Summary
Nuvarande lipidens kultur modeller tillåter inte för funktionellt in vitro- studier som efterliknar i vivo mikromiljö. Använda polyetylenglykol och en zinkoxid mallhantering metod, beskriver det här protokollet utvecklingen av en ultrathin biomimetiska basalmembranet med avstämbara stelhet, porositet och biokemiska sammansättning som noggrant efterliknar i vivo extracellulära matriser.
Abstract
Basalmembranet är en kritisk komponent i cellernas lipidmonolager som kan variera i stelhet, sammansättning, arkitekturen och porositet. In vitro studier av endothelial-epitelial lipidmonolager traditionellt har förlitat sig på genomsläppliga stöd modeller som möjliggör lipidens kultur, men genomsläpplig stöder begränsas i sin möjlighet att replikera mångfalden av mänskliga källaren membran. Däremot hydrogel modeller som kräver kemisk syntes är mycket avstämbara och möjliggör ändringar av både den materiella stelhet och biokemiska sammansättning via inkorporering biomimetiska peptider eller proteiner. Traditionella hydrogel-modeller är dock begränsade funktionalitet eftersom de saknar porer för cell cell kontakter och funktionellt in vitro- migration studier. Dessutom på grund av tjockleken på traditionella hydrogels varit införlivandet av porer som spänner över hela tjockleken på hydrogels utmanande. I den aktuella studien använder vi poly-(ethylene-glycol) (PEG) hydrogels och en roman zinkoxid mallhantering metod för att åtgärda tidigare bristerna i biomimetiska hydrogels. Därför presenterar vi ett supertunt, basalmembranet-liknande hydrogel som tillåter kulturen av konfluenta cellulär lipidmonolager på en anpassningsbar byggnadsställning med variabel pore arkitekturer, mekaniska egenskaper och biokemiska sammansättning.
Introduction
Extracellulära matriser (ECM) utgör de protein-ställningar som stöder cell fastsättning och tjäna som barriärer mellan olika celltyper och är en viktig komponent i komplexa vävnader och organ. I motsats till interstitiell bindväv är basalmembranet (BM) en specialiserad typ av ECM som fungerar som en barriär att dela upp vävnad fack från varandra. BMs är ungefär 100 µm tjockt, och därför tillåta för direkt och indirekt kommunikation mellan celler på vardera sidan. Två vanliga exempel på BMs är vaskulär BMs, Funna i mikrovaskulära väggen mellan pericyter och endotelceller, och luftvägarna BMs som finns mellan endotelceller och epiteliala celler. BMs tjäna en viktig roll i regleringen av cellernas funktion, som cell polaritet och migration, hälsa och sjukdom. 1 den sammansättning, stelhet, arkitekturen och porositet av BMs varierar mellan organsystem att underlätta olika fysiologiska funktioner. Till exempel är BM porer kritiska för att upprätthålla cell-cell kommunikation, lösliga molekyl diffusion, och för migrering av immunceller under inflammation eller bakterier vid infektion. I luftvägarna spänner porer BM, full tjocklek med diametrar alltifrån 0,75 till 3.86 µm.2
Tunn beskaffenhet BM säkerställer att även om celltyper är fysiskt åtskilda från varandra, kommunikationen via parakrin - och kontakt-medierad signalering bevaras. Således, för att studera mänskliga sjukdomar in vitro forskare har förlitat sig på porösa genomsläpplig stöd skär till kultur cellulär lipidmonolager. 3 dessa modeller har varit avgörande för att förstå den cellular kommunikation som spelar en roll vid hälsa och sjukdom. 3 , 4 , 5 , 6 , 7 genomsläpplig stöd skär uppfyller de grundläggande kraven för att förstå hur cell-cell signalering reglerar fysiologiska processer, såsom leukocyt rekrytering och bakteriell infiltration; dock skären har betydande begränsningar och misslyckas att efterlikna en mänsklig BM. Permeable stöd skär saknar både mekanisk och biokemiska tunability, och den förenklade porösa strukturen inte efterlikna den fibrösa struktur som skapar oregelbundna porerna typiskt för BMs. Därför finns det ett växande behov av avstämbara system som kan återskapa de infödda BM-egenskaper som påverkar cellulära processer.
Polymer-baserade substrat är perfekta kandidater för utveckling av biomimetiska BMs att studera cellulära lipidmonolager i ett sammanhang som närmare efterliknar miljön i vivo . 8 , 9 , 10 , 11 , 12 polymerer är mekaniskt avstämbara och kan vara kemiskt modifierade för att införliva biomimetiska peptidfragment. 11 , 12 , 13 de bioinert polymer polyetylenglykol (PEG) kan användas för att konstruera biomimetiska BMs och senaste arbete har detaljerade syntesen av mekaniskt avstämbara PEG arginin-glycin-asparaginsyra (RGD) geler med porösa nätverk som stöder celltillväxt och inflammatoriska celler Kemotaxis. 14 även om publicerade PEG-baserade substrat som tillhandahålls en mer realistisk modell av en mänsklig ECM än genomsläpplig stöder, många av dessa modeller är extremt tjocka, med ett djup av ungefär 775 µm som begränsar möjligheten att skapa lipidens kulturer med cell-cell kontakter. 14
Här presenterar vi ett protokoll för skapandet av en PEG polymerbaserade BM härma som övervinner många av begränsningarna i nuvarande cell lipidens kultur teknik. Vi har utvecklat en templating metod som innehåller zinkoxid, ett flitigt använt material för tillverkning av mikrokristallin produktion, i polymeren under syntes och crosslinking, som därefter och selektivt tas bort från den resulterande bulk polymer. Den här processen genererar ett slumpmässigt porösa nätverk, härma det slingriga och sammankopplade pore nätverket av mänskliga BMs. Ytterligare, porositeten kan ändras genom att ändra storleken och formen av den zinkoxid microcrystals via ändring av den reaktion stökiometri under nålen produktionen. Den teknik som utvecklats här skapar en ultrathin hydrogel som härmar tjockleken på mänskliga BM. Slutligen, mekanik, porositeten och biokemiska sammansättningen av dessa BM-liknande konstruktioner kan enkelt ändras för att generera en närmiljön som är mest liknar att ses i vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Läs materialet varuinformationsblad (MSDS) av allt material som tidigare gånger att använda och använda säkerhetsföreskrifter på alla.
1. Sammanfattning av zinkoxid nålar
- Bereda 250 mL en 0,04 M Zn (nr3)2* 6 H2O lösning genom att tillsätta 2.9749 g zink nitrat till 250 mL vatten.
- Förbereda 150 mL 1 M NaOH genom att lägga till 6 g NaOH till 150 mL vatten.
- Ställa in badkar mineralolja på en värmeplatta med omrörare och dränka en 500 mL rund botten kolven in i olja badet vid rumstemperatur.
- Tillsätt 250 mL av Zn (nr3)2* 6 H2O till kolven och börja omrörning reaktionen.
- Tillsätt 150 mL NaOH-lösning (en vit fällning kommer bilda kort och sedan försvinner när två lösningar fortsätter att blanda). Rör om 2 h avtäckt.
- Upphetta kolven till 55-60 ° C och fortsätt omrörningen under 24 h.
- Stäng av värmen och låt lösningen svalna till rumstemperatur under omrörning.
- Filtrera lösningen på en Büchner tratt med en 11 µm porstorlek och låt torka över natten, avtäckt. När pappersfiltret inte längre våt från hällde lösningen och ett vitt pulver har bildats över tratten hålen, torkas helt partiklarna.
- Samla ZnO nålar och förbereda för svepelektronmikroskopi (SEM) för att bekräfta nål-liknande morfologi. Kortfattat, montera kol bandet till väsentlig PIN-kod och använda en metall spatel för att smeta ZnO nålar på kol bandet. Sputter kappa med 8 mm iridium med en täthet av 22,4 g/cm3 och skaffa bilder på 10 kV.
2. tillägg av uppoffrande zinkskikt på objektglas för HCl inducerad Release av PEG
- Förbereda zink Acetat lösning genom att lösa 1.756 g zinkacetat i 200 mL metanol.
- Ren 3 ”x 1” vanligt objektglas med 70% etanol och en disponibel torka. Låt lufttorka i 10 min.
- Placera en 150-mm glas Petri maträtt på en varm tallrik och Värm till 150-160 ° C.
- Med ett glas Pipettera med en Pipettera glödlampa, håll glas glasen med pincett och coat bilder genom att tillämpa 5 droppar zinkacetat, bildar ett tunt lager spridd på bilden. Låt överflödig lösning att droppa tillbaka in stamlösning.
- Placera bilden i förvärmda petriskål (150-160 ° C) med den acetat belagd från zink som är vänd uppåt. Lämna på värmeplattan för 15 min.
- Ta bort bilden med pincett och låt det svalna till rumstemperatur. Bilden verkar vara belagd med vita ränder.
- Ta bort någon överflödig zink som återstår på bilderna med en disponibel torka bort framträdande vita ränder. Ytan bör vara enhetliga.
- Exponera de förberedda bilder för UV-ljus i en biosäkerhet huva för minst 1 h att säkerställa steriliteten.
Försiktighet: UV-ljus är skadligt för ögonen och utsatt hud. Undvika direkt exponering för ögonen eller huden och stänga av strömförsörjningen när du inte använder.
3. beredning av silikon isolatorer
- Skär silikon ark in rutor mindre än 1 ”x 1” (isolatorer måste kunna passa i en 6-väl maträtt).
- Hål 8-12 mm i mitten av rutor med en biopsi punch.
- Autoklav silikon isolatorer för 20 min vid 121,0 ° C och 1.12 kg/cm.
4. beredning av PEG lösning och PEG Gel syntes
Obs: Funktionalisering och polymerisation av PEG har utförligt utforskats och detaljerad tidigare av våra lab m.fl. 8 , 10 , 11 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17
- Kombinera RGD cell självhäftande peptiden med acryloyl-PEG-NHS i 50 mM natriumbikarbonat (pH 8,5) på en 1:1 molar förhållandet att aktivera funktionalisering av amine slutstationen för peptiden med akrylat-delen, en biokemisk reaktion som har varit tidigare kännetecknas för att ge mer än 85% effektivitet. 17
- Förbereda foto-initierare genom att blanda 2,2-dimetoxi-2-phenylacetophenone med 1-Vinyl-2-pyrrolidon vid en koncentration på 300 mg/mL.
- I separat 1,5 mL tuber, väga in följande: ZnO nålar 20 mg, 12,5 mg PEG-DA och 2,5 mg av PEG-RGD.
- Avbryta 20 mg ZnO nålar i 270 µL 10% FBS/PBS lösning; Vortex att blanda (ca 15 s).
- Kort (< 1 s) snurra lösningen i en bänkmonterade mini centrifug att föra någon ZnO aggregat till basen av röret.
- Samla in 250 µL från toppen av ZnO lösningen, att säkerställa att aggregat förblir på botten av röret. Kombinera med PEG-DA och PEG-RGD för att skapa en PEG-lösning med cirka 2,5 mM RGD. Vortex att blanda (ca 15 s).
- Tillsätt 2 µL av acetofenon/n-vinyl pyrrolidon foto-initiativtagare och vortex kort att blanda (ca 5 s).
- Tillsätt 20 µL av polymer lösningen längs mitten av ZnO belagda bilderna.
- Sakta sänka en andra bild på topp, med ZnO beläggning ansiktet ned (PEG lösningen bör vara mellan två ZnO belagda). Försök att förhindra bildandet av eventuella luftbubblor. Flytta bilder sidled längs huvudaxeln så att eventuella bubblor att fly och sprida lösningen på ett tunt lager. Omfatta merparten av bilden med polymer lösningen. Skapa en liten överhäng med den översta bilden så att bilderna kan dras isär i senare steg.
- Crosslink bilderna under en 365 nm UV-lampa (cirka 10 mW/cm2) under 15 minuter.
5. utsläpp av PEG geler från glasskivor
- Applicera tryck att den överhängande bild och manuellt dra två bilderna apart i långsam takt för att undvika sprickbildning i bilderna. Låt gelen torka minst 5 minuter, eller över natten.
- Placera bilden i en steril 25 mm glas petriskål och häll försiktigt den 1 M HCl-lösningen in i bilden, med bara tillräckligt för att täcka bilden (ungefär 10-20 mL). Skaka försiktigt petriskål; gelen ska börja lyfta bilden som HCl upplöser den uppoffrande zinkbeläggning och nålar. När gelen är fri från bilden, häll i HCl tillbaka i stamlösning.
- Skölj gelen genom att försiktigt hälla cirka 25 mL 1 x PBS i petriskål tills luckan och gel är nersänkta.
6. sådd Cell lipidmonolager
- Förbereda A549 celler för sådd. Kort, skölj en 75 cm2 kolv med 5 mL 1 x PBS, tillsätt 3 mL 0,25% Trypsin-EDTA och låt sitta under 2-3 minuter vid 37 ° C.
- Mekaniskt agitera kolven, släcka reaktionen med 3 mL Dulbeccos modifierade Eagle Medium med 10% fetalt bovint serum och 1% penicillin-streptomycin och samla i en 15 mL konisk kolv. Skölj med ytterligare 4 mL av komplett Dulbeccos modifierade Eagle Media och samla in samma koniska. Snurra celler vid 475 x g i 6 min.
- Medan celler snurrar ner, lägga till en liten droppe av komplett Dulbeccos modifierade Eagle Medium till varje brunn 6-well platta. Använd pincett för att överföra de silikon isolatorer med gels i nya 6-väl plattan, så att gelen vilar på släpp av media. Nu när geler är spridda i ett tunt lager, kontrollera att det finns inga stora hål som är synliga för ögat. Detta bör göras omedelbart före cellen sådd för att undvika uttorkning och sprickbildning av gelerna.
- Att resuspendera cellerna i Dulbeccos modifierade Eagle Medium med 10% fetalt bovint serum och 1% penicillin-streptomycin med en koncentration på 6 x 105 celler/mL. Tillsätt den cell suspension droppe klokt att centrera av gelen, försöker upprätthålla en menisk i området stansade ut silikon membran. Tillåta celler att följa i 4 h.
- Efter 4 h, tillsätt 0,5 mL Dulbeccos modifierade Eagle komplett Medium till brunnen och inkubera över natten vid 37 ° C för fullständig vidhäftning.
- Följande dag, förbereda HUVECs för cell sådd.
- Skölj en 75 cm2 kolv med 5 mL 1 X PBS, tillsätt 3 mL 0,25% Trypsin-EDTA och låt sitta under 2-3 minuter vid 37 ° C.
- Mekaniskt agitera kolven, släcka reaktionen med 3 mL M199 media med 20% fetalt bovint serum, 1% penicillin-streptomycin och 1% tillägg och samla in i en 15 mL konisk.
- Skölj med 4 mL M199 komplett media och samla in samma koniska. Snurra celler vid 475 x g i 6 min.
- Medan celler snurrar ner, lägga till en liten droppe av komplett medium 199 i varje brunn i en ny 6-bra platta. Placera en ny silikon isolator i brunnen med släpp av media i mitten av silikon.
- Med pincett, noggrant flip silikon Frånkopplingsdonet stödja PEG gelen med A549 celler på Frånkopplingsdonet i den nya 6-väl-plattan.
- Omsuspendera HUVECs med en koncentration på 6 x 105 celler/mL och lägga till cellsuspensionen i mitten av den flippade gel droppe klokt, försöker upprätthålla en menisk på gel inom området stansade ut silikon membran. Tillåta celler att följa för 2 h.
- Efter 2 h, varsamt Tillsätt 2 mL av M199 komplett media till varje brunn.
7. immunofluorescens
- Försiktigt ta bort medier från geler med manuell pipett och tillsätt cirka 500 µL av 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) till mitten av gelen där cellerna är seedade. Låt sitta i 30 min i rumstemperatur.
Försiktighet: PFA är en giftig kemikalie; bära skydd och säkerställa hantering ske i biologiska säkerhetsdragskåp. - Försiktigt bort PFA och tillsätt cirka 500 µL av 2% BSA i PBS till varje gel. Låt sitta i 1 h i rumstemperatur.
- Ta försiktigt bort BSA. Förbereda primära antikroppar vid en spädningsgrad av 1: 100 i 2% BSA i PBS, och tillsätt 500 µL till varje gel. Låt sitta i 1 h i rumstemperatur. Skölj försiktigt med 500 µL 1 x PBS.
- Upprepa samma process med de sekundära antikropparna. Använda följande antikroppar: 1) anti-humant CD144 (VE-Cadherin) klon 16B1; (2) anti-humant CD324 (E-Cadherin) klon 6714; (3) anti-humant CD31 (PECAM-1) klon C-20; (4) anti-A549; (5) antimus FITC; (6) anti geten Alexa Fluor 647. För att visualisera F-aktin, tillsätt 500 µL Phalloidin (10 µg/mL i PBS) i 20 min.
- Ta försiktigt bort sekundära antikroppar eller phalloidin och tillsätt 500 µL av DAPI (0.1 µg/mL) för 20 min. Ta försiktigt bort DAPI lösning och försiktigt lägga 1,5 mL 1 x PBS till varje brunn så att geler i suspension.
- Använda pincett och silikon isolatorer, överföra en gel till en glasskiva. Gör detta för varje gel omedelbart före imaging och ersätta geler till PBS lösning efter imaging.
- Du kan också montera geler med en DAPI monteringsmedium. Försegla väl proverna med nagellack, förvärva bilder inom 2 dagar för att förhindra uttorkning och sprickbildning av gelen. Se tabell 1 för felsökning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
PEG-RGD hydrogels bildades genom sandwiching polymer lösningen mellan två uppoffrande zinkoxid och skapa pore mallar med zinkoxid nålar. Uppoffrande zinkoxid komponenter togs sedan bort med saltsyra, generera ultrathin PEG hydrogels med kontinuerlig porer (figur 1). Morfologi av zinkoxid nålar bekräftades av svepelektronmikroskopi (SEM), och genomsnittlig längd och bredd var fast beslutna att vara 3.92 ± 0.089 µm och 0,43 ± 0,02 µm, respektive (figur 2A - 2B). Efter avlägsnande av zinkoxid nålar, hydrogel porerna var visualiserat av SEM och kännetecknas (figur 2C - 2E). Den genomsnittliga pore tätheten för hydrogeler var 176,863 ± 49,532 porer. SEM användes också för att visualisera och beräkna pore densiteten av en standard 3 µm porstorlek polykarbonat genomsläpplig stöd infoga och pore tätheten befanns vara betydligt lägre, med ungefärligt 2,51 ± 0,05 porer per kvadrat mm (figur 2D, (Se tabell 2). Den genomsnittliga pordiameter i den zinkoxid mallade PEG hydrogel var 0,19 ± 0,01 µm, och var betydligt mindre än 3,47 ± 0,21 µm porerna observerats i genomsläppliga stöd Infoga (figur 2E, tabell 2). Optisk koherenstomografi användes att förvärva både 2 - och 3-dimensionella bilder och bestämma tjockleken på hydrogels flytande i 1 x PBS (figur 3A - 3B). Genomsnittliga gel tjockleken var 18.89 ± 3,47 µm (tabell 2). Gel mekanik utvärderades också genom att mäta den elasticitetsmodul som tidigare beskrivs, och den genomsnittliga Youngs modul befanns vara 96.78 ± 23.92 kPa (tabell 2). 14
Immunofluorescens mikroskopi visar att både endothelial celler och epitelceller upprätthålla sina fenotypiska identiteter efter att odlade på ultrathin PEG-RGD hydrogels. Endotelceller underhålls uttryck för PECAM-1 och epiteliala celler färgade positivt med en anti-A549 antikropp (figur 4A - 4B). Båda celltyper underhålls också förmågan att bilda åtsittande föreningspunkter. Endotelceller uttryckt VE-cadherin cell cell knytpunkter och epitelceller uttrycks E-cadherin (figur 4C - 4 D). De PEG-RGD hydrogels också stödja cellulära lipidmonolager, och möjliggör cell cell kontakter till form inom porösa strukturer, vilket visas av Immunofluorescerande avbildning av phalloidin målat prover (figur 4E).
Figur 1 . Schematisk översikt av Hydrogel förberedelse protokoll. (A) syntes och samling av ZnO nålar. B) beredning av glasskivor; skapa ett uppoffrande ZnO-lager. C) beredning och sterilisering av silikon isolatorer. D) beredning av PEG lösning med ZnO nålar. E) polymerisation av PEG geler mellan ZnO belagda glas diabilder. Vita linjer representerar uppoffrande ZnO nålar och beläggningar. F) HCl skölj för avlägsnande av nålar och frisättning av gel från bilderna. Mörka linjer representerar porer skapad av upplöst ZnO nålar. G) överföring av geler och silikon isolatorer till 6-väl maträtt att förbereda för cell sådd. H) Cell sådd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 . Zink nål karakterisering och Hydrogel porositet. (A) SEM-bild av zink nålar (skala bar 5 µm). B) längd och bredd av zink nålar. Punkter representerar mätningar för enskilda nålar; linjerna representerar medelvärdet och standardavvikelsen. C) SEM-bild av porösa hydrogel (skala bar 2 µm). D) Pore densitet och E) genomsnittliga pordiameter för polykarbonat genomsläpplig stöder och PEG hydrogels. Staplarna representerar medelvärdet och standardavvikelsen. p < 0,0001 via T-test. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 . Hydrogel tjocklek. Optisk koherenstomografi visar (A) 3-dimensionell och (B) 2-dimensionella bilder av hydrogels flytande i PBS. Pilarna representerar vätskeytan, asterisk representerar hydrogel. Skalstapeln är 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 4 . Hydrogeler stöd enskiktslager och lipidens kultur. Båda endothelial celler och epitelceller ska kunna bilda konfluenta enskiktslager på PEG hydrogels, vilket framgår av fluorescerande färgning för A) CD31 (CD31 röd, DAPI blå) och (B) A549 (A549 röd, DAPI blå), respektive. Bildandet av intakt cadherin korsningar demonstreras för C) endothelial celler (VE cadherin grön, DAPI blå) och D) epitelceller (E cadherin grön, DAPI blå) (skala barer 100 µm). E) två exempel på cellulär lipidmonolager demonstreras av phalloidin färgning (phalloidin röd, DAPI blå) (skala barer 10 µm). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Problemet | Möjlig lösning |
| Geler har stora hål. | Kontrollera att zink nålar tillräckligt bryts innan de används. |
Tabell 1. Lösningsförslag för felsökning av problem.
| Hydrogel | Transwell | Extracellulär Matrix | |
| Pore densitet (porer/mm2) | 1.77 x 105 ± 4,9 x 104 | 2,51 ± 0,05 | 8,50 x 102 till 7.0 x 104 2,14 |
| Pordiameter (µm) | 0,19 ± 0,01 | 3,47 ± 0,21 | 0,47 till 3,86 2,14 |
| Tjocklek (µm) | 18.89 ± 3,47 | 10 | 0,05 till 0,10 17 |
| Youngs modulus (kPa) 5 | 96.78 ± 23.92 | > 1000 | 3,5 14 |
Tabell 2. Jämförelse av Hydrogel egenskaper att genomsläppliga standardsupport infoga och extracellulär Matrix (värdena representerar medelvärdet ± medelfel)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet beskrivs här har tillåtit oss att skapa en avstämbara PEG hydrogel att fungera som en biomimetiska BM byggnadsställning. Specifikt, av varierande PEG molekylvikter, peptid konjugation strategier, och zinkoxid mikrokristallin strukturer eller koncentrationer, elasticitetsmodulen, kan biokemiska egenskaper och porös struktur av hydrogels ändras, respektive. Ultratunna PEG ställningen har högre pore densitet och en mindre pordiameter som är mer mimetiska av de funktioner som finns i i vivo källaren membran jämfört med en standard genomsläpplig stöd modell (tabell 2). Ytterligare, genom denna metod har vi uppnått en ultrathin struktur med en genomsnittlig tjocklek på mindre än 20 µm. Medan de polykarbonat genomsläppliga stöd modellerna redan uppnått ett supertunt lager av bara 10 µm, till vår kunskap, är detta det första fritt flytande och avstämbara hydrogel-systemet för att uppnå denna tjocklek. Slutligen har de PEG hydrogeler en elasticitetsmodul av ungefärligt 100 kPa, vilket är storleksordningar mindre hård än traditionella genomsläpplig stöder, vävnadsodling plast och glas, som alla har elastiska moduli av utbud av WTO, och därför är mer jämförbar med låga (< 10 kPa) elasticitetsmodul av i vivo extracellulär matrix (tabell 2).
Att uppnå en låg elasticitetsmodul var en av de primära målen för det arbete som presenteras här, och är en begränsning för användningen av traditionella polykarbonat genomsläpplig stöd modeller. Det är väl känt att substrat stelhet kan diktera cell beteende, och arbete har visat att substrat stelhet kan vägleda cellulära öde skilja celler. 12 stel substrat används också ofta att efterlikna sjukdomstillstånd, inklusive fibrotisk vävnad eller cancertumörer, och därför är inte korrekt representant för friska vävnader. 18 , 19 , 20 , 21 för att studera quiescent cellulära fenotyper och funktioner, är det viktigt att använda substrat som efterliknar en elasticitetsmodul som är relevanta i vivo. En av de stora fördelarna med detta system är förmågan att ställa mekaniken i gelen, som kan uppnås med hjälp av PEG med olika molekylvikter. Många sjukdomar är associerade med ECM stelna, ger detta system en biomimetiska plattform för att studera effekterna av friska kontra sjuka BM på cellernas funktion. Ytterligare ändring av detta system kan också uppnås genom att ändra peptid fragmentet ingår för celladhesion. För tillämpningen av denna studie användes RGD på grund av dess allestädes närvarande uttryck i många BM proteiner och dess förmåga för att underlätta fast cell fastsättning. Utöver RGD, kan laminin fragment också införlivas för att främja laminin-epitelial interaktioner som guide apikala-basal cell polarisering. 1 precis som BM styvheten ändras i sjukdom, sammansättningen av basalmembranet är ombyggda i sjukdomstillstånd. Med amine-reaktivt PEG-NHS föregångare, är det möjligt att böja en mängd peptider och proteiner till PEG polymer basen. 11 , 14 , 15 detta är speciellt fördelaktigt för att undersöka effekterna av integrin engagemang för olika integrin receptorer. Till exempel RGD sekvensen som uttrycks i Fibronektin och kollagen engagerar flera integriner, men har en hög specificitet för integrin αvβ3. För att specifikt efterlikna en Fibronektin rikt substratet, leucin-aspartic syra-valin (LDV) sekvensen kan ingå att engagera α4β1, eller för att efterlikna ett kollagen membran, asparaginsyra-glycin-glutaminsyra syra-alanin (DGEA) kunde läggas till engagera integrin Α2Β1. 8
Endothelial-epitelial lipidmonolager är bara ett exempel på en cellulär lipidens som kan skapas med den modell som presenteras här. Andra lipidmonolager som finns naturligt i vivo, avgränsade med endast en tunn BM eller ECM, inkluderar endothelial-pericyt och endotel-smidig muskel cell lipidmonolager. Således, ansökningar om denna metod är bred och sträcker sig från Lungmedicin till vaskulär biologi. Ytterligare, på grund av den unika porositeten av dessa hydrogels, de erbjuder möjligheten att genomföra funktionella studier som tidigare hydrogel-modeller inte har kunnat stödja. Genom att införliva porer i vår ultratunna hydrogel-system, har vi skapat en förbättrad biomimetiska ersättning för genomsläpplig stöd modeller, gör det möjligt för utredningen av bakteriell infiltration, vanligt över den pulmonell epitelial-endotel barriär i tuberkulos. 3 , 6 , 14 , 22 likaså själavandring eller chemotaxis av inflammatoriska celler över vaskulär cellkulturer kan undersökas genom att mäta graden av cell capture på RGD functionalized självhäftande cellytan av gelen, som har visats tidigare. 16 detta är en klar fördel jämfört med tidigare hydrogel baserade metoder som har uppnått samtidig odlingsbetingelser via inkapsling. Sådana system möjliggör närhet och cell-cell kontakt mellan två celltyper och har varit framgångsrika för att mäta funktioner såsom angiogenes och vasculogenesis, men saknar den tillgänglighet som erbjuds av tvådimensionella system, som ger en mycket enklare plattform för mäta läcka, infiltration eller aktiv migrering över en samtidig odlade cellulära barriär. 17
Således den metod som visat här erbjuder en plattform för en mängd olika studier inom flera områden, och ger en språngbräda mot generera mer relevanta data från in vitro studier för att ytterligare förstå i vivo patologier och mekanismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Prof. Paul Van Tassel och Prof. Chinedum Osuji för sin tankeväckande konversationer och materialvetenskap expertis. Finansiering för detta arbete lämnade Dubinsky nya initiativ tilldelning och nationella institut för hälsa NIBIB BRPR01 EB16629-01A1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1M Hydrogel Chloride (HCl) | EMD | HX0603-75 2.5L | Sterile. Use in fume hood with eye protection and gloves. |
| 1X PBS | Gibco | 14040-133 500 mL | None |
| Zinc Nitrate Hexahydrate (Zn(NO3)2•6H2O) | Sigma-Aldrich | 228737-500g | Use with eye protection and gloves. |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Macron Chemicals | 278408-500g | Use with eye protection and gloves. |
| Zinc Acetate Dihydrate ((CH3O2)2Zn2+•2H2O) | Fisher Scientific | AC45180010 1 kg | Use with eye protection and gloves. |
| Methanol (CH3OH) | J.T. Baker | 9070-05 4L | Use in fume hood with eye protection and gloves. |
| VWR Life Science Seradigm Premium Grade FBS | VWR | 97068-085 | Sterile filter. 5 mL FBS in 45 mL PBS |
| Mineral oil | CVS | PLD-B280B | None |
| Round bottom flask | ChemGlass | N/A | |
| Thermometer | N/A | ||
| Stir bar | N/A | ||
| Plain precleaned microscope slides 3"x1"x1" mm thick | Thermo Scientific | 420-004T | Spray with ethanol and let dry prior to use. |
| Glass pasteur pipets | N/A | ||
| 1 mL rubber bulbs | N/A | ||
| Plastic 100 mm petri dishes | N/A | ||
| Sterile forceps | N/A | ||
| Silicone isolators | 0.8 mm thick | ||
| Polydimethylsiloxane (PDMS) punches | N/A | ||
| Glass bottles | N/A | ||
| 6 well plates | Cellstar | 657 160 | N/A |
| Filter Paper | Whatman | 8519 | N/A |
| Stirrer-hot plate | VWR Dya-Dual | 12620-970 | Use with eye protection and gloves. |
| 2,2-Dimethoxy-2-phenylacetophenone (C6H5COC(OCH3)2C6H5 | Sigma-Aldrich | 24650-42-8 | Use with eye protection and gloves. |
| 1-Vinyl-2-pyrrolidone (C6H9NO) | Aldrich | Use with eye protection and gloves. | |
| Polyethylene Glycol 10,000 (H(OCH2CH2)10,000OH) | Fluka | 81280-1kg | Use with eye protection and gloves. |
| RGDS | Life Tein | 180190 | Use with eye protection and gloves. |
| Blak-Ray long wave UV lamp | UVP | Model B 100AP | N/A |
| Eppendorf tubes | USA Scientific | 1615-5500 | N/A |
References
- Domogatskaya, A., Rodin, S., Tryggvason, K.
- Howat, W. J., Holmes, J. A., Holgate, S. T., Lackie, P. M. Basement membrane pores in human bronchial epithelium: a conduit for infiltrating cells. Am J Pathol. 158, 673-680 (2001).
- Lauridsen, H. M., Pober, J. S., Gonzalez, A. L. A composite model of the human postcapillary venule for investigation of microvascular leukocyte recruitment. FASEB J. 28, 1166-1180 (2014).
- Mul, F. P., et al. Sequential migration of neutrophils across monolayers of endothelial and epithelial cells. J Leukoc Biol. 68, 529-537 (2000).
- Hermanns, M. I., Unger, R. E., Kehe, K., Peters, K., Kirkpatrick, C. J. Lung epithelial cell lines in coculture with human pulmonary microvascular endothelial cells: development of an alveolo-capillary barrier in vitro. Lab Invest. 84, 736-752 (2004).
- Birkness, K. A., et al. An in vitro tissue culture bilayer model to examine early events in Mycobacterium tuberculosis infection. Infect Immun. 67, 653-658 (1999).
- Wang, L., et al. Human alveolar epithelial cells attenuate pulmonary microvascular endothelial cell permeability under septic conditions. PLoS One. 8, 55311 (2013).
- Pellowe, A. S., Gonzalez, A. L. Extracellular matrix biomimicry for the creation of investigational and therapeutic devices. Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol. 8, 5-22 (2016).
- Peyton, S. R., Raub, C. B., Keschrumrus, V. P., Putnam, A. J. The use of poly(ethylene glycol) hydrogels to investigate the impact of ECM chemistry and mechanics on smooth muscle cells. Biomaterials. 27, 4881-4893 (2006).
- West, J. L. Protein-patterned hydrogels: Customized cell microenvironments. Nat Mater. 10, 727-729 (2011).
- DeLong, S. A., Gobin, A. S., West, J. L. Covalent immobilization of RGDS on hydrogel surfaces to direct cell alignment and migration. J Control Release. 109, 139-148 (2005).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- Taite, L. J., et al. Bioactive hydrogel substrates: probing leukocyte receptor-ligand interactions in parallel plate flow chamber studies. Ann Biomed Eng. 34, 1705-1711 (2006).
- Lauridsen, H. M., Walker, B. J., Gonzalez, A. L. Chemically- and mechanically-tunable porated polyethylene glycol gels for leukocyte integrin independent and dependent chemotaxis. Technology. 02, 133-143 (2014).
- DeLong, S. A., Moon, J. J., West, J. L. Covalently immobilized gradients of bFGF on hydrogel scaffolds for directed cell migration. Biomaterials. 26, 3227-3234 (2005).
- Lauridsen, H. M., Gonzalez, A. L. Biomimetic, ultrathin and elastic hydrogels regulate human neutrophil extravasation across endothelial-pericyte bilayers. PLOS one. 12, 0171386-0171405 (2017).
- Peters, E. B., Christoforou, N., Leong, K. W., Truskey, G. A., West, J. L. Poly(Ethylene Glycol Hydrogel Scaffolds Containing Cell-Adhesive and Protease-Sensitive Peptides Support Microvessel Formation by Endothelial Progenitor Cells. Cellular and Molecular Bioengineering. 9, 38-54 (2016).
- Schwartz, M. P., et al. A synthetic strategy for mimicking the extracellular matrix provides new insight about tumor cell migration. Integr Biol (Camb). 2, 32-40 (2010).
- Booth, A. J., et al. Acellular normal and fibrotic human lung matrices as a culture system for in vitro investigation. Am J Respir Crit Care Med. 186, 866-876 (2012).
- Kalluri, R. Basement membranes: structure, assembly and role in tumour angiogenesis. Nat Rev Cancer. 3, 422-433 (2003).
- Roudsari, L. C., Keffs, S. E., Witt, A. S., Gill, B. J., West, J. L. A 3D Poly(ethylene glycol)-based Tumor Angiogenesis Model to Study the Influence of Vascular Cells on Lung Tumor Cell Behavior. Scientific Reports. 6, 1-15 (2016).
- Bermudez, L. E., Sangari, F. J., Kolonoski, P., Petrofsky, M., Goodman, J. The efficiency of the translocation of Mycobacterium tuberculosis across a bilayer of epithelial and endothelial cells as a model of the alveolar wall is a consequence of transport within mononuclear phagocytes and invasion of alveolar epithelial cells. Infect Immun. 70, 140-146 (2002).
