Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Bioengineering

Fonksiyonel analiz bağırsak kök ve niş hücre Organoid sulandırma tahlil (ORA)

doi: 10.3791/56329 Published: November 20, 2017

Summary

Bağırsak organoid kültürler tüm kriptalarının kurulur ve kendini yenileme ve farklılaşma analizi bir hücre özgü biçimde izin vermez. Bu iletişim kuralı sulandırma sıralanmış kök (Lgr5+) açıklar ve neden olmaktadır organoids için onların önceki biyokimyasal ve genetik modifikasyon ve fonksiyonel analiz etkinleştirilirken (Paneth) hücreleri niş.

Abstract

Bağırsak epiteli tarafından son derece hızlı devir hızı ile karakterizedir. Memelilerde, 4-5 gün içinde tüm epitel astar yenilenir. Yetişkin bağırsak kök hücre Lieberkühn kriptalarının alt kısmında bulunan, Lgr5 gen ifade tarafından ayrılmış bulunmaktadır ve ile onların karakteristik yüksek proliferatif oranı1homeostazı korumak. İnce bağırsak boyunca Lgr5+ kök hücre Paneth hücreleri denilen özel salgı hücreleri ile iç içe. Paneth hücreleri antibakteriyel bileşikler (Yani, lizozim ve cryptdins/defensins) salgılar ve bağırsak florasının denetleme rolünü uygulamayın. Son zamanlarda, yeni bir işlev Paneth hücreleri, yani kendi kapasitesi Wnt3, EGF ve Dll12olarak birkaç anahtar ligandlar ile Lgr5+ kök hücreleri için niş destek sağlamak için keşfetti.

Ne zaman ex vivo izole ve belirli büyüme faktörleri ve hücre dışı matriks bileşenlerinin huzurunda kültürlü, tüm bağırsak kriptalarının için uzun ömürlü ortaya çıkmasına ve 3D yapılar kendini sürekli yenileyen denilen son derece crypt villus benzer organoids 3yetişkin ince bağırsak epitel mimarisi. Organoid kültürler, tüm kriptalarının kurulan zaman bireysel bileşenleri, yani Lgr5+ katkısı olsa adresleme olmadan kendini yenileme, çalışma ve bağırsak kök hücre niş farklılaşma izin ve Paneth hücreleri.

Burada, biz Paneth yeteneği yararlanır organoid tahlil için yeni bir yaklaşım tarif ve Lgr5+ hücreleri ilişkilendirmek ve organoids oluşturmak için zaman ortak kültürlü. Burada "organoid sulandırma tahlil" olarak adlandırılan bu yaklaşım (ORA), Paneth genetik ve biyokimyasal modifikasyonu sağlar veya Lgr5+ organoids sulandırma tarafından takip, kök hücre. Bu nedenle, iki ana bileşen bağırsak kök hücre niş fonksiyonel analiz sağlar.

Introduction

Bağırsak epitel memeli vücuttaki en hızlı kendini yenileyerek doku ve, bu nedenle, nesne kimliği ve Türbenin alt kısmında bulunan yetişkin kök hücrelerin fonksiyonel karakterizasyonu yönelik çalışmalar bir bolluk olmuştur Lieberkühn, ifade Lgr5 gen tarafından ayrılmış ve kurallı Wnt sinyal1bağımlı. Özellikle Lgr5+ kök hücre çevrili ve özel niş hücreleri, Yani da kendi olgunlaşma2için Wnt sinyal üzerinde bağlıdır Paneth hücreleri tarafından desteklenen. Birlikte, bu iki hücre tipleri öz-yenileme bağırsak epitel astar altında yatan ve günlük homeostatik denge korumak: Lgr5+ kök hücre hızla Böl ve yaratıcı için ortaya çıkmasına ve daha fazla bağırsak İhtisas epitel hücreleri; Paneth hücreleri sağlamak temel niş faktörler (örneğin, Dll1, Wnt3, EGF) için Lgr5+ kök hücreleri2. Kapasite organize ve kendini yenileyerek yapıları oluşturmak için kaplama ex vivo organoids veya "mini-cesaret", çağrıldığında bağırsak kriptalarının kendini yenileme gibi süreçleri içgörü sağlamak için deneysel bir araç olarak kullanan ve farklılaşma kanser4de dahil olmak üzere normal ve patolojik koşullarda. Organoid kültürlerden gelen çeşitli dokular, bağırsak, pankreas, karaciğer ve böbrek, fare ve insan örnekleri4de dahil olmak üzere kurulmuştur. Çıkarma yöntemi ve bu organoid kültürler geliştirmek için istihdam büyüme faktörleri doku özgü ve çoklu soy farklılaşma sürücü ve mümkün olduğunca özgün kök hücre niş taklit etmek için tasarlanmış içinde vivo. Organoids genetik hastalıklar tedavi, kanser tedavi edici etkinliği, ilaç toksisitesi analizi veya organogenesis vitro5çalışmanın değerlendirilmesi de dahil olmak üzere potansiyel uygulamalar olabilir.

Genel olarak, doku örnekleri kuruldu organoid kültürlerin ana sınırlama hücre-özgüllük olmaması. Örneğin, tüm bağırsak kriptalarının kurulan bağırsak organoids içinde doku kaynağı kapsıyordu hücresel bileşenleri tek tek analiz izin verme (örneğin, tüm kriptalarının içeren Lgr5+, Paneth, ve progenitör hücre).

Burada, ORA anılacaktır ve bağırsak organoid kültürler avantajlarını en temel bileşenleri, yani kök (Lgr5+) ve niş (Paneth) hücrelerin fonksiyonel analiz ile birleştiren yeni bir yöntem, açıklayın. Bu Paneth benzersiz yeteneği elde edilir ve fiziksel olarak ortak inkübe ve organoids2,6,10' a ortaya çıkmasına birbirleri ile ilişkilendirmek için Lgr5+ hücreleri. Biz bu özelliğin avantajlarından aldı ve iki hücre türleri tek tek izin vermeden önce onları organoids reconstitute önceden tedavi. Bunu yaparken, her hücre bileşeni herhangi bir verilen ilaç, büyüme faktörü, biyokimyasal inhibitörü, genetik modifikasyon veya önce sulandırma ve organoid oluşumu kimyasal işleme maruz kalabilirler. Bu nedenle, ORA tahlil kullanarak bir özel uyuşturucu tedavi veya genetik değişiklik kök hücre veya onların niş karşılığı belirli bir etkiye sahip olup olmadığını belirler belirlenmesi sağlayacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm yordamları yerel hayvan refah kanun ve kurallara göre yapıldı.

1. hazırlanması aletleri, kültür medya ve yemekleri

  1. Otoklav 1 dizi bağırsak makas, normal makas ve forseps steril bir kap içinde.
  2. Bir kuluçka 37 ° C'de bir 96-iyi (düz dipli) tabak yerleştirin
  3. 10 mL tam kültür ortamının malzemeleri tabloda listelenen reaktifleri ile hazır olun.
  4. Bir su banyosu içinde 37 ° C'de tam orta kuluçkaya.
  5. Tezcan bir buz kovası yerleştirerek membran Claudia adıyla yeniden düzenlendi. Sulandırılan membran 4 ° C'de sıvı hale gelir.
  6. 4 Petri yemekler soğuk fosfat tamponlu tuz veya kısaltılmış PBS (4 ° C) doldurun.

2. izolasyon küçük bağırsak kriptalarının

  1. CO2 inhalasyon tarafından Lgr5- eGFP-DDE'ler-CreERt2 fare C57BL6/J arka plan üzerinde kurban. Karın zarını boyuna makas çifti ile incelemek.
  2. Mide Forseps ile tutun ve transversally ikiye kesilmiş.
  3. Şu andan itibaren bağırsak makas kullanırken, bağırsak çekin ve PBS içeren bir kabında yerleştirin.
    Not: Bağırsak makas keskin bir ve künt bir ipucu var. Bu makas künt ucu crypt-villus mimari bağırsak açılırken zarar vermemesi gerekiyordu.
  4. Künt ipucu mide yerleştirerek başlayın ve yavaşça mide itin. Makas ile kesme ve Forseps ile çekerek devam edin.
  5. Bir kez tüm ince bağırsak boyuna açıldı, soğuk PBS Forseps ile tutarak yıkayın ve yavaşça U şeklindeki hareketleri ile PBS çözümde durulayın.
  6. Bir kez tüm dışkı artıkları temizlenir, bağırsak luminal tarafı yukarı bir kesme tahtası üzerinde dümdüz devam edin. Kan damarları yokluğu ve dış kısmı ile karşılaştırıldığında soluk görünümü tarafından kolayca tanınabilir luminal takımıdır.
  7. Bir cam slayt ile düzleştirilmiş bağırsak kazıma villus yavaşça çıkarın. İki kez dokunun tüm uzunluğu boyunca bu adımı gerçekleştirin.
  8. Bağırsağın bir steril cerrahi bıçak ile 2-5 mm parçalar halinde kesin.
  9. Küçük bağırsak parçaları buz soğuk PBS 10 mL içeren bir 50 mL tüp içinde yerleştirin.
  10. Onları yukarı ve aşağı içinde PBS pipetting tarafından kalan herhangi bir yabancı maddelerin kaldırılması doku parçaları, temiz. Süpernatant atın ve PBS tamamen temizlenene kadar bu adımı yineleyin.
  11. 15 mL soğuk PBS PBS son hacmi 25 mL getirmek için ekleyin. 2 mM ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) eklemek ve bir silindir 4 ° C'de 45 dk için kuluçkaya
  12. PBS/EDTA atmak.
  13. PBS 10 mL ekleyin ve doku parçaları yukarı ve aşağı (en az üç kez) pipetting sert tarafından kriptalarının ayır. Süpernatant toplamak.
  14. Adımı yineleyin 2,13 dört kez. Kültür son hacmi 50 mL ulaşmak için orta ekleyin.
  15. Santrifüjü (5 min için 300 x g) tarafından hücreleri cips.
  16. Pelet 10 mL kültür orta resuspend ve aralıklarla (3 dk 80 x g) tarafından kriptalarının cips.

3. tek hücre hazırlık

  1. Süpernatant pelleted kriptalarının atın ve onları 1 mL tripsin benzeri-enzimler ile birlikte 50 µL resuspend Dnaz (50 µg/mL).
  2. Bir su banyosu için 2 dk 32 ° C'de hücrelerde kuluçkaya.
  3. Kültür orta 10 mL ekleyin. Kriptalarının sert yukarı ve aşağı en az 5 kez pipetting tarafından tek hücrelere ayırmak.
  4. Çözüm (kümeleri ve diğer yabancı maddelerin ortadan kaldırmak için) 40 µm süzgeç aracılığıyla filtre ve 300 x g 5 min için de tek hücre.

4. Akış Sitometresi ve kaplama

  1. 50 mL 1 x Hank tamponlu tuz solüsyonu veya HBSS/2% fetal inek serum (FCS) çözüm hazırlamak ve Pelet her 106 hücreler için 1 ml resuspend
  2. Hücre süspansiyon BV421 Lin- (CD31, CD45, TER119), 1: 100 ve CD24 APC ve CD117-PE her iki konsantrasyon için 30 dk 1:250 antikorların bir konsantrasyon, ekleyin.
  3. Sıralama Lgr5+ kök hücre ve ayrı düşük Paneth hücreleri bağlamak tüpler. İletişim kuralları için sıralama hakkında ayrıntılı bilgi için Lgr5+ ve Paneth hücreleri, lütfen bakın Roth vd. 7 ve Schewe vd. 6
    1. 300 x g 5 dakika süreyle de sıralanmış hücreleri 1.3 olduğu gibi açıklanan bileşenleri ile 100 µL orta hücrelerde Resuspend santrifüj ( Tablo reçetesigörmek).
  4. Paneth hücreleri (örneğin, kimyasal ve genetik modifikasyonu ile) tedavi (n = 2000) veya Lgr5+ kök hücre (n = 2000).
    1. Hücreleri tedavi için toplam hacmi 100 µL kültür orta ve küçük müdahale RNA (siRNA) 100 bir konsantrasyon, lipozom aracılı transfection reaktif 5 µL kullanın nM. 37 ° C'de siRNA için veya seçilen değiştirilmesi için gerekli süre 30 dk için kuluçkaya.
  5. 500 µL kültür orta iki kez hücrelerde yıkayın.
  6. 300 x g 5 min için de santrifüj kapasitesi ve 10 µL kültür orta hücrelerde resuspend.
  7. İki hücresel bileşenleri havuz (Paneth veya Lgr5+ hücreleri) 20 µl Toplam hacim ve RT., 5 min için 300 x g, santrifüj
  8. Paneth co kuluçkaya ve RT., 10 dk Lgr5+ hücreleri
  9. 10 µL süpernatant, kaldırmak ve bir Menisküs sıvı emin olmak için hücre Pelet Aspire edin değil bırakın.
  10. Toplam hacmi 40 µL için hücreleri Sulandırılan membran 30 µL eklemek, hücreleri resuspend ve Önceden ısıtılmış bir 96 iyi tabak içinde plakası. 10 dakika sonra tam orta 200 µL ekleyin ( Tablo reçetesigörmek). Değişim orta her 48 h.
  11. Organoid çeşitlilik gün 5 say.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Organoid sulandırma tahlil küçük müdahale RNA Apc gen tarafından (siRNA) aşağıda gösterildiği bağırsak epitel temel niş ve kök hücre bileşenlerinin ayrı fonksiyonel analiz sağlar.

Bu amaca ulaşmak için ilk floresan aktif hücre (FACS) 8000 Lgr5+ hücreleri ve 6000 Paneth hücreleri doğuştan C57BL6/J fareler ayırmak için sıralama kullanılmıştır. Şekil 1a', bir akış ORA testin tasvir edilir. Organoid sulandırma kapasitesi değerlendirildi Apc mRNA karşı yönetmen siRNA oligonucleotides ile Lgr5+ hücreleri kuluçka tarafından veya bir denetim olarak şifreli bir sıra (SCR) kapsayan. Kullanımdan sonra aynı siRNA tedavi Lgr5+ hücreleri ya doğrudan organoid orta/yeniden membran içinde kaplama veya tedavi edilmemiş Paneth hücreleri eşit sayıda ile inkübe ve daha sonra dışarı kaplama. Bir denetim olarak tedavi edilmezse Lgr5+ hücreleri yalnız kaplama (Yani, Paneth hücreleri olmadan) tedavi edilmezse Lgr5+ hücrelerden türetilmiş organoids sayısını belirlemek için. Ayrıca, ek bir denetim Paneth hücreleri yalnız arka plan Paneth-Lgr5 hücre birini Paneth hücre kapıda sıralanmış kirlenme türetilen organoid oluşumu olup olmadığını denetlemek için kaplama. Beklendiği gibi fare Apc gen Lgr5+ kök hücre (ve sonuçta elde edilen aktivasyonu kurallı Wnt/β-catenin sinyal) siRNA aracılı nakavt olumlu kıyasla organoid çokluğu etkilenen tedavi edilmemiş meslektaşları veya şifreli denetimi (şekil 1B). Kurucu Wnt harekete geçirmek de daha önce raporlanmış1Paneth hücreleri, gereksinimini kurtarıldı. Ayrıca, bu organoids gibi içi boş küre (pulcuklarının), bir de açıklanan fenotip Apciçin ortaya çıktı-mutant veya organoids (şekil 1 c, panel 1), Wnt uyarılmış bu Paneth-Lgr5 hücreden elde edilen morfolojisi ile karşılaştırıldığında birini (1 C rakam, panel 2)8,9. Toplu olarak, bu sonuçlar o başlamaktan göstermek Paneth hücreleri ve Lgr5+ hücreleri hücre özel mekanizmalar içinde bu iki hücre tipleri; fikir verebilir onların hücre kompozisyon organoids Morfoloji yansıtan bu yana mikroskobu tarafından organoids morfolojik analiz bu açıdan değerli olabilir (örneğin, pulcuklarının teşkil tarafından Lgr5+ sadece hücreleri). Dikkate alınması gereken bir başka önemli organoid (örneğin, crypt tomurcuklanma olay sayısı) karmaşıklığı parametredir.

Figure 1
Şekil 1. SiRNA etkisini aracılı nakavt Apc Lgr5+ hücreleri. Deneysel işlemin (A) akış çizelgesi. Lgr5 EGFP muhabir fareler (Lgr5EGFP-DDE'ler-creERT2)1 Lgr5+ bir kaynak kök hücreler sıralı olarak istihdam. Paneth hücreleri belirtilen ve yukarıda açıklanan6,7olarak sıralanmış. (B) Organoid çokluğu Lgr5+ kök hücre ve Paneth sulandırma hücreler görülmektedir. Belirtilen hücreleri ile ön işleme ne zaman siRNA oligonucleotides Apc karşı (siRNA Apc) Yönetmen veya (SCR) denetim sırası şifreli. Yıldız işaretlerini istatistiksel olarak anlamlı farklılıklar göstermektedir (n = 3, * p < 0,05 ** p < 0.001). Hata çubukları SD (1) Lgr5+ hücrelere başvurmak, SCR, (3) Lgr5+ hücreleri siRNA Apc, (4) Lgr5+ hücreleri + Paneth hücreleri, (5) Lgr5hücreleri (2) Lgr5+ + hücreleri siRNA Apc + Paneth hücreleri, (6) Paneth hücreleri. (C) organoids temsilcisi görüntüleri (1) Lgr5+ hücreleri siRNA Apc, (2) Lgr5+- Paneth hücreleri türetilmiş. Ölçek çubuğu 10 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ORA iki temel bileşenleri bağırsak kök hücre niş, yani Lgr5+ ve Paneth hücreleri rafine fonksiyonel analiz sağlar. Bu yaklaşım daha önce bize ve diğerleri tarafından hafif değişiklikler6,10,11ile istihdam edilmiştir. Burada, ORA yordamı bir tekrarlanabilir ve standart laboratuvar iletişim kuralı olarak mevcut. Ayrıca, biz Lgr5+ kök hücre, Apc downregülasyon etkileri genetik uygulama imkanı örnek olarak rapor (ya da biyokimyasal6) sıralanmış hücresel bileşenleri değişiklikler. Toplu olarak, bu siRNA verileri göstermek APC'nin aracılı nakavt geliştirir Lgr5+ hücre, kök hücre işlevi artan organoid çokluğu (şekil 1B) tarafından belirtildiği gibi.

Bağırsak 3D organoid kültürler kullanmanın birçok yararları zaten değerlendirmeleri4özellikle için karşılaştırıldığında onların organizasyon çarpıcı benzerlik crypt-villus mimarisi içinde vivo, bununla da dahil olmak üzere, listede var Standart 2D kültür yöntemleri ölümsüzleştirdi hücre hatları ile gelen Mimarlık. Ancak, bu yöntemin önemli sınırlamaları vakalarının çoğu özellikle, kök ve niş içinde kültürler tüm bağırsak kriptalarının tek tek bileşenlerini ve fonksiyonel analiz izin vermeyen bir süreç kurulan organoid biri hücreleri, burada Lgr5+ ve Paneth hücreleri, sırasıyla temsil ediyor.

ORA bu sınırlamalarının üstesinden gelir. Kök ve niş hücreler ayrı ayrı--dan belgili tanımlık hayvan sıralanmış ve organoids oluşturmak için yeniden düzenlendi. Bu nedenle, bu yaklaşım belirli genetik değişiklikler taşıyan istihdam her iki fare modelleri tarafından bu iki hücresel bileşenleri fonksiyonel analiz sağlar veya belirli stres faktörlerine (örneğin, DSS ve/veya özel diyetler); maruz veya doğrudan genetik olarak sıralanmış hücreleri değiştirerek (siRNA, CRISPR-Cas9) ya da biyokimyasal olarak, önce onları organoids oluşturmak için başlamaktan. Çeşitlilik, Morfoloji, kendini yenileme kapasitesi ve elde edilen organoids farklılaşma (ve sonunda metaplastic değişiklikleri kapsamını) fonksiyonel okuma istihdam edilebilir. Morfolojik bir etkisi belirgin, olmadığında siRNA gibi genetik manipülasyon durumunda hücreleri bir saat geçtikten sonra transfection mRNA ilgi nakavt doğrulamak için analiz edilmelidir. Paneth ve Lgr5+ gelen bu iki hücre türleri ve farklı bir organoid değişmiş Hofstede kök ve niş hücrelerde farklı mutasyon neden olup olmadığını incelemek için farklı mutasyon ile genetik fareler de sıralanabilir oluşumu verimliliği ve/veya morfolojisi.

Villus (Adım 2.7) kaldırılması ve HBSS/2%FCS (Adım 4.1) hücrelerde resuspension protokol içinde önemli adımlardır. Villus çıkartılmasıdır Paneth zenginleştirmek için kritik ve Lgr5+ hücreleri bulunan alt üçüncü kriptalarının ve sıralama verimliliğini artırmak için. FACS protokolleri yaygın olarak PBS/FCS hücrelerde sıralama önermek rağmen HBSS PBS yerine kullanımı arttı ve hücre canlılığı sıralama süre boyunca istikrarlı devam etti. Diğer önemli adımları 4.7 ve 4.8, fiziksel yerde adımlardır Paneth Derneği ve Lgr5+ hücre bu soy artış organoids için sonunda verecektir formu birini için sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Hiçbir rakip finansal faiz veya diğer çatışmaları yazarlar var

Acknowledgments

Bu çalışmada Hollanda Kanser Derneği (KWF; fon tarafından mümkün yapıldı EMCR 2012-5473) ve dünya kanser araştırma fonları International (WCRF; Proje No 2014-1181)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Advanced DMEM F12 * Thermo Fisher Scientific 12634-010
Glutamax * Thermo Fisher Scientific 35050061 Final concentration: 10 mM
Penicillin/streptomycin * Thermo Fisher Scientific 15140122 Final concentration: 1%
Hepes * Thermo Fisher Scientific 15630080 Final concentration: 10 mM
Recombinant murine EGF * Thermo Fisher Scientific PMG8041 Final concentration: 50 ng/ml
Recombinant murine Noggin * Peprotech 250-38 Final concentration: 100 ng/ml
y27632 * Sigma Y0503 Final concentration: 10 µM
Jagged-1 * Anaspec Bio AS-61298 Final concentration: 1 µM
Recombinant murine R-spondin * R&D systems 3474-RS-050 Final concentration: 1 mg/ml
Flexitube Gene solution siRNA APC Qiagen GS11789 Final concentration: 100 nM
Lipofectamine 2000 Thermo Fisher Scientific 11668019
CD24 APC Biolegend 101814
c-kit PE Biolegend 105808
BV 421 CD31 Biolegend 102424
BV 421 CD45 Biolegend 103134
BV421 TER119 Biolegend 116234
HBSS Thermo Fisher Scientific 14180046
B6.129P2-Lgr5tm1(cre/ERT2)Cle/J Jackson Laboratories 008875
Low binding tubes Eppendorf Z666548-250EA
Matrigel Corning 356230
* The combination of these reagents constitutes the complete culture medium

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449, 1003-1007 (2007).
  2. Sato, T., et al. Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts. Nature. 469, 415-418 (2011).
  3. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
  4. Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165, 1586-1597 (2016).
  5. Cantrell, M. A., Kuo, C. J. Organoid modeling for cancer precision medicine. Genome Med. 7, 32 (2015).
  6. Schewe, M., et al. Secreted Phospholipases A2 Are Intestinal Stem Cell Niche Factors with Distinct Roles in Homeostasis, Inflammation, and Cancer. Cell Stem Cell. 19, 38-51 (2016).
  7. Roth, S., et al. Paneth cells in intestinal homeostasis and tissue injury. PLoS One. 7, e38965 (2012).
  8. Rodriguez-Colman, M. J., et al. Interplay between metabolic identities in the intestinal crypt supports stem cell function. Nature. 543, 424-427 (2017).
  9. Dow, L. E., et al. Apc Restoration Promotes Cellular Differentiation and Reestablishes Crypt Homeostasis in Colorectal Cancer. Cell. 161, 1539-1552 (2015).
  10. Yilmaz, O. H., et al. mTORC1 in the Paneth cell niche couples intestinal stem-cell function to calorie intake. Nature. 486, 490-495 (2012).
  11. Igarashi, M., Guarente, L. mTORC1 and SIRT1 Cooperate to Foster Expansion of Gut Adult Stem Cells during Calorie Restriction. Cell. 436-450 (2016).
Fonksiyonel analiz bağırsak kök ve niş hücre Organoid sulandırma tahlil (ORA)
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Schewe, M., Sacchetti, A., Schmitt, M., Fodde, R. The Organoid Reconstitution Assay (ORA) for the Functional Analysis of Intestinal Stem and Niche Cells. J. Vis. Exp. (129), e56329, doi:10.3791/56329 (2017).More

Schewe, M., Sacchetti, A., Schmitt, M., Fodde, R. The Organoid Reconstitution Assay (ORA) for the Functional Analysis of Intestinal Stem and Niche Cells. J. Vis. Exp. (129), e56329, doi:10.3791/56329 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter