Summary
Les auteurs décrivent un protocole visant à mesurer la transmigration de monocytes dans l’ensemble des monocouches endothéliales humaines et leur maturation ultérieure en cellules spumeuses. Cela fournit une méthode polyvalente pour évaluer les propriétés athérogènes des monocytes isolés de personnes atteintes de différentes maladies et d’évaluer des facteurs dans le sang qui peut améliorer cette propension.
Abstract
Coronaropathie (CP) est des principales causes de morbidité et de mortalité dans le monde. L’athérosclérose, une importante cause de CAD, est initiée par la transmigration des monocytes immunitaires innées vers les sites inflammatoires des lipides déposés appelées veines grasses, qui sont présents dans les parois artérielles du milieu aux grandes artères. La principale caractéristique de pathogène des lésions à ce stade précoce de l’athérosclérose est la maturation des monocytes qui migrent dans les artères pour former les cellules spumeuses ou macrophages chargés de lipides. De nombreux témoignages appuient l’hypothèse de risque d’athérosclérose est porté par des affections inflammatoires chroniques qui accompagnent les maladies comme l’arthrite rhumatoïde et le VIH, ainsi que vieillissement général, et que ce risque est prédite par les monocytes activation. Modèles murins fournissent une bonne plate-forme pour enquêter sur le rôle des monocytes dans l’athérogenèse in vivo, ils nécessitent une modification génétique du métabolisme du cholestérol naturel et altération drastique des diètes de souris normales et ont peu de pertinence pour l’étude des influences athérogènes des maladies comorbides humaine. Cela nous motivés pour développer un modèle humain in vitro permettant de mesurer le potentiel athérogène des monocytes isolés de personnes atteintes de maladies déterminées. Actuellement, les modèles humains in vitro limitent qu’ils évaluent la formation des cellules monocytes transmigration et de la mousse dans l’isolement. Nous décrivons ici un protocole dans lequel monocytes isolés du sang de patients transmigrer dans les cellules endothéliales humaines dans une matrice de collagène de type 1, et leur propension à se transforment en cellules spumeuses en présence ou en absence de lipides exogènes est mesurée. Le protocole a été validé pour l’utilisation des monocytes humains purifiée à partir d’individus infectés par le VIH et les personnes âgées de VIH non infecté. Ce modèle est polyvalent et permet la formation des cellules monocytes transmigration et de la mousse à évaluer à l’aide d’un microscope ou écoulement cytometry comme permettant l’évaluation des facteurs athérogènes présentes dans le sérum ou le plasma.
Introduction
Transmigration de monocytes est une étape cruciale dans le développement de la plaque athéromateuse qui peut conduire à des thromboses, accidents vasculaires cérébraux et infarctus du myocarde. Les plaques d’athérome se développent à partir des stries gras, généralement présents sur les sites de faible irrigation sanguine oscillatoire dans le milieu de grosses artères, où les lipides déposés contribue à l’activation endothéliale et localisé l’inflammation1. Monocytes sont recrutés aux cellules endothéliales en stries gras par l’intermédiaire de protéines chimiotactiques monocyte (tels que CCL2) et transmigrer dans l' intima2. Suite de transmigration, monocytes peuvent former des macrophages athérogènes, chargées de lipides appelés cellules spumeuses suite à l’absorption de lipides, synthèse des lipides, régulation négative de l’efflux de cholestérol ou une combinaison de ces facteurs. Monocytes peuvent également accumuler des lipides dans la circulation et ont un phénotype « mousseux », éventuellement prédisposant cellules de mousse cellule formation3,4. Cellules spumeuses sont la caractéristique déterminante des traînées grasses et les plaques d’athérosclérose précoce et leur formation est influencée par les lipides et les médiateurs inflammatoires5. Alternativement, les monocytes ont la capacité d’inverser transmigrer de l’artère dans la circulation sanguine6, éliminant ainsi les lipides de l’intima et intérimaire à maintenir la santé de l’artère.
Déterminer la propension des monocytes à transmigrer dans l’endothélium artériel et cellules de mousse de forme dans l’intima, ou faire marche arrière transmigrer et transporter les lipides hors de la plaque, sont une condition essentielle pour comprendre le rôle de l’activation des monocytes en augmentant risques athérosclérose. Des modèles de souris de CADs telles que l’athérosclérose sont importants à élucider en temps réel en vivo informations sur le développement de la plaque gras strie/athérosclérose. Cependant, ces modèles nécessitent une modification génétique du cholestérol naturel traitement des capacités de ces animaux généralement couplée avec des changements drastiques dans le régime alimentaire (par exemple, le modèle de régime ApoE-/-type occidental)7,8, ainsi, induisant l’accumulation des lipides en circulation non physiologiques niveaux qui stimulent le développement plaque. Ces modèles peuvent ont peu de pertinence aux conditions humaines inflammatoires chroniques tels que l’infection par le VIH qui ne sont pas associés à augmenté en circulation cholestérol ou niveaux de lipoprotéines de basse densité (LDL). En outre, les différences dans la biologie de monocyte entre les humains et les souris font les tests immunologiques questions concernant la pertinence des sous-populations des monocytes (telles que les monocytes intermédiaires (CD14++CD16+))9 difficile. Ceci est important lorsque l'on étudie les mécanismes conduisant les maladies cardiovasculaires comme intermédiaire monocyte comtes prédisent indépendamment des complications cardiovasculaires10,11. Parmi les essais pour mesurer de manière séquentielle ou l’autre formation des cellules monocytes transmigration ou de la mousse dans l’isolement, aucun essai in vitro n’a été validé pour quantifier les deux aspects de l’athérogénèse précoce en utilisant les mêmes cellules de cohortes cliniques. Transwell modèles utilisent un système à deux chambres Boyden modifié par lequel les cellules sont chargés dans la chambre supérieure et transmigrer au-delà d’une barrière en plastique poreux ou une monocouche de cellules dans une chambre inférieure qui contient généralement des médias avec chemoattractant12 , 13. bien que largement utilisée pour analyser la transmigration des leucocytes, ces modèles n’intègrent pas généralement une couche qui représente l’intima, résultant dans des cellules réincarnés migrer vers la solution et ne permettent pas la mesure de la cellule mousse formation ou transmigration inverse des mêmes cellules. À l’inverse, les modèles de formation de mousse cellulaire ne tiennent pas compte pour toute modification induite par la transmigratory de monocytes ou effets d’activation endothéliale qui est appelé à contribuer à mousse cellulaire formation14. En outre, ces systèmes induisent mousse la formation des cellules de macrophages respectés plaques de culture cellulaire par l’ajout de concentrations saturantes d’exogène, LDL oxydées (LDLOx)15,16, un inducteur de la clé de formation de mousse de cellules. LDL utilisé dans ces modèles est souvent oxydé par des procédés non physiologiquement-pertinents tels que CuSO4 traitement17, par conséquent, questionner l’importance physiologique des études à l’aide de ces modèles.
Nous décrivons ici une analyse qui quantifie la transmigration de monocytes et de la formation de cellules de mousse des cellules mêmes qui ne nécessite pas l’ajout de LDLOx exogène, donc meilleure modélisation du rôle des monocytes dans la formation de cellules de mousse. Ce modèle a été développé par le professeur William Muller (Northwestern University, Chicago)18et a été encore affiné dans notre laboratoire pour évaluer ex vivo l’athérogénicité des monocytes isolés sous non activation conditions émanant de particuliers sous-jacents des conditions inflammatoires accompagnant les maladies comme le VIH infection19 ainsi que le vieillissement20, qui sont associés à une augmentation du risque de l’athérosclérose. Ce modèle fournit également une plate-forme pour répondre à des questions biologiques fondamentales concernant la propension des sous-ensembles différents monocyte forme mousse cellules20, l’influence de l’activation endothéliale par les cytokines comme le TNF sur la formation de cellules de mousse14 et les propriétés migratoires des monocytes telles que la profondeur et la vitesse de la transmigration en gels19. En outre, formation des cellules monocytes transmigration et de la mousse peut être quantifiée à l’aide de la microscopie standard, vivre l’imagerie cellulaire, cytométrie en imagerie et cytométrie en flux, par conséquent, fournissant une méthode polyvalente afin d’évaluer le rôle des monocytes dans l’athérogenèse.
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Protocol
Remarque : toutes les expériences à l’aide d’échantillons biologiques humains ont été effectués avec l’approbation de l’éthique de la Commission d’éthique humaine Alfred Hospital, Melbourne. Toutes les expériences ont été effectuées dans les armoires de la sécurité biologique de classe II, sauf si précisé. " Prewarmed " se rapporte aux réactifs chauffés à 37 ° C dans un bain d’eau.
1. préparation de Type I fibreux collagène Gels : jour 1
- Prepare polymérisé gels collagène en ajoutant séquentiellement et en mélange 35,7 mM NaOH, 0,71 x M199, acide acétique 4,58 mM et 1,71 mg/mL fibreux du collagène type I dans un polystyrène de 5 mL tube selon le tableau 1.
Remarque : Veiller à ce que le collagène est bien mélangé par pipetage doucement et descendre 5 fois afin d’empêcher la formation de collagène ' poches ' dans le mélange de gel. Préparer des gels de 4-6 par la condition de test pour la microscopie ou 15 gels par la condition de test pour la cytométrie. - Une fois bien mélangé, aliquote 50 µL du mélange de gel de collagène dans chaque puits d’une plaque 96 puits à fond plat stérile de vitroplants. Ne pas utiliser les lignes et les colonnes à l’extérieur, mais remplir ces 200 µL de 1 x Dubecco ' phosphate s solution saline tamponnée (PBS) pour protéger les gels contre la dessiccation. Incuber les plaques à 37 °C/5% CO 2 pendant 2 h permettre le collagène polymériser.
Remarque : Placer les plaques directement sur les grilles métalliques propre à l’incubateur pour assurer la répartition égale de la chaleur. - Après l’incubation, superposer les gels avec 150 µL de 1 x M199 complétée (voir Table des matières) et incuber pendant 5 jours jusqu'à utilisation.
2. Expansion des Stored HUVEC : jour 1
- Label et manteau un diamètre de 10 cm boîte de Pétri avec 1 mL de 50 µg/mL la fibronectine dilué dans du PBS de x 1 et incuber à température ambiante pendant 10 min.
- Dégel aliquotes de cryoconservés ombilical humain primaire de la veine des cellules endothéliales (HUVEC, 1,0 x 10 6 cellules) dans 10 mL M20.
NOTE : HUVEC doit être préparé comme décrit précédemment 21 et utilisé dans un certain nombre de passage bas (< passage 4). HUVEC peut-être être remplacé par des cellules endothéliales humaines coronarienne ici. - Resuspendre HUVEC dans 10 mL M20 et ajouter au plat enduit la fibronectine, aspirer les excès fibronectine avant l’addition de cellules et de la culture à confluence (environ 5 jours), remplaçant les médias le jour 3.
3. Mise en culture monocouche HUVEC sur Gels collagène : jour 5
- le jour 5, détacher HUVEC par aspirer le surnageant de la boîte de Pétri de culture et emportant les milieux contenant du sérum avec 10 mL de milieu sans sérum M199.
- Ajoute 5 mL 0,05 % trypsine/0,53 EDTA dans M199 HUVEC et incuber pendant 1-2 min à température ambiante en agitant doucement jusqu'à ce que les cellules se détachement.
- Une fois détaché, rapidement rincer Pétri avec 5 mL M20 et transférer les médias contenant des cellules dans un tube de 10 mL.
- Échantillons de centrifuger à 300 x g pendant 5 min à température ambiante, aspirer le surnageant, remettre en suspension des cellules dans 200 µL de la M20 et compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
- Remettre en suspension les cellules à 2,0 x 10 5 cellules/mL dans le M20, aspirer le M199 sur les gels de la plaque à 96 puits (étape 1.3) et ajouter 100 µL de suspension HUVEC (2,0 x 10 4 cellules) à chaque gel de collagène préparé au-dessus (étape 1.2). Culture des plaques pour un nouveau délai de 3 jours à 37 °C/5% CO 2.
Remarque : L’intégrité de la monocouche HUVEC peut être confirmée après 3 jours de nitrate d’argent souillant 22 ou immunohistochimie pour jonction serrée protéines 23 à ce stade. Gels supplémentaires doivent être préparés à cette fin.
4. Activation des HUVEC monocouche et isolement/Activation des Monocytes de Transmigration : jour 8
- sur le jour 8, activer chaque monocouche HUVEC avant l’ajout des monocytes en aspirant la M20 médias qui vient se superposer les gels et ajouter 100 µL de 10 ng/mL TNFα humain en M20 par gel. Incuber à 37 °C/5% CO 2 pendant 4 h.
Remarque : Non activé HUVEC conditions peuvent aussi être incluses si nécessaire sous forme de contrôles.
Monocytes - durant les 4 h HUVEC étape d’activation, l’isolat de PBMC utilisant magnétique techniques pour sélectionner négativement pour les cellules selon les directives du fabricant de billes ' instructions de s. Un minimum de 6,5 x 10 6 PBMC doit être utilisé à cette étape afin de recouvrer toute fiabilité 3.0 x 10 5 monocytes nécessaires à une condition, comme monocytes représentent typiquement environ 10 à 15 % des PBMC.
NOTE : Afin d’évaluer l’effet de l’activation des monocytes avant la formation des cellules monocytes transmigration et de la mousse, monocytes peuvent être activés à ce stade. Monocytes peuvent être isolés des PBMC décongelées si nécessaire (c'est-à-dire, des échantillons de patients stockés). Sous-ensembles de monocyte isolés en triant les FACS peuvent être préparés pour l’ajout aux gels (Figure 1).
5. Transmigration des Monocytes humains primaires : jour 8
- pour mesurer la transmigration de monocytes, retirer les milieux contenant du TNFα et laver les gels deux fois avec 100 µL M199 en ajoutant et supprimant des médias. Après lavage, ajouter 2,0 x 10 5 fraîchement isolées ou décongelés et lavé cryopréservé PBMC ou 5.0 x 10 4 fraîchement isolées monocytes ou purifié des sous-ensembles de monocyte aux monocouches HUVEC dans 100 µL M20. Incuber pendant 1 heure à 37 ° C et 5 % de CO 2 pour permettre la transmigration vers l’avant des monocytes dans le gel. Il est préférable de laisser 6 puits pour chaque condition expérimentale examinés.
NOTE : Afin d’évaluer l’effet du sérum autologue sur la formation des cellules transmigration et de la mousse, incuber les cellules avec M20 contenant la concentration désirée de sérum du donneur inactivés par la chaleur et le comparer aux conditions avec un contrôle de sérum humain. Autres que les monocytes, les leucocytes peuvent être ajoutés à ce stade. Si l’enquête sur l’impact des espèces de lipides/lipides spécifiques (p. ex., HDL, oxHDL), effectuez les opérations suivantes tous les médias sans sérum contenant des lipides de 20 à 50 µg/mL. - Après 1 h de transmigration vers l’avant, recueillir les cellules non-transmigré en lavant les gels deux fois avec 100 µL de préchauffée 1 mM EGTA dans du PBS 1 x et une fois avec 100 µL M199 (même centrifuger des conditions), mettre en commun les surnageants de chaque puits de la même conditions expérimentales (habituellement 6 puits) dans un tube de microtubes de 1,5 mL sur la glace. Centrifuger les cellules non-transmigré à 4 ° C, 300 x g pendant 5 min et resuspendre dans 30 µL de PBS 1 x.
- Compter les cellules recueillies dans le surnageant pour déterminer le nombre de cellules réincarnés avant.
- Le pourcentage de cellules réincarnés avant est déterminée comme suit :
- couvrir la lavé gels contenant des cellules réincarnés avec 100µl M20 et incuber pendant une autre 48 h.
- Après 48 h, récupérer le surnageant et cellules de non-transmigré laver deux fois avec 100 µL préchauffé 1 mM EGTA/PBS, collecter et mettre en commun le surnageant de chaque condition comme à l’étape 5.2.
Remarque : Le phénotype des cellules réincarnés inverses peut être testé avec ces cellules fla suite standard cytométrie souillant des protocoles. - Centrifuger à 4 ° C, 300 x g pendant 5 min, les cellules et remettre en suspension des cellules dans 30 µL de PBS 1 x. Compter les cellules et déterminer la viabilité par la coloration bleu trypan.
- Déterminer le pourcentage de cellules réincarnés inverses en utilisant l’équation suivante :
Remarque : représentent le nombre total de cellules réincarnés avant donne une indication plus précise de la transmigration inverse car il est peu probable avant transmigration sera 100. - Pour analyse au microscope, fixez les gels en ajoutant 100 µL 2 % de formaldéhyde (concentration finale) dans chaque puits, couvrir les plaques en aluminium feuille et conserver à 4 ° C jusqu'à l’analyse. Pour la cytométrie en flux, ne fixent pas les cellules à ce stade. Voir les protocoles ci-dessous pour microscopie (article 6) ou analyse d’écoulement cytometry (article 7).
ATTENTION : Le formaldéhyde est toxique et corrosif ; utiliser un équipement de protection individuelle (EPI). Il faut veiller lors de l’ajout de formaldéhyde, cependant, cette étape ne doit pas être effectuée sous une hotte en raison de la faible concentration utilisée.
6. Quantification des cellules spumeuses et de Macrophages par microscopie (Oil-Red O Stain)
- enlever le formaldéhyde et laver les gels avec 100 µL de méthanol à 50 % (v/v) pendant 5 min et puis 100 µL 78 % (v/v) de méthanol pendant 15 min.
Nota : Les étapes de coloration peuvent être effectuées sur le banc de laboratoire et non dans une armoire de classe II Biohazard. - Tache de gouttelettes lipidiques en ajoutant 100 µL de fraîchement préparés à 0,2 % (p/v) O huile rouge (voir Table des matières pour plus de détails) pendant 1 h à température ambiante.
- Enlever tache excès en lavant les gels 4 fois avec 100 µL de méthanol à 78 % (v/v), aspirant et jeter le surnageant après chaque lavage.
- Contre-coloration pour 15 min à température ambiante avec 100 µL de Giemsa, dilué 01:10 dans l’eau distillée.
- Aspirer la coloration de Giemsa et gels une fois avec de l’eau de lavage.
- Pour détacher les gels de la plaque, les puits à l’aide d’une aiguille 21 G, avec le biseau vers l’extérieur, sur le pourtour du gel de jante.
- Pour monter les gels sur une lame de microscope, percez deux trous (diamètre de 6,35 mm) dans une bande de 2,54 cm x 1,5 cm de ruban adhésif double-face. Fixer le ruban sur un côté de microscope ordinaire et retirer le revêtement de protection sur le dessus.
- Ajouter une goutte d’eau pour les trous dans la bande à l’aide d’une pipette de transfert. À l’aide de pinces à épiler, transférer doucement gels aux trous dans le ruban adhésif et couvrir avec une lamelle de verre 1,5 taille. Appuyer doucement sur la lamelle, il respecte la bande.
- Examiner au microscope de lumineux-zone de contraste interférentiel différentiel sur un microscope inversé à l’aide d’objectif 40.
- Apportez la monocouche HUVEC dans le foyer à 40 X grossissement et défilement ' en ' le gel, le comptage des cellules macrophages/mousse sur toute la profondeur du gel. Répéter pour trois champs distincts de vue situés à une distance similaire depuis le bord du gel afin de minimiser les effets de bord possibles. Cela garantira la profondeur de gel est cohérente entre les régions de comptage.
NOTE : Marquer des cellules dans le gel comme étant cellules spumeuses (définies comme des cellules contenant > 1/3 de leur cytoplasme comme O huile rouge teinté de gouttelettes lipidiques) ou macrophages dans les 2 h de montage sur des lames ( Figure 2). Formation de mousse cellulaire est exprimée en pourcentage de cellules spumeuses par rapport au nombre total de cellules migrés et s’exprime comme les comtes médians dans 3 champs de vue examinés pour 6 gels par condition, donc une valeur médiane de 18 mesures par condition. Un exemple de numération cellulaire brut d’une expérience typique est montré dans le tableau 2.
NOTE : Classer une cellule comme un macrophage de vs mousse cellulaire au microscope est subjective et par conséquent peut dépendre de l’enquêteur. Dans les études cliniques, où des expériences sont effectuées sur une longue période de temps, il est important pour compter tous les à réaliser aveuglés par un seul enquêteur. Exemples de cellules spumeuses et de macrophages dans les gels sont donnés à la Figure 2.
- Apportez la monocouche HUVEC dans le foyer à 40 X grossissement et défilement ' en ' le gel, le comptage des cellules macrophages/mousse sur toute la profondeur du gel. Répéter pour trois champs distincts de vue situés à une distance similaire depuis le bord du gel afin de minimiser les effets de bord possibles. Cela garantira la profondeur de gel est cohérente entre les régions de comptage.
7. Analyse des cellules transmigré par écoulement Cytometry
- de phénotypiquement caractériser les cellules spumeuses et macrophages suite à la migration transendothéliale, digérer les gels en ajoutant 100 µL de collagénase de 1 mg/mL de 37 ° C préchauffé D dilué dans M199 à chaque puits et incuber pendant 20 min à 37 °C/5% CO 2.
Remarque : Placez les plaques de 96 puits directement sur les grilles métalliques propre à l’incubateur pour assurer la répartition égale de la chaleur. - Après l’incubation, macérer les gels à l’aide d’une pointe de pipette de 200 µL et incuber pendant un autre 20 min à 37 °C/5% CO 2.
- Une fois entièrement digérée, filtre et piscine les gels répétées digérées par le biais de 35 µm en nylon mesh plafonnés tubes FACS mis dans la glace et lavage une fois avec FACS se laver (voir Table des matières) à 4 ° C, 300 x g. remettre en suspension les cellules dans 100 µL de FACS Wash
- Incuber les cellules résultantes avec anticorps conjugués fluorophore spécifiques CD45, un marqueur de vivre/dead cell et surface/intracellulaire marqueurs phénotypiques ou fonctionnelles d’intérêt à l’aide de protocoles de cytométrie de flux standard.
NOTE : Préparer le contrôle tubes d’indemnisation en utilisant les fluorophores appropriés et les perles de compensation Ig. Extrait de cellules peuvent également être collectées sur lames de verre pour la microscopie en immunofluorescence par cytospinning. Alternativement, nous avons recueilli avec succès des cellules utilisant ce protocole pour évaluation par imagerie de cytométrie.
Acquérir des cellules à l’aide d’un cytomètre en flux - et effectuer une compensation conformément à.
NOTE : Comme mousse cellules/macrophages peuvent ne pas faire les populations individuelles à l’aide de propriétés de la lumière et peuvent différer considérablement en taille et en forme, définissez libérale avant scatter (FSC) et les portails de diffusion (SSC) côté afin de capturer toutes les cellules migrés comme indiqué dans < classe forte = « xfig » > Figure 3 a. - Après acquisition, effectuer l’analyse des données à l’aide de logiciels de cytométrie de flux. Pour identifier les cellules migrés, commencez par sélectionner les cellules comme négative pour le marqueur de vivre/morts, comme illustré à la Figure 3 b. Ensuite, effectuer une discrimination unicellulaires en créant une barrière étanche autour des cellules montré sur un terrain de vs SSC-hauteur SSC-domaine.
- Sélectionnez CD45 + cellules et porte la population majeure de cellules migrés dans une parcelle FSC/SSC car ce sont les cellules macrophages/mousse.
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Representative Results
Quantifier la transmigration de monocyte
Monocytes sont ajoutés au modèle tel que décrit à la Figure 1, et 6 gels sont préparés pour chaque condition. Monocytes pour 6 gels par donneur (i.e.5.0 x 104 monocytes par gel 6 gels = 3.0 x 105 monocytes par donneur) sont remises en suspension pour un volume final de 600 µL de M199 médias contenant les lipides de sérum requise ou isolées. Cellules (c’est à dire, 100 µL par gel = 5,0 x 104 monocytes) sont ensuite aliquotés sur gels et couvés comme ci-dessus pendant 1 h afin de faciliter la transmigration de monocytes. Suite de transmigration, non-transmigré cellules sont comptées comme ci-dessus. Dans cet exemple, 1,5 x 104 non-transmigré cellules ont été récupérées. Le pourcentage de transmigration vers l’avant a été déterminé à l’aide de formules décrites à l’étape 5.4 :
Après 48 h d’incubation, 3. 6 x 104 cellules de réincarné inverse ont été récupérés comme indiqué ci-dessus. Le pourcentage de transmigration inverse a été déterminé à l’aide de la formule à l’étape 5.8 :
Transmigration et inverse peut-être être comparée entre les conditions en utilisant les tests statistiques appropriés et les monocytes, préparés à partir de plusieurs donateurs indépendants pour déterminer si la capacité de transmigration de monocytes est altérée entre expérimental conditions.
Évaluation de la formation de mousse cellulaire
Fond clair microscopie
Lipoprotéines oxydées sont connus pour promouvoir les macrophages dérivés de monocytes mousse cellulaire formation in vitro par rapport aux lipides non oxydés15. Ici, nous confirmons que le traitement des monocytes avec LDLOx, couramment utilisé pour induire la formation de cellules de mousse dans les modèles classiques de mousse cellulaire induction, stimule la formation des cellules macrophages dérivés de monocytes mousse dans ce modèle de formation des cellules transendothéliale migration et mousse par rapport aux LDL natives. Après la formation des cellules monocytes transmigration et de la mousse dans les gels incubées avec M199 contenant 50 µg/mL natif ou CuSO4-LDL oxydées (voir étape 5.1, Figure 1), les cellules ont été analysées au microscope. Exemples de cellules spumeuses et de macrophages observés dans des expériences représentatives sont indiquées à la Figure 2. Les cellules ont été dénombrés dans trois domaines différents par gel, en se concentrant à la monocouche HUVEC et progressivement se concentrant plus profondément dans le gel. Le nombre de cellules est enregistré pour chaque donneur, comme indiqué dans le tableau 2 pour un seul donneur, de comparer le pourcentage de cellules spumeuses, formé en réponse à oxyder et LDL natives. Agréger des données de n = 12 chefs indépendants sont indiqués dans la Figure 4 pour confirmer que l’incubation des monocytes avec LDLOx dans ce modèle induit la formation des cellules mousse plus que les conditions où les monocytes sont incubés avec native médias LDL ou M199 seul.
Cytométrie en flux
Pour déterminer le phénotype des cellules migrés, les cellules sont extraites de gels digérées et étiquetés à l’aide d’un panneau de cytométrie de flux standard. Cellules sont marquées avec un marqueur de vivre/mort cellulaire et des anticorps spécifiques pour CD45 et d’autres marqueurs de surface phénotype à l’aide de protocoles de cytométrie de flux standard. Commandes de compensation doivent être aussi préparés à compenser intégralement selon les techniques de cytométrie de flux standard. Migration de cellules sont bloquées comme illustré à la Figure 3 dans les parcelles représentant de 10 expériences indépendantes. Des cellules vivantes sont bloquées à l’aide d’analyses de viabilité de cellules live/dead (Figure 3 b) et les doublets sont exclues par l’analyse de cellule unique (Figure 3). Les cellules sont ensuite bloquées comme CD45+ afin d’exclure des HUVEC (car ces cellules sont CD45-, Figure 3D). La population majeure est alors contrôlée par discrimination de nuages de points XY dispersion/face avant (Figure 3E) et l’intensité de la fluorescence moyenne (IMF) des récepteurs d’intérêt sont déterminées par rapport à une fluorescence moins un (FMO) ou isotype contrôler) Figure 3F) pour déterminer l’expression (ΔMFI) ou le pourcentage de cellules positives.
Figure 1 : Un à la vitro modèle de formation des cellules monocytes transmigration et de la mousse. PBMC (A), (B) totales monocytes ou des sous-ensembles de monocyte FACS-tri (C) sont ajoutés à fibreux collagène type I gels formé en plaques 96 puits et recouvertes d’une monocouche d’activés ombilical humain primaire les cellules endothéliales (HUVEC), dont l’intégrité peut être évaluée par ()Dde coloration à l’argent de la veine) et autorisés à (E) transmigrer pendant 1 h en présence de sérum ou de lipides contenant des médias. Les cellules non-transmigré sont comptées (F) et gels sont incubés pendant une autre 48 h avec le même sérum/lipide contenant des médias. Après incubation, (G) inverse des cellules migrés sont comptées et le pourcentage de cellules spumeuses vs macrophages dans le gel est déterminé par microscopie à contraste de phase (H) après coloration à l’huile rouge O ou le phénotype des cellules migrés est déterminé par (je) cytométrie en flux. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Exemples de cellules spumeuses et de macrophages dans un à la vitro modèle de formation des cellules monocytes transmigration et de la mousse. Représentantexemples d’ive de cellules a marqué comme mousse cellules (flèches blanches) et les macrophages (flèches noires) après Giemsa coloration afin de visualiser les cellules et la coloration rouge-huile O pour visualiser les gouttelettes lipidiques tel que déterminé par microscopie en contraste de phase de gels extraites à l’aide d’un inversé microscope à grossissement X 40. Echelle = 20 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Gating stratégie des cellules réincarnés par cytométrie. Cellules réincarnés sont phénotypiquement caractérisés par cytométrie en flux après l’extraction des cellules de gels. Les cellules sont bloquées par (A) FSC/SSC, (B) des cellules vivantes, (C) cellules individuelles, CD45 (D)+, CSE/FSC (E) et (F) l’expression du récepteur par rapport à l’isotype ou fluorescence moins un contrôle (FMO). Expression des récepteurs d’intérêt est défini comme l’intensité de la fluorescence moyenne (IFM) et exprimées en ce qui concerne les niveaux d’isotype. ΔMFI = Stain (MFI) moins contrôle isotype/FMO (IFM). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Effet d’exogène LDLOx et LDL sur la formation des cellules macrophages dérivés de monocytes mousse. Formation de mousse cellulaire est déterminée dans des conditions où monocytes provenant d’un donneur unique sont incubées avec les médias (M199) ou 50 µg/mL prend des lipoprotéines de basse densité (LDL) ou de sulfate de cuivre (II) oxydé LDL (LDLOx) ajouté à la transmigration des gels. Chefs d’accusation pour 12 sites distincts sont présentés. Cellules spumeuses sont exprimées sous forme de pourcentage du totales cellules migrés. Gammes médianes et intervalle interquartiles sont indiqués dans les graphiques à barres et des comparaisons ont été faites à l’aide de tests non paramétriques de U de Mann-Whitney. p < 0,001, *** p < 0,0001. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Réactif | [Stock] | [Final] | Volume pour 60 gels (µL) |
| NaOH | 100 mM | 35,7 mM | 1071 |
| M199 | x 10 | 0.71 x | 213 |
| AcCOOH | 20 mM | 4,58 mM | 687 |
| Collagène | 5 mg/mL | 1,71 mg/mL | 1029 |
| Volume total | - | - | 3000 |
Tableau 1 : Préparation du gel fibreux de collagène de Type I
| LDL | LDLOx | |||||||
| Gel | Comte | Des cellules de mousse1 | Migration de cellules1 | Mousse des cellules (%)2 | Des cellules de mousse1 | Migration de cellules1 | Mousse des cellules (%)2 | |
| 1 | 1 | 5 | 44 | 11.4 | 26 | 55 | 47.3 | |
| 2 | 5 | 27 | 18.5 | 10 | 23 | 43,5 | ||
| 3 | 11 | 52 | 21.2 | 19 | 39 | 48,7 | ||
| 2 | 1 | 5 | 34 | 14,7 | 9 | 31 | 29 | |
| 2 | 14 | 50 | 28 | 32 | 55 | 58.2 | ||
| 3 | 5 | 37 | 13.5 | 19 | 37 | 51,4 | ||
| 3 | 1 | 10 | 37 | 27 | 28 | 52 | 53,8 | |
| 2 | 7 | 33 | 21.2 | 11 | 31 | 35,5 | ||
| 3 | 7 | 38 | 18,4 | 28 | 53 | 52,8 | ||
| 4 | 1 | 9 | 44 | 20.5 | 14 | 33 | 42,4 | |
| 2 | 7 | 33 | 21.2 | 22 | 47 | 46,8 | ||
| 3 | 11 | 50 | 22 | 11 | 30 | 36,7 | ||
| Cellules de mousse médiane (%) | 20,8 | 47 | ||||||
| Cellules de mousse moyenne (%) | 19,8 | 45,5 | ||||||
Tableau 2 : numérations Raw de comparaison des cellules macrophages dérivés de monocytes mousse suite de LDL vs LDLOx traitements. 1 Les numérations par champ de vision en gel. 2 Pourcentage de cellules spumeuses = mousse cellulaire comtes/total migrés les numérations x 100. * Données sont représentatives d’une expérience à l’aide de monocytes provenant d’un donneur unique
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Discussion
Le protocole décrit ici vous propose une méthode polyvalente et physiologiquement pertinente pour évaluer l’athérogénicité des monocytes de cohortes cliniques humaines, en combinant les transmigration de monocyte et formation de cellules de mousse. Ce modèle offre des avantages par rapport aux autres méthodes de formation de mousse cellulaire car il prend en compte l’effet de la transmigration de monocyte sur la formation de mousse cellulaire et permet la mesure de transmigration inverse6 en plus inhérent propension des monocytes à deviennent des cellules spumeuses dans la présence ou l’absence de facteurs exogènes. En outre, le rôle d’activation endothéliale est aussi tenir compte que nous avons démontré que l’oxydation augmente activation endothéliale des espèces de lipides qui est associés avec mousse cellulaire formation14. Enfin, le phénotype des monocytes qui subissent une évacuation (une propriété associée de régression de la plaque) peut être quantifié et caractérisé par microscopie et écoulement cytometry.
En raison du caractère tridimensionnel de la transmigration dans les gels, les identifier et marquer les cellules réincarnés en cellules spumeuses ou macrophages peuvent être difficiles, comme cellules transmigrer à différents niveaux dans le gel de19. Pour faciliter l’identification des cellules spumeuses, tache d’huile-Red O frais doit toujours être utilisée. Il est également de noter que les États de maladie différents ex vivo ou in vitro conditions peuvent altérer transmigration de monocytes dans le gel. Nous avons utilisé l’imagerie de cellules vivantes pour identifier que les monocytes de personnes infectées par le VIH ont tendance à transmigrer points moins profondes dans les gels et à des vitesses différentes que ceux des individus non infectés19. En outre, formation de mousse cellulaire est associée à moins motilité de monocytes dans le gel afin que les cellules ont tendance à se déplacer dans les milieux à un profilé en z particulière par rapport aux cellules par des individus non infectés du VIH qui ont tendance à migrer en ligne relativement droite vers le bas du gel. Ces résultats soulèvent la possibilité d’un phénomène similaire qui se produisent dans des expériences utilisant des échantillons de patients humains provenant d’autres États de la maladie associées athérogénicité accrue des monocytes.
Lorsque vous effectuez des analyses axée sur la cytométrie de flux, il est fréquent d’observer une proportion importante des cellules mortes dans la population de cellules récupérées lors de l’évaluation de la viabilité à l’aide de marqueurs de vivre/mort cellulaire (Figure 4 b). Ces cellules sont principalement CD45– HUVEC qui a été endommagée lors de l’étape de digestion/macération de collagène nécessaire à l’extraction des cellules macrophages dérivés de la matrice de collagène. Ce processus est particulièrement sévère sur la monocouche HUVEC, mais n’est pas préjudiciable au phénotypage des cellules réincarnés.
Ce modèle diffère des autres aucun artificiellement oxydé lipidique exogène n’est nécessaire dans les milieux de culture pour la formation des cellules macrophages dérivés de monocytes mousse en voiture. Au lieu de cela, formation de cellules de mousse dans cet essai est influencée par le sérum présent dans les milieux de culture, permettant les discrets effets de facteurs solubles provenant d’échantillons cliniques pour être évalué. Par conséquent, nous avons montré que l’incubation des monocytes de contrôle avec du sérum de jeunes infectés par le VIH19 ou de personnes âgées non infectés du VIH20 individus favorise la formation de mousse de cellules, ce qui indique que des facteurs solubles peuvent promouvoir indépendamment de mousse formation des cellules. Comme le dosage est influencé par les constituants solubles, un seul lot de sérum humain doit être utilisé pour des expériences visant à déterminer la différence intrinsèque des propriétés athérogènes des monocytes provenant de différents individus afin de normaliser conditions de contrôle. Ce test peut également être utilisé pour évaluer le rôle des lipides spécifiques des espèces provenant d’échantillons cliniques (Figure 3). Par exemple, nous avons trouvé que l’incubation des monocytes avec un milieu contenant des lipides isolés espèces telles que les lipoprotéines de haute densité d’individus atteints de lipides connues dysfonction24 favorise également la formation de cellules de mousse. Dans ce cas, les monocytes d’un seul individu sain ou groupe d’individus peuvent être utilisés en présence de sérum ou de facteurs de sérum provenant de sujets. Ce modèle permet donc, pour des questions spécifiques à poser concernant les effets discrets de composants solubles et cellulaires sur la formation de cellules de mousse.
Ce test utilise HUVEC comme modèle d’endothélium coronaire en raison de la difficulté pratique d’obtenir un grand nombre de cellules de l’artère coronaire primaire numéros passage bas. Cependant, nous avons comparé les résultats de tests utilisant des cellules endothéliales humaines coronarienne ou HUVEC et observé peu de différence dans la formation des cellules monocytes transmigration ou mousse (données non présentées), ce qui indique que l’utilisation des HUVECs dans ce système est une substitut acceptable. Le comptage manuel de cellules spumeuses est un facteur limitant dans ce modèle, comme il peut introduire un biais de l’opérateur. Par conséquent, tous les échantillons montés sur des glissières doivent être aveuglés à l’opérateur afin d’éliminer le risque de partialité. Nous avons, cependant, par rapport à la formation des cellules mousse tel que mesuré par comptage manuel et par cytométrie en flux d’imagerie et a conclu que ces méthodes similaires résultats19. Une limitation clée de ce modèle est que les migrations et l’adhérence des monocytes se produisent en l’absence de forces de cisaillement associée à flux sang physiologique in vivo. Nous émettons l’hypothèse que les flux de cisaillement affectera principalement transmigration de monocytes et de la formation de cellules de mousse pas ultérieure au sein de la matrice ; Cependant, ceci doit être considéré lors de l’interprétation des résultats de cet essai. Aussi, cet essai ne modélise pas l’influence des cellules musculaires lisses dans la formation des cellules macrophages dérivés de monocytes mousse qui est une limitation physiologique du système ; Cependant, c’est conforme à toutes les conditions permettant le potentiel athérogène discret des monocytes à comparer entre états pathologiques différents.
En résumé, ce modèle fournit une méthode polyvalente et physiologiquement pertinente pour quantifier la transmigration de monocytes et de mousse cellule formation à partir des échantillons humains par la maladie différents États ex vivo. Ce modèle comporte d’autres applications pour évaluer la propension des monocytes pour former des cellules de la mousse dans des conditions où l’athérogénicité de monocytes est associée à un risque accru de CAO tels que l’obésité25, diabète26 et insuffisance rénale chronique 27de la maladie. Donc, ce modèle peut également être optimisé pour une utilisation dans les États de la maladie, autre que l’athérosclérose, où transmigration cellulaire peut-être influencer pathogenèse de la maladie.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs remercient les travaux du Prof. William Muller et Dr Clare Westhorpe pour leur rôle clé dans le développement d’itérations précédentes de ce modèle. Les auteurs tiens également à remercier le noyau AMREP Flow Cytometry pour le triage des monocytes sous-ensembles et la Alfred Infectious Disease unité hospitalière clinique infirmières pour le recrutement d’individus séropositifs pour certaines études de recherche. Les auteurs remercient la contribution à ce travail, de l’Infrastructure opérationnelle Victoria programme de soutien reçus par l’Institut Burnet. TAA est pris en charge par un RMIT University rectorale bourse postdoctorale. Ce travail a été soutenu par la subvention de projet NHMRC 1108792 attribué à AJ et AH. TK est pris en charge par NIH accorde NIH K08AI08272, Grant NIH/NCATS # UL1TR000124.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gel preparation reagents | |||
| NaOH | Sigma-Aldrich | 221465-500G | 0.1 M NaOH diluted in H20 |
| 10x M199 | Sigma-Aldrich | M0650 | |
| AcCOOH | Sigma-Aldrich | 695092-100ML | 20 mM Acetic acid diluted in H20 |
| Cultrex Bovine Collagen I | R&D Systems | 3442-050-01 | Type I Fibrous Collagen |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture | |||
| M199 | Life Technologies | 11150-059 | M199 media containing Earle's salts, L-glutamine and 2.2 g/L Sodium Bicarbonate. Media supplemented with 100 µg/mL L-glutamine and 100 U/mL penicillin/streptomycin |
| M20 | Supplemented M199 containing 20% heat-inactivated pooled or donor serum. Individual lipid species such as LDL can be added to M199. |
||
| HUVEC | Primary human umbilical cord endothelial cells (HUVEC) can be isolated from umbilical cords donated with informed consent and ethics approval. Isolated HUVEC may also be purchased commercially. | ||
| Human coronary artery endothelial cells | Primary human coronary artery endothelial cells can be isolated from arteries donated with informed consent and ethics approval. Isolated cells may also be purchased commercially. | ||
| EDTA | BDH Merck | 10093.5V | Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) - 0.5 M, pH 8.0 |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889-500G | Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) - 1 mM, pH 8.0 |
| 0.05% trypsin EDTA | Gibco | 25300-054 | 0.05% trypsin/0.53 EDTA (1X) |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | L-glutamine (200 mM) |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | Penicillin/streptomycin (10,000 units/mL Penicillin and 10,000 µg/mL Streptomycin) |
| New born calf serum | Gibco | 16010-142 | New born calf serum: New Zealand origin |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1056-1MG | Fibronectin - 50 µg/mL aliquots prepared and stored |
| PBS (1x) | Gibco | 14200-075 | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (10x): Dilute to 1x with sterile H20 |
| 0.1% TNF | Gibco | PHC3015 | Recombinant human TNF - Reconstituted in H20 and stored in 10 µg/mL aliquots |
| Low-density lipoprotein | Merck Millipore | LP2-2MG | Low-density lipoprotein (LDL) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopy | |||
| 1 or 2% formaldehyde | Polysciences | 4018 | 1 or 2% formaldehyde diluted with sterile H20 |
| 50% and 78% methanol | Ajax Finechem | 318-2.5L GL | 50% or 78% v/v methanol, diluted with H20 |
| Oil Red O stain | Sigma-Aldrich | O0625-25G | Dilute to 2 mg/mL in 22% 1M NaOH and 78% (v/v) methanol |
| Microscope slides | Mikro-Glass | S41104AMK | Twin frosted 45 degree ground edge microscope slides (25 X 76 mm) |
| Cover slips | Menzel-Gläser | MENCS224015GP | 22 x 40 mm #1.5 size glass cover slips |
| Double-sided tape | 3M Scotch | 4011 | Super strength exterior mounting tape (25.4 mm x 1.51 m) |
| Giemsa stain | Merck Millipore | 1.09204.0500 | Giemsa's azur eosin methylene blue solution (dilute stock 1:10 in H20) |
| Hole punch | Hand-held single hole punch (6.35 mm punch) | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flow cytometry | |||
| Collagenase D | Roche Diagnostics | 11088858001 | Collagenase D diluted in M199 media to 1 mg/mL |
| 35 µm nylon mesh capped polystyrene FACS tubes | BD Biosciences | 352235 | 35 µm nylon mesh capped polystyrene FACS tubes |
| Live/Dead Fixable Yellow Dead Cell stain | Life Technologies | L34959 | Live/Dead Fixable Yellow Dead Cell stain |
| FACS wash | Prepare by mixing 1 X PBS-, 2 mM EDTA and 1% New born calf serum | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasticware | |||
| 96 well plate | Nunclon | 167008 | Delta surface flat-bottomed 96 well plate |
| 10 cm Petri Dish | TPP | 93100 | Sterile 10 cm Petri dish |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | Eppendorf | 0030 125.150 | Eppendorf tubes |
| Transfer pipette | Samco Scientific | 222-20S | Sterile transfer pipette (1 mL, large bulb) |
References
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