Dendrimer-basierte ungleiche Nanopatterns, lokal Steuerfläche Haftfähigkeit: eine Methode, um direkte Chondrogenic Differenzierung
Summary
Eine Methode, um Dendrimer-basierte ungleiche Nanopatterns zu erhalten, die die nanoskaligen Kontrolle über lokale Arginin Glycin Asparagin (RGD) Oberfläche Säuredichte ermöglichen ist beschrieben und für das Studium der Zelldifferenzierung Adhäsion und Chondrogenic angewendet.
Abstract
Zelluläre Adhäsion und Differenzierung ist bedingt durch die nanoskaligen Disposition Bestandteile der extrazellulären Matrix (ECM) mit lokalen Konzentrationen, die eine große Wirkung. Hier präsentieren wir Ihnen eine Methode, um groß angelegte unebenen Nanopatterns von Arginin-Glycin-Asparaginsäure (RGD) zu erhalten-funktionalisierten Dendrimere, die es die nanoskaligen Kontrolle der lokalen RGD ermöglichen Oberfläche Dichte. Nanopatterns von Oberfläche Adsorption von Dendrimere aus Lösungen in verschiedenen ursprünglichen Konzentrationen gebildet werden und zeichnen sich durch Wasser Kontaktwinkel (CA), Röntgen-Photoelektronen-Spektroskopie (XPS) und scanning Mikroskopiertechniken wie z. B. Sonde Scanning tunneling Microscopy (STM) und Rasterkraftmikroskopie (AFM). Die lokalen Oberflächendichte des RGD wird gemessen mit AFM Bilder mittels Wahrscheinlichkeit Konturkarten der Oberflächenkräfte Mindestabstände und dann korreliert mit Zell-Adhäsion-Antwort und Differenzierung. Die hier vorgestellte Methode der Nanopatterning ist ein einfaches Verfahren, das auf einfache Weise zu großen Flächen skaliert werden kann. Es ist daher voll kompatibel mit Zelle Kultur Protokolle und kann auch auf andere Liganden, die Konzentration-abhängige Effekte auf Zellen ausüben.
Introduction
Hier beschreiben wir eine einfache und vielseitige Dendrimer-basierte Nanopatterning Prozedur Zelloberflächen Kultur zu erhalten, die der Kontrolle der lokalen Haftfähigkeit im Nanobereich zu ermöglichen. Nanoskalige Details der ECM-Organisation wurden gemeldet,1,2,3 und die Nanopatterning der Zelle Klebeflächen hat tiefe Einblicke in die zellulären Anforderungen in Bezug auf Haftung4zur Verfügung gestellt, 5. Experimente mit Mizellen Lithographie-basierte Nanopatterns ergab einen Schwellenwert von etwa 70 nm für RGD Peptid Nanospacing, Zelladhäsion verzögert deutlich über diesem Wert6,7,8 ,9. Diese Studien hervorgehoben, auch die größeren Einfluss der lokalen als globale Liganden Dichte Zelle Adhäsion9,10,11.
Während der Morphogenese auslösen Zell-Interaktionen mit der Umgebung die ersten Differenzierung Ereignisse, die fortfahren, bis endgültige komplexer Gewebestrukturen gebildet haben. In diesem Rahmen wurden Nanopatterned Oberflächen gegen den Einfluss der anfänglichen Zelloberfläche Interaktionen auf Morphogenese verwendet. Lithographie-basierte RGD Nanopatterns mit einem seitlichen Abstand von 68 nm in β-Typ Ti-40Nb Legierungen Hilfe weiterhin die undifferenzierten Phänotyp nicht begangen Stammzellen12, während RGD Nanospacings der zwischen 95 und 150 nm die Differenzierung der erhöhen mesenchymale Stammzellen (MSCs) in Richtung adipogenen/osteogene13,14,15 und Chondrogenic Schicksale16. Auch wurden selbstorganisierende Makromoleküle mit Signalisierung Komponenten geändert, Zelladhäsion und Differenzierung zu lenken, durch die Bereitstellung von nanoskaligen architektonische Verordnung der Signalisierung Cues17gezeigt. In diesem Zusammenhang wurde die Ablagerung von Dendrimere mit Zelle Interaktion Moieties in ihre äußere Kugel18,19,20 auf Oberflächen verwendet, um die Zelle Adhäsion21,22zu studieren, Morphologie23,24und Migration Veranstaltungen25,26. Allerdings erschwert der Mangel an Oberflächencharakterisierung in diesen Studien keinen Zusammenhang zwischen Dendrimer Oberflächengestaltung und Zell-Antwort zu etablieren.
Dendrimer-Nanopatterns mit Flüssigkeit-wie Ordnung und definierten Abstand erhalten Sie beim Dendrimere aus Lösungen mit geringen Ionischen stärken zu niedrig geladene Oberflächen adsorbieren. 27 auf der Grundlage dieser Eigenschaft, hier präsentieren wir eine Methode, um groß angelegte unebenen Nanopatterns RGD funktionalisiert Dendrimere auf Low-geladene Oberflächen zu erhalten, die die nanoskaligen Kontrolle über lokale RGD Oberflächendichte ermöglichen. Wasser Kontaktwinkel (CA), Röntgen-Photoelektronen-Spektroskopie (XPS) und Scannen Sonde Mikroskopie-Techniken (STM und AFM Nanopatterns) zeigen, dass lokale Liganden dichten ändern die anfängliche Dendrimer-Konzentration in Lösung angepasst werden können. Die lokalen RGD Oberflächendichte ist durch Wahrscheinlichkeit Konturkarten der Oberflächenkräfte Mindestabstände von AFM Bilder quantifiziert und dann mit Zellexperimente korreliert. Verglichen mit anderen Nanopatterning Techniken4, Dendrimer-basierten Nanopatterning ist unkompliziert und kann leicht bis auf großen Flächen, so wird voll kompatibel mit Zelle Kultur Anwendungen skaliert werden. Nanopatterns werden als bioaktive Substrate zur Bewertung der Wirkung der lokalen RGD Oberfläche Dichte Zelle Adhäsion28 und auf die Chondrogenic Induktion der Erwachsenen menschlichen MSCs-29. Unsere Ergebnisse zeigen, dass RGD Dendrimer-basierte Nanopatterns Zelle Wachstum aufrechtzuerhalten und Zelladhäsion durch hohe lokale RGD Oberfläche dichten verstärkt wird. In den Experimenten Differenzierung begünstigt intermediate Haftfähigkeit der Zellen auf den Substraten MSC Kondensation und frühen Chondrogenic Differenzierung. Wegen der Leichtigkeit, mit welcher, die Dendrimer Randgruppen geändert werden können, kann die hier beschriebene Methode zu anderen ECM-Liganden erweitert werden, die Konzentration-abhängige Effekte auf Zellen ausüben.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bei der Entwicklung des Protokolls beschrieben sollte eine Reihe von kritischen Schritte berücksichtigt werden. Die erste bezieht sich auf Nanopattern Charakterisierung mit Scan-Sonde-Mikroskopie-Techniken. Um die Nanopatterns sichtbar zu machen, muss die Oberfläche, wo Musterung entsteht liegt der Rauheitswert unterhalb der mittlere Durchmesser der Dendrimere, was ungefähr 4 – 5 nm gemessen an STM (Abbildung 1 b). Auch sollte berücksichtigt werden, dass hochauflösende STM Bildgebung auf leitfähi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren erkennen Oriol Font-Bach und Albert G. Castaño für ihre Hilfe bei dmin Quantifizierung. Sie erkennen auch die erweiterte digitale Mikroskopie Einheit am Institut für Forschung in der Biomedizin (IRB Barcelona), die Autoren, die das Video in ihren Räumlichkeiten aufnehmen zu lassen. Diese Arbeit wurde durch die Vernetzung Biomedical Research Center (CIBER), Spanien unterstützt. CIBER ist eine Initiative der VI National R & D & i Plan 2008-2011, Iniciativa Ingenio 2010, Consolider Programm, CIBER Aktionen und das Instituto de Salud Carlos III, mit Unterstützung des Europäischen Fonds für regionale Entwicklung finanziert. Diese Arbeit wurde unterstützt durch die Kommission für Universitäten und Forschung der Abteilung für Innovation, Universitäten und Unternehmen von der Generalitat de Catalunya (2014 SGR 1442). Es wurde auch von den Projekten OLIGOCODES (Nr. finanziert. MAT2012-38573-C02) und CTQ2013-41339-P, verliehen durch das spanische Ministerium für Wirtschaft und Wettbewerbsfähigkeit, zusätzlich zu INTERREG V-A Spanien / Portugal 2014-2020 POCTEP (0245_IBEROS_1_E). C.R.P. erkennt finanziellen Unterstützung vom spanischen Ministerium für Wirtschaft und Wettbewerbsfähigkeit gewähren (No. IFI15/00151).
Materials
| Gold (111) on mica. 1.4×1.1 cm | Spi Supplies | 466PS-AB | |
| Glass micro slides, plain | Corning | 2947-75×25 | |
| Deionized water | Millipore | 18MΩ cm | |
| Ethanol 96% | PanReac | 131085.1212 | |
| L-Lactide/DL-Lactide copolymer | Corbion | 95/05 molar ratio | |
| 1,4 – dioxane | Sigma-Aldrich | 296309-1L | |
| Silicone oil, high temperature | Acros Organics | 174665000 | |
| Spinner | Laurell | WS-650MZ-23NPP/Lite | |
| Tissue culture laminar flow hood | Telstar | Bio II Advance | Class II biological safety cabinet |
| Filter unit | Millex-GP | SLGP033RB | 0.22 µm |
| Syringe 10 mL | Discardit | 309110 | |
| Atomic Force microscope | Veeco Instruments | Dimension 3000 AFM instrument | |
| Silicon AFM probes | Budget Sensors | Tap300AI-G | Resonant Freq. 300 kHz, k = 40 N/m |
| Scanning tunneling microscope | Molecular Imaging | PicoSPM microscope | |
| Pt0.8:Ir0.2 wire | Advent | PT671012 | Diameter 0.25 mm |
| WSxM 4.0 software | Nanotec electronica | ||
| Optical contact angle (CA) system | Dataphysics | ||
| SCA20 software | Dataphysics | ||
| X-ray photoelectron spectrometer | Physical Electronics | Perkin-Elmer PHI 5500 Multitechnique System | |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | F1141-1MG | 1.0 mL solution |
| Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (DPBS) | Gibco | 21600-10 | Powder |
| Mouse embryo fibroblasts | ATCC | ATCC CRL-1658 | NIH/3T3 |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) liquid high glucose | Gibco | 11960044 | liquid high glucose, no glutamine, 500 mL |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000044 | 500 mL |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | 200 mM (100X) |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
| Sodium pyruvate | Invitrogen | 11360039 | 100 mL |
| T75 culture flasks | Nunclon | 156499 | |
| Trypsin | Life Technologies | 25200072 | 0,25% EDTA |
| Centrifuge | Hermle Labortechnik | Z 206 A | |
| Non-tissue culture treated plate, 12 well | Falcon | 351143 | Non-adherent |
| Adipose-derived hMSCs | ATCC | ATCC PCS-500-011 | Cell vial 1 mL |
| MSC basal medium | ATCC | ATCC PCS-500-030 | |
| MSC growth kit | ATCC | ATCC PCS-500-040 | Low serum |
| Chondrocyte differentiation tool | ATCC | ATCC PCS-500-051 | |
| Formalin solution | Sigma-Aldrich | HT5011-15ML | neutral buffered, 10% |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434-500G | for molecular biology, suitable for cell culture, ≥99.5% |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036-50G-F | for molecular biology, used as non-ionic surfactant, adjuvant |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3059-50G | |
| Rabbit monoclonal [Y113] anti-paxillin antibody | Abcam | ab32084 | Diluted 1:200 |
| Mouse monoclonal [1F5] anti-collagen alpha-1 XX chain | Acris Antibodies | AM00212PU-N | Diluted: 1:400 |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody | Invitrogen | A10667 | 2 mg/mL. Diluted 1:1000 |
| Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody | Invitrogen | A11036 | 2 mg/mL. Diluted 1:1000 |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | H3570 10ML | 10 mg/mL. Diluted 1:1000 |
| Cover glass 24×24 mm | Deltalab | D102424 | |
| Fluoromount | Sigma-Aldrich | F4680-25ML | |
| Epifluorescence Microscope | Nikon | Eclipse E1000 upright microscope | with a CCD camera |
| Confocal Microscope | Leica Microsystems | Leica SPE Upright Confocal Microscope | |
| ImageJ 1.50g freeware | http://imgej.nih.gov/ij | ||
| MATLAB software | The MATHWORKS, Inc. | ||
| OriginPro 8.5 software | OriginLab Coorporation |
References
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