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Neuroscience

体外骨髄由来マクロファージによって髄鞘の残骸の貪食

Published: December 30, 2017 doi: 10.3791/56322
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biomedical Sciences, College of Medicine, Florida State University

Summary

蛍光に分類された髄鞘の残骸と細胞内脂質液滴染色を使用してプライマリ マウス骨髄由来マクロファージの貪食能を評価する手法を提案します。

Abstract

骨髄由来マクロファージ (BMDMs) は、さまざまな粒子をクリアできるプロの食として重要な生理的役割を果たす成熟した白血球です。通常、中枢神経系 (CNS)、BMDMs が制限されているが、外傷後に容易に侵入することができます。一度負傷した中枢神経組織内 BMDMs、外傷由来の細胞の残骸を含む脂質豊富な髄鞘の残骸の大量のクリアランスに対して責任がある一次電池タイプです。中枢神経系内 BMDM 浸潤と髄鞘の残骸貪食能の神経病理学的影響が複雑でも理解していません。ここで、説明プロトコルは、BMDMs の直接の in vitro研究中枢神経損傷のコンテキストで許可します。BMDM 髄鞘の残骸の貪食能を評価するためにマウスの BMDM 分離と文化、髄鞘の残骸の準備とアッセイを取り上げます。これらの技術は重要な特殊な機器や材料を必要とせず堅牢な定量化可能な結果を生むまだ研究者のニーズに合わせて簡単にカスタマイズすることができます。

Introduction

骨髄由来マクロファージ (BMDMs) は、自然免疫と適応免疫システム間の重要なリンクです。抗原提示細胞 (APCs)、彼らは両方の抗原提示によるリンパ球と通信できるし、サイトカインのリリース1,2,3。しかし、プロの食、主な機能は病原体、高齢者の細胞および細胞残骸1,4をクリアします。脊髄損傷 (SCI)、次は、中枢神経系の軸索の髄鞘化5担当細胞型死ぬオリゴデンドロ サイトから髄鞘の残骸の相当な量が生成されますように。私たちと他の人は髄鞘の残骸のクリアランスが主に浸潤 BMDMs5,6、7の責任であることを示しています。しかし、脊髄損傷で炎症状態5,8,9に向けてこれらの通常抗炎症のセルをシフトさせるサイト髄鞘の残骸の貪食を示唆されています。脊髄損傷における神経炎症の主要メディエーターとして BMDMs、重要な臨床目標です。

脊髄損傷の BMDMs の影響を調査するため、直接 BMDMs と髄鞘の残骸の対応を研究する生体外モデルを開発しました。生物学的関連性を高めるためには、プライマリ マウス BMDMs と新鮮単離髄鞘の残骸の両方はこれらの調査で使用されます。プライマリ マウス BMDMs の分離文化紹介方法についても詳しく説明し、マウス中枢神経系を分離するために使用変更されたショ糖勾配法は髄鞘の残骸10、11,12派生します。髄鞘の残骸は、蛍光染料、carboxyfluorescein サクシニミジルエステル (CFSE)、BMDMs。 CFSE によってその内面は非細胞傷害性だからこのアプリケーションに適してトラックとその狭い蛍光スペクトル許可で容易にラベル付けできます。その他の蛍光多重13,14をプローブします。次の貪食、髄鞘の残骸の脂質は、リソソームを経由、細胞内脂質液滴5に中性脂質としてパッケージします。この細胞内の脂質の蓄積を定量化するには、オイル赤い O (オロ) 染色法の定量的画像解析の最適化を提案する.この単純な染色法は、堅牢な再現性のある結果と定量化15を生成します。これらのメソッドは、限られた特殊な設備とミエリンの破片貧食能および脂質保持の研究を促進します。

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Protocol

メソッドここで説明のセクション 2 では、フロリダ州立大学機関動物のケアおよび使用委員会 (IACUC) によって承認されているし、ケアと 8th版実験動物の使用のためのガイドに定めるガイドラインに従います.このプロトコルでは、これのすべての動物は、使用まで専用の実験室の動物実験施設で家をしています。生体内で実験を犠牲にする前に実行がありませんでした。動物の数字は、使用量を最小限に抑えるためにガイドとして平均セルとミエリンのコレクションを使用して実験の必要性に基づいていた。

注:このプロトコルを記述する骨髄由来マクロファージ (BMDMs) (セクション 1) 蛍光に分類された脳由来の髄鞘の残骸 (セクション 2)、髄鞘の残骸貪食 (セクション 3) を分析するための一般的な手順の準備の世代と髄鞘の残骸の脂肪蓄積 (セクション 4) の分析のための一般的な手順です。試薬調製、セルを収穫し操作、ミエリン コレクション、ラベル付け、およびアッセイ パフォーマンスは層流気流バイオ セーフティ キャビネットで完了する必要があります。

1. プライマリ骨髄由来マクロファージの生成

  1. 完全なマクロファージ培養培地 (CMCM) の準備
    注:    から骨髄マクロファージ世代大食細胞のコロニー刺激因子 (M-CSF) の使用が必要です。この準備は、M-CSF のソースとして L929 マウス線維芽細胞エアコン メディアを利用しています。
    1. 50 mL の高グルコース (4500 mg/L L ブドウ糖) ダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) 5% 新しい生まれた子牛血清 (NCS) とペニシリン/ストレプトマイシンを 7 日間で 145 mm 皿で培養細胞による L929 マウス線維芽細胞エアコン メディアを生成します。
    2. 3500 × g、4 ° C で 30 分間、50 mL コニカル遠沈管および遠心分離機に文化からメディアを収集します。
    3. 0.2 μ m のシリンジ フィルターを通して培養上清を新しい 50 mL の円錐形遠心管にフィルターします。エアコン メディアは、最大 6 ヶ月間-80 ° C で保存できます。
    4. 高グルコース DMEM、5% 巻/巻 NCS を追加、15% 巻/巻 L929 マウス線維芽細胞エアコン DMEM、および 1% ペニシリン/ストレプトマイシン。メディアは、2-3 か月の 4 ° C で保存できます。使用する前に 37 ° C に暖かい。
  2. 主な骨髄細胞とマクロファージ誘導のコレクション
    注:このプロトコルの 1 つのマウスを使用して、約 2000 万骨髄由来マクロファージ (BMDMs) が生成されます。
    1. 8-10 週間の標準的な CO2窒息ガイドラインを使用して古いマウスは続いて頚部転位の桁数を安楽死させます。
    2. 70% (巻/巻) エタノール: H2O を使用し、毛皮を飽和動物をサニタイズします。
    3. 腹部に小さな開口部をカットし、基になる組織を明らかにするため皮膚を慎重に引いてください。腹腔穿刺に注意してください。
    4. 両方の後ろ足の股関節から始まると足首で終わるを削除します。場所 5-10 mL 滅菌リン酸を含む 100 mm のペトリ皿に収集した組織緩衝生理食塩水 (PBS) 1% を添加したペニシリン/ストレプトマイシン。
      注:組織の劣化を制限する氷の上の皿を維持するとき確認いくつかの動物を処理します。
    5. メスを使用して骨から筋肉や結合組織を削除します。大腿骨と脛骨のみ使用されますセルのコレクションの腓骨を破棄できます。
    6. メスの各端からの小さなセクションをトリミングすることによって収集された骨の髄腔を公開します。
    7. 25 g の針を使用して、50 mL の円錐形遠心チューブに CMCM と骨髄腔をフラッシュします。骨は、一度十分にフラッシュされている白表示されます。
    8. コレクションが完了すると、単一細胞懸濁液を生成する 30-90 s のための 18 g 針で吸引を振りま します。
      注:この時点で、オプションの赤い血球 (RBC) 換散のステップが行われます。最近、細胞内の鉄分がマクロファージ偏波16髄鞘の残骸の影響に影響を及ぼすことが示唆されています。赤血球の包含について散のステップは、Trouplinらを参照してください。17。
    9. 新しい 50 mL の円錐形遠心管に 70 μ m 無菌細胞ストレーナー懸濁液をフィルタ リングします。
    10. 種子は、15 〜 20 mL CMCM を含む 145 mm 細胞培養皿に均等に細胞を収集しました。マウスを犠牲にしたあたりの約 3 つの培養皿を使用します。37 ° c、5% CO2文化を孵化させなさい。
    11. 72 時間は、非付着性のセルを削除する滅菌 PBS で 1 回プレートを洗って後、15 ~ 20 mL を追加新鮮な CMCM。37 ° C、5% CO2でさらに 4 日間文化を孵化させなさい。総文化の日の 7 日後、最初に分離した造血骨髄細胞は成熟した BMDMs (図 1) になります。

2. 脳由来の蛍光に分類された髄鞘の残骸の世代

注:すべての試薬は、1 ヶ月の 4 ° C で保存できます。

  1. 髄鞘の残骸のコレクション試薬の調製
    1. Tris· を準備します。Cl 緩衝液。
      1. 800 mL 蒸留脱イオン H2O (ddiH2O) 追加 1 M Tris· 20 mLCl、ナ2EDTA (最終濃度が 2 mM) 100 mM の pH 7.45 (最終濃度が 20 の mM) および 20 mL。
      2. 7.45 に pH を調整します。DdiH20.2 μ m ろ過ユニットを介して o. フィルター ソリューションと 1000 の mL にボリュームを調整します。
    2. 1 M ショ糖液を準備します。
      1. Tris· 100 mlCl バッファー溶液、ショ糖の 68.46 g を追加。Tris· と 200 mL にボリュームを調整します。Cl 緩衝液。0.2 μ m のろ過装置を通してソリューションをフィルター処理します。
    3. Tris· で 1 M 溶液を希釈することによって 0.32 M ショ糖溶液 200 mL を準備します。Cl バッファー ソリューション 0.83:0.16 (巻/巻)。
    4. Tris· で 1 M 溶液を希釈することによって 0.83 M ショ糖溶液 150 mL を準備します。Cl バッファー ソリューション 0.83:0.16 (巻/巻)。
  2. 脳由来の原油髄鞘の残骸のコレクション
    注:ここで説明するコレクション メソッドは、原油髄鞘の残骸の隔離のためです。
    1. 10-12 マウス頚部転位続いて CO2窒息の標準のガイドラインを使用して年齢の 8-10 週を安楽死させます。
    2. 脳を解剖し、0.32 M ショ糖溶液の 10 mL を含む 100 mm ディッシュに配置します。
氷の上の皿を保ちます。
  • 約 5 mm3の大きさの部分に脳をカット滅菌手術用はさみを使ってします。
  • 50 mL の円錐形遠心管に組織を転送し、約 0.32 M ショ糖液 30 mL を追加します。
  • スムーズな解決が達成されるまで滅菌手持ち回転式ホモジナイザーをホモジナイズしてください。
  • 0.32 M ショ糖液 90 mL の最終巻に均質化された脳を希釈します。
  • 6 38.5 mL 薄肉ポリプロピレン遠心チューブ、0.83 M ショ糖溶液の 20 mL を追加します。
  • 優しくホモ脳ソリューションを 2 つの層をミックスしないように世話 0.83 M ショ糖液の最上部に追加します。
  • 0.32 M ショ糖液各管のバランスをとる。
  • 100,000 × g で遠心する適切なを使用して 4 ° C の 45 分の事前超遠心機のローターを冷却しました。ロータ加速と減速を髄鞘の残骸の損失を低減する最小値に設定します。
  • ショ糖密度の 2 つのインタ フェースから髄鞘の残骸を収集します。
    注: 破片は管の中心に向かって白いバンドとして表示されます。
  • 50 mL の円錐形遠心チューブに原油ミエリンの破片を組み合わせるし、約 35 ml Tris· を使用して音量を調整します。Cl 緩衝液。
  • 30-60 秒の滅菌手持ち回転式ホモジナイザーを用いた原油の髄鞘の残骸を均質化します。
  • 6 きれいな遠心チューブと Tris· の適切な量とバランスの懸濁液を均等に分割します。Cl 緩衝液。
  • 100,000 × g で遠心する適切なを使用して 4 ° C の 45 分の事前超遠心機のローターを冷却しました。ローターの加速と減速を最大値に設定します。
  • 固体白いペレットが表示されます、上澄みを廃棄、再 Tris· の 10-15 mL にペレットを中断Cl 緩衝液。
  • 2 きれいな遠心チューブと Tris· の適切な量とバランスの懸濁液を均等に分割します。Cl 緩衝液。
  • 遠心分離機再び 4 ° C、適切なを使用しての 45 分の 100,000 × g で事前冷却遠心ローター。ローターの加速と減速を最大値に設定します。
  • 上澄みを廃棄し、5-6 mL の滅菌 PBS でペレットを再懸濁します前体重 1.5 mL マイクロ遠心チューブの適切な数の間の懸濁液を分割します。
  • 22,000 x g で 4 ° C で 10 分間遠心
  • 上澄みを廃棄し、髄鞘の残骸のペレットの重量を決定します。
  • 100 mg/mL の最終的な集中に PBS でペレットを再中断します。
    注: 10 から 12 の脳は 100 mg/mL の髄鞘の残骸の 10-15 mL を生成するのに十分です。髄鞘の残骸は、6 ヶ月間-80 ° c ストアをすることができます。
  • 髄鞘の残骸の蛍光標識
    1. 使用直前に 50 μ M carboxyfluorescein 染色エステル (CFSE) ソリューションを準備します。
      1. CFSE 100% ジメチルスルホキシド (DMSO) を 50 μ M の最終作業濃度と準備の 5 mM の原液を希釈滅菌 PBS を使用すると。
      2. 0.2 μ m のシリンジ フィルターを通してソリューションをフィルターします。
    2. 100 mg/mL の髄鞘の残骸の必要な量を解凍し、再滅菌の 29 g 針を停止できます。
      注: 髄鞘の残骸を凍結に使用する前に再懸濁が必要な解決から落ちる原因となります。
    3. あらかじめ重量を量られた 1.5 mL マイクロ遠心チューブに髄鞘の残骸を転送します。
    4. 14,800 x g で 4 ° C で 10 分間遠心上清を捨てます。
    5. ペレット 100 μ L ミエリン破片ごと CFSE ソリューションの 200 μ L に髄鞘の残骸を再懸濁します。
    6. 光から保護部屋の温度 (RT) で 30 分間インキュベートします。
    7. 14,800 x g で 4 ° C で 10 分間遠心上清を捨てます。
    8. 洗浄バッファーの 600-800 μ L でペレットを再懸濁します (0.2 μ m フィルター滅菌 PBS で 100 mM グリシン)。
    9. 14,800 x g で 4 ° C で 10 分間遠心上清を捨てます。
    10. 手順 2.3.8-2.3.9 倍を繰り返します。
    11. 最終的な洗浄後髄鞘の残骸のペレットの重量を決定して再滅菌 PBS と 100 mg/mL に中断します。
      注: ラベル付けされた髄鞘の残骸は最大 6 ヶ月間-80 ° c ストアをすることができます。

    • 3. 髄鞘の残骸貪食アッセイ

    注:以下は、蛍光に分類された髄鞘の残骸の貪食能を観察する基本的な方法です。他のトリートメントや実験条件の付加は調査官によって最適化する必要があります。

    1. 治療プレートの準備
      1. 各 145 mm プレート 10 mM エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) の 5-6 mL を使用して 15 mL コニカル遠心管にダルベッコ リン酸緩衝生理食塩水 (dPBS) (pH 7.4) の成熟した BMDMs を収集します。
        注:18細胞のアクティブ化の状態を変えるかもしれないので、トリプシンを使用しないでください。
      2. 集められたセルの各チューブに予め温めておいた CMCM の等しい量を追加します。
      3. 180 x g で 20 ° C で 8 分間遠心上清を捨てます。
      4. 再細胞 CMCM とカウントを中断します。
      5. 24 ウェル細胞培養プレートのウェルに CMCM の 1 mL で 1 x 10 の5セルを追加します。
      6. 37 ° c、5% CO2 24 時間孵化させなさい。
    2. 髄鞘の残骸処理と解析
      1. 100 mg/mL CFSE の 10 μ L (最終濃度が 1 mg/mL) 各ウェルに髄鞘の残骸のラベルを追加します。
      2. 37 ° C、5% CO21 3 時間孵化させなさい。
      3. 包まれている非髄鞘の残骸を削除する滅菌 PBS で 3 回プレートを洗います。
      4. 4% のパラホルムアルデヒドの 400 μ L を各ウェルに追加します。室温 30 分間インキュベートします。
      5. 滅菌 PBS で 2 回プレートを洗います。
      6. ヘキスト 33258 ソリューションの 400 μ L を各ウェルに追加します。光から保護された RT で 5 分間インキュベートします。
      7. 滅菌 PBS で 2 回プレートを洗います。
      8. 退色を抑える各ウェルに Tris バッファー フッ素ゲルの 200 μ L を追加します。
      9. 倒立のエピ蛍光ことができる顕微鏡を用いたイメージ セルです。
        注:CFSE の励起・発光波長が 494 nm と 521 nm、それぞれ。
      10. 相対的な髄鞘の残骸取り込みを決定する核の数によって CFSE 陽性細胞の数で割ります。
      11. 画像、前に光から保護 4 ° C で 7 日前までのプレートを維持します。

    4. オイル赤 O 染色による細胞内脂質の定量化

    注:髄由来の破片の細胞内の脂質を観察する基本的な方法は以下です。CFSE 髄鞘の残骸のラベルの使用はスペクトルの重なりによる染色オロの蛍光定量化のため推奨されません。他のトリートメントや実験条件の付加は調査官によって最適化する必要があります。

    1. 汚損の解決の準備
      1. 0.5% オイル赤い O (オロ) の染色液を準備します。
        1. ゆっくりとオロ (攪拌しながら 1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol) 0.5 g に 100 mL 100% プロピレング リコール (1, 2-プロパンジ オール) を追加します。
        2. 95 ° c 15 分またはすべての大きな粒子が溶解するまでソリューションを加熱します。
          注: 100 ° C 以上に加熱しないでください
        3. 新しいコンテナーにまだ暖かい間、フィルター紙を通じてソリューションをフィルターします。
        4. 室温は、1 年間し、RT。 ソリューションで一晩冷却ソリューションを格納できる許可します。
      2. 85% プロピレング リコール溶液を準備します。
        1. DdiH2o ・攪拌混合されるまでの 15 mL に 100% プロピレング リコールの 85 mL を追加します。室温は、1 年間にソリューションを保存できます。
    2. 治療プレートの準備
      1. 次のセクション 3 で説明する方法 24 ウェル プレートを準備します。
      2. 37 ° c、5% CO2 24 時間孵化させなさい。
    3. 髄鞘の残骸の治療
      1. (最終濃度が 1 mg/mL) 各ウェルに 100 mg/mL の髄鞘の残骸の 10 μ L を追加します。
      2. 37 ° C、5% CO21-3 時間孵化させなさい。
      3. 非消化髄鞘の残骸を削除する滅菌 PBS で 3 回プレートを洗います。
        この時点で、プレートは、即時固定を受けることができるかまたは新鮮な CMCM を追加でき、メモ: 追加の時間ポイントのインキュベーションに返されるセル。
      4. 4% のパラホルムアルデヒドの 400 μ L を各ウェルに追加します。室温 30 分間インキュベートします。
      5. 2 回で滅菌 PBS、染色からプレートを洗います。
    4. オロの染色と分析
      1. DdiH2o. で 3 回固定プレートを洗う
      2. 各ウェルに 100% プロピレング リコールの 400 μ L を追加し、室温 5 分間インキュベート
        注: これは ddiH2o. のキャリー オーバーを削減
      3. プロピレング リコールを吸引し、オロ ソリューションの 400 μ L を各ウェルに追加します。
      4. 60 ° C で 8 分間インキュベートします。
      5. オロ ソリューションを吸い出しなさい。各ウェルに 85% プロピレング リコールの 400 μ L を追加し、室温 5 minumintes インキュベート
      6. DdiH2o. で 3 回洗浄プレート
      7. ヘキスト 33258 ソリューションの 400 μ L を各ウェルに追加します。光から保護、常温 5 分間インキュベートします。
      8. 滅菌 PBS で 2 回プレートを洗います。
      9. 各ウェルに Tris バッファー フッ素ゲルの 200 μ L を追加します。
      10. 倒立のエピ蛍光ことができる顕微鏡を用いたイメージ セルです。オロは、標準テキサス赤や下流のフィルター セットを使ってイメージ化されることができます。
      11. 各イメージ フィールドにオロ肯定的な領域を決定する核の数で割って算出して相対的な脂質保持を定量化します。
      12. 4 ° C で 7 日間のプレートは、光から保護を維持します。

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    Representative Results

    CFSE は髄鞘の残骸のラベルと BMDMs の治療は、明確な内部 (図 2) を得られるはず。3 時間作用時間は下流の検出が確実に十分な追加された髄鞘の残骸の貪食に BMDMs のための十分なが、相互作用の 1 時間ほどの細胞内蓄積を観察できます。ただし、いくつかの髄鞘の残骸まだあるかもしれない細胞表面に洗浄後。これは不十分な洗浄またはない貪食の初期の段階で完全に内面化粒子が原因かもしれません。

    BMDMs することができます急速に髄鞘の残骸を内面化、ライソゾーム処理オロ染色脂質液滴を形成する前に必要です。BMDMs は示すために、髄鞘の残骸で 90 分間インキュベートし、洗浄し、固定および汚損 (図 3) 前に時間の追加量の培養されました。図 4は、および中性脂質外観と治療開始の遅れがあるを示します。また、文化の中には脂質の保持が不安定をする必要があります。BMDMs は、液滴形成後すぐに蓄積された脂質を代謝する開始されます。など、もはや洗濯離れて非包まれて髄鞘の残骸と固定の間 24 時間以上待機をお勧めします。

    オロすすけるエリアの定量化は、BMDMs (図 5) のミエリン脂質代謝の割合を示しています。90 分間相互作用期間に続いて細胞が新鮮な CMCM のインキュベーションに戻されました。新鮮な培地で初期の追跡期間中に、BMDMs は中性オロ染色脂質に貪食髄鞘の残骸脂質を代謝します。オロ肯定的な領域での着実な増加は次の相互作用時間で一般的です。24 時間後ただし、BMDMs effluxed を持っている、または代謝細胞内脂質の重要な部分。

    Figure 1
    図 1: 代表 BMDM 文化。いくつかの付着性のセルは最初観察します。3 日目、任意の非付着性のセルが削除されます。7 日で成熟した骨髄由来マクロファージが観察されます。スケール = 50 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

    Figure 2
    図 2: BMDM 髄鞘の残骸の貪食の代表画像アッセイします。セルが 1 mg/ml の髄鞘の残骸の洗濯および 4% で固定の前に 1 時間ラベル CFSE 扱われた PFA。内面化された髄鞘の残骸は、エピ蛍光ことができる顕微鏡の標準 GFP フィルタ セットを使用して視覚化できます。スケール = 50 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

    Figure 3
    図 3: オイル赤い O (オロ) 実験的なデザインの図。BMDM は、続いて洗濯と固定する前に新鮮な培地で培養、90 分間、1 mg/mL の髄鞘の残骸 (1: 100 希釈) と扱われます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

    Figure 4
    図 4: オロ染色 BMDM 次の髄鞘の残骸の貪食します。指定した時間点、BMDMs で PFA オロとヘキスト 33258 染色 4% 以下固定。各時点の代表的な画像が表示されます。スケール = 100 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

    Figure 5
    図 5: オロ染色の定量的画像解析します。染色オロの定量化, 3 井戸は 5 枚もの 20 X でイメージしました。すべてのイメージの取得設定は同一であった。誤差 = SEM. (n = 3)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

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    Discussion

    ここで説明する手順は、新鮮単離粗中枢神経系ミエリン破片とプライマリ骨髄由来マクロファージを利用します。動物の支出を減らすためには、両方の脳をお勧めします、犠牲の時に各マウスの骨髄細胞を収穫します。一緒に働く 2 つの研究者は、同時に両方の材料を準備できます。また、脳は髄鞘の残骸の分離前に抗生物質を添加した PBS で-80 ° C で保存できます。脳の私たちの経験は、髄鞘の残骸ポテンシャルのないかなりの損失とは、1 ヶ月のこれらの条件で維持できるとしています。

    CFSE は、その使いやすさと蛍光強度のための髄鞘の残骸のラベルに使用されます。染料のまま細胞エステラーゼ分子14酢酸グループを切断する焼入れ。解放された染色エステル グループ、細胞蛋白質14キャラクタリゼーションの結果一次アミドと反応できます。CFSE は興奮標準緑蛍光チャネルを使用して、異なるスペクトル特性を持つ市販いくつかの誘導体があります。したがって、複数の蛍光色素を用いた似たような貪食能アッセイを設計することが可能です。また、染料は容易に細胞膜を通過するためそれとしても使えますラベル アポトーシス細胞を同様の方法で髄鞘の残骸の19に注意する必要があります。さらに、本手法が標準画像解析、最適化、ユーザーに依存する一方定量化実行できますフローサイトメトリーまたはイメージング システム スループットの高い板を使用します。

    オイル赤 O (溶剤赤 27 またはスーダン赤 5 b とも呼ばれます) は、中性脂質は組織標本の染色に広く使用されている脂溶性の色素です。その深い赤色の色素沈着は、明視野と蛍光顕微鏡5,20の両方を介して細胞内脂質の可視化が可能です。蛍光顕微鏡を用いたオロ脂質液滴をステンド グラスの単一チャネル イメージングと堅牢な定量化のためことができます。染色法は簡単で再現性が高いが、試料中に注意が必要があります。染色の大幅な削減につながる細胞内の脂質を溶解することができます、アルコールや酸ベースの定着剤を使用しないことが重要です。さらに、任意の定量的画像解析と標準化されたイメージ キャプチャ設定と十分な公平なサンプリングの重要性を軽視することはできません。任意のサンプルの自己蛍光を考慮してコントロールを染色の使用勧めします。このような染色のコントロールは同じように扱う必要がありますが、自動蛍光バック グラウンドのレベルを測定するオロと左無染色します。そうであっても、私たちの画像解析法他脂質定量技術より以下の最適化が必要オロ抽出法21、標準曲線の準備を必要とする実験的変動を受けやすいが必要とサンプルの破壊。イメージ ベース解析の使用は、いくつかのそれは非破壊でするオロ抽出方法を伝統的に利点し、染色21,22と互換性のあります。

    最後に、記載されている手順は、比較的まっすぐ進む、それは適切な無菌テクニックが使用する、マクロファージが病原体関連分子パターン (PAMPS) エンドトキシンなどを認識する複数の受容器を表現するので重要ですリポ多糖 (LPS)23。細菌との相互作用の汚染はマクロファージ活性化の結果し、その関数24,25劇的な変化をすることができます。に関して収集された髄鞘の残骸、汚染のためにテストしてください。カブトガニ含まライセート (ラル) アッセイなどのエンドトキシン検出法は感度が高いとこのアプリケーション5,19以前使用されています。

    マクロファージ健康と病気の両方で重要な役割を果たしますが中枢神経損傷のコンテキストにおける BMDMs の役割は現在の調査の重要なトピック。ここで説明する方法を使用して、研究者は BMDMs によって髄鞘の残骸の貪食の機構を理解する開始できます。

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    Disclosures

    著者の開示があります。

    Acknowledgments

    著者は、グレン ・ サンガー ・ ホジソン、ビデオ制作、編集、音声のすべての彼の仕事のため旧ソ連医科大学、メディアの専門家に感謝したいと思います。

    この作品は、国立衛生研究所 (R01GM100474 および R01GM072611) によって支えられました。

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    DMEM GE Healthcare Life Sciences SH30243.01 High glucose with L-glutamine, sodium pyruvate
    Penicillin-Streptomycin Solution Corning 30-002-CI 100X Solution
    New Born Calf Serum (NCS) Rocky Mountain Biologics NBS-BBT-5XM United States Origin
    NCTC clone 929 [L cell, L-929, derivative of Strain L]  ATCC CCL-1 L929 Cell Line of Conditioned Media Preparation
    24-well Cell Culture Plates VWR 10062-896 
    Cell Culture Dish Greiner Bio-One 639960 Polystyrine, 145/20mm
    CFSE Cell Proliferation Kit Thermo Fisher C34570 DMSO for Reconsitution Provided
    Fluoro-gel with Tris Buffer  Electron Microscopy Sciences 17985-11
    Oil Red O Sigma Aldrich O0625
    Equipment
    Materials Company Catalog Number Comments
    Ultracentrifuge Tubes Beckman Coulter 326823 Thinwall, Polypropylene, 38.5 mL, 25 x 89 mm
    SW 32 Ti Ultracentrifuge Rotor Beckman Coulter 369650 SW 32 Ti Rotor, Swinging Bucket, Titanium
    Hand Held Rotary Homogenizer Fisher Science 08-451-71

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    References

    1. Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
    2. Unanue, E. R. Antigen-presenting function of the macrophage. Annu Rev Immunol. 2, 395-428 (1984).
    3. Cavaillon, J. M. Cytokines and macrophages. Biomed Pharmacother. 48 (10), 445-453 (1994).
    4. Ren, Y., Savill, J. Apoptosis: the importance of being eaten. Cell Death Differ. 5 (7), 563-568 (1998).
    5. Wang, X., et al. Macrophages in spinal cord injury: phenotypic and functional change from exposure to myelin debris. Glia. 63 (4), 635-651 (2015).
    6. Goodrum, J. F., Earnhardt, T., Goines, N., Bouldin, T. W. Fate of myelin lipids during degeneration and regeneration of peripheral nerve: an autoradiographic study. J Neurosci. 14 (1), 357-367 (1994).
    7. Greenhalgh, A. D., David, S. Differences in the Phagocytic Response of Microglia and Peripheral Macrophages after Spinal Cord Injury and Its Effects on Cell Death. J Neurosci. 34 (18), 6316 (2014).
    8. Sun, X., et al. Myelin activates FAK/Akt/NF-kappaB pathways and provokes CR3-dependent inflammatory response in murine system. PLoS One. 5 (2), e9380 (2010).
    9. Gensel, J. C., Zhang, B. Macrophage activation and its role in repair and pathology after spinal cord injury. Brain Res. , 1-11 (2015).
    10. Bourre, J. M., Pollet, S., Daudu, O., Le Saux, F., Baumann, N. Myelin consists of a continuum of particles of different density with varying lipid composition: major differences are found between normal mice and quaking mutants. Biochimie. 59 (10), 819-824 (1977).
    11. Larocca, J. N., Norton, W. T. Current Protocols in Cell Biology. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
    12. Norton, W. T., Poduslo, S. E. Myelination in rat brain: method of myelin isolation. J Neurochem. 21 (4), 749-757 (1973).
    13. Wang, X. Q., Duan, X. M., Liu, L. H., Fang, Y. Q., Tan, Y. Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester fluorescent dye for cell labeling. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 37 (6), 379-385 (2005).
    14. Parish, C. R. Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies. Immunol Cell Biol. 77 (6), 499-508 (1999).
    15. Deutsch, M. J., Schriever, S. C., Roscher, A. A., Ensenauer, R. Digital image analysis approach for lipid droplet size quantitation of Oil Red O-stained cultured cells. Anal Biochem. 445, 87-89 (2014).
    16. Kroner, A., et al. TNF and increased intracellular iron alter macrophage polarization to a detrimental M1 phenotype in the injured spinal cord. Neuron. 83 (5), 1098-1116 (2014).
    17. Trouplin, V., et al. Marrow-derived Macrophage Production. J Vis Exp. (81), e50966 (2013).
    18. Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function. J Immunol Methods. 426, 56-61 (2015).
    19. Guo, L., et al. Rescuing macrophage normal function in spinal cord injury with embryonic stem cell conditioned media. Mol Brain. 9 (1), 48 (2016).
    20. Bosco, D. B., et al. A new synthetic matrix metalloproteinase inhibitor reduces human mesenchymal stem cell adipogenesis. PLOS ONE. 12 (2), e0172925 (2017).
    21. Ramírez-Zacarías, J. L., Castro-Muñozledo, F., Kuri-Harcuch, W. Quantitation of adipose conversion and triglycerides by staining intracytoplasmic lipids with oil red O. Histochem. 97 (6), 493-497 (1992).
    22. Koopman, R., Schaart, G., Hesselink, M. K. Optimisation of oil red staining permits combination with immunofluorescence and automated quantification of lipids. Histochem Cell Biol. 116 (1), 63-68 (2001).
    23. Fang, H., et al. Lipopolysaccharide-Induced Macrophage Inflammatory Response Is Regulated by SHIP. J Immunol. 173 (1), (2004).
    24. Martinez, F. O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M. Macrophage activation and polarization. Front Biosci. 13, (2008).
    25. Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat Rev Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).

    Tags

    神経科学、問題 130、骨髄由来マクロファージ、貪食能、髄鞘の残骸、オイル赤い O、carboxyfluorescein サクシニミジルエステル、脊髄損傷、頭部外傷
    <em>体外</em>骨髄由来マクロファージによって髄鞘の残骸の貪食
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    Rolfe, A. J., Bosco, D. B.,… More

    Rolfe, A. J., Bosco, D. B., Broussard, E. N., Ren, Y. In Vitro Phagocytosis of Myelin Debris by Bone Marrow-Derived Macrophages. J. Vis. Exp. (130), e56322, doi:10.3791/56322 (2017).

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