Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Supertynn Porated elastisk Hydrogels som en Biomimetic kjelleren membran for dobbelt celle kultur

Published: December 26, 2017 doi: 10.3791/56384
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Biomedical Engineering, Yale University

Summary

Bilayer kultur modellene tillater ikke for funksjonell i vitro studier som etterligner i vivo microenvironments. Bruke polyetylenglykol og sinkoksid templating metode, beskriver denne protokollen utviklingen av en supertynn biomimetic kjelleren membran med tunable stivhet, porøsitet og biokjemiske sammensetningen som nærmere etterligner i vivo ekstracellulære matriser.

Abstract

Kjelleren membranen er en kritisk komponent i cellulære bilayers som kan variere i stivhet, komposisjon, arkitektur og porøsitet. In vitro studier av endothelial-epitelial bilayers har tradisjonelt støttet seg på permeable støtte modeller som aktiverer bilayer kultur, men permeable støtter er begrenset i sin evne til å gjenskape mangfoldet av menneskelig kjelleren membraner. Derimot hydrogel modeller som krever syntese er svært tunable og tillate endringer av både materielle stivhet og biokjemiske sammensetningen via innlemmelse av biomimetic peptider eller proteiner. Men har tradisjonelle hydrogel modeller begrenset funksjonalitet fordi de mangler porene for celle-celle kontakter og funksjonelle i vitro migrasjon studier. I tillegg, på grunn av tykkelsen på tradisjonelle hydrogels, har inkorporering av porene som dekker hele tykkelsen på hydrogels vært utfordrende. I studien bruker vi poly-(ethylene-glycol) (PEG) hydrogels og en roman sinkoksid templating metode for å løse tidligere svakhetene i biomimetic hydrogels. Derfor presenterer vi en supertynn, kjelleren membran-lignende hydrogel som tillater kultur confluent mobilnettet bilayers et passelig skafott med variabel pore arkitekturer, mekaniske egenskaper og biokjemiske sammensetningen.

Introduction

Ekstracellulære matriser (EFM) utgjør protein stillasene som støtter cellen vedlegg og tjene som barrierene mellom forskjellige celletyper, og er en vesentlig komponent av komplekse vev og organer. I motsetning til interstitiell bindevev er kjelleren membranen (BM) en spesialisert type ECM som fungerer som en barriere å dele vev rom fra hverandre. BMs er ca 100 µm tykk, og derfor gir mulighet for direkte og indirekte kommunikasjon mellom celler på hver side. To vanlige eksempler på BMs er vaskulær BMs, funnet i mikrovaskulær veggen mellom pericytes og endotelceller, og luftveier BMs som finnes mellom endothelial og epithelial celler. BMs tjene en viktig rolle i å regulere celle funksjon, for eksempel celle polaritet og migrasjon, i helse og sykdom. 1 den komposisjon, stivhet, arkitektur og porøsitet av BMs varierer over organsystemer å lette distinkte fysiologisk funksjoner. For eksempel er BM porene avgjørende for å opprettholde celle-celle kommunikasjon, løselig molekyl diffusjon, og migrasjon av immunceller ved betennelse eller bakterier under infeksjon. I luftveiene dekker porene full tykkelsen på BM, med diameter mellom 0,75 3.86 µm.2

Tynn natur i BM sikrer at selv om celletyper er fysisk atskilt fra hverandre, intercellulære kommunikasjon via paracrine - og kontakt-mediert signalnettverk er bevart. Således, for å studere menneskelig sykdom i vitro, forskere har stolt på porøse permeable støtte setter til kultur mobilnettet bilayers. 3 disse modellene har vært avgjørende for å forstå cellular kommunikasjon som spiller en rolle i helse og sykdom. 3 , 4 , 5 , 6 , 7 permeable støtte setter oppfyller de grunnleggende kravene for å forstå hvordan celle-celle signalisering regulerer fysiologiske prosesser, som leukocytter rekruttering og bakteriell infiltrasjon; men skivene har betydelige begrensninger og ikke klarer å etterligne en menneskelig BM. Permeable støtte setter mangler både mekaniske og biokjemiske tunability, og den forenklede porøse strukturen ikke etterligne fibrøs strukturen som skaper uregelmessig porene typisk for BMs. Derfor er det et økende behov for tunable systemer som kan gjenskape innfødt BM egenskapene som påvirker mobilnettet prosesser.

Polymer-baserte underlag er velegnet for utviklingen av biomimetic BMs å studere mobilnettet bilayers i en sammenheng som nærmere etterligner i vivo miljøet. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 polymerer er mekanisk tunable og kjemisk kan endres for å innlemme biomimetic peptid fragmenter. 11 , 12 , 13 bioinert polymer polyetylenglykol (PEG) kan brukes til å konstruere biomimetic BMs og nyere arbeid har detaljert syntesen av mekanisk tunable PEG arginine-glycine-aspartic syre (RGD) gels med porøse nettverk som støtter cellevekst og provoserende celle chemotaxis. 14 men publisert PEG-baserte underlag gitt en mer realistisk modell av en menneskelig ECM enn permeable støtter, mange av disse modellene er svært tykk, med en dybde på ca 775 µm som begrenser muligheten til å lage bilayer kulturer med celle-celle kontakter. 14

Her presenterer vi en protokoll for etableringen av en PEG polymer-baserte BM etterligne som overvinner mange av begrensningene for gjeldende celle bilayer kultur teknologier. Vi har utviklet en templating metode som inkorporerer sink oksid, en mye brukt materiale for produksjon av mikrokrystallinsk produksjon, i polymer syntese og crosslinking, som senere og selektivt fjernes fra den resulterende bulk polymer. Denne prosessen genererer et tilfeldig porøse nettverk, etterligne kroket og sammenhengende pore nettverket av menneskelig BMs. Videre, porøsitet kan endres ved å endre størrelsen og formen på sink oksid microcrystals via endring av reaksjonen støkiometri under nål produksjon. Teknikken utviklet her oppretter en supertynn hydrogel som etterligner tykkelsen på menneskelige BM. endelig, mekanikere, porøsitet og biokjemiske sammensetningen av disse BM-lignende konstruerer kan enkelt endres for å generere en microenvironment som er ligner på at sett i vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Kan du lese Material Safety Data Sheet (MSDS) av alle materialer før tider å bruke og bruker sikkerhetstiltak på alle.

1. syntese av sink oksid nåler

  1. Forberede 250 mL 0.04 M Zn (ingen3)2* 6 H2O løsning ved å legge 2.9749 g av sink nitrat til 250 mL vann.
  2. Forberede 150 mL 1 M NaOH ved å legge til 6 g av NaOH 150 mL vann.
  3. Definere mineralolje badekar på en kokeplate med rørestang og senke en 500-mL runde bunnen kolbe i olje badekaret ved romtemperatur.
  4. Legge til 250 mL av Zn (ingen3)2* 6 H2O til flasken og begynne røring reaksjonen.
  5. Legge til 150 mL NaOH løsning (en hvit bunnfall vil danne kort og forsvinner som de to løsningene fortsetter å blande). Rør for 2t avdekket.
  6. Varme flasken til 55-60 ° C og fortsette omrøring for 24 timer.
  7. Slå av varmen og la løsning avkjøles til romtemperatur under omrøring.
  8. Filtrere løsningen på en Büchner trakt med en 11 µm porestørrelse og la tørke over natten, avdekket. Når filter papir er ikke lenger våt fra helte løsning og et hvitt pulver har dannet over trakt hullene, er partiklene helt tørket.
  9. Samle ZnO nåler og forberede for skanning elektronmikroskop (SEM) å bekrefte nål som morfologi. Kort, montere karbon bånd til mangelfull pin og bruke metall spatula for å smøre ZnO pinnene på karbon båndet. Spraking frakk med 8 mm iridium på en tetthet 22.4 g/cm3 og hente bilder på 10 kV.

2. tillegg av oppofrende sinkbelegg på objektglass for HCl indusert utgivelsen av PEG

  1. Klargjør sink acetate løsning ved oppløsning 1.756 g sink acetatark i 200 mL av metanol.
  2. Rengjør 3 "x 1" vanlig objektglass med 70% etanol og en engangs tørke. La luften tørr i 10 min.
  3. Plasser et 150 mm glass Petriskål på en kokeplate og Forvarm til 150-160 ° C.
  4. Bruker et glass Pipetter med en Pipetter pære, hold glass lysbilder med pinsett og belegge lysbilder ved å bruke 5 dråper av sink acetate, danner et tynt lag spredt på lysbildet. Tillate overflødig løsning å dryppe ut lagerløsning.
  5. Sett lysbildet i forvarmet Petriskål (150-160 ° C) med sink acetate belagt siden vendt opp. La på varmeplaten i 15 min.
  6. Fjerne lysbildet med pinsett og la den avkjøles til romtemperatur. Lysbildet vises være belagt med hvite striper.
  7. Fjern eventuelle overskytende sink som er igjen på lysbildene bruker en engangs tørke fjerne fremtredende hvite striper. Overflaten skal være ensartet.
  8. Utsette den forberedt lysbildene for UV-lys i biosikkerhet hette til minst 1 time å sikre sterilitet.
    Forsiktig: UV lys er skadelig for øynene og utsatt huden. Unngå direkte eksponering mot øyne eller hud og deaktivere strømforsyning når du ikke bruker.

3. forberedelse av silikon isolatorer

  1. Kutt silikon ark i rutene mindre enn 1 "x 1-tommers (isolatorer må kunne passe i en 6-vel rett).
  2. Slå 8-12 mm hull i midten av rutene med biopsi punch.
  3. Autoclave silikon isolatorer for 20 min 121.0 ° C og 1,12 kg/cm.

4. forberedelse av PEG løsning og PEG Gel syntese

Merk: Functionalization av PEG har vært mye utforsket og beskrevet tidligere av vår lab og andre. 8 , 10 , 11 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17

  1. Kombinere RGD celle selvklebende peptid med acryloyl-PEG-NHS i 50 mM natriumbikarbonat (pH 8.5) i 1:1 molar forholdet aktivere functionalization av Amin endestasjonen til peptid med acrylate moiety, en biokjemiske reaksjon som har vært tidligere preget for å gi større enn 85% effektivitet. 17
  2. Forberede Foto-initiatoren ved å blande 2,2-Dimethoxy-2-phenylacetophenone med 1-Vinyl-2-pyrrolidone i en konsentrasjon av 300 mg/mL.
  3. I separate 1,5 mL rør, veier ut følgende: 20 mg ZnO nåler, 12.5 mg av PEG-DA og 2,5 mg av PEG-RGD.
  4. Avbryte 20 mg ZnO nåler 270 µL av 10% FBS/PBS løsning; Vortex å blande (ca 15 s).
  5. Kort (< 1 s) spinne løsningen i en Borstemmaskin mini sentrifuge å bringe noen ZnO aggregater til bunnen av røret.
  6. Samle 250 µL fra toppen av ZnO løsningen, sikre at aggregater forblir på bunnen av røret. Kombinere med PEG-DA og PEG-RGD for å lage en PEG-løsning med ca 2,5 RGD. Vortex å blande (ca 15 s).
  7. Legge til 2 µL acetophenone/n-vinyl pyrrolidone Foto-initiatoren og vortex kort å blande (ca 5 s).
  8. Legge til 20 µL av polymer løsning langs midten av ZnO belagt lysbildene.
  9. Sakte senke enda ett lysbilde øverst, med ZnO belegg ansiktet ned (PEG løsningen skal være mellom to ZnO belagt lag). Prøv å hindre dannelsen av eventuelle luftbobler. Flytte lysbildene lateralt langs store aksen tillate bobler å rømme og å spre løsningen på et tynt lag. Dekk mesteparten av lysbildet med polymer løsning. Lag en liten overheng med det øverste lysbildet slik at lysbildene kan trekkes fra hverandre i senere trinn.
  10. Krysskobling lysbildene under en 365 nm UV-lampe (ca 10 mW/cm2) i 15 min.

5. slipp av PEG Gels fra Glass lysbilder

  1. Bruk trykk overhengende lysbilde og manuelt trekke de to lysbildene fra hverandre i sakte tempo for unngå sprengning lysbildene. Tillate geléer tørke i minst 5 minutter eller over natten.
  2. Legg lysbildet i et sterilt 25 mm glass Petriskål og forsiktig helle den 1 M HCl løsningen på lysbildet ved hjelp av bare nok til å dekke lysbildet (ca 10-20 mL). Forsiktig rock Petriskål; gel bør begynne å løfte av lysbildet som HCl oppløser oppofrende sink belegg og nåler. Når gel er gratis fra lysbildet, hell HCl tilbake i lager løsningen.
  3. Skyll gel ved å forsiktig helle ca 25 mL 1 x PBS i Petriskål til lysbildet og gel senkes.
Forsiktig helle på PBS i en avfallsbeholderen.
  • Forsiktig Hell ca 25 mL 1 x PBS i Petriskål til gel er flytende i løsningen.
  • Ved hjelp av pinsett, nøye Skyv silikon isolator under gel og løft gel på den.
  • Overføre isolator og gel i en 6-vel parabol fylt med sterilt 1 x PBS.
  • Gjenta denne prosessen til alle geléer er fjernet fra lysbildene og er soaking i PBS. Utsett forberedt geléer UV lys i biosikkerhet hette til minst 1 time å sikre sterilitet.

    • 6. seeding cellen Bilayers

    1. Forberede A549 celler seeding. Kort, skyll en 75 cm2 kolbe med 5 mL 1 x PBS, tilsett 3 mL 0,25% Trypsin-EDTA og la sitte i 2-3 minutter på 37 ° C.
      1. Mekanisk agitere kolbe, slukke reaksjon med 3 mL Dulbecco endret Eagle Medium med 10% fosterets bovin serum og 1% penicillin-streptomycin, og samle inn en 15-mL konisk kolbe. Skyll med en ekstra 4 mL komplett Dulbecco endret Eagle Media og samle på samme konisk. Spinne celler 475 x g for 6 min.
    2. Når celler starter ned, Legg en liten dråpe komplett Dulbecco endret Eagle Medium i hver brønn av en 6-vel plate. Bruke pinsett for å overføre silikon isolatorer med geléer til den nye 6-vel platen, slik at gel hviler på slipp av media. Nå som gels er spredt i et tynt lag, kontroller at det er ingen store hull synlige for øyet. Dette bør gjøres umiddelbart før cellen frø for å unngå tørking og cracking av geléer.
    3. Resuspend celler i Dulbeccos endret Eagle Medium med 10% fosterets bovin serum og 1% penicillin-streptomycin i en konsentrasjon av 6 x 105 celler/mL. Legge til celle suspensjon drop klok til midten av gel, prøver å opprettholde en menisk innen stemplet ut av silikon membranen. Lar celler å følge 4 h.
    4. Etter 4 h, Legg til 0,5 mL av Dulbeccos endret Eagle komplett Medium til brønnen og ruge over natten på 37 ° C å ha fullført vedheft.
    5. Dagen forberede HUVECs celle seeding.
      1. Skyll en 75 cm2 kolbe med 5 mL 1 X PBS, tilsett 3 mL 0,25% Trypsin-EDTA og la sitte i 2-3 minutter på 37 ° C.
      2. Mekanisk agitere kolbe, slukke reaksjon med 3 mL M199 media med 20% fosterets bovin serum, 1% penicillin-streptomycin og 1% vekst supplement og samle i en 15-mL konisk.
      3. Skyll med 4 mL M199 komplett medier og samle på samme konisk. Spinne celler 475 x g for 6 min.
    6. Mens celler er spinner ned, Legg en liten dråpe komplett medium 199 hver brønn i en ny 6-vel-plate. Sett en ny silikon isolator i brønnen med drop medier i midten av silikon.
    7. Ved hjelp av pinsett, nøye Vend silikon isolator støtte PEG gel med A549 celler på isolator i den nye 6-vel-platen.
    8. Resuspend HUVECs i en konsentrasjon av 6 x 105 celler/mL og legge celle suspensjon til midten av snudd gel drop klok, prøver å opprettholde en menisk på gel innen området stemplet ut av silikon membranen. Lar celler å overholde 2 h.
    9. Etter 2 h, forsiktig legge 2 mL M199 komplett medier i hver brønn.

    7. immunofluorescence

    1. Nøye fjerne media fra gels med en manuell pipette og legge til ca 500 µL av 4% paraformaldehyde (PFA) i midten av gel hvor cellene er sådd. La sitte i 30 min ved romtemperatur.
      Forsiktig: PFA er et giftig kjemisk stoff; bærer beskyttelse og sikre håndtering er gjort i en biologisk sikkerhet regjering.
    2. Nøye fjerne PFA og legger til ca 500 µL av 2% BSA i PBS hver gel. La sitte i 1 time ved romtemperatur.
    3. Fjern forsiktig BSA. Forberede primære antistoffer i en fortynning av 1: 100 i 2% BSA i PBS, og legge til 500 µL hver gel. La sitte i 1 time ved romtemperatur. Skyll forsiktig med 500 µL av 1 x PBS.
      1. Gjenta den samme prosessen med sekundær antistoffer. Bruke følgende antistoffer: 1) anti-menneskelige CD144 (VE-Cadherin) klone 16B1; 2) anti-menneskelige CD324 (E-Cadherin) klone 6714; 3) anti-menneskelige CD31 (PECAM-1) klone C-20; 4) anti-A549; 5) anti-musen FITC; 6) anti-geit Alexa Fluor 647. For å visualisere F-utgangen, legge 500 µL av Phalloidin (10 µg/mL i PBS) for 20 min.
    4. Nøye fjerne sekundære antistoffer eller phalloidin og legge til 500 µL av DAPI (0,1 µg/mL) for 20 min. nøye fjerne DAPI løsning og forsiktig legge 1,5 mL 1 x PBS hver brønn slik at gels i suspensjon.
      1. Bruke pinsett og silikon isolatorer, overføre en gel til et glass lysbilde. Gjør dette for hver gel umiddelbart før bildebehandling, og erstatte gels i PBS løsning etter bildebehandling.
      2. Alternativt, montere gels med en DAPI montering medium. Forsegle godt utvalg med neglelakk, hente bilder innen 2 dager å hindre tørking og cracking av gel. Se tabell 1 for feilsøking.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    PEG-RGD hydrogels ble dannet av sandwiching polymer løsning mellom to oppofrende sinkoksid lag og skape pore maler med sink oksid nåler. Oppofrende sinkoksid komponentene ble deretter fjernet med saltsyre, genererer ultrathin PEG hydrogels med kontinuerlig porene (figur 1). Morfologi av sink oksid nåler ble bekreftet av skanning elektronmikroskop (SEM) og gjennomsnittlig lengden og bredden var bestemt på å være 3.92 ± 0.089 µm og 0.43 ± 0,02 µm, henholdsvis (figur 2A - 2B). Etter fjerning av sink oksid nåler, hydrogel porene var visualisert ved SEM og preget (figur 2C - 2E). Gjennomsnittlig pore tetthet for hydrogels var 176,863 ± 49,532 porene. SEM ble også brukt til å visualisere og beregne pore tettheten av en standard 3 µm pore polykarbonat permeable støtte setter og pore tetthet ble funnet for å være betydelig lavere, med ca 2.51 ± 0,05 porene per kvadrat mm (figur 2D, Tabell 2). Gjennomsnittlig pore diameter i sink oksid mal PEG hydrogel var 0,19 ± 0,01 µm, og var betydelig mindre enn 3.47 ± 0,21 µm porene i permeable støtte innsatsen (figur 2E, tabell 2). Optical coherence tomografi ble brukt til å anskaffe både 2 - og 3-dimensjonale bilder og angi tykkelsen på hydrogels flytende i 1 x PBS (Figur 3A - 3B). Gjennomsnittlig gel tykkelsen var 18.89 ± 3.47 µm (tabell 2). Gel mekanikk var også evaluert av måling elastisk modulus som beskrevet tidligere, og den gjennomsnittlige unge modulus ble funnet for å være 96.78 ± 23.92 kPa (tabell 2). 14

    Immunofluorescence mikroskopi viser at både endotelceller og epitelceller opprettholde fenotypiske identitet etter blir kultivert på ultrathin PEG-RGD hydrogels. Endotelceller opprettholdt uttrykk for PECAM-1 og epithelial celler farget positivt med et anti-A549 antistoff (Figur 4A - 4B). Begge celletyper også beholdt evnen til å danne tett veikryss. Endotelceller uttrykt VE-cadherin på celle-celle veikryss og epitelceller uttrykt E-cadherin (Figur 4C - 4 D). PEG-RGD hydrogels også støtte Mobiltlf bilayers, og la for celle-celle kontakter form i porøse strukturer, som demonstrert av immunofluorescent bildebehandling av phalloidin farget prøver (Figur 4E).

    Figure 1
    Figur 1 . Skjematisk oversikt over Hydrogel forberedelse protokollen. A) syntese og samling av ZnO nåler. B) utarbeidelse av glass lysbilder. oppretting av en oppofrende ZnO lag. C) forberedelse og sterilisering av silikon isolatorer. D) forberedelse av PEG løsning med ZnO nåler. E) polymerisering av PEG gels ZnO belagt glass lysbilder. Hvite linjer representerer oppofrende ZnO nåler og belegg. F) HCl skyll for fjerning av nåler og utgivelsen av gel fra lysbilder. Mørke linjer representerer porene opprettet av oppløst ZnO nåler. G) overføring av gels og silikon isolatorer til 6-vel rett å forberede celle seeding. H) celle seeding. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figure 2
    Figur 2 . Sink nål karakterisering og Hydrogel porøsitet. A) SEM bilde av sink nåler (skala bar 5 µm). B) lengden og bredden på sink nåler. Prikker representerer målinger for individuelle nåler; linjene representerer betyr og standardfeil. C) SEM bilde av porøse hydrogel (skala bar 2 mikron). D) Pore tetthet og E) gjennomsnittlig pore diameter for polykarbonat permeable støtter og pinne hydrogels. Barer representerer betyr og standardfeil. p < 0,0001 via T-test. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figure 3
    Figur 3 . Hydrogel tykkelse. Optical Coherence tomografi demonstrerer A) 3-dimensjonale og B) 2-dimensjonal bilder av hydrogels flytende i PBS. Piler Representer flytende overflaten, stjernen representerer hydrogel. Skala bar er 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figure 4
    Figur 4 . Hydrogels støtte Monolayer og Bilayer kultur. Begge endotelceller og epitelceller er stand til å danne confluent monolayers på pinne hydrogels, som demonstrert av fluorescerende flekker A) CD31 (CD31 rød, DAPI blå) og B) A549 (A549 rød, DAPI blå), henholdsvis. Dannelsen av intakt cadherin veikryss er vist C) endotelceller (har cadherin green, DAPI blå) og D) epitelceller (E cadherin green, DAPI blå) (skala barer 100 mikron). E) to eksempler på mobilnettet bilayers er demonstrert av phalloidin flekker (phalloidin rød, DAPI blå) (skala barer 10 µm). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Problem Mulig løsning
    Gels har store hull. Kontroller at sink nåler er tilstrekkelig brutt opp før de.
    Det kan hjelpe for å bruke en morter for å bryte dem opp.. Kontroller at store mengder fjernes med en rask runde etter suspensjon i fortynne FBS. Gel er fast til undersiden av 6-vel plate etter seeding celler. Legg en dråpe media under gel før du overfører til den 6-vel platen for seeding. Gel dekker både toppen og bunnen av silikon isolator. For lengre geleer, Pakk alle overflødig gel rundt silikon isolator å sikre at det er bare ett lag i sentrum der cellene vil bli sådd. Cellen lag popping av gel. Cellene kan ligge over confluent. Frø på lavere tetthet. Være veldig forsiktig med alle skyll skritt. Du kan også øke peptid konsentrasjonen for å forbedre celleadhesjon. Cellene er ikke veldig raskt voksende og kommer ikke der. Frø cellene på en høy tetthet slik at de er nær samløpet ved seeding. Gel stivhet er høyere enn forventet. Redusere tiden som gel holdes i HCl. Gel tykkelsen er høyere enn forventet. Kontroller at alle ZnO aggregater fjernes av glass lysbildene før avstøpning PEG gel for å sikre at lysbildene er glatt. Flytte lysbildene langs hovedakse å spre PEG løsningen mer.

    Tabell 1. Foreslåtte løsninger for å feilsøke problemer.

    Hydrogel Transwell Ekstracellulær Matrix
    Pore tetthet (porene/mm2) 1,77 x 105 ± 4,9 x 104 2.51 ± 0,05 8,50 x 102 7.0 x 104 2,14
    Pore diameter (µm) 0,19 ± 0,01 3.47 ± 0,21 0.47 til 3.86 2,14
    Tykkelse (µm) 18.89 ± 3.47 10 0,05 til 0,10 17
    Youngs modul (kPa) 5 96.78 ± 23.92 > 1000 3,5 14

    Tabell 2. Sammenligning av Hydrogel egenskaper for å sette inn Standard Permeable støtte og ekstracellulær Matrix (verdiene representerer gjennomsnittet ± standardfeil)

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Protokollen finnesher har tillatt oss å lage en tunable PEG hydrogel å tjene som en biomimetic BM stillaset. Spesielt av varierende PEG molekylvekt, peptid Bøyning strategier, og sink oksid mikrokrystallinsk strukturer eller konsentrasjoner, elastisk modulus, kan biokjemiske egenskaper og porøs struktur av hydrogels endres, henholdsvis. Supertynn PEG stillaset har en høyere pore tetthet og mindre pore diameter som er mer mimetic av funksjonene som finnes i i vivo kjelleren membraner sammenlignet med en standard permeable støttemodell (tabell 2). Videre gjennom denne metoden har vi oppnådd en supertynn struktur med en gjennomsnittlig tykkelse på mindre enn 20 µm. Mens polykarbonat permeable støtte modellene har allerede oppnådd en supertynn lag av bare 10 µm, vi vet, er dette den første frittflytende og tunable hydrogel systemet å oppnå denne tykkelsen. Til slutt, PEG-hydrogels har en elastisk modulus av omtrent 100 kPa, som er flere størrelsesordener mindre stiv enn tradisjonelle permeable støtter, vev kultur plast og glass, som alle har elastiske moduli i området av GPa, og er derfor mer sammenlignes med lav (< 10 kPa) elastisk modulus av i vivo ekstracellulær matrix (tabell 2).

    Oppnå en lav elastisk modulus var en av de primære mål av arbeidet presentert her, og er en begrensning for bruk av tradisjonelle polykarbonat permeable støtte modeller. Det er velkjent at substrat stivhet kan diktere celle atferd og arbeid har vist at substrat stivhet kan guide mobilnettet skjebnen til skille celler. 12 stiv underlag er også vanlig å etterligne sykdom stater, inkludert fibrotiske vev eller kreftsvulster, og derfor er ikke nøyaktig representant for sunt vev. 18 , 19 , 20 , 21 for å studere quiescent mobilnettet fenotyper og funksjoner, er det viktig å bruke underlag som etterligner en elastisk modulus som er relevante i vivo. En av de store fordelene med dette systemet er evnen til tune mekanikken i gel, som kan oppnås ved hjelp av PEG med ulike molekylvekt. Som mange sykdommer er assosiert med ECM stivne, gir systemet en biomimetic plattform for å studere virkningene av sunn kontra sykelig BM på celle-funksjonen. Videre modifikasjon av dette systemet kan også oppnås ved å endre peptid fragmentet inkludert for celleadhesjon. Ved anvendelsen av denne studien, ble RGD brukt på grunn av sin allestedsnærværende uttrykk i mange BM proteiner og dens evne til å lette fast celle vedlegg. I tillegg til RGD, kan laminin fragmenter også innlemmet for å fremme laminin-epitelial interaksjoner som guide apikale-basale celle polarisering. 1 like BM stivhet endres i sykdom, sammensetningen av kjelleren membranen er ombygd i patologiske forhold. Bruke Amin-reaktive PEG-NHS forløperen, er det mulig å bøye en rekke peptider og proteiner til PEG polymer base. 11 , 14 , 15 dette er spesielt fordelaktige for undersøker virkningene av integrin engasjement for ulike integrin reseptorer. For eksempel RGD sekvensen som uttrykkes i fibronectin og kollagen engasjerer flere integrins, men har en høy spesifisitet for integrin αvβ3. Å spesielt etterligne en fibronectin rike substrat, leucine-aspartic syre-Valin (LDV) rekkefølgen kan være innarbeidet å engasjere α4β1, eller å etterligne en collagenous membran, aspartic syre-glycine-glutamic syre-alanin (DGEA) kan legges til engasjere integrin Α2Β1. 8

    Endothelial-epitelial bilayers er bare ett eksempel på en mobil bilayer som kan opprettes med modellen presentert her. Andre bilayers som finnes naturlig i vivo, med bare en tynn BM eller ECM, inkluderer endothelial-pericyte og endothelial-glatt muskel celle bilayers. Dermed søknadene for denne metoden er bred og strekker seg fra lunge medisin til vaskulær biologi. Videre, på grunn av den unike porøsitet av disse hydrogels, de tilbyr muligheten til å gjennomføre funksjonelle studier som tidligere hydrogel modeller ikke er kjøpedyktig oppbacking. Ved å innlemme porene i ultrathin hydrogel systemet, har vi opprettet en forbedret biomimetic erstatning for permeable støtte modeller, slik at etterforskningen av bakteriell infiltrasjon, en vanlig foreteelse over den lunge epitel-endothelial barriere i tuberkulose. 3 , 6 , 14 , 22 , transmigration eller chemotaxis av inflammatoriske celler over vaskulær cellekulturer kan undersøkes ved å måle frekvensen av cellen fangst RGD functionalized celle selvklebende overflate gel, som har vist tidligere. 16 dette er en klar fordel over tidligere hydrogel basert metoder som har oppnådd co oppdrettsforholdene via innkapsling. Slike systemer tillater nærhet og celle-celle kontakt mellom to cellen og har vært vellykket for å måle funksjoner som angiogenese og vasculogenesis, men mangler tilgjengelighet tilbys av todimensjonal systemer, som gir en mye enklere plattform for å måle lekkasje, infiltrasjon eller aktive overføring over en co kulturperler mobilnettet barriere. 17

    Dermed metoden demonstrert her tilbyr en plattform for en rekke studier på tvers av flere felt, og gir et springbrett mot generere mer relevante data fra i vitro studier til videre forstå i vivo patologi og mekanismer.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Forfatterne ikke avsløre.

    Acknowledgments

    Forfatterne vil takke Prof Paul Van Tassel og Prof Chinedum Osuji for sine gjennomtenkte samtaler og materialkunnskap kompetanse. Midler til dette arbeidet ble gitt av Dubinsky nye initiativ Award og nasjonale institutter for helse NIBIB BRPR01 EB16629-01A1.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    1M Hydrogel Chloride (HCl) EMD HX0603-75 2.5L Sterile. Use in fume hood with eye protection and gloves.
    1X PBS Gibco 14040-133 500 mL None
    Zinc Nitrate Hexahydrate (Zn(NO3)2•6H2O) Sigma-Aldrich 228737-500g Use with eye protection and gloves.
    Sodium Hydroxide (NaOH) Macron Chemicals 278408-500g Use with eye protection and gloves.
    Zinc Acetate Dihydrate ((CH3O2)2Zn2+•2H2O) Fisher Scientific AC45180010 1 kg Use with eye protection and gloves.
    Methanol (CH3OH) J.T. Baker 9070-05 4L Use in fume hood with eye protection and gloves.
    VWR Life Science Seradigm Premium Grade FBS VWR 97068-085 Sterile filter. 5 mL FBS in 45 mL PBS
    Mineral oil CVS  PLD-B280B None
    Round bottom flask ChemGlass N/A
    Thermometer N/A
    Stir bar N/A
    Plain precleaned microscope slides 3"x1"x1" mm thick Thermo Scientific 420-004T Spray with ethanol and let dry prior to use.
    Glass pasteur pipets N/A
    1 mL rubber bulbs N/A
    Plastic 100 mm petri dishes N/A
    Sterile forceps N/A
    Silicone isolators 0.8 mm thick
    Polydimethylsiloxane (PDMS) punches N/A
    Glass bottles N/A
    6 well plates Cellstar 657 160 N/A
    Filter Paper Whatman 8519 N/A
    Stirrer-hot plate VWR Dya-Dual 12620-970 Use with eye protection and gloves.
    2,2-Dimethoxy-2-phenylacetophenone (C6H5COC(OCH3)2C6H5 Sigma-Aldrich 24650-42-8 Use with eye protection and gloves.
    1-Vinyl-2-pyrrolidone (C6H9NO) Aldrich Use with eye protection and gloves.
    Polyethylene Glycol 10,000 (H(OCH2CH2)10,000OH) Fluka 81280-1kg Use with eye protection and gloves.
    RGDS Life Tein 180190 Use with eye protection and gloves.
    Blak-Ray long wave UV lamp UVP Model B 100AP N/A
    Eppendorf tubes USA Scientific 1615-5500 N/A

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Domogatskaya, A., Rodin, S., Tryggvason, K. Functional diversity of laminins. Annu Rev Cell Dev Biol. 28, 523-553 (2012).
    2. Howat, W. J., Holmes, J. A., Holgate, S. T., Lackie, P. M. Basement membrane pores in human bronchial epithelium: a conduit for infiltrating cells. Am J Pathol. 158, 673-680 (2001).
    3. Lauridsen, H. M., Pober, J. S., Gonzalez, A. L. A composite model of the human postcapillary venule for investigation of microvascular leukocyte recruitment. FASEB J. 28, 1166-1180 (2014).
    4. Mul, F. P., et al. Sequential migration of neutrophils across monolayers of endothelial and epithelial cells. J Leukoc Biol. 68, 529-537 (2000).
    5. Hermanns, M. I., Unger, R. E., Kehe, K., Peters, K., Kirkpatrick, C. J. Lung epithelial cell lines in coculture with human pulmonary microvascular endothelial cells: development of an alveolo-capillary barrier in vitro. Lab Invest. 84, 736-752 (2004).
    6. Birkness, K. A., et al. An in vitro tissue culture bilayer model to examine early events in Mycobacterium tuberculosis infection. Infect Immun. 67, 653-658 (1999).
    7. Wang, L., et al. Human alveolar epithelial cells attenuate pulmonary microvascular endothelial cell permeability under septic conditions. PLoS One. 8, 55311 (2013).
    8. Pellowe, A. S., Gonzalez, A. L. Extracellular matrix biomimicry for the creation of investigational and therapeutic devices. Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol. 8, 5-22 (2016).
    9. Peyton, S. R., Raub, C. B., Keschrumrus, V. P., Putnam, A. J. The use of poly(ethylene glycol) hydrogels to investigate the impact of ECM chemistry and mechanics on smooth muscle cells. Biomaterials. 27, 4881-4893 (2006).
    10. West, J. L. Protein-patterned hydrogels: Customized cell microenvironments. Nat Mater. 10, 727-729 (2011).
    11. DeLong, S. A., Gobin, A. S., West, J. L. Covalent immobilization of RGDS on hydrogel surfaces to direct cell alignment and migration. J Control Release. 109, 139-148 (2005).
    12. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
    13. Taite, L. J., et al. Bioactive hydrogel substrates: probing leukocyte receptor-ligand interactions in parallel plate flow chamber studies. Ann Biomed Eng. 34, 1705-1711 (2006).
    14. Lauridsen, H. M., Walker, B. J., Gonzalez, A. L. Chemically- and mechanically-tunable porated polyethylene glycol gels for leukocyte integrin independent and dependent chemotaxis. Technology. 02, 133-143 (2014).
    15. DeLong, S. A., Moon, J. J., West, J. L. Covalently immobilized gradients of bFGF on hydrogel scaffolds for directed cell migration. Biomaterials. 26, 3227-3234 (2005).
    16. Lauridsen, H. M., Gonzalez, A. L. Biomimetic, ultrathin and elastic hydrogels regulate human neutrophil extravasation across endothelial-pericyte bilayers. PLOS one. 12, 0171386-0171405 (2017).
    17. Peters, E. B., Christoforou, N., Leong, K. W., Truskey, G. A., West, J. L. Poly(Ethylene Glycol Hydrogel Scaffolds Containing Cell-Adhesive and Protease-Sensitive Peptides Support Microvessel Formation by Endothelial Progenitor Cells. Cellular and Molecular Bioengineering. 9, 38-54 (2016).
    18. Schwartz, M. P., et al. A synthetic strategy for mimicking the extracellular matrix provides new insight about tumor cell migration. Integr Biol (Camb). 2, 32-40 (2010).
    19. Booth, A. J., et al. Acellular normal and fibrotic human lung matrices as a culture system for in vitro investigation. Am J Respir Crit Care Med. 186, 866-876 (2012).
    20. Kalluri, R. Basement membranes: structure, assembly and role in tumour angiogenesis. Nat Rev Cancer. 3, 422-433 (2003).
    21. Roudsari, L. C., Keffs, S. E., Witt, A. S., Gill, B. J., West, J. L. A 3D Poly(ethylene glycol)-based Tumor Angiogenesis Model to Study the Influence of Vascular Cells on Lung Tumor Cell Behavior. Scientific Reports. 6, 1-15 (2016).
    22. Bermudez, L. E., Sangari, F. J., Kolonoski, P., Petrofsky, M., Goodman, J. The efficiency of the translocation of Mycobacterium tuberculosis across a bilayer of epithelial and endothelial cells as a model of the alveolar wall is a consequence of transport within mononuclear phagocytes and invasion of alveolar epithelial cells. Infect Immun. 70, 140-146 (2002).

    Tags

    Bioteknologi problemet 130 biologisk materiale kjelleren membran Polyethylene glycol mikro-pore Bilayer elastisk Hydrogels
    Supertynn Porated elastisk Hydrogels som en Biomimetic kjelleren membran for dobbelt celle kultur
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Pellowe, A. S., Lauridsen, H. M.,… More

    Pellowe, A. S., Lauridsen, H. M., Matta, R., Gonzalez, A. L. Ultrathin Porated Elastic Hydrogels As a Biomimetic Basement Membrane for Dual Cell Culture. J. Vis. Exp. (130), e56384, doi:10.3791/56384 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter