 모든 실험은 클래스 II Biosafety 캐비닛에 수행 했다. " Prewarmed "는 waterbath에서 37 ° C로 예 열 하는 약을 말합니다.
1. 준비의 유형 I 섬유 콜라겐 젤: 1 일
- 준비 순차적으로 추가 하 고 혼합 35.7 m m NaOH에 의해 콜라겐 젤 생산, 0.71 x M199, 4.58 m m 초 산 및 1.71 mg/mL 유형 I 섬유 콜라겐 5 mL 폴리스 티 렌으로 표 1에 의하여 관.
참고: 콜라겐은 콜라겐의 형성을 중지 하기 위해서는 5 번 위아래로 부드럽게 pipetting으로 잘 혼합 되도록 ' 주머니 ' 젤 혼합물에서. 현미경 검사 법에 대 한 테스트 조건 당 4-6 젤 또는 cytometry에 대 한 테스트 조건 당 15 젤 준비. - 한번 메 마른 플랫 96-잘 조직 배양 플레이트의 각 음에 콜라겐 젤 혼합물의 혼합, aliquot 50 µ L을 잘. 외부 행 및 열, 사용 하지 않지만 이러한 200 µ L 1의 채우기 x Dubecco ' s 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 건조에서는 젤을 보호 하기 위해. 유해를 콜라겐 수 있도록 2 h 37 °C/5% CO 2 접시를 품 어.
참고: 위 판 직접도 열 분포를 보장 하기 위해 인큐베이터에서 깨끗 한 금속 선반. - 인큐베이션, 다음 오버레이 보충된 M199 x 1의 150 µ L로 젤 (재료의 표 참조) 사용까지 5 일 동안 품 어와.
2. 확장 저장 HUVEC: 하루 1
- 라벨 코트 10 cm 직경 50 µ g/mL fibronectin의 1 mL를 페 트리 접시 1 x PBS에 희석 하 고 10 분에 대 한 실 온에서 품 어
- 해 동 aliquots cryopreserved 주 인간의 탯 줄의 정 맥 내 피 세포 (HUVEC, 1.0 x 10 6 셀) 10 ml M20.
참고: 이전 21을 설명 하 고 낮은 통로에 사용 준비 되어야 한다 HUVEC (< 4 구절). HUVEC 여기 인간의 관상 동맥 내 피 세포로 대체 될 수 있습니다. - 10 ml M20 HUVEC resuspend 및 fibronectin 코팅 접시, 3 일에 미디어 대체 셀, 그리고 문화에 합류 (약 5 일)의 추가 전에 초과 fibronectin 발음 추가.
3. 콜라겐 젤에 HUVEC 단층 배양: 하루 5
- 날 5, HUVEC 문화는 배양 접시에서 표면에 뜨는 발음 하 분리 혈 청 무료 M199의 10 mL와 함께 혈 청에 포함 된 미디어를 멀리 세척.
- M199에 HUVEC 5 mL 0.05 %trypsin / 0.53 EDTA를 추가 하 고 셀 분리 될 때까지 부드럽게 흔들어, 실내 온도에 1-2 분 동안 품 어.
- 분리, 일단 신속 하 게 5 mL M20 페 트리 접시를 헹 구 고 10 mL 튜브에 세포를 포함 하는 미디어 전송.
- 실 온에서 5 분에 대 한 300 x g에서 원심 분리기 샘플 상쾌한 발음, M20의 200 µ L 셀 resuspend 및는 hemocytometer를 사용 하 여 셀.
- 는 M20에서 10 5 셀/mL x 2.0 셀 resuspend, 96 잘 접시 (1.3 단계)에서 젤에 M199 발음 하 고 추가의 resuspended HUVEC (2.0 x 10 4 셀) 100 µ L 각 콜라겐 젤 (1.2 단계) 위의 준비. 추가 3 일 37 °C/5% CO 2 격판덮개 문화.
참고: HUVEC 단층의 무결성 수 수 3 일 후에 의해 확인 실버 질산염이이 단계에서 22 또는 꽉 접합 단백질 23 immunohistochemistry 얼룩. 이 목적에 대 한 추가 젤을 준비 해야 합니다.
4. HUVEC 단층와 환생에 대 한 Monocytes의 절연/정품 인증: 하루 8
- 하루 8에는 M20 발음 monocytes의 추가 하기 전에 각 HUVEC 단층 활성화 미디어는 젤을 오버레이 및 100 µ L 10 ng/mL의 추가 M20 젤 당에 인간 TNFα입니다. 37 °C/5%에서 품 어 공동 2 4 h.
참고: 비-활성화 HUVEC 조건 또한 포함 될 수 있습니다 컨트롤으로 필요한 경우. - 동안 4 h HUVEC 활성화 단계, 격리 monocytes PBMCs 자석 사용 하 여에서 구슬 제조 업체 마다 셀에 대 한 부정적인 선택 기법 ' s 지시. 10 6 PBMCs x 6.5의 최소 monocytes는 일반적으로 PBMCs의 대략 10-15%에 대 한 계정으로 한 조건에 필요한 10 5 monocytes x 3.0을 안정적으로 복구 하려면이 단계에서 사용 해야 합니다.
참고: monocyte 환생 및 거품 세포 형성 이전 monocyte 활성화의 효과 평가 하려면 monocytes는이 단계에서 활성화할 수 있습니다. Monocytes는 해 동된 PBMCs (즉, 저장 된 환자 샘플) 필요한 경우 격리 될 수 있습니다. FACS 정렬 하 여 격리 하는 monocyte 하위 집합 추가 젤 (그림 1)를 위해 준비 될 수 있다.
5. 기본 인간 Monocytes의 환생: 하루 8
- monocyte 환생을 측정, TNFα 포함 된 미디어를 제거 하 고 세척 젤 100 µ L로 두 번을 추가 하 고 미디어를 제거 하 여 M199. 2.0 x 10을 추가 다음 세척, 5 갓 절연 또는 재개 되 고 씻어 cryopreserved PBMCs 또는 10 4 갓 절연 monocytes x 5.0 또는 정화를 100 µ L에서 HUVEC monolayers 하위 집합 monocyte M20. 젤으로 monocytes의 앞으로 환생 있도록 37 ° C, 5% CO 2에서 1 시간에 품 어. 그것은 모든 실험 조건 검사에 대 한 6 우물 수 있도록 최고의.
참고: 환생 및 거품 세포 형성에 헌 혈 청의 효과 평가 하려면 품 어 셀 M20 열 비활성화 기증자 혈 청의 원하는 농도 포함 하 고 조건에 풀링된 인간의 혈 청 제어 됩니다. Monocytes 이외의 백혈구는이 단계에서 추가할 수 있습니다. 특정 지질/지질 종 (예를 들어, HDL, oxHDL)의 영향을 조사 하는 경우 20-50 µ g/mL 지질을 포함 하는 혈 청 자유로운 미디어와 모든 다음 단계를 수행. - 앞으로 환생의 h 1 후 젤 prewarmed 1mm 1 x PBS에 EGTA 100 µ L로 두 번 그리고 한 번 100 µ L를 세척 하 여 비 transmigrated 세포를 수집 M199 (같은 원심 조건), 같은 각 우물에서 supernatants 풀링 얼음에 1.5 mL microcentrifuge 튜브로 실험 상태 (일반적으로 6 우물). 4 ° C, 5 분에 대 한 300 x g에서 비 transmigrated 세포를 원심과 30 µ L 1 x PBS에서 resuspend.
- 셀에서 앞으로 transmigrated 셀의 수를 확인 하는 상쾌한 수집.
- 앞으로 transmigrated 셀의 백분율은 다음과 같이 결정 됩니다:
- 는 씻어 커버 transmigrated 셀 100 µ L 포함 하는 젤 M20 및 추가 48 헤에 대 한 품 어
- 후 48 h는 상쾌한 수집과 100 µ L로 두 번 세척 비 transmigrated 셀 prewarmed 1mm EGTA/PBS, 수집 및 풀링 단계 5.2와 같이 각 조건에서 상쾌한.
참고: 이러한 셀 f에 테스트 수 있습니다 역방향 transmigrated 세포의 표현 형ollowing 표준 cytometry 프로토콜을 얼룩이 지. - 4 ° c, 5 분에 대 한 300 x g 세포를 원심 및 셀 30 µ L 1 x PBS에 resuspend. 셀 하 고 trypan 푸른 얼룩 통해 생존 능력 결정.
- 다음과 같은 방정식을 사용 하 여 역방향 transmigrated 세포의 비율 결정:
참고: 될 것입니다 가능성 앞으로 환생은 앞으로 transmigrated 세포의 총 수 역 환생의 더 정확한 표시를 제공에 대 한 회계 100%. - 분석 현미경, 각 잘을 100 µ L 2% 포름알데히드 (최종 농도)를 추가 하 여는 젤을 수정에 대 한 알루미늄에서 플레이트 커버 호 일 및 분석까지 4 ° C에서 저장. Cytometry에 대 한이 단계에서 셀을 해결 하지 않습니다. 현미경 검사 법 (단원 6) 또는 교류 cytometry (섹션 7) 분석에 대 한 아래 프로토콜 참조.
주의: 포름알데히드는 유독 하 고 부식성; 개인 보호 장비 (PPE)를 사용 합니다. 그러나 주의 해야 포름알데히드를 추가할 때,,이 단계 사용 하는 낮은 농도 때문에 증기 두건에서 필요 하지 않습니다.
6. 거품 세포와 대 식 세포 (기름 빨간 O 얼룩) 현미경 검사 법에 의해 정량
- 는 포름알데히드를 제거 하 고 5 분 동안 50% (v/v) 메탄올과 15 분에 대 한 다음 100 µ L 78% (v/v) 메탄올의 100 µ L로 젤을 씻어
참고: 실험실 벤치에와 클래스 II 생물 캐비닛 안에 수행 될 수 있습니다 얼룩 단계. - 지질 방울 갓 0.2%의 추가 100 µ L에 의해 (w/v) 기름 빨간 O (대 한 자세한 내용은 테이블의 자료를 참조) 실 온에서 1 시간을 위한 얼룩.
- 4 젤을 세척 하 여 제거 초과 얼룩 100 µ L의 78% (v/v) 메탄올, 발음 및 각 워시 후 상쾌한 삭제 된 시간
- Giemsa, 100 µ L로 실 온에서 15 분 증류수에 1시 10분 희석에 대 한 counterstain.
- Giemsa 얼룩을 발음 하 고 젤 물으로 한번 씻어.
- 접시에서 젤을 분리, rim 21 G 바늘을 사용 하 여 바깥쪽, 젤의 가장자리 주위에 직면 하는 경사와 우물.
- 현미경 슬라이드에는 젤을 탑재 펀치 양면 테이프의 2.54 cm x 1.5 cm 스트립에 두 구멍 (6.35 m m 직경). 표준 현미경 쪽으로 테이프를 수정 하 고 위에서 보호 코팅 제거.
- 추가 전송 피 펫을 사용 하 여 테이프에 구멍에 물 한 방울. 핀셋을 사용 하 여, 부드럽게 전송 젤 크기 1.5 유리 coverslip 커버 테이프에 구멍을. 테이프에 그것을 준수 하는 coverslip을 살짝 누릅니다.
- 40 X 목표는 거꾸로 한 현미경에 사용 하는 미분 간섭 명암 밝은 분야 현미경 검사 법으로 검사.
- 가져와 40 X에 초점으로 HUVEC 단층 확대 및 스크롤 '으로 ' 젤, 젤의 전체 깊이 걸쳐 세포/거품 세포를 계산. 세 가지 필드 보기 가능한 가장자리 효과 최소화 하기 위해 젤의 가장자리에서 비슷한 거리에 있는 반복 합니다. 이렇게 하면 젤 깊이 세 지역 사이 일관.
참고: 점수 젤 셀으로 어느 거품 세포 (포함 된 셀으로 정의 된 > 1/3의 기름 빨간 O로 그들의 세포질 지질 방울 스테인드) 또는 슬라이드 ( 그림 2)에 장착의 2 시간 내 대 식 세포. 거품 세포 형성 마이그레이션된 셀의 총 수를 기준으로 거품 세포의 백분율로 표시 하 고 보기의 3 분야에서 중간 계산 조건, 당 6 젤에 대 한 검사 조건 당 18 측정의 중간값 따라서 표현 된다. 전형적인 실험에서 원시 세포의 예는 표 2에 표시 됩니다.
참고: 셀 폼 셀 vs macrophage 현미경 검사 법에 의해 분류 주관적 이며 따라서 탐정 종속 될 수 있습니다. 임상 연구에서 어디 실험 시간의 연장된 기간 동안 수행 됩니다, 단일 수 사관에 의해 멀게 수행 될 모든 계산에 대 한 중요 하다. 거품 세포와 젤에서 세포의 예는 그림 2에 제공 됩니다.
- 가져와 40 X에 초점으로 HUVEC 단층 확대 및 스크롤 '으로 ' 젤, 젤의 전체 깊이 걸쳐 세포/거품 세포를 계산. 세 가지 필드 보기 가능한 가장자리 효과 최소화 하기 위해 젤의 가장자리에서 비슷한 거리에 있는 반복 합니다. 이렇게 하면 젤 깊이 세 지역 사이 일관.
7. Flow Cytometry 셀 Transmigrated 분석
- phenotypically 거품 세포와 대 식 세포 transendothelial 마이그레이션 다음 특성, prewarmed는 37 ° C 1 mg/mL 콜라에 M199에 희석 D의 100 µ L을 추가 하 여에서 젤 소화 고 37 °C/5% CO 2에서 20 분 동안 품 어 각.
참고:도 열 분포를 보장 하기 위해 인큐베이터에서 깨끗 한 금속 선반에 직접 96 잘 접시를 놓습니다. - 인큐베이션, macerate 200 µ L 피 펫 팁을 사용 하 여 젤 하 고 37 °C/5% CO 2에 추가 20 분 동안 품 어.
- 한번 완벽 하 게 소화, 35 µ m 나일론을 통해 소화 복제 젤 얼음에 뒤덮인된 FACS 튜브 메쉬 필터 및 수영장 세척 한 번 FACS와 세척 (재료의 표 참조) 4 ° C에서, 300 x g. Resuspend FACS의 100 µ L 셀 워시
- CD45, 라이브/죽은 세포 마커 및 표준 흐름 cytometry 프로토콜을 사용 하 여 관심사의 표면/세포내 phenotypic 또는 기능 마커 fluorophore 활용 된 항 체 특정 결과 셀을 품 어.
참고: 컨트롤 준비 적절 한 fluorophores Ig 보상 비즈를 사용 하 여 보상에 대 한 관. 또한 cytospinning에 의해 추출 된 세포 면역 형광 검사 현미경 검사 법에 대 한 유리 슬라이드에 수집 수 있습니다. 또는, 우리는 성공적으로이 프로토콜을 사용 하 여 이미징 cytometry 통해 평가 대 한 셀을 수집. - 교류 cytometer를 사용 하 여 셀을 습득 하 고 수행 하는 필요에 따라 보상.
참고: 거품 세포/세포 가벼운 살포 속성을 사용 하 여 개별 인구를 형성 하지 않을 수 있습니다 하 고 크기와 모양에 상당히 다를 수 있습니다, 설정 자유 앞으로 분산형 (FSC)와 측면 살포 (SSC) 빌 게이츠와 같이 모든 마이그레이션된 셀을 캡처 < 강력한 클래스 "xfig" = > 그림 3A. - 수집, 다음 흐름 cytometry 소프트웨어를 사용 하 여 데이터 분석을 수행. 마이그레이션된 셀을 확인 하려면 먼저 그림 3B와 같이 라이브/죽은 표식에 대 한 부정으로 셀을 선택 합니다. 그런 다음 단일 셀 차별 SSC-지역 대 SSC 높이에 표시 된 셀 주위에 꽉 게이트를 만들어서 수행.
- CD45 선택 + 세포와 세포/거품 세포 이들은 FSC/SSC 플롯에 마이그레이션된 셀의 주요 인구 문.
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Representative Results
Monocyte 환생을 측정
Monocytes는 그림 1에 설명 된 대로 모델에 추가 되 고 6 젤 각 조건에 대 한 준비가. Monocytes 기증자 당 6 젤에 대 한 (즉, 젤 6 젤 당 104 monocytes x 5.0 = 기부자 당 105 monocytes x 3.0) 포함 하는 필요한 혈 청/절연 지질 M199 미디어의 600 µ L의 최종 볼륨을 resuspended. 셀 (즉, 젤 당 100 µ L = 5.0 x 104 monocytes) 젤에 aliquoted 및 monocyte 환생을 촉진 하기 위하여 1 h 대 위의 incubated 있습니다. 환생, 다음 비 transmigrated 셀 위와 같이 계산 됩니다. 이 예에서는 1.5 x 104 비 transmigrated 세포 발견 했다. 앞으로 환생의 비율이 5.4 단계에서 설명한 수식을 사용 하 여 결정 되었습니다.
외피의 48 h, 다음 104 역 transmigrated 셀 x 3.6 위에서 발견 했다. 역방향 환생의 백분율 단계 5.8에서에서 수식을 사용 하 여 결정 되었습니다.
정방향 및 역방향 환생 monocyte 환생 능력 실험 사이 변경 여부를 확인 하는 적절 한 통계적 테스트 및 monocytes 여러 독립적인 기증자에서 준비를 사용 하 여 조건을 사이 비교 될 수 있습니다. 조건입니다.
거품 세포 형성 평가
명시 야 현미경 검사 법
산화 지 단백질 monocyte 파생 된 거품 세포 형성에서 체 외에서 unoxidized 지질15에 비해 촉진으로 알려져 있습니다. 여기 우리는 일반적으로 기존의 거품 세포 유도 모델, 거품 세포 형성을 유도 하는 데 사용 하는 oxLDL로 monocytes의 치료 transendothelial 마이그레이션 및 거품 세포 형성의이 모델에 monocyte 파생 된 거품 세포 형성을 향상 확인 네이티브 한 LDL에 비해 M199 포함 50 µ g/mL 네이티브 또는 CuSO4incubated 젤에서 monocyte 환생 및 거품 세포 형성에 따라-LDL 산화 (단계 5.1, 그림 1참조), 세포는 현미경에 의해 분석 되었다. 거품 세포와 대 식 세포의 대표적인 실험에서 관찰의 예는 그림 2에 표시 됩니다. 셀은 HUVEC 단층에 집중 하 고 점차적으로 젤으로 깊은 초점으로 젤, 당 세 개의 다른 필드에 포함 되었습니다. 셀 수는 네이티브 LDL 산화에 대 한 응답에 형성 하는 거품 세포의 비율을 비교 하는 하나의 기증자에 대 한 표 2 와 같이 각 기증자에 대 한 기록 됩니다. 데이터를 집계 하는 n에서 = 12 독립 수 확인이 모델에서 oxLDL로 monocytes의 인큐베이션 monocytes 네이티브 LDL 또는 M199 미디어 혼자 인 큐베이 팅 하는 조건 보다 더 많은 거품 세포 형성을 유도 하 그림 4 에 표시 됩니다.
Cytometry
마이그레이션된 세포의 표현 형을 결정 하는 세포 소화 젤에서 추출 하 고 표준 흐름 cytometry 패널을 사용 하 여 표시. 셀은 표시 라이브/죽은 세포 마커 및 항 체 특정 CD45 및 표준 흐름 cytometry 프로토콜을 사용 하 여 다른 표면 표현 형 마커. 보상 제어는 또한 표준 교류 cytometry 기법에 의하여 완전 한 보상에 대 한 준비 되어야 한다. 마이그레이션된 셀 10 독립적인 실험의 대표 작에 그림 3 에서 같이 문이 있다. 라이브 셀 라이브/죽은 세포 생존 능력 분석 실험 (그림 3B)를 사용 하 여 문이 되 고 남자는 단일 세포 분석 (그림 3C)에 의해 제외 됩니다. 셀으로 CD45 문이 다음은+ HUVEC를 제외 하려면 (이 셀은 CD45-, 그림 3D). 주요 인구는 다음 앞으로 분산형/사이드 분산형 차별 (그림 3E)에 의해 문이 관심의 수용 체의 평균 형광 강도 (MFI)에서 1 (FMO)을 뺀 어느 형광 비교 결정 됩니다 또는 isotype 제어 ( 그림 3 층) 식 (ΔMFI) 또는 긍정적인 세포의 백분율을 결정 합니다.
그림 1 : 한 생체 외에서 monocyte 환생 및 거품 세포 형성의 모델. (A) PBMC (B) 총 monocytes 또는 (C) FACS 정렬 monocyte 하위 유형 I 섬유 콜라겐 젤 96 잘 접시에 형성 및 활성화 기본 인간의 배꼽의 단층으로 중첩 추가 됩니다 정 맥 내 피 세포 (HUVEC), 누구의 무결성 실버 (D얼룩에 의해 사정 될 수 있습니다) 수 (E) transmigrate 1 h 혈 청 또는 미디어를 포함 하는 지질 존재에 대 한. 비 transmigrated 셀 계산 됩니다 (F) 젤은 알을 품 더 48 h에 대 한와 같은 혈 청/지질 미디어를 포함 하 고. 부 화, (G)에 따라 역 마이그레이션된 셀 계산 됩니다 및 젤에 대 식 세포 대 거품 세포의 비율에 의해 결정 됩니다 (H) 단계 대조 현미경 다음 오일-레드와 얼룩 또는 마이그레이션된 세포의 표현 형에 의해 결정 됩니다 (나) cytometry. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 거품 세포와 대 식 세포에서의 예는 생체 외에서 monocyte 환생 및 거품 세포 형성의 모델. 아닌거품 세포 (흰색 화살표)로 득점 하는 전지와 Giemsa 얼룩 세포와 기름 빨간 O 얼룩을 시각화 하기 위해 지질 방울 거꾸로 사용 하 여 추출 된 젤의 단계 대조 현미경 검사 법에 의해 결정으로 시각화 하 후 세포 (검은 화살표)의 필자 예 40 X 확대 한 현미경 눈금 막대 = 20 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : Transmigrated 세포의 전략 cytometry에 의해 게이팅. Transmigrated 셀 젤에서 세포의 추출 다음 cytometry phenotypically 특징입니다. 셀 (A) 금감위/SSC, 라이브 셀 (B), (C) 단일 셀, CD45 (D)에 의해 문이+(E) 금감위/SSC와 (F) 표현의 수용 체 isotype 또는 형광 (FMO) 컨트롤 마이너스에 비해. 관심의 수용 체의 표현 의미 형광 강도 (MFI)으로 정의 되며 isotype의 수준에 관하여 표현. ΔMFI 얼룩 (MFI) isotype/FMO 제어 (MFI) 마이너스 =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : Monocyte 파생 된 거품 세포 형성에 것 추가 oxLDL 및 LDL의 효과. 거품 세포 형성 어디 단일 기증자 로부터 monocytes 미디어 (M199)와 함께 알을 품는 50 µ g/mL unoxidized 저밀도 지 단백질 (LDL) 또는 구리 (II) 황산 염 산화 LDL (oxLDL) 젤 후 환생에 추가 조건 하에서 결정 됩니다. 12 가지 사이트에 대 한 수 표시 됩니다. 거품 세포 총 마이그레이션된 세포의 백분율로 표현 됩니다. 메디아와 interquartile 범위 막대 그래프에 표시 되 고 비교 비패라메트릭 맨-휘트니 U 테스트를 사용 하 여 만들어졌다. p < 0.001, * * * p < 0.0001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 시 약 | [주식] | [최종] | 60 젤 (µ L)에 대 한 볼륨 |
| NaOH | 100 m m | 35.7 m m | 1071 |
| M199 | 10 배 | 0.71 x | 213 |
| AcCOOH | 20 mM | 4.58 m m | 687 |
| 콜라겐 | 5 mg/mL | 1.71 mg/mL | 1029 |
| 총 볼륨 | - | - | 3000 |
표 1: 유형 I 섬유 콜라겐 젤 준비
| LDL | oxLDL | |||||||
| 젤 | 개수 | 거품 세포1 | 마이그레이션된 셀1 | 거품 세포 (%)2 | 거품 세포1 | 마이그레이션된 셀1 | 거품 세포 (%)2 | |
| 1 | 1 | 5 | 44 | 11.4 | 26 | 55 | 47.3 | |
| 2 | 5 | 27 | 18.5 | 10 | 23 | 43.5 | ||
| 3 | 11 | 52 | 21.2 | 19 | 39 | 48.7 | ||
| 2 | 1 | 5 | 34 | 14.7 | 9 | 31 | 29 | |
| 2 | 14 | 50 | 28 | 32 | 55 | 58.2 | ||
| 3 | 5 | 37 | 13.5 | 19 | 37 | 51.4 | ||
| 3 | 1 | 10 | 37 | 27 | 28 | 52 | 53.8 | |
| 2 | 7 | 33 | 21.2 | 11 | 31 | 35.5 | ||
| 3 | 7 | 38 | 18.4 | 28 | 53 | 52.8 | ||
| 4 | 1 | 9 | 44 | 20.5 | 14 | 33 | 42.4 | |
| 2 | 7 | 33 | 21.2 | 22 | 47 | 46.8 | ||
| 3 | 11 | 50 | 22 | 11 | 30 | 36.7 | ||
| 중간 거품 세포 (%) | 20.8 | 47 | ||||||
| 평균 거품 세포 (%) | 19.8 | 45.5 | ||||||
표 2: LDL vs oxLDL 치료 따르는 monocyte 파생 된 거품 세포의 비교에서 원시 셀 계산. 1 셀 젤에 시야 당 계산합니다. 2 거품 세포의 비율 = 거품 개수/총 마이그레이션된 셀 계산 x 100. * 데이터는 단일 기증자 로부터 monocytes를 사용 하 여 한 실험의 대표
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Discussion
여기에 설명 된 프로토콜 monocyte 환생 및 거품 세포 형성을 결합 하 여 인간의 임상 동료에서 monocytes의 atherogenicity를 평가 하기 위한 다양 하 고 생리 적으로 관련 된 방법을 제공 합니다. 이 모델은 거품 세포 형성에 monocyte 환생의 효과 고려 하 고 이외에 고유의 역 환생6 의 측정을 허용 한다 거품 세포 형성의 다른 방법을 통해 장점을 제공합니다 버 외 인 요인의 존재 여부에 거품 세포로 성숙 하 릇 monocytes의 또한, 내 피 활성화의 역할은 또한 고려 거품 세포 형성14와 관련 된 지질 종의 그 내 피 활성화 upregulates 산화를 같이 우리. 마지막으로, 출구 (패 회귀와 연결 된 속성)을 받아야 하는 monocytes의 표현 형 계량 하 고 현미경 및 흐름 cytometry 특징 될 수 있습니다.
젤으로 환생의 3 차원 특성 식별 및 거품 세포 또는 대 식 세포 transmigrated 세포를 득점 어려울 수 있습니다 셀 transmigrate 젤19에서 다른 수준으로. 거품 세포의 식별을 돕기 위해 신선한 기름 빨간 O 얼룩 항상 사용 해야 합니다. 그것은 또한의 질병 상태 다른 비보 전 또는 생체 외에서 조건 젤에 monocyte 환생을 변경할 수 있습니다. 라이브 셀 이미징 사용 에이즈에 감염 된 개인에서 monocytes에 얕은 젤에서 다른 속도로 감염 되지 않은 개인19보다 transmigrate 하는 경향이 식별 했습니다. 또한, 거품 세포 형성 이므로 젤에 적은 monocyte 운동 성 연관 셀 셀에 비해 특정 z 섹션에 원형에서 HIV에 감염 되지 않은 개인으로 상대적으로 직선에서 이동 하는 경향이 이동 하는 경향이 있는 젤의 하단입니다. 이러한 연구 결과 발생 증가 monocyte atherogenicity와 관련 된 다른 질병 상태에서 인간의 환자 샘플을 사용 하 여 실험에서 발생 하는 비슷한 현상의 가능성.
교류 cytometry 기반 분석을 수행할 때 라이브/죽은 셀 표식 (그림 4B)를 사용 하 여 생존 능력을 평가할 때 복구 된 세포 인구에 있는 죽은 세포의 상당한 비율을 관찰 하는 것이 일반적입니다. 이 세포는 주로 CD45- HUVEC 콜라겐 소화/단식 단계에서 손상 된 콜라겐 매트릭스에서 monocyte 파생 된 세포를 추출 하는 데 필요한. 이 과정 HUVEC 단층에 특히 가혹한 하지만 형질에 해로운 transmigrated 셀.
이 모델 달리 다른 사람들 로부터 아무런 인위적으로 산화 외 인 지질 드라이브 monocyte 파생 된 거품 세포 형성을 문화 미디어에 필요 합니다. 대신, 거품 세포 형성이 분석이 결과에서 혈 청 임상 견본에서 용 해 요인 개별 효과 대 한 평가 될 수 있도록 문화 미디어에 의해 좌우 된다. 이와 같이, 우리가 나타났습니다 젊은 HIV 감염19 또는 노인 HIV에 감염 되지 않은20 개인에서 혈 청으로 제어 monocytes의 인큐베이션 거품 세포 형성을 촉진는 수용 성 요소 수 독립적으로 홍보 하지 거품을 나타내는 세포 형성입니다. 분석 결과 수용 성 구성 요소에 의해 영향을, 풀링된 인간 혈 청의 단일 일괄 처리를 사용 해야 합니다 다른 개인에서 파생 하는 monocytes의 atherogenic 속성의 고유한 차이 결정 하기 위한 실험 표준화 하기 위해 제어 조건입니다. 이 분석 결과 특정 지질 종 임상 샘플 (그림 3)에서 역할을 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다. 예를 들어 우리가 알려진된 지질 부전24 개인에서 고밀도 지 단백질 또한 거품 세포 형성을 촉진과 같은 고립 된 지질 종을 포함 하는 미디어 monocytes의 그 외피를 나타났습니다. 이 경우에 하나의 건강 한 개인 또는 개인의 그룹에서 monocytes 혈 청 또는 시험 과목에서 파생 된 혈 청 요인의 존재에 사용할 수 있습니다. 따라서,이 모델을 거품 세포 형성에 가용성과 세포질 구성 요소 개별 효과 대 한 특정 질문에 대 한 수 있습니다.
이 분석 결과 낮은 통로 숫자 기본 관상 동맥 세포의 많은 수를 취득에 실질적인 어려움으로 인해 관상 동맥 피 내 막의 모델 HUVEC를 사용 합니다. 그러나 우리 인간의 관상 동맥 내 피 세포 또는 HUVEC를 사용 하 여 분석 실험에서 결과 비교 하 고 monocyte 환생 또는 거품 세포 형성 (데이터 표시 되지 않음)에 약간의 차이 관찰이 시스템에서 HUVECs를 사용 하 여 나타내는 한 허용 대체 하십시오입니다. 거품 세포의 수동 계산 연산자 바이어스 소개 수 있습니다 그것은이 모델에 제한 요소 이다. 따라서, 모든 샘플 슬라이드에 장착 된 바이어스의 가능성을 제거 하기 위해 운영자에 게 멀게 될 해야 합니다. 그러나 우리,, 거품 세포 형성 및 이미징 cytometry 수동 계산 하 여 측정을 비교 하 고 이러한 방법은 비슷한 결과19줄 발견. 이 모델의 주요 한계는 monocyte 접착 및 환생 생리 혈액 흐름에서 에 비보와관련 된 전단 세력의 부재에서 발생 이다. 우리는 전단 흐름 것 이다 주로 영향을 미칠 monocyte 환생 및 매트릭스; 내 하지 후속 거품 세포 형성 가설 그러나,이 결과이 분석 결과를 해석할 때 고려 되어야 한다. 이 분석 결과 또한 시스템;의 생리 적 한계는 monocyte 파생 된 거품 세포 형성에 부드러운 근육 세포의 영향을 모델링 하지 않습니다. 그러나, 이것은 다른 질병 국가 사이 비교 monocytes의 개별 atherogenic 잠재력을 허용 하는 모든 조건에 일치입니다.
요약 하자면,이 모델 monocyte 환생 및 다른 질병 국가 비보 전인간의 샘플에서 거품 세포 형성을 측정 하는 다양 하 고 순수 관련 방법 제공. 이 모델은 더 monocyte atherogenicity가 비만25,26 당뇨병 및 만성 신장 등 CAD의 증가 위험과 관련 된 조건에서 거품 세포 형성 monocytes의 성향을 평가 하기 위한 응용 프로그램 질병27 따라서,이 모델 또한 셀룰러 환생 질병 병 인 영향을 미칠 수 있는 동맥 경화 이외 질병 상태에 사용 하기 위해 최적화 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자는 기꺼이이 모델의 이전 반복의 개발에 그들의 중요 한 역할에 대 한 교수 윌리엄 뮬러 박사 클레어 Westhorpe의 작품을 인정합니다. 저자 또한 monocyte의 정렬에 대 한 AMREP Flow Cytometry 코어를 감사 하 고 싶습니다 하위 집합 및 알프레드 병원 감염 질병 단위 임상 연구 일부 연구에 대 한 HIV + 개인의 채용에 대 한 간호사. 저자는 기꺼이 버넷 연구소를 받은 빅토리아 운영 인프라 지원 프로그램의이 작품에 기여를 인정 합니다. TAA는 RMIT 대학 담당-장관의 박사 장학금에 의해 지원 됩니다. 이 작품은 NHMRC 프로젝트 그랜트가 아에 게 수 여 하는 1108792에 의해 지원 되었다. TK에 의해 지원 됩니다 NIH 부여 NIH K08AI08272, NIH/NCATS 그랜트 # UL1TR000124.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gel preparation reagents | |||
| NaOH | Sigma-Aldrich | 221465-500G | 0.1 M NaOH diluted in H20 |
| 10x M199 | Sigma-Aldrich | M0650 | |
| AcCOOH | Sigma-Aldrich | 695092-100ML | 20 mM Acetic acid diluted in H20 |
| Cultrex Bovine Collagen I | R&D Systems | 3442-050-01 | Type I Fibrous Collagen |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture | |||
| M199 | Life Technologies | 11150-059 | M199 media containing Earle's salts, L-glutamine and 2.2 g/L Sodium Bicarbonate. Media supplemented with 100 µg/mL L-glutamine and 100 U/mL penicillin/streptomycin |
| M20 | Supplemented M199 containing 20% heat-inactivated pooled or donor serum. Individual lipid species such as LDL can be added to M199. |
||
| HUVEC | Primary human umbilical cord endothelial cells (HUVEC) can be isolated from umbilical cords donated with informed consent and ethics approval. Isolated HUVEC may also be purchased commercially. | ||
| Human coronary artery endothelial cells | Primary human coronary artery endothelial cells can be isolated from arteries donated with informed consent and ethics approval. Isolated cells may also be purchased commercially. | ||
| EDTA | BDH Merck | 10093.5V | Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) - 0.5 M, pH 8.0 |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889-500G | Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) - 1 mM, pH 8.0 |
| 0.05% trypsin EDTA | Gibco | 25300-054 | 0.05% trypsin/0.53 EDTA (1X) |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | L-glutamine (200 mM) |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | Penicillin/streptomycin (10,000 units/mL Penicillin and 10,000 µg/mL Streptomycin) |
| New born calf serum | Gibco | 16010-142 | New born calf serum: New Zealand origin |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1056-1MG | Fibronectin - 50 µg/mL aliquots prepared and stored |
| PBS (1x) | Gibco | 14200-075 | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (10x): Dilute to 1x with sterile H20 |
| 0.1% TNF | Gibco | PHC3015 | Recombinant human TNF - Reconstituted in H20 and stored in 10 µg/mL aliquots |
| Low-density lipoprotein | Merck Millipore | LP2-2MG | Low-density lipoprotein (LDL) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopy | |||
| 1 or 2% formaldehyde | Polysciences | 4018 | 1 or 2% formaldehyde diluted with sterile H20 |
| 50% and 78% methanol | Ajax Finechem | 318-2.5L GL | 50% or 78% v/v methanol, diluted with H20 |
| Oil Red O stain | Sigma-Aldrich | O0625-25G | Dilute to 2 mg/mL in 22% 1M NaOH and 78% (v/v) methanol |
| Microscope slides | Mikro-Glass | S41104AMK | Twin frosted 45 degree ground edge microscope slides (25 X 76 mm) |
| Cover slips | Menzel-Gläser | MENCS224015GP | 22 x 40 mm #1.5 size glass cover slips |
| Double-sided tape | 3M Scotch | 4011 | Super strength exterior mounting tape (25.4 mm x 1.51 m) |
| Giemsa stain | Merck Millipore | 1.09204.0500 | Giemsa's azur eosin methylene blue solution (dilute stock 1:10 in H20) |
| Hole punch | Hand-held single hole punch (6.35 mm punch) | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flow cytometry | |||
| Collagenase D | Roche Diagnostics | 11088858001 | Collagenase D diluted in M199 media to 1 mg/mL |
| 35 µm nylon mesh capped polystyrene FACS tubes | BD Biosciences | 352235 | 35 µm nylon mesh capped polystyrene FACS tubes |
| Live/Dead Fixable Yellow Dead Cell stain | Life Technologies | L34959 | Live/Dead Fixable Yellow Dead Cell stain |
| FACS wash | Prepare by mixing 1 X PBS-, 2 mM EDTA and 1% New born calf serum | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasticware | |||
| 96 well plate | Nunclon | 167008 | Delta surface flat-bottomed 96 well plate |
| 10 cm Petri Dish | TPP | 93100 | Sterile 10 cm Petri dish |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | Eppendorf | 0030 125.150 | Eppendorf tubes |
| Transfer pipette | Samco Scientific | 222-20S | Sterile transfer pipette (1 mL, large bulb) |
References
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