Basado en el dendrímero nanopatrones desigual para adherencia de superficie de Control local: un método para dirigir la diferenciación condrogénica
Summary
Un método para obtener nanopatrones desigual basado en el dendrímero que permiten el control de escala nanométrica de local arginina-glicina-aspártico (RGD) superficie densidad del ácido es descrito y aplicado para el estudio de la diferenciación celular de adherencia y condrogénica.
Abstract
Diferenciación y adhesión celular está condicionada por la disposición de escala nanométrica de los componentes de la matriz extracelular (MEC), con concentraciones locales tener un efecto importante. Aquí presentamos un método para obtener a gran escala nanopatrones desigual de ácido arginina-glicina-aspártico (RGD)-densidad superficial de dendrímeros funcionalizados que permiten el control de escala nanométrica de servicios locales. Nanopatrones se forman por adsorción superficial de dendrímeros de soluciones a diferentes concentraciones iniciales y se caracterizaron por ángulo de contacto de agua (CA), espectroscopía de fotoelectrones de rayos x (XPS), y análisis de sonda tales como técnicas de microscopía Microscopía de efecto túnel (STM) y microscopía de fuerza atómica (AFM). La densidad superficial local de RGD se mide utilizando imágenes AFM mediante mapas de contorno de probabilidad de las distancias entre partículas mínimas y luego correlacionados con la diferenciación y la respuesta de la adherencia de la célula. El método nanomotivos presentado aquí es un procedimiento simple que puede ampliarse de forma sencilla a grandes superficies. Por lo tanto es totalmente compatible con protocolos de cultivo celular y se puede aplicar a otros ligandos que ejercen efectos dependiente de la concentración en las células.
Introduction
Aquí describimos un procedimiento sencillo y versátil basada en el dendrímero nanomotivos para obtener superficies de cultivo celular que permiten el control de adherencia local a escala nanométrica. Se han divulgado detalles de nanoescala de la organización de ECM,1,2,3 y nanomotivos de las superficies de adherencia de célula ha proporcionado penetraciones profundas en los requisitos celulares relacionados con la adherencia4, 5. Experimentos con micelar nanopatrones basado en litografía revelaron un valor umbral de alrededor de 70 nm de nanospacing de péptido RGD, adhesión celular se retrasará por encima de este valor6,7,8 ,9. Estos estudios también destacan la mayor influencia de locales de densidad global ligando el cell adhesión9,10,11.
Durante la morfogénesis, interacciones de la célula con el entorno activan los primeros eventos de la diferenciación, que continúan hasta que se han formado estructuras de tejido complejo final. Dentro de este marco, se han utilizado superficies nanopatterned para hacer frente a la influencia de las interacciones de superficie de la célula iniciales en la morfogénesis. Basado en litografía nanopatrones RGD con una separación lateral de 68 nm en β-tipo Ti-40Nb aleaciones ayudan a mantener el fenotipo indiferenciado de las células madre no comprometida12, mientras que nanospacings RGD de entre 95 y 150 nm mejorar la diferenciación de células madre mesenquimales (MSCs) hacia adipogenic/osteogénico13,14,15 y condrogénica sinos16. También, uno mismo-montaje macromoléculas modificados con componentes de señalización han demostrado directa de adhesión celular y la diferenciación proporcionando regulación arquitectónica a nanoescala de señalización señales17. En este sentido, la deposición de dendrímeros con partes de células interactuando en su esfera externa18,19,20 sobre superficies se ha utilizado para estudiar células adherencia21,22, morfología23,24y de25,de eventos de migración26. Sin embargo, la falta de caracterización superficial en estos estudios hace difícil establecer ninguna correlación entre la configuración superficial del dendrímero y respuesta de la célula.
Dendrímero nanopatrones con líquido-como orden y espaciamiento definido pueden obtenerse cuando dendrímeros por adsorción a las superficies de carga baja de soluciones con baja fuerza iónica. 27 sobre la base de esta propiedad, aquí presentamos un método para obtener a gran escala nanopatrones desigual de dendrímeros funcionalizados de RGD en superficies de baja carga que permiten el control de escala nanométrica de densidad superficial local de RGD. Ángulo de contacto de agua (CA), espectroscopía de fotoelectrones de rayos x (XPS) y exploración sonda microscopia técnicas (nanopatrones STM y AFM) mostrar que las densidades locales ligando pueden ajustarse modificando el dendrímero inicial concentración en solución. La densidad superficial local de RGD es cuantificada de imágenes AFM de mapas de contorno de probabilidad de las distancias entre partículas mínimas y luego correlacionada con experimentos de la célula. En comparación con otras técnicas de nanomotivos4, nanomotivos basado en el dendrímero es sencilla y pueden fácilmente ampliarse a grandes superficies, siendo totalmente compatible con aplicaciones de la cultura de célula. Nanopatrones se utilizan como substratos bioactivos para evaluar el efecto de la densidad superficial local de RGD en células adherencia28 y en la inducción condrogénica de adultos de MSCs humanos29. Nuestros resultados muestran que RGD basados en el dendrímero nanopatrones mantienen el crecimiento de la célula y que adhesión celular se ve reforzada por la alta densidad superficial local de RGD. En los experimentos de diferenciación, intermedio adherencia de células a los sustratos favoreció la condensación de MSC y temprana diferenciación condrogénica. Debido a la facilidad con que dendrímero grupos periféricos pueden ser modificados, el método descrito aquí puede ser ampliado a otros ligandos de ECM que ejercen efectos dependiente de la concentración en las células.
Protocol
Representative Results
Discussion
Durante el desarrollo del protocolo descrito, se debe considerar una serie de pasos críticos. La primera se refiere a la caracterización de la nanopattern con técnicas de microscopía de sonda de exploración. Para visualizar el nanopatrones, la superficie donde se produce el patrón debe tener un valor de rugosidad bajo el diámetro medio de los dendrímeros, que es alrededor de 4 – 5 nm medida por STM (figura 1B). Además, debe tenerse en cuenta que la proyección de imagen de STM de alta resoluci…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores reconocen Oriol Font-Bach y Albert G. Castaño por su ayuda en dmin cuantificación. También reconocen a la unidad de microscopía Digital avanzada en el Instituto de investigación biomédica (IRB Barcelona) dejó a los autores de grabar el vídeo en sus instalaciones. Este trabajo fue apoyado por la red biomédica investigación centro (CIBER), España. CIBER es que una iniciativa financiada por el VI nacional R & D & i Plan 2008-2011, Iniciativa Ingenio 2010, programa Consolider, acciones CIBER y el Instituto de Salud Carlos III, con el apoyo del Fondo Europeo de Desarrollo Regional. Este trabajo ha sido apoyado por la Comisión de universidades e investigación de la Consejería de innovación, universidades y empresa de la Generalitat de Catalunya (SGR 2014 1442). También fue financiado por los proyectos OLIGOCODES (no. MAT2012-38573-C02) y CTQ2013-41339-P, otorgado por el Ministerio de economía y competitividad, además a INTERREG V-A Portugal España 2014-2020 POCTEP (0245_IBEROS_1_E). C.R.P. reconoce apoyo económico de la beca de Ministerio de economía y competitividad Español (no. IFI15/00151).
Materials
| Gold (111) on mica. 1.4×1.1 cm | Spi Supplies | 466PS-AB | |
| Glass micro slides, plain | Corning | 2947-75×25 | |
| Deionized water | Millipore | 18MΩ cm | |
| Ethanol 96% | PanReac | 131085.1212 | |
| L-Lactide/DL-Lactide copolymer | Corbion | 95/05 molar ratio | |
| 1,4 – dioxane | Sigma-Aldrich | 296309-1L | |
| Silicone oil, high temperature | Acros Organics | 174665000 | |
| Spinner | Laurell | WS-650MZ-23NPP/Lite | |
| Tissue culture laminar flow hood | Telstar | Bio II Advance | Class II biological safety cabinet |
| Filter unit | Millex-GP | SLGP033RB | 0.22 µm |
| Syringe 10 mL | Discardit | 309110 | |
| Atomic Force microscope | Veeco Instruments | Dimension 3000 AFM instrument | |
| Silicon AFM probes | Budget Sensors | Tap300AI-G | Resonant Freq. 300 kHz, k = 40 N/m |
| Scanning tunneling microscope | Molecular Imaging | PicoSPM microscope | |
| Pt0.8:Ir0.2 wire | Advent | PT671012 | Diameter 0.25 mm |
| WSxM 4.0 software | Nanotec electronica | ||
| Optical contact angle (CA) system | Dataphysics | ||
| SCA20 software | Dataphysics | ||
| X-ray photoelectron spectrometer | Physical Electronics | Perkin-Elmer PHI 5500 Multitechnique System | |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | F1141-1MG | 1.0 mL solution |
| Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (DPBS) | Gibco | 21600-10 | Powder |
| Mouse embryo fibroblasts | ATCC | ATCC CRL-1658 | NIH/3T3 |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) liquid high glucose | Gibco | 11960044 | liquid high glucose, no glutamine, 500 mL |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000044 | 500 mL |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | 200 mM (100X) |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
| Sodium pyruvate | Invitrogen | 11360039 | 100 mL |
| T75 culture flasks | Nunclon | 156499 | |
| Trypsin | Life Technologies | 25200072 | 0,25% EDTA |
| Centrifuge | Hermle Labortechnik | Z 206 A | |
| Non-tissue culture treated plate, 12 well | Falcon | 351143 | Non-adherent |
| Adipose-derived hMSCs | ATCC | ATCC PCS-500-011 | Cell vial 1 mL |
| MSC basal medium | ATCC | ATCC PCS-500-030 | |
| MSC growth kit | ATCC | ATCC PCS-500-040 | Low serum |
| Chondrocyte differentiation tool | ATCC | ATCC PCS-500-051 | |
| Formalin solution | Sigma-Aldrich | HT5011-15ML | neutral buffered, 10% |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434-500G | for molecular biology, suitable for cell culture, ≥99.5% |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036-50G-F | for molecular biology, used as non-ionic surfactant, adjuvant |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3059-50G | |
| Rabbit monoclonal [Y113] anti-paxillin antibody | Abcam | ab32084 | Diluted 1:200 |
| Mouse monoclonal [1F5] anti-collagen alpha-1 XX chain | Acris Antibodies | AM00212PU-N | Diluted: 1:400 |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody | Invitrogen | A10667 | 2 mg/mL. Diluted 1:1000 |
| Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody | Invitrogen | A11036 | 2 mg/mL. Diluted 1:1000 |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | H3570 10ML | 10 mg/mL. Diluted 1:1000 |
| Cover glass 24×24 mm | Deltalab | D102424 | |
| Fluoromount | Sigma-Aldrich | F4680-25ML | |
| Epifluorescence Microscope | Nikon | Eclipse E1000 upright microscope | with a CCD camera |
| Confocal Microscope | Leica Microsystems | Leica SPE Upright Confocal Microscope | |
| ImageJ 1.50g freeware | http://imgej.nih.gov/ij | ||
| MATLAB software | The MATHWORKS, Inc. | ||
| OriginPro 8.5 software | OriginLab Coorporation |
References
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