Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Ultratynde Porated elastiske Hydrogels som en biomimetiske basalmembranen til Dual celle kultur

Published: December 26, 2017 doi: 10.3791/56384
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Biomedical Engineering, Yale University

Summary

Nuværende tolagede kultur modeller tillader ikke for funktionelle in vitro- undersøgelser, der efterligner i vivo microenvironments. Ved hjælp af polyethylen glycol og en zink oxid templating metode, beskriver denne protokol udviklingen af en ultratynde biomimetiske basalmembranen med afstemmelige stivhed, porøsitet og biokemiske sammensætning, der nøje efterligner i vivo ekstracellulære matricer.

Abstract

Basalmembranen er et afgørende element i cellulære dobbeltlag, der kan variere i stivhed, sammensætning, arkitektur og porøsitet. In vitro undersøgelser i endothelial-epitelial dobbeltlag har traditionelt påberåbt sig gennemtrængelig støtte modeller, der aktiverer tolagede kultur, men gennemtrængelig understøtter er begrænsede i deres evne til at replikere mangfoldighed af menneskelige kælderen membraner. Derimod hydrogel modeller, der kræver kemisk syntese er yderst afstemmelige og giver mulighed for ændringer af både den materielle stivhed og den biokemiske sammensætning via indarbejdelse af biomimetiske peptider eller proteiner. Dog er traditionelle hydrogel modeller begrænset funktionalitet, fordi de mangler porer for celle-celle kontakter og funktionelle i vitro Migrationsstudier. Desuden, på grund af tykkelsen af traditionelle hydrogels, har inkorporering af porer, der spænder over hele tykkelsen af hydrogels været udfordrende. I den foreliggende undersøgelse bruger vi poly-(ethylene-glycol) (PEG) hydrogels og en roman zinkoxid templating metode til at afhjælpe de tidligere mangler af biomimetiske hydrogels. Som et resultat, præsenterer vi en ultratynde, basalmembranen-lignende hydrogel, der tillader sammenflydende cellulære dobbeltlag kultur på en tilpasselig stillads med variabel pore arkitekturer, mekaniske egenskaber og biokemiske sammensætning.

Introduction

Ekstracellulære matricer (ECM) udgør de protein stilladser, som understøtter celle vedhæftet fil og tjene som barrierer mellem forskellige celletyper og er en væsentlig bestanddel af komplekse væv og organer. I modsætning til interstitielle bindevæv er basalmembranen (BM) en specialiseret type af ECM, der fungerer som en barriere for at opdele væv rum fra hinanden. BMs er ca 100 µm tykt, og derfor giver mulighed for direkte og indirekte kommunikation mellem cellerne på begge sider. To almindelige eksempler på BMs er vaskulære BMs, fundet i mikrovaskulære væggen mellem pericytes og endotelceller, og luftvejene BMs, der findes mellem endotel og epitel celler. BMs tjene en vigtig rolle i reguleringen af cellefunktion som celle polaritet og migration, sundhed og sygdom. 1 sammensætning, stivhed, arkitektur og porøsitet af BMs varierer på tværs af organsystemer til at lette forskellige fysiologiske funktioner. For eksempel, er BM porer afgørende for at opretholde celle-celle kommunikation, opløselige molekyle diffusion, og for overførslen af immunceller under betændelse eller bakterier under infektion. I luftvejene span porer af BM, fuld tykkelse med diametre spænder fra 0,75 til 3,86 µm.2

Den tynde karakter af BM sikrer, at selv om celletyper er fysisk adskilt fra hinanden, intercellulær kommunikation via paracrine - og kontakt-medieret signalering bevares. Således, for at studere menneskelig sygdom in vitro forskere har stolet på porøse gennemtrængelig støtte skær til kultur cellulære dobbeltlag. 3 disse modeller har været afgørende for at forstå den trådløse kommunikation, der spiller en rolle i sundhed og sygdom. 3 , 4 , 5 , 6 , 7 gennemtrængelig støtte skær opfylder de grundlæggende krav for at forstå hvordan cell-celle signalering regulerer fysiologiske processer, såsom leukocyt rekruttering og bakteriel infiltration; men indsætter har betydelige begrænsninger og undlader at efterligne en menneskelig BM. Permeable støtte skær mangler både mekanisk og biokemiske tunability, og den forsimplede porøse struktur ikke efterligne den fibrøse struktur, der skaber de uregelmæssige porer typisk af BMs. Derfor er der et voksende behov for afstemmelige systemer, der kan genskabe de indfødte BM egenskaber, der påvirker cellulære processer.

Polymer-baserede substrater er ideelle kandidater til at udvikle biomimetiske BMs at studere cellulær dobbeltlag i en kontekst, der nærmere efterligner i vivo miljø. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 polymerer er mekanisk afstemmelige og kan være kemisk modificeret til at indarbejde biomimetiske peptid fragmenter. 11 , 12 , 13 bioinert polymer polyethylenglycol (PEG) kan bruges til at konstruere biomimetiske BMs, og de seneste arbejde har detaljerede syntesen af mekanisk afstemmelige PIND arginin-glycin-aspartinsyre (M.H.T.) geler med porøse netværk, som understøtter cellevækst og inflammatoriske celle chemotaxis. 14 selvom offentliggjort PIND-baserede substrater givet en mere realistisk model af en menneskelig ECM end gennemtrængelig understøtter, mange af disse modeller er ekstremt tykke, med en dybde på omkring 775 µm, der begrænser muligheden for at oprette tolagede kulturer med celle-celle kontakter. 14

Vi præsenterer her, en protokol til oprettelse af en PIND polymer-baserede BM efterligner, der overvinder mange af begrænsningerne i nuværende celle tolagede kultur teknologier. Vi har udviklet en templating metode, der indeholder zinkoxid, en udstrakt grad anvendte materiale til fremstilling af mikrokrystallinsk produktion, i polymeren under syntese og crosslinking, som efterfølgende og selektivt fjernes fra den resulterende bulk polymer. Denne proces skaber en tilfældig porøse netværk, efterligne den indviklede og sammenkoblede pore netværk af menneskelige BMs. Yderligere, porøsitet kan ændres ved at ændre størrelsen og formen af zinkoxid microcrystals via ændring af reaktion støkiometrisk under nålen produktion. Den teknik udviklet her skaber en ultratynde hydrogel, der efterligner tykkelsen af menneskelige BM. Endelig, mekanik, porøsitet, og den biokemiske sammensætning af disse BM-lignende konstruerer kan let ændres til at generere en mikromiljø, der er mest svarende til at ses i vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Læs materiale Safety Data Sheet (MSDS) af alle materialer forudgående tidspunkter for at bruge og anvende sikkerhedsforanstaltninger på alle.

1. Sammenfatning af zinkoxid nåle

  1. Forberede 250 mL af en 0,04 M Zn (3)2* 6 H2O løsning ved at tilføje 2.9749 g zink nitrat til 250 mL vand.
  2. Forbered 150 mL 1 M NaOH ved at tilføje 6 g NaOH til 150 mL vand.
  3. Opsætning af spabad mineralsk olie på en varm tallerken med omrøreren, og dykke en kolbe på 500 mL rund bund i oliebad ved stuetemperatur.
  4. Der tilsættes 250 mL Zn (3)2* 6 H2O kolben og begynde omrøring reaktion.
  5. Tilføj 150 mL natriumhydroxidoploesning (et hvidt bundfald vil danne kort og derefter forsvinde som de to løsninger fortsætter med at blande). Rør for 2 h afdækket.
  6. Kolbe opvarmes til 55-60 ° C og fortsætte omrøring i 24 timer.
  7. Slukke for varmen og lad løsning afkøle til stuetemperatur under omrøring.
  8. Filtrer løsning på en Büchner tragt med en 11 µm porestørrelse og lad tørre natten, afdækket. Når filtrerpapir er ikke længere våde fra opløsningen hældes og et hvidt pulver har dannet over tragt huller, tørret partiklerne fuldt ud.
  9. Indsamle ZnO nåle og forberede scanning elektronmikroskopi (SEM) at bekræfte nål-lignende morfologi. Kort, montere carbon bånd på påbegyndt pin og bruge en metal spatel til at smøre ZnO nåle på carbon båndet. Sputter frakke med 8 mm iridium med en tæthed på 22,4 g/cm3 og erhverve billeder på 10 kV.

2. tilsætning af hellige zink lag på objektglas HCL induceret frigivelse af PIND

  1. Forberede zink acetat løsning ved at opløse 1.756 g zink acetat i 200 mL methanol.
  2. Rengør 3 "x 1" plain objektglas med 70% ethanol og en engangs tørre. Lad lufttørre i 10 min.
  3. Placer en 150-mm glas petriskål op på en varm tallerken og Forvarm til 150-160 ° C.
  4. Ved hjælp af et glas afpipetteres med en pipette pære, holde glas dias med pincet og frakke dias ved at anvende 5 dråber af zink acetat, danner et tyndt lag spredt på diaset. Tillade overskydende løsning at dryppe tilbage i stamopløsningen.
  5. Placer slide i forvarmet petriskålen (150-160 ° C) med zink acetat coatede side vender opad. Forlade på kogeplade i 15 min.
  6. Fjerne diaset med pincet og lad det køle til stuetemperatur. Diaset vises skal belægges med hvide striber.
  7. Fjern eventuelle overskydende zink, der er tilbage på dias ved hjælp af en engangs tør fjerne fremtrædende hvide striber. Overfladen skal være ensartet.
  8. Udsætte den forberedte dias til UV lys i en biosikkerhed hætte i mindst 1 time at sikre sterilitet.
    Forsigtig: UV-lys er skadelige for øjnene og udsat hud. Undgå direkte eksponering for øjne eller hud og slukke elektriske forsyning, når du ikke bruger.

3. forberedelse af silikone isolatorer

  1. Cut silikone ark i firkanter, mindre end 1 "x 1" (isolatorer skal være i stand til at passe i en 6-godt parabol).
  2. Punch 8-12 mm huller i midten af firkanterne med en biopsi punch.
  3. Autoklave silikone isolatorer i 20 min. ved 121.0 ° C og 1.12 kg/cm.

4. forberedelse af PIND løsning og PLØK Gel syntese

Bemærk: Functionalization og polymerisering af PIND har været grundigt udforsket og detaljerede tidligere af vores lab m.fl. 8 , 10 , 11 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17

  1. Kombinere M.H.T. celle klæbende peptid med acryloyl-PIND-NHS i 50 mM natriumbicarbonat (pH 8,5) i forholdet 1:1 molar at muliggøre functionalization af amin endestation for peptid med acrylat gruppe, en biokemisk reaktion, der tidligere har været kendetegnet for at give større end 85% effektivitet. 17
  2. Forberede foto-initiativtager ved at blande 2,2-Dimethoxy-2-phenylacetophenone med 1-Vinyl-2-pyrrolidon på en koncentration af 300 mg/mL.
  3. I separate 1,5 mL rør, afvejes følgende: 20 mg af ZnO nåle, 12,5 mg PIND-DA og 2,5 mg af PEG-M.H.T..
  4. Suspendere 20 mg af ZnO nåle i 270 µL af 10% FBS/PBS løsning; vortex at blande (ca. 15 s).
  5. Kort (< 1 s) spin løsning i en benchtop mini centrifuge at bringe enhver ZnO aggregater til bunden af røret.
  6. Indsamle 250 µL fra toppen af ZnO-løsning til at sikre, at aggregater forbliver i bunden af røret. Kombinere med PIND-DA og PLØK-M.H.T. til at skabe en PIND løsning med ca 2.5 mM M.H.T.. Vortex at blande (ca. 15 s).
  7. Tilføj 2 µL af acetophenone/n-vinyl pyrrolidon foto-initiativtager og vortex kortvarigt at blande (ca 5 s).
  8. Tilføj 20 µL af polymer løsning langs midten af ZnO belagt dias.
  9. Langsomt sænke et andet dias på toppen, med ZnO belægning ansigt ned (PIND løsning bør være mellem to ZnO belagt lag). Forsøge at forhindre dannelsen af eventuelle luftbobler. Flytte dias sideværts langs den største akse at tillade nogen bobler at flygte og til at sprede løsningen til et tyndt lag. Dække størstedelen af dias med polymer løsning. Oprette et lille udhæng med top diaset for at sikre, at diasene kan trækkes fra hinanden i senere trin.
  10. Bitmapgenkendelse dias under en 365 nm UV lampe (ca 10 mW/cm2) til 15 min.

5. frigivelsen af PIND geler fra glas dias

  1. Lægge pres på udhængende dias og manuelt træk de to dias fra hinanden i et langsomt tempo i orden undgå sprængning dias. Tillad geler til tørre i mindst 5 min., eller natten over.
  2. Placer diasset i en steril 25 mm glas petriskål og forsigtigt hældes 1 M HCl løsning i diaset, bruger kun nok til at dække diasset (ca 10-20 mL). Forsigtigt rock petriskål; gelen skal begynde at ophæve væk fra diaset som HCl opløser opoffrende zink belægning og nåle. Når gelen er gratis fra diaset, hæld HCl tilbage i stamopløsningen.
  3. Skyl gel ved forsigtigt hælde ca. 25 mL 1 x PBS i petriskålen indtil dias og gel er nedsænket.
Omhyggeligt hæld off PBS i en spildbakken.
  • Forsigtigt hældes ca. 25 mL 1 x PBS i petriskålen, indtil gel flydende i opløsningen.
  • Brug af pincet, omhyggeligt slide silikone isolator under gel og løfte gel på det.
  • Overføre isolator og gel i en 6-godt skål fyldt med steril 1 x PBS.
  • Gentag denne proces, indtil alle gel er blevet fjernet fra dias og er iblødsætning i PBS. Udsætte de forberedte geler UV lys i en biosikkerhed hætte i mindst 1 time at sikre sterilitet.

    • 6. såning celle dobbeltlag

    1. Forberede A549 celler til såning. Kort, skyl en 75 cm2 kolbe med 5 mL af 1 x PBS, tilsættes 3 mL 0,25% Trypsin-EDTA og lad sidde i 2-3 min. ved 37 ° C.
      1. Mekanisk agitere kolben, slukke reaktion med 3 mL Dulbecco ændret Eagle Medium med 10% føtal bovin serum og 1% penicillin-streptomycin og indsamle i en 15 mL konisk kolbe. Skyl med en yderligere 4 mL af komplet Dulbecco ændret Eagle medier og samler ind den samme koniske. Spin celler på 475 x g for 6 min.
    2. Mens celler er spinning ned, skal du tilføje en lille dråbe af komplet Dulbecco ændret Eagle Medium til hver brønd med en 6-godt plade. Bruge pincet til at overføre silikone isolatorer med geler til den nye 6-godt plade, så gelen hviler på dråbe af medier. Nu, geler er spredes i et tyndt lag, check for at sikre, at der er ingen store huller synlig for øjet. Dette bør gøres umiddelbart før celle seeding for at undgå udtørring og revnedannelse i gels.
    3. Resuspend celler i Dulbeccos modificerede Eagle Medium med 10% føtal bovin serum og 1% penicillin-streptomycin i en koncentration på 6 x 105 celler/mL. Tilføje celle suspension drop kloge til midten af gel, forsøger at opretholde en menisk i området udstansede ud af silikone membran. Tillad celler til at overholde for 4 h.
    4. Efter 4 h, tilsættes 0,5 mL Dulbeccos modificerede Ørnen komplet Medium til brønden og inkuberes natten over ved 37 ° C og giver mulighed for komplet vedhæftning.
    5. Den følgende dag, forberede HUVECs for celle såning.
      1. Skyl en 75 cm2 kolbe med 5 mL af 1 X PBS, tilsættes 3 mL 0,25% Trypsin-EDTA og lad sidde i 2-3 min. ved 37 ° C.
      2. Mekanisk agitere kolben, slukke reaktion med 3 mL M199 medier med 20% føtal bovint serum, 1% penicillin-streptomycin og vækst på 1% tillæg og indsamle i en 15 mL konisk.
      3. Skyl med 4 mL af M199 komplet media og samler ind den samme koniske. Spin celler på 475 x g for 6 min.
    6. Mens celler er spinning ned, skal du tilføje en lille dråbe af komplette mellemstore 199 til hver brønd i en ny 6-godt plade. Placere en ny silikone isolator i godt med dråbe af medier i midten af silikone.
    7. Brug af pincet, omhyggeligt flip silikone isolator støtte PIND gel med A549 celler på isolator i den nye 6-godt plade.
    8. Resuspend HUVECs i en koncentration på 6 x 105 celler/mL og tilføje cellesuspension til midten af kådhed gel drop kloge, forsøger at opretholde en menisken på gel inden for området udstansede ud af silikone membran. Tillad celler til at overholde i 2 timer.
    9. Efter 2 h, forsigtigt tilsættes 2 mL af M199 komplet media til hver brønd.

    7. immunfluorescens

    1. Forsigtigt fjerne medier fra geler med en manuel pipette og tilføje ca 500 µL af 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) til midten af gel hvor cellerne udsås. Lad sidde i 30 min. ved stuetemperatur.
      Forsigtig: PFA er en giftig kemisk; bære beskyttelse og sikre håndtering sker på et biologisk sikkerhed kabinet.
    2. Forsigtigt fjerne PFA og tilføje ca 500 µL af 2% BSA i PBS til hver gel. Lad sidde i 1 time ved stuetemperatur.
    3. Fjern forsigtigt BSA. Forberede primære antistoffer i en fortynding på 1: 100 i 2% BSA i PBS, og tilføje 500 µL til hver gel. Lad sidde i 1 time ved stuetemperatur. Skyl forsigtigt med 500 µL 1 x PBS.
      1. Gentag den samme proces med de sekundære antistoffer. Bruge følgende antistoffer: 1)-anti-humant CD144 (VE-Cadherin) klon 16B1; 2)-anti-humant CD324 (E-Cadherin) klon 6714; 3)-anti-humant CD31 (PECAM-1) klon C-20; 4) anti-A549; 5) anti-mus FITC; 6) anti-ged Alexa Fluor 647. For at visualisere F-actin, tilsættes 500 µL af Phalloidin (10 µg/mL i PBS) i 20 min.
    4. Forsigtigt fjerne sekundær antistoffer eller phalloidin og tilsættes 500 µL af DAPI (0,1 µg/mL) i 20 min. Fjern forsigtigt DAPI løsning og forsigtigt tilføje 1,5 mL 1 x PBS til hver brønd, så gels er i suspension.
      1. Brug af pincet og silikone isolatorer, overføre en gel til et glas dias. Gør dette for hver gel umiddelbart før billedbehandling, og erstatte geler i PBS løsning efter billeddannelse.
      2. Alternativt kan du montere geler ved hjælp af en DAPI montering medium. Forsegle godt prøver med neglelak, erhverve billeder inden 2 dage til at forhindre udtørring og revner af gelen. Se tabel 1 for fejlfinding.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    PIND-M.H.T. hydrogels blev dannet ved sandwiching polymer løsning mellem to hellige zinkoxid lag og skabe pore skabeloner med zink oxid nåle. Hellige zinkoxid komponenter blev derefter fjernet med saltsyre, generere ultratynde PIND hydrogels med kontinuerlig porer (figur 1). Morfologi af zinkoxid nåle blev bekræftet af scanning elektronmikroskopi (SEM), og den gennemsnitlige længde og bredde blev fastsat til henholdsvis 3.92 ± 0.089 µm og 0,43 ± 0,02 µm, (figur 2A - 2B). Efter fjernelse af zinkoxid nåle, hydrogel porer blev visualiseret af SEM og karakteriseret (figur 2C - 2E). Den gennemsnitlige pore tæthed for hydrogels var 176,863 ± 49,532 porer. SEM blev også brugt til at visualisere og beregne pore tætheden af en standard 3 µm pore polycarbonat gennemtrængelig støtte indsætte, og pore tæthed fandtes for at være betydeligt lavere, med cirka 2,51 ± 0,05 porer pr. kvadrat mm (figur 2D, Tabel 2). Den gennemsnitlige pore diameter i zink oxid skabelonbaserede PIND hydrogel 0,19 ± 0,01 µm, og var væsentligt mindre end 3,47 ± 0,21 µm porerne observeret i gennemtrængelig støtte indsatsen (figur 2E, tabel 2). Optisk kohærens tomografi blev brugt til at erhverve både 2 - og 3-dimensionelle billeder og bestemme tykkelsen af hydrogels flyder i 1 x PBS (fig. 3A - 3B). Den gennemsnitlige gel tykkelse var 18,89 ± 3.47 µm (tabel 2). Gel mekanik blev også vurderet ved at måle elasticitetsmodul som tidligere beskrevet, og den gennemsnitlige unge modulus fandtes for at være 96.78 ± 23.92 kPa (tabel 2). 14

    Immunfluorescens mikroskopi viser, at både endotelceller og epitelceller opretholder deres fænotypiske identitet efter at være kulturperler på ultratynde PIND-M.H.T. hydrogels. Endotelceller vedligeholdes udtryk af PECAM-1, og epitel celler farves positivt med en anti-A549 antistof (figur 4A - 4B). Begge celletyper vedligeholdes også evnen til at danne stramme kryds. Endotelceller udtrykt VE-cadherin i celle-celle vejkryds, og epitelceller udtrykt E-cadherin (fig. 4C - 4 D). PIND-M.H.T. hydrogels også støtte cellulære dobbeltlag, og mulighed for celle-celle kontakter til form inden for de porøse strukturer, som påvist af immunfluorescent billeddannelse af phalloidin plettet prøver (figur 4E).

    Figure 1
    Figur 1 . Skematisk oversigt over Hydrogel forberedelse protokol. A) syntese og samling af ZnO nåle. B) forberedelse af glas lysbilleder; oprettelse af en opoffrende ZnO lag. C) forberedelse og Sterilisation af silikone isolatorer. D) forberedelse af PLØK løsning med ZnO nåle. E) polymerisering af PLØK geler mellem ZnO belagt glas lysbilleder. Hvide linjer repræsenterer opoffrende ZnO nåle og belægninger. F) HCl skyl for fjernelse af nåle og frigivelse af gel fra dias. Mørke linjer repræsenterer porer lavet af opløste ZnO nåle. G) overførsel af gels og silikone isolatorer til 6-godt parabol til at forberede celle såning. H) celle såning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

    Figure 2
    Figur 2 . Zink nål karakterisering og Hydrogel porøsitet. A) SEM billede af zink nåle (skala bar 5 µm). B) længde og bredde af zink nåle. Prikker repræsenterer målinger for enkelte nåle; linjer repræsenterer middelværdi og standardafvigelse. C) SEM billede af porøse hydrogel (skala bar 2 mikron). D) Pore tæthed og E) gennemsnitlige pore diameter for polycarbonat gennemtrængelig understøtter og PIND hydrogels. Søjler repræsenterer middelværdi og standardafvigelse. p < 0,0001 via T-test. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

    Figure 3
    Figur 3 . Hydrogel tykkelse. Optisk kohærens tomografi viser A) 3-dimensionale og B) 2-dimensionelle billeder af hydrogels flyder i PBS. Pile repræsenterer væskes overflade, stjerne repræsenterer hydrogel. Skalalinjen er 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

    Figure 4
    Figur 4 . Hydrogels støtte éncellelag og tolagede kultur. Begge endotelceller og epitelceller er i stand til at danne Konfluerende monolag på PIND hydrogels, som det fremgår af fluorescerende farvning A) CD31 (CD31 rød, DAPI blå) og B) A549 (A549 rød, DAPI blå), henholdsvis. Dannelsen af intakt cadherin vejkryds er påvist C) endothelial celler (VE cadherin grøn, DAPI blå) og D) epitelceller (E cadherin grøn, DAPI blå) (skala barer 100 micron). E) to eksempler på cellulære dobbeltlag er påvist af phalloidin farvning (phalloidin rød, DAPI blå) (skala barer 10 µm). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

    Problem Mulig løsning
    Gels har store huller. Sørg for, at zink nåle tilstrækkeligt er brudt op før du bruger dem.
    Det kan hjælpe for at bruge et morter og støder for at bryde dem. Sørg for, at store aggregater er fjernet med en hurtig spin efter suspension i fortyndet FBS. Gel er fast til bunden af 6-godt plade efter såning celler. Tilføj en dråbe af medier nedenunder gelen inden flytningen i 6-godt pladen for såning. Gel dækker både toppen og bunden af silikone isolator. For længere geler, wrap eventuelle overskydende gel omkring silikone isolator til at sikre, at der er kun et enkelt lag i midten hvor cellerne vil blive seedet. Cellelag popping ud af gelen. Celler kan være overdrevne sammenflydende. Frø med en lavere tæthed. Være meget forsigtig med alle skyl trin. Du kan også øge peptid koncentration for at forbedre celle vedhæftning. Celler skyder ikke meget hurtigt og vil ikke nå sammenløb. Seed celler med en høj tæthed, således at de er i nærheden af sammenløbet på tidspunktet for såning. Gel stivhed er højere end forventet. Nedsætte mængden af tid, at gelen er holdt i HCl. Gel tykkelse er højere end forventet. Sørg for, at enhver ZnO aggregater er visket ud af glas dias før støbning PIND gel for at sikre, at dias er glat. Flytte dias langs den største akse til at sprede PIND løsningen mere.

    Tabel 1. Foreslået løsninger til fejlfinding af problemer.

    Hydrogel Transwell Ekstracellulær Matrix
    Pore tæthed (porer/mm2) 1,77 x 105 ± 4,9 x 104 2,51 ± 0,05 8,50 x 102 til 7,0 x 104 2,14
    Pore diameter (µm) 0,19 ± 0,01 3,47 ± 0,21 0,47 til 3,86 2,14
    Tykkelse (µm) 18,89 ± 3.47 10 0,05 til 0,10 17
    Young's modulus (kPa) 5 96.78 ± 23.92 > 1000 3,5 14

    Tabel 2. Sammenligning af Hydrogel egenskaber til Standard gennemtrængelig støtte Indsæt og ekstracellulære Matrix (værdier repræsenterer middelværdien ± standardafvigelse)

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Protokollen detaljeret her har tilladt os at skabe en afstemmelige PIND hydrogel til at tjene som en biomimetiske BM stillads. Specifikt, af varierende PIND Molekylær vægte, peptid konjugation strategier, og zinkoxid mikrokrystallinsk strukturer eller koncentrationer, elastisk modulus, kan biokemiske egenskaber og porøse struktur af hydrogels redigeres, henholdsvis. De ultratynde PIND stillads har en højere pore tæthed og mindre porestørrelse, der er mere mimetiske af de funktioner, der findes i i vivo kælderen membraner i forhold til en standard gennemtrængelig støtte model (tabel 2). Yderligere, gennem denne metode har vi opnået en ultratynde struktur med en gennemsnitlig tykkelse på mindre end 20 µm. Mens polycarbonat gennemtrængelig støtte modeller har allerede opnået en ultratynde lag på bare 10 µm, at vores viden, er dette den første frit svævende og afstemmelige hydrogel system for at opnå denne tykkelse. Endelig har PIND hydrogels en elastisk modulus af ca. 100 kPa, som er størrelsesordener mindre stiv end traditionelle gennemtrængelig understøtter, vævskultur plastik og glas, som alle har elastiske moduli i vifte GPa, og derfor er mere sammenlignes med lave (< 10 kPa) elasticitetsmodul i vivo ekstracellulære matrix (tabel 2).

    At opnå en lav elasticitetsmodul var en af de primære mål for det arbejde, der præsenteres her, og er én begrænsning for brugen af traditionelle polycarbonat gennemtrængelig støtte modeller. Det er velkendt at substrat stivhed kan diktere celle adfærd, og arbejde har vist, at substrat stivhed kan guide cellulære skæbne at skelne celler. 12 stiv substrater er også almindeligt anvendt til at efterligne sygdomstilstande, herunder fibrotisk væv eller kræft tumorer, og kan derfor ikke præcist repræsentant for sundt væv. 18 , 19 , 20 , 21 for at studere inaktiv cellulære fænotyper og funktioner, det er afgørende at bruge substrater, der efterligner en elastisk modulus, der er relevante i vivo. En af de store fordele ved dette system er evnen til at tune mekanik af gel, som kan opnås ved hjælp af PIND med forskellig Molekylær vægt. Da mange sygdomme er forbundet med ECM stivhed, giver dette system en biomimetiske platform for at studere virkningerne af sunde versus syge BM på cellefunktion. Yderligere ændring af dette system kan også opnås ved at ændre peptid fragment omfattet for cellen vedhæftning. Med henblik på denne undersøgelse, blev M.H.T. brugt på grund af sin allestedsnærværende udtryk i mange BM proteiner og dens evne til at lette fast celle vedhæftet fil. Ud over M.H.T., kan laminin fragmenter også blive indarbejdet for at fremme laminin-epitelial interaktioner, der guide apikale-basal celle polarisering. 1 ligesom BM stivhed er ændret i sygdom, sammensætningen af basalmembranen er ombygget i patologiske tilstande. Med Amin-reaktiv PIND-NHS forløber, er det muligt at konjugat en række peptider og proteiner til PIND polymer base. 11 , 14 , 15 dette er særligt fordelagtigt for at undersøge virkningerne af integrin engagement for forskellige integrin receptorer. F.eks. M.H.T. sekvens, der er udtrykt i fibronektin og kollagen engagerer flere integriner, men har en høj specificitet for integrin αvβ3. At specielt efterligne fibronektin rige substrat, leucin-aspartinsyre syre-valin (LDV) sekvens kunne indarbejdes engagere α4β1 eller efterligne en kollagen membran, asparaginsyre-glycin-glutaminsyre syre-alanin (DGEA) kunne føjes til engagere integrin Α2Β1. 8

    Endotel-epitelial dobbeltlag er blot ét eksempel på en cellulær tolagede, der kan oprettes med den model, der præsenteres her. Andre dobbeltlag, der findes naturligt i vivo, adskilt af kun en tynd BM eller ECM, omfatter endotel-pericyte og endotel-glat muskel celle dobbeltlag. Således ansøgninger om denne metode er bred og strækker sig fra pulmonal medicin til vaskulær biologi. Yderligere, på grund af den unikke porøsitet af disse hydrogels, de tilbyder muligheden for at foretage funktionelle studier, der tidligere hydrogel modeller ikke har blevet købedygtig opbakning. Ved at indarbejde porerne i vores ultratynde hydrogel system, har vi skabt en forbedret biomimetiske erstatning for gennemtrængelig støtte modeller, gør det muligt for undersøgelse af bakteriel infiltration, en fælles begivenhed i hele den pulmonal epitel-endotel barriere i tuberkulose. 3 , 6 , 14 , 22 tilsvarende transmigration eller chemotaxis af inflammatoriske celler på tværs af vaskulære cellekulturer kan undersøges ved at måle hastigheden af celle opsamling på M.H.T. functionalized celle selvklæbende overflade af gel, som har været vist tidligere. 16 dette er en klar fordel over tidligere hydrogel baseret metoder, der har opnået fælles kultur betingelser via indkapsling. Sådanne systemer giver mulighed for tæt på og cell-celle kontakt mellem to celletyper og har haft held til at måle funktioner f.eks angiogenese og vasculogenesis, men mangler tilgængelighed tilbydes af to-dimensionelle systemer, som giver en meget enklere platform til at måle lækage, infiltration eller aktive overflytning på tværs af en co kulturperler cellulære barriere. 17

    Derfor, metoden demonstreret her tilbyder en platform for en lang række undersøgelser på tværs af flere områder, og giver et springbræt mod generere mere relevante data fra in vitro undersøgelser til yderligere at forstå, i vivo patologier og mekanismer.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Forfatterne har ikke noget at oplyse.

    Acknowledgments

    Forfatterne vil gerne takke professor Paul Van Tassel og Prof. Chinedum Osuji for deres tankevækkende samtaler og materialevidenskab ekspertise. Finansiering af dette arbejde blev leveret af Dubinsky nye initiativ Award og nationale institutter for sundhed NIBIB BRPR01 EB16629-01A1.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    1M Hydrogel Chloride (HCl) EMD HX0603-75 2.5L Sterile. Use in fume hood with eye protection and gloves.
    1X PBS Gibco 14040-133 500 mL None
    Zinc Nitrate Hexahydrate (Zn(NO3)2•6H2O) Sigma-Aldrich 228737-500g Use with eye protection and gloves.
    Sodium Hydroxide (NaOH) Macron Chemicals 278408-500g Use with eye protection and gloves.
    Zinc Acetate Dihydrate ((CH3O2)2Zn2+•2H2O) Fisher Scientific AC45180010 1 kg Use with eye protection and gloves.
    Methanol (CH3OH) J.T. Baker 9070-05 4L Use in fume hood with eye protection and gloves.
    VWR Life Science Seradigm Premium Grade FBS VWR 97068-085 Sterile filter. 5 mL FBS in 45 mL PBS
    Mineral oil CVS  PLD-B280B None
    Round bottom flask ChemGlass N/A
    Thermometer N/A
    Stir bar N/A
    Plain precleaned microscope slides 3"x1"x1" mm thick Thermo Scientific 420-004T Spray with ethanol and let dry prior to use.
    Glass pasteur pipets N/A
    1 mL rubber bulbs N/A
    Plastic 100 mm petri dishes N/A
    Sterile forceps N/A
    Silicone isolators 0.8 mm thick
    Polydimethylsiloxane (PDMS) punches N/A
    Glass bottles N/A
    6 well plates Cellstar 657 160 N/A
    Filter Paper Whatman 8519 N/A
    Stirrer-hot plate VWR Dya-Dual 12620-970 Use with eye protection and gloves.
    2,2-Dimethoxy-2-phenylacetophenone (C6H5COC(OCH3)2C6H5 Sigma-Aldrich 24650-42-8 Use with eye protection and gloves.
    1-Vinyl-2-pyrrolidone (C6H9NO) Aldrich Use with eye protection and gloves.
    Polyethylene Glycol 10,000 (H(OCH2CH2)10,000OH) Fluka 81280-1kg Use with eye protection and gloves.
    RGDS Life Tein 180190 Use with eye protection and gloves.
    Blak-Ray long wave UV lamp UVP Model B 100AP N/A
    Eppendorf tubes USA Scientific 1615-5500 N/A

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Domogatskaya, A., Rodin, S., Tryggvason, K. Functional diversity of laminins. Annu Rev Cell Dev Biol. 28, 523-553 (2012).
    2. Howat, W. J., Holmes, J. A., Holgate, S. T., Lackie, P. M. Basement membrane pores in human bronchial epithelium: a conduit for infiltrating cells. Am J Pathol. 158, 673-680 (2001).
    3. Lauridsen, H. M., Pober, J. S., Gonzalez, A. L. A composite model of the human postcapillary venule for investigation of microvascular leukocyte recruitment. FASEB J. 28, 1166-1180 (2014).
    4. Mul, F. P., et al. Sequential migration of neutrophils across monolayers of endothelial and epithelial cells. J Leukoc Biol. 68, 529-537 (2000).
    5. Hermanns, M. I., Unger, R. E., Kehe, K., Peters, K., Kirkpatrick, C. J. Lung epithelial cell lines in coculture with human pulmonary microvascular endothelial cells: development of an alveolo-capillary barrier in vitro. Lab Invest. 84, 736-752 (2004).
    6. Birkness, K. A., et al. An in vitro tissue culture bilayer model to examine early events in Mycobacterium tuberculosis infection. Infect Immun. 67, 653-658 (1999).
    7. Wang, L., et al. Human alveolar epithelial cells attenuate pulmonary microvascular endothelial cell permeability under septic conditions. PLoS One. 8, 55311 (2013).
    8. Pellowe, A. S., Gonzalez, A. L. Extracellular matrix biomimicry for the creation of investigational and therapeutic devices. Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol. 8, 5-22 (2016).
    9. Peyton, S. R., Raub, C. B., Keschrumrus, V. P., Putnam, A. J. The use of poly(ethylene glycol) hydrogels to investigate the impact of ECM chemistry and mechanics on smooth muscle cells. Biomaterials. 27, 4881-4893 (2006).
    10. West, J. L. Protein-patterned hydrogels: Customized cell microenvironments. Nat Mater. 10, 727-729 (2011).
    11. DeLong, S. A., Gobin, A. S., West, J. L. Covalent immobilization of RGDS on hydrogel surfaces to direct cell alignment and migration. J Control Release. 109, 139-148 (2005).
    12. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
    13. Taite, L. J., et al. Bioactive hydrogel substrates: probing leukocyte receptor-ligand interactions in parallel plate flow chamber studies. Ann Biomed Eng. 34, 1705-1711 (2006).
    14. Lauridsen, H. M., Walker, B. J., Gonzalez, A. L. Chemically- and mechanically-tunable porated polyethylene glycol gels for leukocyte integrin independent and dependent chemotaxis. Technology. 02, 133-143 (2014).
    15. DeLong, S. A., Moon, J. J., West, J. L. Covalently immobilized gradients of bFGF on hydrogel scaffolds for directed cell migration. Biomaterials. 26, 3227-3234 (2005).
    16. Lauridsen, H. M., Gonzalez, A. L. Biomimetic, ultrathin and elastic hydrogels regulate human neutrophil extravasation across endothelial-pericyte bilayers. PLOS one. 12, 0171386-0171405 (2017).
    17. Peters, E. B., Christoforou, N., Leong, K. W., Truskey, G. A., West, J. L. Poly(Ethylene Glycol Hydrogel Scaffolds Containing Cell-Adhesive and Protease-Sensitive Peptides Support Microvessel Formation by Endothelial Progenitor Cells. Cellular and Molecular Bioengineering. 9, 38-54 (2016).
    18. Schwartz, M. P., et al. A synthetic strategy for mimicking the extracellular matrix provides new insight about tumor cell migration. Integr Biol (Camb). 2, 32-40 (2010).
    19. Booth, A. J., et al. Acellular normal and fibrotic human lung matrices as a culture system for in vitro investigation. Am J Respir Crit Care Med. 186, 866-876 (2012).
    20. Kalluri, R. Basement membranes: structure, assembly and role in tumour angiogenesis. Nat Rev Cancer. 3, 422-433 (2003).
    21. Roudsari, L. C., Keffs, S. E., Witt, A. S., Gill, B. J., West, J. L. A 3D Poly(ethylene glycol)-based Tumor Angiogenesis Model to Study the Influence of Vascular Cells on Lung Tumor Cell Behavior. Scientific Reports. 6, 1-15 (2016).
    22. Bermudez, L. E., Sangari, F. J., Kolonoski, P., Petrofsky, M., Goodman, J. The efficiency of the translocation of Mycobacterium tuberculosis across a bilayer of epithelial and endothelial cells as a model of the alveolar wall is a consequence of transport within mononuclear phagocytes and invasion of alveolar epithelial cells. Infect Immun. 70, 140-146 (2002).

    Tags

    Bioteknologi emnet 130 biomaterialer basalmembranen polyethylenglycol mikro-pore tolagede elastisk Hydrogels
    Ultratynde Porated elastiske Hydrogels som en biomimetiske basalmembranen til Dual celle kultur
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Pellowe, A. S., Lauridsen, H. M.,… More

    Pellowe, A. S., Lauridsen, H. M., Matta, R., Gonzalez, A. L. Ultrathin Porated Elastic Hydrogels As a Biomimetic Basement Membrane for Dual Cell Culture. J. Vis. Exp. (130), e56384, doi:10.3791/56384 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter