Dendrimer-आधारित असमान Nanopatterns को स्थानीय रूप से नियंत्रित करने के लिए सतह चिपकने वाला: एक विधि Chondrogenic भेदभाव प्रत्यक्ष करने के लिए
Summary
dendrimer प्राप्त करने के लिए एक विधि-आधारित असमान nanopatterns कि स्थानीय arginine के नेनो नियंत्रण की अनुमति-glycine-एसपारटिक एसिड (RGD) सतह घनत्व का वर्णन किया गया है और सेल आसंजन और chondrogenic भेदभाव के अध्ययन के लिए आवेदन किया ।
Abstract
सेलुलर आसंजन और भेदभाव extracellular मैट्रिक्स (ECM) घटकों के नेनो स्वभाव से वातानुकूलित है, स्थानीय सांद्रता एक प्रमुख प्रभाव होने के साथ । यहां हम arginine-glycine-एसपारटिक एसिड (RGD) के बड़े पैमाने पर असमान nanopatterns प्राप्त करने के लिए एक विधि प्रस्तुत है कि स्थानीय dendrimers सतह घनत्व के नेनो नियंत्रण की अनुमति कार्यात्मक । Nanopatterns अलग प्रारंभिक सांद्रता पर समाधान से dendrimers की सतह सोखना द्वारा गठित कर रहे है और जल संपर्क कोण (सीए), एक्स-रे photoelectron स्पेक्ट्रोस्कोपी (XPS), और स्कैनिंग की जांच माइक्रोस्कोपी तकनीक की विशेषता के रूप में कर रहे है स्कैनिंग सुरंगिंग माइक्रोस्कोपी (STM) और परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (AFM). RGD के स्थानीय सतह घनत्व न्यूनतम कण दूरी की संभाव्यता समोच्च नक्शे के माध्यम से AFM छवियों का उपयोग कर मापा जाता है और फिर सेल आसंजन प्रतिक्रिया और भेदभाव के साथ संबंधित. nanopatterning विधि यहां प्रस्तुत एक सरल प्रक्रिया है कि बड़े सतह क्षेत्रों के लिए एक सीधा तरीके से बढ़ाया जा सकता है । यह इस प्रकार सेल संस्कृति प्रोटोकॉल के साथ पूरी तरह से संगत है और अंय लाइगैंडों है कि कोशिकाओं पर एकाग्रता पर निर्भर प्रभाव डालती करने के लिए लागू किया जा सकता है ।
Introduction
यहां हम एक सरल और बहुमुखी dendrimer आधारित nanopatterning प्रक्रिया का वर्णन सेल संस्कृति प्राप्त करने के लिए सतहों कि नेनो में स्थानीय चिपचिपाहट के नियंत्रण की अनुमति है । ECM संगठन के नेनो विवरण में बताया गया है,1,2,3 और सेल आसंजन सतहों के nanopatterning4आसंजन से संबंधित सेलुलर आवश्यकताओं में गहरी अंतर्दृष्टि प्रदान की गई है, 5. micellar लिथोग्राफी-आधारित nanopatterns के प्रयोग से RGD पेप्टाइड nanospacing के लिए लगभग ७० एनएम के दहलीज मूल्य का पता चला, सेल आसंजन काफी इस मूल्य के ऊपर देरी की जा रही है6,7,8 ,9. ये अध्ययन भी सेल आसंजन9,10,11पर वैश्विक ligand घनत्व की तुलना में स्थानीय के अधिक से अधिक प्रभाव पर प्रकाश डाला ।
morphogenesis के दौरान, आसपास के वातावरण के साथ सेल बातचीत पहले भेदभाव की घटनाओं को ट्रिगर, जो अंतिम जटिल ऊतक संरचनाओं का गठन किया गया है जब तक जारी है । इस ढांचे के भीतर, nanopatterned सतहों morphogenesis पर प्रारंभिक कोशिका सतह बातचीत के प्रभाव से निपटने के लिए इस्तेमाल किया गया है । लिथोग्राफी-आधारित RGD nanopatterns में ६८ एनएम के पार्श्व रिक्ति के साथ β-प्रकार Ti-40Nb मिश्र धातु गैर के विभेदित phenotype को बनाए रखने के लिए मदद स्टेम सेल12, जबकि RGD nanospacings के बीच ९५ और १५० एनएम के भेदभाव को बढ़ाने mesenchymal स्टेम सेल (MSCs) की ओर adipogenic/osteogenic13,14,15 और chondrogenic फाटे16. इसके अलावा, स्व-कोडांतरण अणुओं संकेत घटकों के साथ संशोधित संकेतात्मक cues के नेनो वास्तु विनियमन17प्रदान करके सीधे सेल आसंजन और भेदभाव को दिखाया गया है । इस संबंध में, सेल के साथ dendrimers के जमाव-बातचीत moieties उनके बाहरी क्षेत्र में18,19,20 सतहों पर सेल आसंजन21,22अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, आकृति विज्ञान23,24, और माइग्रेशन ईवेंट्स25,26. फिर भी, इन अध्ययनों में सतह लक्षण वर्णन की कमी यह मुश्किल dendrimer सतह विंयास और सेल प्रतिक्रिया के बीच किसी भी संबंध स्थापित करने के लिए बनाता है ।
Dendrimer nanopatterns तरल की तरह आदेश और परिभाषित रिक्ति के साथ प्राप्त किया जा सकता है जब dendrimers कम ईओण ताकत के साथ समाधान से adsorb सतहों का आरोप लगाया । 27 इस गुण के आधार पर, यहां हम कम-चार्ज किए गए सतहों पर RGD-कार्यात्मक dendrimers के बड़े पैमाने पर असमान nanopatterns प्राप्त करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते है जो स्थानीय RGD सतह घनत्व के नेनो नियंत्रण की अनुमति देते हैं । जल संपर्क कोण (सीए), एक्स-रे photoelectron स्पेक्ट्रोस्कोपी (XPS) और स्कैनिंग जांच माइक्रोस्कोपी तकनीक (STM और AFM nanopatterns) बताते हैं कि स्थानीय ligand घनत्व समाधान में प्रारंभिक dendrimer एकाग्रता को संशोधित करने के लिए समायोजित किया जा सकता है । स्थानीय RGD सतह घनत्व AFM छवियों से ंयूनतम कण दूरी की संभावना समोच्च नक्शे से मात्रा है और फिर सेल प्रयोगों के साथ संबंधित । अंय nanopatterning तकनीक के साथ तुलना में4, dendrimer-आधारित nanopatterning सीधा है और आसानी से बड़े सतह क्षेत्रों के लिए बढ़ाया जा सकता है, इस प्रकार सेल संस्कृति अनुप्रयोगों के साथ पूरी तरह से संगत जा रहा है । Nanopatterns सेल आसंजन28 पर स्थानीय RGD सतह घनत्व के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए और वयस्क मानव MSCs के chondrogenic प्रेरण पर29के रूप में इस्तेमाल किया जाता है । हमारे परिणाम बताते है कि RGD dendrimer-आधारित nanopatterns सेल विकास को बनाए रखने और सेल आसंजन उच्च स्थानीय RGD सतह घनत्व द्वारा प्रबलित है । विभेदक प्रयोगों में, कोशिकाओं के मध्यवर्ती चिपकने के लिए MSC संघनित्र और जल्दी chondrogenic भेदभाव इष्ट । कारण आसानी से जो dendrimer परिधीय समूहों संशोधित किया जा सकता है के लिए, विधि यहां वर्णित अंय ECM लाइगैंडों कि कोशिकाओं पर एकाग्रता पर निर्भर प्रभाव डालती करने के लिए आगे बढ़ाया जा सकता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
वर्णित प्रोटोकॉल के विकास के दौरान कई अहम कदमों पर विचार किया जाना चाहिए । पहले जांच माइक्रोस्कोप तकनीक स्कैनिंग के साथ nanopattern लक्षण वर्णन करने के लिए संदर्भित करता है । nanopatterns कल्पना करने के लिए, सतह जहां ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक ओरिओल फ़ॉंट-बाख और अल्बर्ट जी Castaño डीमिन ठहराव में उनकी मदद के लिए स्वीकार करते हैं । उंहोंने यह भी (आईआरबी बार्सिलोना) में अनुसंधान के लिए संस्थान में उंनत डिजिटल माइक्रोस्कोपी इकाई स्वीकार करते है लेखक अपने परिसर में वीडियो रिकॉर्ड है । यह काम नेटवर्किंग जैव चिकित्सा अनुसंधान केंद्र (CIBER), स्पेन द्वारा समर्थित किया गया था । CIBER एक छठी राष्ट्रीय आर एंड डी और मैं योजना 2008-2011, Iniciativa Ingenio २०१०, ठोस कार्यक्रम, CIBER कार्रवाई, और Instituto de सैलड कार्लोस III, यूरोपीय क्षेत्रीय विकास निधि के समर्थन के साथ द्वारा वित्त पोषित पहल है । यह काम विश्वविद्यालयों और नवाचार, विश्वविद्यालयों के विभाग के अनुसंधान के लिए आयोग द्वारा समर्थित किया गया है, और Generalitat de Catalunya (२०१४ SGR १४४२) के उद्यम । यह भी परियोजनाओं OLIGOCODES द्वारा वित्त पोषित किया गया था (सं. MAT2012-38573-C02) और CTQ2013-41339-P, स्पेनी अर्थव्यवस्था और प्रतिस्पर्धा के मंत्रालय द्वारा संमानित किया, INTERREG वी के अलावा एक स्पेन-पुर्तगाल 2014-2020 POCTEP (0245_IBEROS_1_E) । C.R.P. अर्थव्यवस्था और प्रतिस्पर्धात्मकता अनुदान के स्पेनी मंत्रालय से वित्तीय सहायता स्वीकार करता है (सं । IFI15/00151) ।
Materials
| Gold (111) on mica. 1.4×1.1 cm | Spi Supplies | 466PS-AB | |
| Glass micro slides, plain | Corning | 2947-75×25 | |
| Deionized water | Millipore | 18MΩ cm | |
| Ethanol 96% | PanReac | 131085.1212 | |
| L-Lactide/DL-Lactide copolymer | Corbion | 95/05 molar ratio | |
| 1,4 – dioxane | Sigma-Aldrich | 296309-1L | |
| Silicone oil, high temperature | Acros Organics | 174665000 | |
| Spinner | Laurell | WS-650MZ-23NPP/Lite | |
| Tissue culture laminar flow hood | Telstar | Bio II Advance | Class II biological safety cabinet |
| Filter unit | Millex-GP | SLGP033RB | 0.22 µm |
| Syringe 10 mL | Discardit | 309110 | |
| Atomic Force microscope | Veeco Instruments | Dimension 3000 AFM instrument | |
| Silicon AFM probes | Budget Sensors | Tap300AI-G | Resonant Freq. 300 kHz, k = 40 N/m |
| Scanning tunneling microscope | Molecular Imaging | PicoSPM microscope | |
| Pt0.8:Ir0.2 wire | Advent | PT671012 | Diameter 0.25 mm |
| WSxM 4.0 software | Nanotec electronica | ||
| Optical contact angle (CA) system | Dataphysics | ||
| SCA20 software | Dataphysics | ||
| X-ray photoelectron spectrometer | Physical Electronics | Perkin-Elmer PHI 5500 Multitechnique System | |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | F1141-1MG | 1.0 mL solution |
| Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (DPBS) | Gibco | 21600-10 | Powder |
| Mouse embryo fibroblasts | ATCC | ATCC CRL-1658 | NIH/3T3 |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) liquid high glucose | Gibco | 11960044 | liquid high glucose, no glutamine, 500 mL |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000044 | 500 mL |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | 200 mM (100X) |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
| Sodium pyruvate | Invitrogen | 11360039 | 100 mL |
| T75 culture flasks | Nunclon | 156499 | |
| Trypsin | Life Technologies | 25200072 | 0,25% EDTA |
| Centrifuge | Hermle Labortechnik | Z 206 A | |
| Non-tissue culture treated plate, 12 well | Falcon | 351143 | Non-adherent |
| Adipose-derived hMSCs | ATCC | ATCC PCS-500-011 | Cell vial 1 mL |
| MSC basal medium | ATCC | ATCC PCS-500-030 | |
| MSC growth kit | ATCC | ATCC PCS-500-040 | Low serum |
| Chondrocyte differentiation tool | ATCC | ATCC PCS-500-051 | |
| Formalin solution | Sigma-Aldrich | HT5011-15ML | neutral buffered, 10% |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434-500G | for molecular biology, suitable for cell culture, ≥99.5% |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036-50G-F | for molecular biology, used as non-ionic surfactant, adjuvant |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3059-50G | |
| Rabbit monoclonal [Y113] anti-paxillin antibody | Abcam | ab32084 | Diluted 1:200 |
| Mouse monoclonal [1F5] anti-collagen alpha-1 XX chain | Acris Antibodies | AM00212PU-N | Diluted: 1:400 |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody | Invitrogen | A10667 | 2 mg/mL. Diluted 1:1000 |
| Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody | Invitrogen | A11036 | 2 mg/mL. Diluted 1:1000 |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | H3570 10ML | 10 mg/mL. Diluted 1:1000 |
| Cover glass 24×24 mm | Deltalab | D102424 | |
| Fluoromount | Sigma-Aldrich | F4680-25ML | |
| Epifluorescence Microscope | Nikon | Eclipse E1000 upright microscope | with a CCD camera |
| Confocal Microscope | Leica Microsystems | Leica SPE Upright Confocal Microscope | |
| ImageJ 1.50g freeware | http://imgej.nih.gov/ij | ||
| MATLAB software | The MATHWORKS, Inc. | ||
| OriginPro 8.5 software | OriginLab Coorporation |
References
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