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Bioengineering

Hydrogels ultraminces évaluation élastique comme une Membrane de sous-sol biomimétiques pour Dual Culture cellulaire

Published: December 26, 2017 doi: 10.3791/56384
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Biomedical Engineering, Yale University

Summary

Les modèles actuels de culture bicouche ne permettent pas des études fonctionnelles in vitro qui imitent en vivo microenvironnements. À l’aide de polyéthylène glycol et une méthode de création de modèles d’oxyde de zinc, ce protocole décrit le développement d’une membrane de sous-sol biomimétique ultra-mince avec rigidité ajustable, la porosité et la composition biochimique qui imite étroitement en vivo matrices extracellulaires.

Abstract

La membrane basale est un élément essentiel des bicouches cellulaires qui peut varier dans la rigidité, la composition, architecture et porosité. Études in vitro des bicouches endothéliales épithéliaux comptent traditionnellement sur des modèles de soutien perméables qui permettent la culture de bicouche, mais les supports perméables sont limités dans leur capacité à reproduire la diversité des humains des membranes basales. En revanche, hydrogel modèles nécessitant une synthèse chimique sont hautement accordables et permettent des modifications de la rigidité du matériau et la composition biochimique par incorporation de protéines ou de peptides biomimétiques. Cependant, les modèles traditionnels d’hydrogel sont limitées à fonctionnalité parce qu’ils manquent de pores pour contacts cellule-cellule et fonctionnelle in vitro les études de la migration. En outre, en raison de l’épaisseur des hydrogels traditionnelles, incorporation des pores qui s’étendent sur toute l’épaisseur des hydrogels a été difficile. Dans la présente étude, nous utilisons des hydrogels poly-(ethylene-glycol) (PEG) et une méthode de création de modèles de roman d’oxyde de zinc à combler les lacunes antérieures des hydrogels biomimétique. Par conséquent, nous présentons un hydrogel ultramince, membrane basale-like qui permet la culture de bicouches cellulaires confluentes sur un échafaud personnalisable avec pore variable architectures, propriétés mécaniques et composition biochimique.

Introduction

Les matrices extracellulaires (ECM) composent les échafaudages de protéine qui soutiennent la fixation des cellules et servent de barrières entre les types cellulaires distincts et constituent une composante essentielle du complexes tissus et organes. Contrairement au tissu conjonctif interstitiel, la membrane basale (BM) est un type spécialisé de ECM qui agit comme une barrière pour diviser les compartiments tissulaires de l’un de l’autre. BMs environ 100 µm d’épaisseur et donc permettant une communication directe et indirecte entre les cellules de chaque côté. Deux exemples courants de BMs sont vasculaires BMs, trouvées dans la paroi microvasculaire entre les péricytes et les cellules endothéliales et BMs des voies aériennes qui sont trouvent entre les cellules endothéliales et épithéliales. BMs jouent un rôle important dans la régulation de la fonction des cellules, telles que la polarité cellulaire et migration, sain ou malade. 1 la composition, rigidité, architecture et porosité du BMs varie de systèmes d’organes pour faciliter les fonctions physiologiques distinctes. Par exemple, BM pores sont essentiels pour le maintien de la cellule-cellule communication, diffusion de la molécule soluble et pour la migration des cellules immunitaires au cours de l’inflammation ou des bactéries lors de l’infection. Dans les voies respiratoires, pores couvrent la pleine épaisseur de la BM, d’un diamètre allant de 0,75 à 3,86 µm.2

La nature mince de la BM assure que même si les types de cellules sont physiquement séparés l’un de l’autre, la communication intercellulaire via paracrine et contact-signalisation médiée par est préservée. Ainsi, pour étudier les maladies humaines in vitro, les chercheurs comptent sur insertions de support perméable poreux à doubles couches cellulaires de la culture. 3 ces modèles ont été essentiels pour la compréhension de la communication cellulaire qui joue un rôle dans la santé et la maladie. 3 , 4 , 5 , 6 , 7 support perméable insertions satisfont les exigences de base pour comprendre comment cellule-cellule signalisation régule les processus physiologiques, tels que le recrutement des leucocytes et infiltration bactérienne ; Toutefois, les foyers ont des limitations importantes et ne parviennent pas à imiter un soutien humain de BM. perméable insertions manquent d’accordabilité mécanique et biochimique et la structure poreuse simpliste n’imite pas la structure fibreuse qui crée les pores irréguliers typique de BMs. Par conséquent, il y a un besoin croissant pour les systèmes accordables peut recréer les propriétés natives de BM qui influent sur les processus cellulaires.

Substrats à base de polymères sont des candidats idéaux pour le développement de la biomimétique BMs pour étudier des bicouches cellulaires dans un contexte qui imite mieux l’environnement in vivo . 8 , 9 , 10 , 11 , 12 polymères sont mécaniquement accordables et peuvent être chimiquement modifiés afin d’incorporer des fragments de peptide biomimétique. 11 , 12 , 13 le bioinert polymère polyéthylène glycol (PEG) peut être utilisé pour construire biomimétique BMs et travaux récents a détaillé la synthèse des gels d’arginine-glycine-aspartique (RGD) PEG mécaniquement accordables avec réseaux poreux qui soutiennent la croissance des cellules et chimiotactisme des cellules inflammatoires. 14 bien que publié axée sur le PEG substrats a fourni un modèle plus réaliste d’un ECM humaine que supports perméables, beaucoup de ces modèles sont très épais, avec une profondeur d’environ 775 µm qui limite la possibilité de créer des cultures bicouche avec cellule-cellule contacts. 14

Nous présentons ici un protocole pour la création d’un imitateur BM-à base de polymère PEG qui dépasse de beaucoup les limites des technologies actuelles de la culture du bicouche cellulaire. Nous avons développé une méthode de création de modèles qui incorpore d’oxyde de zinc, un matériau utilisé pour la fabrication de production microcristalline, le polymère au cours de la synthèse et la réticulation, qui est par la suite et sélectivement supprimée de la polymère résultant de vrac. Ce processus génère un réseau poreux aléatoire, imitant le réseau de pores interconnectés et tortueux de BMs humaines. En outre, la porosité peut être modifiée en changeant la taille et la forme de l’oxyde de zinc de microcristaux par une modification de la stoechiométrie de la réaction au cours de la production de l’aiguille. La technique développée ici crée un hydrogel ultra-mince qui imite l’épaisseur humaine BM. Enfin, la mécanique, la porosité et la composition biochimique de ces constructions comme BM peut facilement être modifiée pour générer un micro-environnement qui est la plus semblable à celui vu en vivo.

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Protocol

S’il vous plaît lire matériel fiche signalétique (FS) de tous les documents préalables pour utiliser utiliser les mesures de sécurité à tous les temps.

1. synthèse des aiguilles de l’oxyde de Zinc

  1. Préparer 250 mL de Zn (NO3) 0,04 M2* solution2O 6 H en ajoutant 2,9749 g de nitrate de zinc à 250 mL d’eau.
  2. Préparer 150 mL de 1 NaOH M en ajoutant 6 g de NaOH à 150 mL d’eau.
  3. Mettre en place un bain d’huile minérale sur une plaque chauffante avec agitateur et submerger un ballon à fond rond de 500 mL dans le bain d’huile à la température ambiante.
  4. Ajouter 250 mL de Zn (NO3)2* 6 H2O au ballon et commencent à remuer la réaction.
  5. Ajouter 150 mL de solution de NaOH (un précipité blanc se forment brièvement et puis disparaissent et continuent de mélanger les deux solutions). Remuez pendant 2 h à découvert.
  6. Chauffer le ballon à 55-60 ° C et continuer à remuer pendant 24 h.
  7. Eteignez le feu et laisser la solution refroidir à température ambiante tout en remuant.
  8. Filtrer la solution sur un entonnoir Büchner avec une taille de pore de 11 µm et laisser pour sécher une nuit ou plus, non couvert. Lorsque le filtre en papier n’est plus humide de la solution coulée et une poudre blanche s’est formé sur les trous de l’entonnoir, les particules sont complètement desséchées.
  9. Recueillir des aiguilles de ZnO et se préparer pour la microscopie électronique (MEB) pour confirmer la morphologie aciculaires. Brièvement, bande de carbone sur une fusée de broche de monter et utiliser une spatule métallique pour salir les aiguilles de ZnO sur la cassette de carbone. Bredouiller manteau avec iridium de 8 mm avec une densité de 22,4 g/cm3 et d’acquérir des images à 10 kV.

2. Ajout de la couche de Zinc sacrificielle sur lames de Microscope pour HCl induit la libération de PEG

  1. Préparer la solution d’acétate de zinc en dissolvant 1,756 g d’acétate de zinc dans 200 mL de méthanol.
  2. Nettoyer 3 "x 1" plain lames avec l’éthanol à 70 % et une lingette jetable. Laisser sécher à l’air pendant 10 min.
  3. Placer un verre de 150 mm sur une plaque chauffante de Pétri et préchauffer à 150-160 ° C.
  4. À l’aide d’une pipette de verre avec une ampoule de pipette, tenir les lames de verre avec des pincettes et manteau diapositives par appliquer 5 gouttes d’acétate de zinc, formant une couche mince dispersée sur la diapositive. Permettent l’excédent de solution au goutte à goutte en solution mère.
  5. Placer la lame dans la boîte de Pétri préchauffé (150-160 ° C) avec le côté d’acétate enduit zinc vers le haut. Laisser sur la plaque chauffante pendant 15 min.
  6. Supprimer la diapositive avec des pincettes et laisser refroidir à température ambiante. La diapositive s’affiche à peindre avec des stries blanches.
  7. Enlever tout excès zinc qui est restant sur les diapositives à l’aide d’une lingette jetable pour enlever des stries blanches. La surface doit être homogène.
  8. Exposer le les lames préparées aux UV lumière sous une hotte de sécurité biologique pendant au moins 1 h assurer la stérilité.
    ATTENTION : La lumière UV est nocif pour les yeux et la peau exposée. Éviter l’exposition directe à la peau ou les yeux et s’éteindra alimentation électrique quand ne pas utiliser.

3. préparation des isolateurs de Silicone

  1. Feuille de silicone coupées en carrés de moins de 1 "x 1" (isolateurs doivent pouvoir se glisser dans un plat de 6 puits).
  2. Percer des trous de 8 à 12 mm dans le Centre des carrés avec un poinçon de biopsie.
  3. Isolateurs de silicone autoclave pendant 20 min à 121,0 ° C et 1,12 kg/cm.

4. préparation de la solution de PEG et synthèse de Gel PEG

Remarque : Fonctionnalisation et polymérisation de PEG a été abondamment exploré et décrite par notre laboratoire et d’autres. 8 , 10 , 11 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17

  1. Combiner le peptide RGD cellule adhésive avec acryloyl-PEG-NHS au bicarbonate de sodium de 50 mM (pH 8,5) dans un rapport molaire de 1:1 pour permettre la fonctionnalisation du terminus aminé du peptide avec la portion de l’acrylate d’éthyle, une réaction biochimique qui a été précédemment caractérisé à rendement supérieur à 85 % d’efficacité. 17
  2. Préparer photo-initiateur en mélangeant 2, 2-diméthoxy-2-phenylacetophenone avec la 1-Vinyl-2-pyrrolidone à une concentration de 300 mg/mL.
  3. En séparez les tubes de 1,5 mL, peser ce qui suit : 2,5 mg de PEG-RGD 20 mg d’aiguilles de ZnO et 12,5 mg de PEG-DA.
  4. Suspendre les 20 mg de ZnO aiguilles 270 µL de solution de 10 % FBS/PBS ; Vortex à mélanger (environ 15 s).
  5. Brièvement (< 1 s) tourner la solution dans une centrifugeuse de paillasse mini de porter n’importe quel agrégat de ZnO à la base du tube.
  6. Prélever 250 µL du haut de la solution de ZnO, afin que les agrégats restent au fond du tube. Combiner avec PEG-DA et PEG-RGD pour créer une solution de PEG avec environ 2,5 mM RGD. Vortex à mélanger (environ 15 s).
  7. Ajouter 2 µL de l’acétophénone/n-vinyl pyrrolidone photo-initiateur et vortexer brièvement pour mélanger (environ 5 s).
  8. Ajouter 20 µL de la solution de polymère le long du Centre des diapositives ZnO enduit.
  9. Abaissez lentement une deuxième diapositive sur le dessus, avec le visage enduit de ZnO (la solution de PEG devrait être entre deux couches d’enduit de ZnO) en bas. Essayez d’éviter la formation de bulles d’air. Déplacer les diapositives latéralement le long de l’axe principal pour permettre les bulles s’échapper et à se répandre la solution d’une fine couche. Couvrir la majorité de la diapositive avec la solution de polymère. Créer un léger surplomb avec la glissière supérieure pour s’assurer que les diapositives peuvent être tirés à part dans les étapes ultérieures.
  10. Crosslink les diapositives sous une lampe à 365 nm UV (environ 10 mW/cm2) pendant 15 min.

5. libération de PEG gelées de lames de verre

  1. Appliquer une pression au surplomb diapositive et tirez que les deux glissières apart à un rythme lent afin de ne pas fendre les diapositives manuellement. Laissez les gels sécher pendant au moins 5 minutes, ou jusqu’au lendemain.
  2. Placez la lame dans un verre stérile 25 mm boîte de Pétri et verser doucement la solution de HCl 1 M sur le toboggan, en utilisant juste assez pour couvrir la diapositive (environ 10 à 20 mL). Balançant doucement la boîte de Pétri ; le gel devrait commencer à soulever hors de la diapositive comme le HCl dissout le zingage sacrificiel et les aiguilles. Une fois que le gel est exempt de la diapositive, reversez le HCl dans la solution mère.
  3. Rincer le gel en le versant doucement environ 25 mL de PBS 1 x dans la boîte de Pétri jusqu'à ce que la lame et le gel sont submergées.
Décanter soigneusement PBS dans un conteneur à déchets.
  • Verser environ 25 mL de PBS 1 x dans la boîte de Pétri doucement jusqu'à ce que le gel est flottant dans la solution.
  • À l’aide de pinces à épiler, faites coulisser soigneusement l’isolateur de silicone sous le gel et lever le gel sur elle.
  • Transférer l’isolateur et le gel dans une boite de 6 puits remplie avec du PBS stérile 1 x.
  • Répétez ce processus jusqu'à ce que tous les gels ont été retirés de la glisse et sont tremper dans du PBS. Exposer les gels préparés à la lumière UV dans une hotte de sécurité biologique pendant au moins 1 h assurer la stérilité.

    • 6. semis cellule bicouches

    1. Préparer les cellules A549 pour l’amorçage. En bref, une fiole de2 75 cm avec 5 mL de PBS 1 x de rinçage, ajouter 3 mL de 0,25 % trypsine-EDTA et laissez reposer pendant 2-3 min à 37 ° C.
      1. Mécaniquement agiter la fiole, étancher la réaction avec le milieu Eagle de la modification de 3 mL Dulbecco avec 10 % fœtale bovine sérique et 1 % la pénicilline-streptomycine et recueillir dans une fiole conique de 15 mL. Rincer avec une autre 4 mL de médias de Eagle modifié de Dulbecco complet et recueillir dans le même conique. Faire tourner les cellules à 475 x g pendant 6 min.
    2. Tandis que les cellules se tournent vers le bas, ajouter une petite goutte de milieu d’Eagle modifié de Dulbecco complète dans chaque puits d’une plaque de 6 puits. Utiliser des pinces pour transférer les isolateurs de silicone avec les gels dans la nouvelle plaque 6 puits, tels que le gel se repose sur la chute des médias. Maintenant que les gels sont répartis en une fine couche, vérifiez qu’il n’y a pas de gros trous visibles à le œil. Cela devrait être fait immédiatement avant la cellule semis afin d’éviter le séchage et la fissuration des gels.
    3. Remettre en suspension les cellules dans un milieu Eagle de la modification de Dulbecco avec 10 % fœtale bovine sérique et 1 % la pénicilline-streptomycine à une concentration de 6 x 105 cellules/mL. Ajouter la goutte de suspension cellulaire sage vers le centre du gel, essayant de maintenir un ménisque dans la région a poinçonné dehors de la membrane de silicone. Permettre aux cellules d’adhérer pendant 4 h.
    4. Après 4 h, ajouter 0,5 mL de milieu complet de Dulbecco Modified Eagle dans le puits et incuber une nuit à 37 ° C pour permettre une adhésion complète.
    5. Le lendemain, préparer des HUVECs pour l’ensemencement de la cellule.
      1. Rincer un ballon de2 75 cm avec 5 mL de solution 1 PBS X, ajouter 3 mL de 0,25 % trypsine-EDTA et laissez reposer pendant 2-3 min à 37 ° C.
      2. Mécaniquement agiter la fiole, étancher la réaction avec 3 mL M199 médias avec sérum de veau fœtal 20 %, 1 % la pénicilline-streptomycine et supplément de croissance de 1 % et recueillir dans un 15 mL conique.
      3. Rincer avec 4 mL de M199 multimédia complet et recueillir dans le même conique. Faire tourner les cellules à 475 x g pendant 6 min.
    6. Tandis que les cellules se tournent vers le bas, ajouter une petite goutte de milieu complet 199 dans chaque puits en une nouvelle plaque 6 puits. Placer un nouvel isolateur de silicone dans le puits avec la chute des médias au centre de la silicone.
    7. À l’aide de pinces à épiler, mettez soigneusement l’isolateur de silicone supportant le gel PEG avec cellules A549 sur l’isolateur dans la nouvelle plaque 6 puits.
    8. Resuspendre HUVECs à une concentration de 6 x 105 cellules/mL et ajouter la suspension cellulaire au centre de la goutte de gel flipped sage, essayant de maintenir un ménisque sur le gel dans la zone a poinçonné dehors de la membrane de silicone. Permettre aux cellules d’adhérer pendant 2 h.
    9. Après 2 h, doucement ajouter 2 mL de M199 médias complète dans chaque puits.

    7. immunofluorescence

    1. Retirez délicatement médias de gels avec une pipette manuelle et ajouter environ 500 µL de paraformaldéhyde à 4 % (PFA) au centre du gel où les cellules sont ensemencées. Laisser reposer 30 min à température ambiante.
      ATTENTION : PFA est un produit chimique toxique ; Portez une protection et d’assurer la gestion s’effectue dans une armoire de sécurité biologique.
    2. Retirez la PFA soigneusement et ajouter environ 500 µL de 2 % de BSA dans du PBS à chaque gel. Laisser reposer 1 h à température ambiante.
    3. Retirez soigneusement les BSA. Préparer des anticorps primaires à une dilution de 1/100 à 2 % de BSA dans du PBS et ajouter 500 µL à chaque gel. Laisser reposer 1 h à température ambiante. Rincer doucement avec 500 µL de PBS 1 x.
      1. Répétez le même processus avec l’anticorps secondaires. Utilisez la suite anticorps : 1) anti-humain CD144 (VE-cadhérine) clone 16 b 1 ; 2) anti-humain CD324 (E-cadhérine) clone 6714 ; 3) anti-humain CD31 clone (PECAM-1) C-20 ; 4) anti-A549 ; 5) anti-souris FITC ; 6) anti-chèvre Alexa Fluor 647. Pour visualiser l’actine F, ajouter 500 µL de phalloïdine (10 µg/mL dans du PBS) pendant 20 min.
    4. Délicatement enlever les anticorps secondaires ou la phalloïdine et ajouter 500 µL de DAPI (0,1 µg/mL) pendant 20 min. Retirez soigneusement la solution DAPI et doucement ajouter 1,5 mL de PBS 1 x dans chaque puits pour que les gels sont en suspension.
      1. À l’aide de pincettes et silicone isolateurs, transférer un gel dans une lame de verre. Procéder ainsi pour chaque gel immédiatement avant l’imagerie et remplacer les gels en solution de PBS après l’imagerie.
      2. Vous pouvez également monter gels à l’aide d’un support de montage DAPI. Scellez bien les échantillons avec vernis à ongles, acquérir des images en 2 jours pour empêcher le séchage et la fissuration du gel. Référer au tableau 1 pour le dépannage.

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    Representative Results

    PEG-RGD hydrogels ont été formés en intercalant la solution de polymère entre deux couches d’oxyde de zinc sacrificiel et création de modèles de pore avec des aiguilles de l’oxyde de zinc. Oxyde de zinc sacrificiel composants ont ensuite été déposées par l’acide chlorhydrique, générant ultraminces PEG hydrogels avec pores continues (Figure 1). La morphologie des aiguilles de l’oxyde de zinc a été confirmée par microscopie électronique (MEB) et la durée moyenne et la largeur ont été déterminées à 3,92 µm ± 0,089 et 0,43 ± 0,02 µm, respectivement (Figure 2A - 2 b). Après le retrait des aiguilles de l’oxyde de zinc, les pores de l’hydrogel ont été visualisées par SEM et caractérisent (Figure 2C - 2E). La densité moyenne de pore d’hydrogels a 176 863 ± 49 532 pores. SEM servait aussi de visualiser et de calculer la densité de pores d’un insert standard 3 µm pore en polycarbonate soutien perméables, et la densité des pores s’est avérée significativement plus faible, avec environ 2,51 ± 0,05 pores par mm carré (Figure 2D, Le tableau 2). Le diamètre moyen de pore à l’oxyde de zinc basé sur un modèle PEG hydrogel était de 0,19 ± 0,01 µm et a été significativement plus petites que les pores de µm ± 0,21 3,47 observés dans l’insert de soutien perméable (Figure 2E, tableau 2). Tomographie par cohérence optique a servi à acquérir les deux images 2 et 3 dimensions et pour déterminer l’épaisseur des hydrogels flottant dans du PBS 1 x (Figure 3A - 3 b). L’épaisseur moyenne de gel a été 18.89 ± 3,47 µm (tableau 2). Mécanique de gel ont également été évaluée en mesurant l’élasticité comme décrite précédemment, et la moyenne de l’Young s’est avérée 96.78 ± 23,92 kPa (tableau 2). 14

    La microscopie en immunofluorescence montre que les cellules endothéliales et les cellules épithéliales maintiennent leur identité phénotypique après cultivée sur ultraminces PEG-RGD hydrogels. Les cellules endothéliales maintient expression de PECAM-1 et épithéliales cellules colorées positivement avec un anticorps anti-A549 (Figure 4A - 4 b). Les deux types de cellules a également maintient la capacité à former des jonctions serrées. Les cellules endothéliales expriment la VE-cadhérine au niveau des jonctions cellule-cellule et cellules épithéliales expriment E-cadhérine (Figure 4C - 4D). Les hydrogels PEG-RGD bicouches cellulaires et également permettre des contacts de cellules pour former au sein des structures poreuses, tel que démontré par l’imagerie par immunofluorescence de phalloïdine teintée d’échantillons (Figure 4E).

    Figure 1
    Figure 1 . Aperçu schématique de protocole de préparation d’Hydrogel. A) synthèse et collection d’aiguilles de ZnO. B) préparation des lames de verre ; création d’une couche sacrificielle de ZnO. C) préparation et stérilisation des isolateurs de silicone. D) solution de préparation de PEG avec des aiguilles de ZnO. E) polymérisation de PEG gélifie entre les lames de verre enduit de ZnO. Lignes blanches représentent les revêtements et aiguilles de ZnO sacrificiels. F) HCl rinçage pour l’élimination des aiguilles et libération de gel des diapositives. Des lignes sombres représentent pores créés par les aiguilles de ZnO dissous. G) transfert de gels et isolateurs de silicone à 6 puits plat à préparer pour l’ensemencement de la cellule. H) cellule ensemencement. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

    Figure 2
    Figure 2 . Caractérisation de l’aiguille et de la porosité de l’Hydrogel de zinc. A) image de SEM d’aiguilles de zinc (échelle bar 5 µm). B) longueur et largeur de zinc aiguilles. Les points représentent les mesures pour aiguilles individuelles ; les lignes représentent la moyenne et l’écart-type. C) image SEM d’hydrogel poreux (échelle bar 2 microns). D) densité Pore et E) diamètre moyen de pore pour supports perméables en polycarbonate et PEG hydrogels. Barres représentent la moyenne et l’écart-type. p < 0,0001 via T-test. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

    Figure 3
    Figure 3 . Épaisseur de l’hydrogel. Optical Coherence Tomography montre A) 3 dimensions et B) 2-dimensional images d’hydrogels flottant dans du PBS. Flèches représentent la surface du liquide, astérisque représente hydrogel. Barre d’échelle est 100 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

    Figure 4
    Figure 4 . Soutien d’hydrogels monocouche et bicouche Culture. Les deux cellules endothéliales et les cellules épithéliales sont aptes à former des monocouches confluentes sur PEG hydrogels, comme en témoigne une coloration fluorescente pour A) CD31 (CD31 rouge, bleu DAPI) et B) A549 (A549 rouge, DAPI bleu), respectivement. Formation de jonctions cadhérine intacts sont démontrés pour C) (VE cadhérine vert, DAPI bleu) des cellules endothéliales et D) des cellules épithéliales (cadhérine E vert, DAPI bleu) (échelle bars 100 microns). E) deux exemples de doubles couches cellulaires sont illustrées par la phalloïdine coloration (phalloïdine rouge, DAPI bleu) (échelle bars 10 µm). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

    Problème Solution potentielle
    Gels ont de grands trous. Veillez à ce que les aiguilles de zinc sont suffisamment cassés vers le haut avant de les utiliser.
    Il peut permettre d’utiliser un mortier et un pilon pour les démanteler. Assurez-vous que les grands agrégats sont enlevés avec une rotation rapide après suspension à diluer FBS. Gel est coincé au fond de la plaque 6 puits après l’ensemencement des cellules. Ajoutez une goutte de médias sous le gel avant de les transférer dans la plaque de 6 puits pour l’amorçage. Gel couvre aussi bien le haut et le bas de l’isolateur de silicone. Pour les gels plus, envelopper tout excès gel autour de l’isolateur de silicone pour s’assurer qu’il y a seulement une seule couche dans le centre où les cellules seront attribués. Couche de cellules est popping hors gel. Les cellules peuvent être trop anastomosé. Graine à une densité plus faible. Soyez très prudent avec toutes les étapes de rinçage. Vous pouvez également augmenter la concentration de peptide pour améliorer l’adhérence cellulaire. Les cellules ne prolifèrent pas très vite et n’atteindra pas le confluent. Cellules à une densité élevée de graines afin qu’ils soient près de confluence au moment de l’ensemencement. Raideur de gel est plus élevé que prévu. Diminuer la quantité de temps que le gel est conservé dans HCl. Épaisseur de gel est plus élevé que prévu. S’assurer que n’importe quel agrégat de ZnO est essuyées au loin les lames de verre avant coulage de gel de PEG pour s’assurer que les lames sont lisses. Déplacer les diapositives le long de l’axe principal de répandre la solution PEG plus.

    Le tableau 1. Solutions proposées pour résoudre les problèmes.

    Hydrogel Transwell Matrice extracellulaire
    Densité (pores/mm2) pore 1,77 x 105 ± 4,9 x 104 2,51 ± 0,05 8,50 x 102 à 7,0 x 104 2,14
    Diamètre des pores (µm) 0.19 ± 0,01 3.47 ± 0,21 0,47 à 3,86 2,14
    Epaisseur (µm) 18.89 ± 3,47 10 0,05 à 0,10 17
    Module (kPa) 5 de Young 96.78 ± 23.92 > 1000 3,5 14

    Le tableau 2. Comparaison des propriétés d’Hydrogel à Insert Standard Support perméable et la matrice extracellulaire (valeurs représentent la moyenne ± écart-type)

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    Discussion

    Le protocole détaillé ici nous a permis de créer un hydrogel PEG accordable pour servir un échafaudage biomimétique BM. Plus précisément, de différents poids moléculaires de PEG, stratégies de peptide de conjugaison et oxyde de zinc structures microcristallines ou concentrations, le module d’élasticité, propriétés biochimiques et une structure poreuse des hydrogels peuvent être modifiés, respectivement. L’échafaudage de PEG ultramince dispose d’une plus grande densité de pores et un plus petit diamètre de pore qui est plus mimétique des fonctionnalités présentes dans les membranes en vivo sous-sol par rapport à un modèle de support perméable standard (tableau 2). En outre, grâce à cette méthode, nous avons réalisé une structure ultrafine avec une épaisseur moyenne de moins de 20 µm. Alors que les modèles de soutien perméable en polycarbonate ont déjà atteint une couche ultramince de seulement 10 µm, à notre connaissance, c’est le premier système flottant et accordables hydrogel pour atteindre cette épaisseur. Enfin, les hydrogels PEG ont un module d’élasticité d’environ 100 kPa, ce qui est des ordres de grandeur moins rigides que les supports perméables traditionnels, culture de tissus plastique et verre, qui ont tous des modules d’élasticité dans la gamme de la GPa et sont donc plus comparable à la basse (< 10 kPa) module d’élasticité de la matrice extracellulaire en vivo (tableau 2).

    Atteindre un faible module d’élasticité a été l’un des principaux objectifs du travail présenté ici et est l’une des limitations à l’utilisation traditionnelle en polycarbonate modèles soutien perméable. Il est bien connu que la rigidité du substrat peut dicter le comportement de la cellule, et des travaux ont montré que raideur du substrat peut guider destin cellulaire de différencier les cellules. 12 substrats rigides sont aussi couramment utilisés pour imiter des états pathologiques, y compris le tissu fibreux ou tumeurs cancéreuses et par conséquent ne sont pas exactement représentatifs des tissus sains. 18 , 19 , 20 , 21 afin d’étudier les fonctions et les phénotypes cellulaires quiescentes, il est essentiel d’utiliser des substrats qui imitent un module d’élasticité qui est pertinente en vivo. Un des principaux avantages de ce système est la possibilité de régler la mécanique du gel, qui peut être obtenu en utilisant le PEG avec des poids moléculaires différents. Comme beaucoup de maladies est associées à des renforcements de ECM, ce système fournit une plate-forme de biomimétiques pour étudier les effets de sain par rapport aux malade BM sur la fonction des cellules. Autre modification de ce système est possible aussi en altérant le fragment peptidique inclus pour l’adhésion cellulaire. Aux fins de la présente étude, RGD a été utilisé en raison de son expression omniprésente dans nombreuses protéines de BM et sa capacité à faciliter la fixation des cellules ferme. En plus de la RGD, fragments de laminine peuvent également être incorporés pour promouvoir des interactions laminin-épithéliales qui guident la polarisation de la cellule apicale-basale. 1 a l’instar de la rigidité de la BM est altérée dans la maladie, la composition de la membrane basale est remodelée en conditions pathologiques. En utilisant le précurseur de PEG-NHS amine-réactif, il est possible de conjuguer une variété de peptides et des protéines à la base de polymère de PEG. 11 , 14 , 15 c’est particulièrement avantageuse pour étudier les effets de l’engagement de l’intégrine pour différentes intégrines. Par exemple, la séquence RGD qui s’exprime dans la fibronectine et de collagène s’engage plusieurs intégrines, mais a une grande spécificité pour l’intégrine αvβ3. Pour spécifiquement imiter un substrat riche de la fibronectine, la séquence de leucine-aspartique acide-valine (LDV) pourrait être incorporée de se livrer α4β1, ou d’imiter une membrane collagène, l’acide aspartique-glycine-glutamique acide-alanine (DGEA) peut être ajouté à engager l’intégrine Α2Β1. 8

    Bicouches endothéliales épithéliaux sont qu’un exemple d’une bicouche cellulaire qui peut être créé avec le modèle présenté ici. Autres bicouches qui existent naturellement en vivo, séparés par seulement un mince BM ou ECM, notamment endothéliales-pericyte et bicouches de cellules musculaires lisses-endothélial. Ainsi, les applications de cette méthode sont larges et portent de pneumologie biologie vasculaire. En outre, en raison de la porosité unique de ces hydrogels, ils offrent la possibilité de réaliser des études fonctionnelles que les modèles précédents d’hydrogel n’ont pas été en mesure de soutenir. En intégrant les pores dans notre système d’hydrogel ultraminces, nous avons créé un remplacement biomimétique amélioré pour les modèles de soutien perméable, permettant à l’enquête d’infiltration bactérienne, un phénomène courant à travers la pulmonaire barrière épithéliale et endothéliale dans la tuberculose. 3 , 6 , 14 , 22 de la même façon, transmigration ou chimiotactisme des cellules inflammatoires à travers les cultures de cellules vasculaires peut être étudié en mesurant le taux de capture de cellules sur la surface adhésive de fonctionnalisés cellule RGD du gel, comme l’a montré précédemment. 16 il s’agit d’un net avantage sur les méthodes d’hydrogel basé antérieures qui ont atteint les conditions de culture co via l’encapsulation. Ces systèmes permettent à proximité et cellules de contact entre deux types de cellules et ont réussi pour la mesure des fonctions telles que l’angiogenèse et vasculogénèse, mais manque l’accessibilité offerte par les systèmes bidimensionnels, qui fournissent une grande partie plateforme simple pour mesurer la fuite, infiltration ou migration active à travers une barrière cellulaire co cultivée. 17

    Ainsi, la méthode a démontré ici offre une plate-forme pour une grande variété d’études dans plusieurs domaines et offre un tremplin vers la génération données plus pertinentes à partir d’études in vitro afin de mieux comprendre en vivo pathologies et les mécanismes.

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    Disclosures

    Les auteurs n’ont rien à divulguer.

    Acknowledgments

    Les auteurs aimeraient remercier Prof. Paul Van Tassel et Prof. Chinedum Osuji pour leurs conversations réfléchies et l’expertise de la science des matériaux. Ce travail a été financé par le Dubinsky nouvelle Initiative Award et les instituts nationaux de santé NIBIB BRPR01 EB16629-01 a 1.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    1M Hydrogel Chloride (HCl) EMD HX0603-75 2.5L Sterile. Use in fume hood with eye protection and gloves.
    1X PBS Gibco 14040-133 500 mL None
    Zinc Nitrate Hexahydrate (Zn(NO3)2•6H2O) Sigma-Aldrich 228737-500g Use with eye protection and gloves.
    Sodium Hydroxide (NaOH) Macron Chemicals 278408-500g Use with eye protection and gloves.
    Zinc Acetate Dihydrate ((CH3O2)2Zn2+•2H2O) Fisher Scientific AC45180010 1 kg Use with eye protection and gloves.
    Methanol (CH3OH) J.T. Baker 9070-05 4L Use in fume hood with eye protection and gloves.
    VWR Life Science Seradigm Premium Grade FBS VWR 97068-085 Sterile filter. 5 mL FBS in 45 mL PBS
    Mineral oil CVS  PLD-B280B None
    Round bottom flask ChemGlass N/A
    Thermometer N/A
    Stir bar N/A
    Plain precleaned microscope slides 3"x1"x1" mm thick Thermo Scientific 420-004T Spray with ethanol and let dry prior to use.
    Glass pasteur pipets N/A
    1 mL rubber bulbs N/A
    Plastic 100 mm petri dishes N/A
    Sterile forceps N/A
    Silicone isolators 0.8 mm thick
    Polydimethylsiloxane (PDMS) punches N/A
    Glass bottles N/A
    6 well plates Cellstar 657 160 N/A
    Filter Paper Whatman 8519 N/A
    Stirrer-hot plate VWR Dya-Dual 12620-970 Use with eye protection and gloves.
    2,2-Dimethoxy-2-phenylacetophenone (C6H5COC(OCH3)2C6H5 Sigma-Aldrich 24650-42-8 Use with eye protection and gloves.
    1-Vinyl-2-pyrrolidone (C6H9NO) Aldrich Use with eye protection and gloves.
    Polyethylene Glycol 10,000 (H(OCH2CH2)10,000OH) Fluka 81280-1kg Use with eye protection and gloves.
    RGDS Life Tein 180190 Use with eye protection and gloves.
    Blak-Ray long wave UV lamp UVP Model B 100AP N/A
    Eppendorf tubes USA Scientific 1615-5500 N/A

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    References

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    Bio-ingénierie numéro 130 biomatériaux la Membrane basale polyéthylène-glycol Micro pores bicouche Hydrogels élastique
    Hydrogels ultraminces évaluation élastique comme une Membrane de sous-sol biomimétiques pour Dual Culture cellulaire
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    Pellowe, A. S., Lauridsen, H. M.,… More

    Pellowe, A. S., Lauridsen, H. M., Matta, R., Gonzalez, A. L. Ultrathin Porated Elastic Hydrogels As a Biomimetic Basement Membrane for Dual Cell Culture. J. Vis. Exp. (130), e56384, doi:10.3791/56384 (2017).

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