Summary
이 프로토콜 양적이 고 포괄적으로 여러 영양소 소스의 신진 대사를 조사 하는 실험 절차를 설명 합니다. 이 워크플로, 동위 원소 추적 실험 및 분석 절차의 조합에 따라 결정 될 미생물 소비 영양분의 운명과 분자 synthetized의 대사 기원 수 있습니다.
Abstract
미생물학의 분야에 있는 연구는 다양 한 방법론의 구현에 의존합니다. 특히, 적절 한 방법의 개발은 실질적으로 독특한 질소와 탄소 소스를 포함 하는 화학적으로 정의 된 미디어에서 성장 하는 미생물의 물질 대사의 광범위 한 지식을 제공에 기여 한다. 반면, 여러 소스의 영양소, 자연 또는 산업 환경에 광범위 한 그들의 존재에도 불구 하 고 신진 대사를 통해 관리 거의 미개척 남아 있습니다. 이 상황은 조사 방해 적합 한 방법론의 부족 때문에 주로 이다.
우리는 양적 및 포괄적 대사 영양소는 다른 분자, 즉, 복잡 한 리소스의 혼합물으로 제공 하는 때 작동 하는 방법을 탐구 하는 실험적인 전략을 보고 합니다. 여기, 우리는 효 모 대사 네트워크를 통해 여러 질소 소스의 분할을 평가 하기 위한 응용 프로그램을 설명 합니다. 워크플로 안정 동위 원소 추적 실험 선택한 13C-또는 15N 표시 기판 사용 하는 동안 얻은 정보를 결합 합니다. 그것은 먼저 이루어져 있다 N 포함 된 분자;의 혼합물을 포함 하는 동일한 매체에 병렬 및 재현성 발효 그러나, 선택 된 질소 소스 때마다 표시 됩니다. 대상된 화합물의 라벨 패턴을 평가 하 고 소비 및 다른 대사 산물에 기판의 복구를 계량 분석 절차 (HPLC, GC-MS)의 조합을 구현 됩니다. 완전 한 데이터 집합의 통합된 분석 셀 내에서 사용 된 기판의 운명에 대 한 개요를 제공합니다. 이 방법은 발효의 온라인 모니터링을 위한 로봇 기반 시스템에 의해 샘플-촉진의 컬렉션에 대 한 정확한 프로토콜을 필요-그리고 수많은 시간이 걸리는 분석의 공적. 이러한 제약에도 불구 하 고 그것은 이해 하 고, 처음으로, 효 모 대사 네트워크를 통해 여러 질소 소스의 분할 허용. 우리는 다른 N 화합물 쪽으로 더 풍부한 소스에서 질소의 재분배를 해명 하 고 휘발성 분자와 proteinogenic 아미노산의 대사 기원 결정.
Introduction
미생물 물질 대사 작동 하는 방법 이해는 발효 프로세스를 개선 하 고 발효 화합물의 생산을 조절 하는 효율적인 전략의 디자인에 대 한 중요 한 문제 이다. 유전체학 및 기능 유전체학이 마지막이 십년에서 크게 지식의 많은 미생물 대사 네트워크의 토폴로지를 확장에 기여. 이 정보에 액세스할 세포질 기능1의 포괄적인 개요를 목표로 하는 방식의 개발을 주도. 이러한 방법론은 자주 측정 매개 변수 모델 기반 해석에 의존합니다. 이 실험 데이터 포함, 한 손으로, 대사 산물 통풍 관 및 생산 속도 하 고, 다른 한편으로, 양적 세포내 얻은 정보를 동위 원소 추적 프로그램에서 실험. 이러한 데이터는 정의 된 대사 네트워크2,,34다른 통로의 vivo에서 활동의 공제에 대 한 필수 정보를 제공합니다. 현재, 사용할 수 있는 분석 기법만 단일 요소 동위 원소를 사용 하 여 분자의 패턴을 라벨의 정확한 검색을 사용 가능 하 게 하 고 공동 두 동위 요소와 라벨 때. 또한, 대부분의 성장 조건에서 탄소 소스만 구성 되어 하나 또는 두 화합물의 있습니다. 따라서, 탄소 기판에서 13C 동위 원소 예 광 탄에 따라 접근 넓게 그리고 성공적으로 적용 된 탄소 대사 네트워크 작업5,6,7의 완전 한 이해를 개발 하 ,8.
대조적으로, 많은 자연 및 산업 환경에서 미생물 성장을 지 원하는 사용할 수 있는 질소 리소스는 다양 한 분자의 구성 자주 됩니다. 예를 들어 와인 또는 맥주 발효 하는 동안 질소 18 아미노산 및 가변 농도9암모늄의 혼합물으로 제공 됩니다. Anabolism 액세스할 수 있는 N 화합물의이 만드는이 복잡 한 미디어 조건 크게 다른 생리 적 연구에 대 한 일반적으로 사용 되는 후자 질소, 일반적으로 암모늄의 독특한 소스를 사용 하 여 달성 하는.
전반적으로, 질소 화합물 직접 단백질에 통합 되거나 catabolized 내 면. 효 모 Saccharomyces cerevisiae를 포함 하 여 많은 미생물 물질 대사 질소의 네트워크 구조는 매우 복잡 한 기판의 다양성에 따라. 개요로,이 시스템은 글루타민, 조미료, α ketoglutarate10,11, transaminases와 deaminases의 interconversion를 catalyzes 질소 물질 대사의 중앙 코어의 조합을 기반으로 합니다. 이 네트워크를 통해 암모늄 또는 다른 아미노산에서 아민 그룹 수집 하 고 α-keto 산 발표 했다. 이 중간체는 또한 중앙 탄소 대사 (CCM)12,13synthetized. 이 많은 수의 분기 반응 및 중간체, 외 인 질소 소스의 놓을 proteinogenic 아미노산의 anabolism에 관련 된 세포의 근육 요구 충족. 이러한 다른 상호 경로 통해 활동 대사 산물의 배설에도 발생합니다. 특히, α-keto 산 제품의 감각 프로필에 필수적인 참여자는 더 높은 알콜 및 그들의 아세테이트 에스테 르 유도체14, Ehrlich 통로 통해 리디렉션할 수 있습니다. 그 후, 질소 대사 작동 하는 방법 바이오 매스 생산 및 휘발성 분자를 (향기)의 형성에 중요 한 역할을 재생 합니다.
반응, 효소, 및 질소 대사에 관여 하는 유전자는 문학에서 광대 하 게 기술 된다. 그러나, 대사 네트워크를 통해 여러 질소 소스의 배포의 문제는 아니라 아직 해결 되었습니다. 정보의이 부족을 설명 하는 두 가지 주요 이유가 있습니다. 첫째, 질소 대사 네트워크의 중요 한 복잡성의 관점에서 정량적 데이터의 큰 금액은 사용할 수 작업의 완전 한 이해에 필요한 지금까지. 두 번째, 많은 실험의 제약 조건 및 분석 방법의 한계 방지 이전 CCM 함수 설명에 사용 된 방법의 구현.
이러한 문제를 극복 하기 위해 우리는 일련의 동위 원소 추적 실험에서 데이터의 화해를 기반으로 하는 시스템 수준 접근 방법을 개발 하기로 결정 했다. 워크플로가 포함 되어 있습니다.
-다른 선택한 영양 소스 (기판) 때마다 표시 하는 동안 발효 된 동일한 환경 조건 하에서 실시.
-레이블된 기판 및 농도의 잔류 농도 및에서 파생 된 화합물의 동위 원소 농축 발효의 여러 단계에서 정확한 결정을 위한 분석 절차 (HPLC, GC-MS)의 조합 파생 된 바이오 매스를 포함 하 여 레이블이 지정 된 분자의 놓을.
-각 질량과 동위 균형의 계산 소비 레이블이 분자 및 유동 비율의 결정을 통해 미생물에 의해 여러 영양소 소스 관리에 대 한 글로벌 개요를 얻기 위해 데이터 집합의 추가 통합된 분석 .
이 방법론을 적용 하기 위해 주의 문화 사이의 긴장/미생물의 재현 동작에 지불 되어야 합니다. 또한, 다른 문화에서 샘플 같은 잘 정의 된 발효 진행 중 촬영 해야 합니다. 이 원고에 보고 하는 실험적인 작품에서 로봇 기반 시스템 이러한 제약 조건에 대 한 계정에 발효의 온라인 모니터링에 대 한 사용 됩니다.
또한, 연구의 과학적 문제를 해결 하기 위해 적절 한 레이블이 기판 (화합물, 자연, 그리고 라벨의 위치)의 집합을 선택 하는 것이 필수적입니다. 여기, 15N 표시 된 암모늄, 글루타민, 아르기닌 포도 주스에서 발견 세 가지 주요 질소 근원으로 선정 됐다. 이 proteinogenic 아미노산에 소비 화합물에서 질소 재배포의 패턴을 평가 허용. 우리는 또한 소비 아미노산 및 휘발성 분자의 생산에 그들의 공헌의 탄소 등뼈의 운명을 조사 목적. 충족 시키기 위해이 목표, 균일 하 게 13C 라는 신, 이소류신, 트레오닌, valine 포함 되었다 연구에 Ehrlich 통로의 주요 중간체에서 파생 된 아미노산으로.
전반적으로, 우리 양적 효 모 또한으로 탄소 선구자의 초과 제거 하는 동안 발효를 통해 근육의 요구 사항을 충족 하는 외 인 질소 소스를 재배포 하 여 복잡 한 질소 리소스를 관리 하는 방법을 탐구 휘발성 분자입니다. 이 논문에 보고 된 실험 절차 다른 미생물에 의해 사용 된 다른 여러 영양소 소스 조사에 적용할 수 있습니다. 그것은 미생물의 대사 행동에 유전 배경이 나 환경 조건 영향의 분석에 대 한 적절 한 접근을 것 처럼 보인다.
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Protocol
1. 발효 및 샘플링
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미디어와 fermenters의 준비
참고: 모두는 발효 수행 됩니다 밖으로 동일한 긴장을 사용 하 여 병렬로 같은 화학적 합성 매체 (SM, 표 1에서 제공 하는 구성), 정의 질소 소스15암모늄과 아미노산의 혼합물을 포함. 반면 다른 레이블이 각 발효에 대 한 단일 질소 화합물 균일 하 게 레이블이 지정 된 13C 또는 15N 형태 (100%)에 독점적으로 제공 됩니다. 실험의 세트에 사용 되는 각 레이블이 질소 소스에 대 한 (여기: 15NH4, U-15N4-Arg, U-15n 2-Gln, U-13C6-레이, U-13c 5-발, U-13c 6-일, U-13c 4 세), 두 fermenters는 준비 하 고 있다. 각 조건에 대 한 중복 발효 레이블이 없는 분자 (7 제어 발효)만 사용 하 여 수행 됩니다.- 각 N-소스 공부, SM의 500 mL를 준비에 대 한 100%에 사용 되는 화합물을 제외 하 고 표 1에 나열 된 모든 질소 소스를 포함 하는 매체 형태 분류.
참고: 레이블이 분자는 다음 단계에서 추가 됩니다. - 저온 (10 분, 100 ° C) 1 L 플라스 크에 각 매체 포함 하는 자석 교 반 바. 표 1 에 보고 된 최종 농도 도달 레이블이 분자의 적절 한 금액을 무게와 매체에 그것을 분해.
- (셀 루 로스 아세테이트 멤브레인, 0.22 μ m) 일회용 진공 여과 시스템을 사용 하 여 매체를 소독. 살 균 측정 실린더를 사용 하 여 두 미리 소독된 fermenters (250 mL)와 산소의 항목을 방지 하기 위해 CO2의 릴리스를 수 있도록 발효 잠금을 갖추고 있습니다 자석 교 반 막대를 포함 하는 사이 매체를 나눕니다.
- 1 박 (온도 28 ° C에서 설정)에 대 한 보육 공간에 배치 하 여 28 ° C에 발효 플라스 크를 열.
- 각 N-소스 공부, SM의 500 mL를 준비에 대 한 100%에 사용 되는 화합물을 제외 하 고 표 1에 나열 된 모든 질소 소스를 포함 하는 매체 형태 분류.
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접종 및 발효의 모니터링
- S. cerevisiae 변형 YPD 매체 12 h (150 rpm)을 떨고와 28 ° C에서의 10 mL를 포함 하는 살 균 튜브를 성장. 그런 다음 YPD의 1 mL를 피펫으로 preculture와 10 mL (15 mL 무 균 튜브)에 SM 매체의 전송. 떨고 (150 rpm)와 28 ° C에 12 h에 대 한 문화를 품 어.
- 층 류 흐름에서 preculture aliquot를 수집 하 고 100 µ m 조리개를 장착 하는 전자 입자 카운터를 사용 하 여 셀 인구를 계량 합니다. Preculture (g, 15 분, 4 ° C x 2000) centrifuge와 2.5 x 108 셀/mL의 최종 농도를 살 균 물의 적절 한 볼륨에는 펠 릿을 일시 중단. 셀 서 스 펜 션의 1 mL와 함께 각 fermenter 접종
참고: 발효 진행 상황을 모니터링 하는 데 사용 하는 로봇 시스템은 그림 1에 설명 되어 있습니다. - 제대로 21 위치 교 반 접시에 배치 하 고 270 rpm에서 교 반 속도 설정 하는 지원 가이드에 있는 fermenters를 설치 하 여 발효 플랫폼을 준비 합니다. 각 발효의 온라인 모니터링을 시작 하려면 로봇 제어 응용 프로그램을 시작 다음 "시작 시험" 버튼을 클릭 하 고 발효 볼륨 (300 mL) 실행 될 것을 선택 합니다.
- 표시 된 인터페이스는 플랫폼에 숫자의 표시와 fermenters의 위치를 허용합니다. 이 발생 되도록 슬롯 위치를 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 고 "활성화"이이 위치에 있는 fermenter의 모니터링을 활성화 하려면 선택 합니다.
- 영구적으로 무게 수집을 시작 하기 전에 시스템에서 실행 중인 계산 소프트웨어를 초기화 합니다. "Initialiser" 버튼 클릭 하 고 "확인"을 클릭 확인. 무게 인수를 시작 하는 로봇 제어 응용 프로그램의 "시작 버튼"을 클릭 합니다.
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샘플링 절차
참고: 각 fermenter에 대 한 샘플 촬영 공동2 생산 (값 계산 소프트웨어를 실행 하는 컴퓨터에 온라인 표시)에 도달 하면 필요한 설정 포인트: 5, 10, 40, 그리고이 연구에서 90 g/L.-
레이블이 지정 된 화합물과 문화에 대 한 절차를 샘플링.
- 두 6 mL 샘플 (g, 5 분, 4 ° C x 2000) 원심 저장 하 고 냉동된 supernatants-80 ° c.에 2 개의 aliquots에 저장 5 mL 증 류 물과 동위 원소 풍부의 측정-80 ° C에서 저장소 두 번 펠 릿을 세척.
- 레이블이 지정 된 화합물 없이 문화에 대 한 절차를 샘플링
- 수확 10 mL의 문화, 건조 중량 확인을 위해 사용 될 것입니다. 원심 분리 (2000 x g, 5 분, 4 ° C)에 의해 두 개의 10ml 샘플에서 세포를 작은. 증류수 10 mL로 두 번 펠 릿을 세척 하 고 단백질과 아미노산 콘텐츠 결정-80 ° C에서 저장.
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레이블이 지정 된 화합물과 문화에 대 한 절차를 샘플링.
2입니다. 소비 질소 근원의 정량화
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잔여 암모니아 농도의 효소 결정
참고: supernatants에 암모니아 농도의 결정 상업 효소 기반 키트;를 사용 하 여 수행 됩니다. 모든 시 약은 제조 업체에 의해 제공 됩니다.- 그래서 정확 하 게 무게 (NH4)2의 25 mg를 용 해 하 여 표준 암모니아 솔루션 (61.4 mg/L)를 준비 100 mL 부피 플라스 크에4 .
- 제조업체의 지침을 수행 하기 위해 발효 전에 CO2 출시의 5 g/L에서 찍은 샘플의 1:2 희석을 수행 합니다. 1 M 코를 추가 하 여 약 8 샘플의 pH를 조정 합니다. 추가 볼륨의 고 희석 요인에 계정에 걸릴.
- 4 mL 분 광 광도 계 큐 벳에 믹스 100 µ L의 샘플 (필요한 경우 희석), 물 또는 표준 암모니아 솔루션 (0.75 m m ADP와 pH 7.8 버퍼에서 30 U/mL 조미료 효소)는 약 1의 2 개 mL과 500 µ L 시 2 (1.3 m m NADH)의 소 주. 실 온에서 15 분 동안 품 어와 340 NADH의 흡 광도 읽고 nm (A1).
- 약 3 (60 m m α-pH 8 버퍼에서 ketoglutarate)의 500 µ L를 추가 하 고, 실 온에서 20 분에 대 한 샘플을 품 어 340 NADH의 흡 광도 읽고 nm (A2).
- 암모니아 농도 사용 하 여 계산.
C암모니아 (g/L) = 0.083 x [(0.839 x A1-A2)샘플-(0.839 x A1-A2)증류수] - 정확한 농도 표준 솔루션으로 가져온 확인 하십시오.
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잔여 아미노산 농도의 컬럼에 결정
참고: supernatants에 아미노산 농도의 결정 허용 ninhydrin과 N 화합물의 게시물 열 derivatization와 이온-교환 크로마토그래피에 따라 산 성 아미노산 전용된 분석 시스템을 사용 하 여 달성 그들의 색도계 탐지입니다.- 중성 및 산 성 아미노산의 상업 혼합물의 200 µ L, 기본적인 아미노산의 상업 혼합물의 200 µ L 및 2.5 m m 글루타민의 200 µ L 200 m m 리튬 구 연산 염 버퍼, pH 2.2의 400 µ L을 추가 하 여 참조 솔루션을 준비 합니다. 이 화학적으로 정의 된 참조 솔루션 샘플으로 처리 됩니다.
- 높은 분자 무게를 가진 분자를 제거 하는 샘플의 800 µ L를 2.5 m m norleucine (내부 표준)를 포함 하는 25% (w/v) sulfosalicylic 산 성 솔루션의 200 µ L를 추가 합니다. 1 h 4 ° C 원심 분리기 (g, 10 분, 4 ° C x 3000), 0.22 μ m 기 공 크기 니트로 막 (주사기 시스템)을 통해 필터에 대 한 품 어.
- 프로그래머 소프트웨어 클릭 액체 크로마토그래피를 시작 "실행" 버튼 (LC) 분석 양이온 교환 칼럼 (리튬 양식)을 갖춘 분석기와 함께 합니다. 온도 기울기 (표 2)와 함께에서 카운터 이온 농도에 pH 그라디언트 및 그라디언트를 만들려는 연속 리튬 버퍼가 아미노산 elute
- 570에서 spectrophotometric 검출기 ninhydrin derivatization 후 질소 화합물을 계량 nm (보라색 채색: 아미노산을 ninhydrin과 아민 그룹 사이 반응) 및 440 nm (황색 채색: ninhydrin 및 것의 그룹 사이 반응 프롤린)입니다.
- 제조업체의 소프트웨어를 사용 하 여 샘플에서 아미노산의 농도 계산 하는 내부 표준 참조 솔루션 및 norleucine를 사용 하는 단일-지점 내부 캘리브레이션을 수행 합니다.
3입니다. Proteinogenic 아미노산의 정량화
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드라이 셀 무게의 측정
- 미리 무게에 있는 알루미늄 컵 진공 장치를 사용 하 여 니트로 필터 (기 공 크기 0.45 μ m)를 통해 문화의 10 mL를 필터링 합니다. 증류수 50 mL 두 번 씻어.
- 알루미늄 컵에 필터를 배치 하 고 컵에 필터 reweighing 전에 48 h (때까지 무게에 더 변화는 관찰) 105 ° C에서 열 오븐에서 건조. 무게 차이 계산 합니다.
- 효 모 문화의 건전지 무게를 정확 하 게 결정을 최소한 3 독립적인 측정의 평균을 계산 합니다.
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세포의 단백질 함량의 정량화
참고: 셀의 단백질 분수의 정량화는 적어도 섹션 1.3.2에에서 설명 된 대로 가져온 레이블이 셀 펠 릿을 사용 하 여 3 중에 수행 됩니다.- 냉동된 알 약을 DMSO 솔루션 (50 %v / v)의 1 mL의 추가 의해 단백질을 추출 하 고 건조 열 오븐에서 1 h 105 ° C에서 품 어.
- 더 블루 복합물 (BCA 분석 결과)에 있는 bicinchoninic 산에 의해 시 켰 던 Cu+ 이온으로 Cu ++ 의 단백질에 의해 감소에 따라 생화학 색도계 분석 결과 사용 하 여 DMSO 추출에서 단백질 콘텐츠 계량.
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단백질에서 아미노산의 상대적인 기여의 결정
참고: proteinogenic 아미노산의 프로 파일 레이블이 셀 펠 릿 (1.3.2)에서 3 중에서 적어도 결정 됩니다.- Performic 산 (90% 포 름 산, 과산화 수소 10%)의 200 µ L에서 셀 펠 릿을 일시 중단 하 여 추출 물 산화를 준비 합니다. 4 ° C에서 4 h incubate 고 33.6 mg 나트륨 황산 염의 반응을 중지 합니다.
참고: 산화 단계는 시스테인과 메티오닌의 메티오닌 sulfone 및 cysteic 산, 더 이온-교환 크로마토그래피에 의해 양이 정해질 것 이다 변환 합니다. 그러나, 일부 아미노산 (티로신, 페닐알라닌, 히스티딘, 및 아르기닌)는 산화 처리 하는 동안 변성 됩니다. 따라서, 2 개의 hydrolysates (와 산화 없이) 준비 된다. - 셀 펠 릿을 6N HCl의 800 µ L를 추가 또는 추출 물 산화 및 건 열 오븐에서 110 ° C에서 16 h에 대 한 밀폐 유리 튜브에 샘플을 품 어. 2.5 m m norleucine의 200 µ L을 추가 하 고 질소의 흐름과 함께 HCl을 제거. 씻고 (말린된 추출 물 resuspending 액체 질소 스트림 제거) 그리고 800 µ L의 에탄올과 증류수의 800 µ L로 두 번. 200 m m 리튬 아세테이트 버퍼, pH 2.2의 800 µ L에 차지 합니다.
참고: 주의 가수분해에 대 한 보육 시간에 일부 아미노산은 산 성 조건 하에서 안정으로 지불 합니다. 이 아미노산은 전적으로 HCl 가수분해 중 변성으로 단백질에서 트립토판 분수 문학16에서 발견 하는 데이터에서 추정 된다. - 단일-지점 내부 교정의 표준 준비. 200 m m 리튬 아세테이트 버퍼, pH 2.2, 625 µ M 메티오닌 sulfone, 625 µ M cysteic 산, 및 625 µ M norleucine 포함 된 840 µ L를 분해 된 아미노산의 상용 솔루션의 160 µ L를 추가 합니다.
- 섹션 2.2에에서 설명 된 컬럼에 메서드를 사용 하 여 단백질에서 아미노산의 상대적인 농도 결정 합니다.
- Performic 산 (90% 포 름 산, 과산화 수소 10%)의 200 µ L에서 셀 펠 릿을 일시 중단 하 여 추출 물 산화를 준비 합니다. 4 ° C에서 4 h incubate 고 33.6 mg 나트륨 황산 염의 반응을 중지 합니다.
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계산
- 단백질 추출 (mg/L에서 합계)에서 측정 했다 아미노산의 총계에 의해 각 아미노산 (mg/L)의 측정된 금액을 분할 하 여 단백질에서 각 아미노산의 무게 백분율을 계산 합니다.
- 문화 (mg/L), 즉, 생물 자원의 단백질 콘텐츠 및 문화 (mg/L)에서 각 proteinogenic 아미노산의 농도 평가 하기 위해 건조 중량 사이 제품에 있는 단백질의 농도 의해이 비율을 곱하면 됩니다.
4. Proteinogenic 아미노산의 동위 원소 농축의 측정
참고: proteinogenic 아미노산의 동위 원소 농축의 측정에 대 한 레이블이 셀 펠 릿 사용 합니다. 3 다른 에이전트 derivatization 단계 동위 원소 농축 아미노산의 계량에 사용 됩니다. 클러스터 이온의 농도 아미노산의 라벨 패턴 예측을 측정 됩니다. 대량 isotopomers의 풍부에 해당 하는 각 클러스터 이온에서 신호 (m0 없이 라벨, m+ 1 = = 1 개 아톰...) 아미노산 조각. DMADMF 수술 후 얻은 크로마의 예는 그림 2에 제공 됩니다.
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바이오 매스의 가수분해
- 6 M HCl의 1.2 mL을 추가 하 고 건조 열 오븐에 단단히 닫힌된 유리관에 105 ° C에서 16 h에 대 한 샘플을 배양 하 여 셀 펠 릿 (말린된 바이오 매스의 1-2 밀리 그램에 해당)은.
- 세포질 파편을 제거 하 5 분 동안 3000 x g 에 증류수와 원심 분리기의 1.2 mL를 추가 합니다. 오픈 유리 튜브에 6 400 µ L 분수에는 상쾌한을 배포 합니다. 105 ° C에서 열 오븐에서 분수를 건조 시럽 (4-5 h)의 일관성에 도달할 때까지.
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Ethylchloroformate (ECF) derivatization
- 20 m HCl; M의 200 µ L에 말린된의 해산 그런 다음 피리 딘: 에탄올 (1:4)의 133 µ L를 추가 합니다. 아미노산을 derivatize 하 고 모든 CO2 가 릴리스 되었습니다 때까지 기다려야 하는 ECF의 50 µ L를 추가 합니다. 원심 관의 derivatized 화합물을 추출 하는 dichloromethane 500 µ L을 포함 하는 혼합물을 전송 합니다.
- 와 동 10 s 및 원심 분리기 튜브 10000 x g;에서 4 분에 대 한 그들 샘플 GC/MS에 직접 주입 될 수 있습니다 있도록 원뿔 유리 삽입을 포함 하는 GC 튜브에 파스퇴르 피펫으로와 전송 낮은 유기 단계를 수집 합니다.
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(N, N)-Dimethylformamide 디 메 틸 아 세 탈 (DMFDMA) derivatization.
- 메탄올의 50 µ L에 이기의 200 µ L 말린된의 분해. DMFDMA의 300 µ L를 추가 합니다. 소용돌이 관 및 전송 샘플 GC autosampler 원뿔 유리 삽입을 포함 하는 리 바이 알.
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N, O-Bis (trimethylsilyl) trifluoroacetamide (BSTFA) derivatization
- 이기의 200 µ L에는 일시 중단 합니다. BSTFA의 200 µ L을 추가, 밀폐 유리 튜브를 닫고 추출 GC 튜브를 직접 전송 하기 전에 135 ° C에서 4 h에 대 한 품 어.
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GC-MS 분석
- Autosampler 인젝터를 장착 하는 질량 분 서 계에 결합 하는 가스 크로마 토 그래프와 함께 샘플을 분석 합니다.
- 악기 전용 소프트웨어를 사용 하 여 장비를 제어 하는 chromatograms를 분석. "시퀀스" 메뉴에서 샘플 목록을 만들려면 "예제 로그 테이블" 고 주사를 시작 하려면 "실행" 버튼을 클릭 합니다.
참고: 0.15 μ m 필름 두께 30 m x 0.25 m m apolar 실리 카 모 세관 칼럼 가스 크로마 토 그래프 장착 되어 있습니다. 150 ° C에서 질량 분 서 계 4 중 극 온도 설정 누르고 전송 선 모든 분석에 대 한 250 ° C에서 있습니다. 3 분석 프로그램, 각 derivatization 에이전트에 각 하나의 특정 사용 됩니다. - ECF 파생 상품: 1.2 mL/분의 유량으로 모바일 위상으로 사용 헬륨 230 ° C, 250 ° c.에 소스의 입구의 온도 설정 3: 1의 분할 비율 샘플 1 µ L 주입 autosampler 프로그램. 점차적으로 오븐 온도 다음과 같이 증가 분석 실행: 3 분;에 대 한 130 ° C 260 ° C;에 15 ° C/min의 그라데이션 20 분 동안 260 ° C에 온도 유지 합니다.
- DMFDMA 파생 상품: 1.2 mL/분의 지속적인 흐름으로 모바일 위상으로 사용 헬륨 230 ° C, 250 ° c.에 소스의 입구의 온도 설정 3: 1의 분할 비율 샘플 1 µ L 주입 autosampler 프로그램. 점차적으로 오븐 온도 다음과 같이 증가 분석 실행: 1 분;에 대 한 60 ° C 130 ° C에 20 ° C/min의 그라데이션 260 ° C에 4 ° C/min의 두 번째 그라데이션 10 분 동안 260 ° C에 온도 유지 합니다.
- BSTFA 파생 상품: 1.2 mL/분의 지속적인 흐름으로 모바일 위상으로 사용 헬륨 275 ° C에서 300 ° c.에 소스의 입구의 온도 설정 분석 실행 (사출: 1 µ L), 점차적으로 오븐 온도 다음과 같이 증가: 1 분; 110 ° C 첫 번째 그라데이션 154 ° C에 2 ° C/min의 300 ° C에 5 ° C/min의 두 번째 그라데이션 10 분 동안 300 ° C에 온도 유지 합니다.
- 검색 절차: Derivatization의 각 모드에 대 한 긍정적인 전자 충격 이온화 70 eV에서 스캔 모드에서 샘플 (1 µ L) 주입 하 고 각 아미노산의 보존 기간을 숙지 합니다.
- 이 값을 사용 하 여 시간 윈도우는 크로마 전체와 각 아미노산의 특성 및 표 3;에 나열 된 다른 선택 된 이온에 대 한 정의 이 값은 각 아미노산에 대 한 포함 되어야 합니다. SIM 탐지 프로그램에이 정보를 포함 하 고 70 eV에서 긍정적인 전자 충격 이온화와 시뮬레이션 모드에서 분석을 실행 합니다.
- 악기 전용 소프트웨어를 사용 하 여 장비를 제어 하는 chromatograms를 분석. "시퀀스" 메뉴에서 샘플 목록을 만들려면 "예제 로그 테이블" 고 주사를 시작 하려면 "실행" 버튼을 클릭 합니다.
- 수집; 분석 결과 즉, 각 아미노산에 대 한 해당 하는 농도의 클러스터는 다른 대량 isotopomers에 기록 합니다. 자연 라벨에 대 한 수정 및 proteinogenic 아미노산 (단백질에 그것의 총 금액에 관하여는 아미노산의 레이블이 지정 된 비율로 정의의 동위 원소 농축 계산 dedicatedsoftware17 를 사용 하 여 데이터 처리 샘플)입니다.
참고: 분자의 동위 원소 농축 (즉), 백분율로 표시, 라벨로 대량 isotopomers의 수정 된 농도의 합계를 나누어 계산 됩니다 (m1, m2,...mn)는 수정 된의 합으로 모든 대량 isotopomers의 농도 (m0, m1, m2, mn):
I. E. = (m1 + m2 +... + mn) / (m0 + m1+ m2 +... + mn)
- Autosampler 인젝터를 장착 하는 질량 분 서 계에 결합 하는 가스 크로마 토 그래프와 함께 샘플을 분석 합니다.
5. 정량화 및 휘발성 화합물의 동위 원소 농축
-
레이블이 지정 된 휘발성 화합물의 추출
- 10 µ L deuterated 내부 표준의 상쾌한의 5 mL을 추가 (deuterated 화합물의 최종 농도: 100 µ g/L) 15 mL 유리 튜브에. Dichloromethane의 1 mL을 추가, 단단히 튜브와 20 분 3000 x g에 5 분 동안 원심 분리기에 대 한 락 플랫폼에서 그들을 흔들어 닫고 15 mL 유리 튜브에 유기 낮은 단계를 수집 합니다. 반복 dichloromethane 추출 합니다.
- 건조 한 유기 추출 물 500mg 이상 무수 황산 나트륨 및 수집으로 파스퇴르 피펫으로 액체 단계. 질소 유량에서 4의 요인에 의해 추출 집중 하 고 GC autosampler 유리병에 그것을 전송.
-
휘발성 화합물의 GC-MS 정량화
- 0.25 μ m 두께 30 m x 0.25 m m 용융 실리 카 모 세관 칼럼 가스 크로마 토 그래프 장비와 인젝터와 250 ° c.에 전송 선 1.0 mL/분 대기의 흐름을 일정 헬륨을 적용
- 분할의 비율은 10: 1와 2 µ L의 샘플을 주사 하 고 다음 오븐 온도 프로 파일을 사용 하 여 추출 된 휘발성 분자를 분리: 온도 40 ° C에서 3 분을 잡고, 4 ° C/min으로 증가 최대 220 ° C와 20 분 대 한 오븐 220 ° C에 대기.
- 230 ° C와 사중 극 자 질량 분 서 계 온도 150 ° c.에 설정에서 설정 하는 소스 온도와 질량 분석기를 사용 하 여 화합물을 감지 선택 이온 감시 (SIM) 모드로 70 eV 및 표 4에 보고 되는 휘발성 화합물을 특정 이온 클러스터를 사용 하 여 긍정적인 전자 충격 이온화 질량 스펙트럼을 기록 합니다.
- 외부 7-포인트 보정을 사용 하 여 해당 이온 클러스터의 농도의 합계에서 휘발성 분자의 농도 정량. 100% 에탄올에 각 화합물 (10 g/L)의 재고 솔루션을 준비 합니다. 그런 다음, 재고 솔루션을 혼합 하 여 휘발성 분자 (에틸 에스테 르, 아세테이트, 알콜, 및 산)의 각 클래스에 대 한 표준 솔루션을 준비 합니다. 마지막으로, 교정 솔루션을 준비 하는 3.3 조정 ph 5 g/L tartaric 산을 포함 하는 12 %hydroalcoholic 솔루션에서 표준 솔루션의 다른 양의 희석.
- 동시에, 각 이온 클러스터의 농도의 자연 라벨에 대 한 수정 하 고 휘발성 화합물의 분자의 레이블이 지정 된 비율로 정의 되 고 전용된 소프트웨어를 사용 하 여 백분율로 표현 된다 동위 원소 농축 계산 17.
6. 데이터 집합의 통합된 분석에 대 한 계산
-
원시 데이터의 수집
- 표 5, 6, 7, 및 8 에 표시 된 스프레드시트를 사용 하 여 입력 extracellular 아미노산, 셀 건조 중량, 셀, 휘발성 분자와 동위 원소 농도의 단백질 함량의 농도에 해당 하는 원시 데이터 값 proteinogenic 아미노산 및 휘발성 분자 농축
참고: 테이블에 표시 된 데이터는 m m에서 표현 됩니다. 모든 결과 질소의 원자 질량 proteinogenic 아미노산의 millimolar 농도 곱하여 mg N/L 또는 각 분자의 분자량에 의해 m m에서 값을 곱하여 mg/L에도 표현 됩니다 (14 u)와 질소 ato의 수 이 분자의 놓을에서 제공 되는 ms입니다. - 아미노산 (mg/L에서 그들의 합계)의 총 금액 하 여 mg/L는의 있는 그것의 총계를 분할 하 여 단백질에서 각 아미노산의 대량 비율을 계산 합니다.
- 수단, 표준 편차, 및 독립적인 실험에서 가져온 데이터에서 의미의 표준 오류를 계산 합니다.
- 바이오 매스 (g 단백질/g DW)에 단백질 분수와 건조 중량 콘텐츠 (바이오 매스 생산)에서 각 아미노산의 proteinogenic 농도 (mg/L) (mg aa/g 단백질) 단백질에서이 아미노산의 비율을 곱하여 계산 합니다 중간 (DW/L g)입니다.
- 표 5, 6, 7, 및 8 에 표시 된 스프레드시트를 사용 하 여 입력 extracellular 아미노산, 셀 건조 중량, 셀, 휘발성 분자와 동위 원소 농도의 단백질 함량의 농도에 해당 하는 원시 데이터 값 proteinogenic 아미노산 및 휘발성 분자 농축
-
15 N 동위 원소 추적 실험
- 그들의 총 농도 (mg N/L로 표시)에서 proteinogenic 아미노산 (mg N/L로 표시)에 존재 하는 질소의 레이블 및 레이블 없는 분수 계산 하는 표 9에 표시 된 스프레드시트를 사용 하 여 그들의 동위 원소 풍부입니다. 각 아미노산에 대 한 레이블이 분수의 총 농도와 그것의 동위 원소 농축 제품에 해당 하 고 레이블 없는 부분은 전체와 레이블이 지정 된 금액의 차이.
- 그런 다음, Ala, Gly, 발, Asp, 페, 레이, Ile, Thr, Ser, 프로, 리스의 총 금액 그, Glu, Arg (mg N/L)에 요약 하 고 전체를 분할 하 여이 연구에서 계량 proteinogenic 아미노산에 포함 된 단백질의 총 질소의 일부분을 결정 한 이 합계에 의해 단백질에 포함 된 질소의 마운트.
- 아르기닌, 글루타민 또는 proteinogenic 산 (Ala, Gly, 발, Asp, 연구에서 계량 된 proteinogenic 아미노산의 (mg N/L)에 레이블이 분수를 요약 하 여이 연구에서 계량에 복구 된 염화 질소를 계산 페, 레이, Ile, Thr, Ser, 프로, 리스, 그의 Glu, 및 Arg) 15N 표시 된 아르기닌, 글루타민, 또는 암모늄 및 아미노산 정량된 proteinogenic에서 질소의 총 금액으로이 표시 된 질소 분수를 나누는 존재 실험 중 산입니다.
- 3 가장 풍부한 아미노산 생 합성 드 노 보 13C와 15N 동위 원소 추적 실험 ( 표 7에 스프레드시트)에서 데이터를 결합 하 여 사용 하는 질소의 세포내 풀에의 기여를 평가.
- Proteinogenic 발, 레이, 일, 또는 Thr의 총 금액 (mM로 표시)에서 소비 된 화합물 (13C 실험)의 직접 설립와 드 노 보 synthetized는 3에서 질소를 사용 하는 부분에서 파생 된 일부 공제 주요 소스는 드 노 보 synthetized 다른 아미노산에서 질소를 사용 하 여 분수를 평가.
- 그런 다음, 아미노산 드 노 보 synthetized proteinogenic 아미노산 (mM)의 총 금액을 Gln, Arg, 및 NH4+ (합계 mM로 표시)에서 제공 하는 질소를 사용 하 여 금액의 비율을 계산의 기여를 계량 하기 아르기닌, 글루타민, 그리고 세포내 질소 풀 암모늄.
-
13 C 동위 원소 추적 실험
- 농도 실험 13C 라는 레이 발, 존재 하는 동안 가져온 proteinogenic 아미노산의 동위 원소 풍부에 표현에서 proteinogenic 아미노산의 분류, 레이블이 없는 분수를 계산 일 또는 Thr. (6.2.1, 표 10참조).
- 농도 실험 13C 라는 레이 발, 일, 또는 Thr ( 존재 하는 동안 가져온 휘발성 화합물의 동위 원소 풍부에 표현에서 휘발성 화합물의 분류, 레이블이 없는 분수를 계산 표 10).
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Representative Results
그림 3 워크플로 여러 질소 소스 와인 발효 하는 동안 발견 되는 효 모에 의해 관리를 조사 하기 위해 구현 된의 회로도를 선물 한다.
샘플링, 생물 학적 매개 변수-성장 특성, 질소 소비 패턴 및 proteinogenic 아미노산-쇼 발효 (그림 4) 중 높은 재현성의 프로필의 다른 지점에 대 한 이 일관성 세트 14 독립 발효 중 생성 된 데이터의 조합에 따라 접근의 관련성을 확인 합니다.
그림 5 는 모든 proteinogenic 아미노산을 포도 주스에서 사용할 수 있는 소스에서 질소의 재배포에 대 한 포괄적인 개요를 보여 줍니다. 이 분석은 주로 15N 표시 된 화합물의 실시 하는 실험에서 가져온 결과 의해 지원 됩니다. 질량과 동위 균형의 지와 함께 결합, proteinogenic 아미노산의 동위 원소 농축의 측정 제공 질소 유래 아르기닌, 글루타민, 암모늄, 및 다른 기여의 첫 번째 정량화 이러한 화합물의 각각의 아민 그룹에 소스. 여기에 밑줄은 질소의 중요 한 재분배 유지 효 모 성장에 아미노산 합성 드 노 보 의 실질적인 역할을 반영 합니다.
또한,이 연구, 그들의 소비와 단백질에 레이블이 화합물의 양을 비교 평가를 셀 들어가면 단백질에 직접 통합 하는 소비 N 포함 된 분자의 일부 수 있습니다. Proteinogenic 아미노산; 바이오 매스에서 직접 설립의 그들의 수준에 따라 구분 됩니다. 그들 중 일부는 독점적으로 (Asp, Glu) 또는 80 %novo 드 노 보 synthetized 동안 적은 양의 다른 화합물 보다 더 드 노 보 합성에 의해 생성 됩니다. 흥미롭게도,이 마지막 그룹은 유일한 아미노산 모두 소비 소스는 직접 통합 리 신과 히스티딘, 포함 됩니다.
그림 5B 또한 선물, 일부 아미노산에 대 한 바이오 매스, 15N 라벨 실험에서 얻은 13에에서 실험적으로 측정 하는 데이터에서 계산으로 직접 복구 된 소비 아미노산의 금액을 비교 C 라벨 실험. 이러한 값 사이의 작은 차이 신뢰성과이 연구에서 구현 된 접근의 견고 함을 보여줍니다.
그림 6 는이 문서에서 보고 하는 워크플로 구현 하 여 얻은 대사 경로 통해 용의 양적 분할 (비율)의 예가 나와 있습니다. 이 지도 동위 원소 추적 실험 15N-와 13C 표시 된 기질을 사용 하 여 정보를 결합 하 여 당겨 지 고 valine에 관련 된 대사 네트워크에서 소비 지방 족 아미노산의 분할에 대해 설명 하 고 효 모 생 합성 신 (계산에 대 한 참조 표 1 과 표 2). 생산 및 동위 원소 농축 proteinogenic 아미노산의 휘발성 화합물을 측정 하 여 평가 하는 소비 U C13-valine 및 U-C13-의 탄소 등뼈에서 synthetized은 이러한 화합물의 양을 신에 해당 하는 화합물의 레이블이 분수. 그 후, 그들의 형성 (화합물의 레이블이 없는 부분)에 CCM의 기여를 확인할 수 있었습니다. 탄소 질량 균형 사용 하 여 워크플로 및 여기 제안 계산 절차 보여 소비 valine 및 신의 96% 이상 그들의 변환 제품, 즉 복구는, proteinogenic 신 valine 그리고 휘발성 높은 설정 알콜입니다. 이 대사의 양적 연구에 대 한 보고 방법의 적합성을 확인합니다. 데이터 집합의 통합 및 포괄적인 분석 소비 아미노산의 운명에 새로운 통찰력을 제공합니다. 놀랍게도, valine 및 신의 상당한 분수는 매체에서 이러한 화합물의 가용성 및 바이오 매스에 해당 내용을 사이 상당한 불균형에도 불구 하 고 catabolized. 그러나, 단백질에 직접 통합 외 인 N 화합물의 일부 아미노산의 성격에 따라 달라 집니다. 또 다른 핵심 우려 proteinogenic 아미노산 및 휘발성 분자의 대사 기원. Proteinogenic 신 및 valine 13C 라벨 패턴 분석이 보여준다 이러한 아미노산의 탄소 골격 CCM 통해 synthetized를 했다 선구자에서 주로 온다. 이 관찰에 따라 isobutanol과 isoamyl 알콜에 라벨의 낮은 결합 valine와 누 룩이 더 높은 알콜의 형성에 의해 소비 했다 신 놓의 매우 제한 된 참여를 보여 줍니다.
그림 1입니다. 높은 처리량 발효를 모니터링 하기 위한 로봇 시스템 자동화. (A) 로봇 플랫폼입니다. Fermenters 지원 가이드에 자석 교 반 접시 (b)에 배치 (a) 됩니다. 안전 라이트 커튼 (c)는 사용자를 보호합니다. 로봇 팔 (d) 4 시간 마다 무게를 측정 하는 작업 테이블의 왼쪽에 정밀 균형 (e)에 접시를 감동 하는 6 중 하나에 그들의 위치에서 연속적으로 있는 fermenters 이동 합니다. 로봇 플랫폼은 온도 제어 룸에 위치 해 있습니다. (B) 소프트웨어 아키텍처의 도식 적인 표현입니다. 그래픽 인터페이스를 사용 하면 실험 설정을 정의할 수 있습니다. 이 정보는 로봇 팔을 제어 하 고 다른 원시 data.xlm 파일 (파일 1/발효)에서 서로 다른 무게를 기록 하는 제어 응용 프로그램에 전송 됩니다. 그런 다음 계산 소프트웨어 xlm 파일을 수집 하 고 각 시간 지점에 대 한 CO2 출시 (g/L로 표현),이 시간, 그리고 발효 속도에서 소비 하는 설탕의 양을에 비례, 금액을 계산 g CO2/L/h (설탕 소비의 속도에 비례)에 CO2 생산의 속도에 해당합니다. 데이터는 관계형 데이터베이스에 저장 되 고 헌신적인된 그래픽 인터페이스를 사용 하 여 시각. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2입니다. Proteinogenic 아미노산의 GC-MS 분석: 알라닌의 예. (A) 크로마 DMFDMA를 사용 하 여 proteinogenic 아미노산의 derivatization 후 얻은. (B) 스펙트럼 derivatized 알라닌의 질량. M0/z와 조각에 해당 하는 두 개의 주요 봉우리 = 99와 m0/z 158 =. (C) DMFDMA와 알라닌의 Derivatization 반응. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3입니다. 효 모에 의해 여러 질소 대사의 정량 분석에 대 한 워크플로 소스. 이 프로세스 포함 (i) 된 28의 발효 (7 질소 소스와 발효 또는 질소 화합물 중복에서 없이); (적 출의 다른 절차와 derivatization의 분자 및 HPLC 또는 GM MS 분석 및 (iii) 원시 데이터의 처리와 데이터의 통합된 분석을 포함 한다 ii) 분석 부분. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4입니다. 독립적인 발효 된에서 생물 학적 매개 변수의 재현성. (A-B) 값 및 레이블 없는 화합물을 사용 하 여 실시 14 독립 발효에서 가져온 건조 무게와 단백질 함량의 표준 편차를 의미 합니다. (C D) 평균값 및 표준 편차 proteinogenic 및 14 독립 발효 하는 동안 측정 된 소비 아미노산의 레이블이 없는 화합물을 사용 하 여 실시. CO2 생산: 5 (녹색), 10 (파랑), 40 (핑크) (보라색) 90 g/l. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5입니다. 발효 하는 동안 proteinogenic 아미노산을 세 가지 주요 질소 소스에서 질소의 재배포. (A) proteinogenic 아미노산의 대사 출처: 직접 소비 대응 (파란색) 및 de novo 종합 소비 아르기닌 (오렌지), 글루타민 (녹색), (핑크) 암모늄 또는 다른 아미노산 (에서 제공 하는 질소를 사용 하 여의 보라색). 각 proteinogenic 아미노산의 총 금액의 비율으로 표현합니다. (B) 비교 소비 아미노산 (파란색)의 양과 소모 아미노산 단백질에서 직접 복구 되는의 부분 (보라색) 15N 추적 실험 또는 실험적으로 가져온 데이터에서 계산 (핑크) 13C 표시 된 분자와 발효 하는 동안 측정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6입니다. Valine 및 신 물질 대사의 정량 분석. CO2 의 40 g/L 생산 하는 경우 소비 신 (녹색) 및 대사 네트워크를 통해 (파란색) valine 파티션. 바 각 화합물의 양을에 비례 하 고 µ M, 중앙 탄소 물질 대사 (오렌지)에서 synthetized은 분수를 포함 하 여 표현 됩니다. 일반 글꼴에서 값: 금액 µ M; 기울임꼴 글꼴에서 값: 소비 valine (파란색) 또는 통로 통해 catabolized은 신 (녹색)의 비율. 계산 표 1 과 표 2에 나와 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 화합물 | 리터 당 금액 |
| 포도 당 C6H12O6 | 240 g |
| 금산 C4H6O5 | 6 g |
| 구 연산 C6H8O7 | 6 g |
| 칼륨 인산 염 KH2포4 | 0.75 g |
| 칼륨 황산 염 K2SO4 | 0.5 g |
| 황산 마그네슘 MgSO4, 7 H2O | 0.25 g |
| 염화 칼슘 CaCl2, 2 H2O | 0.155 g |
| 염화 나트륨 NaCl | 0.2 g |
| Myo-이노 시 톨 | 20 mg |
| 칼슘 pantothenate | 1.5 m g |
| 티 아민 염 산 염 | 0.223 mg |
| 니코틴산 산 | 2 밀리 그램 |
| 피리 독신 | 0.25 mg |
| 비타민 b 복합체 | 0.003 |
| MnSO4· H2O | 4 mg |
| ZnSO4·7H2O | 4 mg |
| CuSO4·5H2O | 1 밀리 그램 |
| CoCl2·6H2O | 0.4 밀리 그램 |
| H3보3 | 1 밀리 그램 |
| (NH4) 6 모7O24 | 1 밀리 그램 |
| Ergosterol | 3.75 mg |
| 올레산 | 1.25 Μ L |
| 트윈 80 | 125 Μ L |
| 티로신 | 8.6 mg |
| 트립토판 | 84.4 mg |
| 이소류신 | 15.4 mg |
| Aspartate | 20.9 mg |
| 조미료 | 56.7 m g |
| 아르기닌 | 176.2 mg |
| 신 | 22.8 m g |
| 트레오닌 | 35.7 m g |
| 글리신 | 8.6 mg |
| 글루타민 | 237.8 mg |
| 알라닌 | 68.4 mg |
| Valine | 20.9 mg |
| 메티오닌 | 14.8 m g |
| 페닐알라닌 | 17.9 m g |
| 떠들고 | 37.0 mg |
| 히스티딘 | 15.4 mg |
| Lysine | 8.0 mg |
| 시스테인 | 6.2 mg |
| 프롤린 | 288.3 mg |
| 암모니아 염화 NH4Cl | 220 mg |
| 매체의 pH는 NaOH 10 M 3.3 조정 되었다. | |
표 1입니다. 이 연구에 사용 된 합성 매체의 구성. 이 화학적으로 정의 된 매체 모방 포도 주스의 구성 합니다.
| 차입 버퍼 | 온도 | |
| 0 ~ 6 분에서 | 리튬 구 연산 염, 200 m m, pH 2.8 | 32 ° C |
| 38 분 6 | 리튬 구 연산 염, 300mm, pH 3 | 32 ° C |
| 38-57 분에서 | 리튬 구 연산 염, 500mm, pH 3.15 | 64.5 ° C |
| 57-83 분에서 | 리튬 구 연산 염, 900 m m, pH 3.5 | 75 ° C |
| 83-120 분에서 | 리튬 구 연산 염, 1650 m m, pH 3.55 | 75 ° C |
| 120-130 분 | 수산화 리튬, 300 mM |
표 2입니다. 이온-교환 크로마토그래피 아미노산 분리에 대 한 사용 조건. 차입 버퍼 증가 소금 농도와 아미노산의 분리 수 있도록 온도 기울기와 함께에서 연속적으로 사용 됩니다.
| 아미노산 | Derivatizing 시 약 | RT (분) | 이온 클러스터 (m/z) |
| 알라닌 | ECF는는 | 3.86 | 116, 117, 118, 119 |
| DMFDMAb | 6.37 | 99, 100, 101, 102 | |
| DMFDMAb | 6.37 | 158, 159, 160, 161 | |
| 글리신 | ECF는는 | 4.19 | 102, 103, 104 |
| ECF는는 | 4.19 | 175, 176, 177 | |
| DMFDMAb | 6.61 | 85, 86, 87 | |
| DMFDMAb | 6.61 | 144, 145, 146 | |
| Valine | ECF는는 | 4.97 | 144, 145, 146, 147, 148, 149 |
| DMFDMAb | 7.37 | 127, 128, 129, 130, 131, 132 | |
| DMFDMAb | 7.37 | 143, 144, 145, 146, 147, 148 | |
| DMFDMAb | 7.37 | 186, 187, 188, 189, 190, 191 | |
| 신 | ECF는는 | 5.67 | 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164 |
| 이소류신 | ECF는는 | 5.85 | 158, 159, 160, 161, 162, 163, 165 |
| 트레오닌 | ECF는는 | 6.48 | 146, 147, 148, 149, 150 |
| ECF는는 | 6.48 | 175, 176, 177, 178, 179 | |
| 떠들고 | ECF는는 | 6.53 | 132, 133, 134, 135 |
| ECF는는 | 6.53 | 175, 176, 177, 178 | |
| 프롤린 | ECF는는 | 6.83 | 142, 143, 144, 145, 146, 147 |
| Aspartate | ECF는는 | 7.89 | 188, 189, 190, 191, 192 |
| DMFDMAb | 11.77 | 115, 116, 117, 118, 119 | |
| DMFDMAb | 11.77 | 216, 217, 218, 219, 220 | |
| 조미료 | ECF는는 | 8.81 | 202, 203, 204, 205, 206, 207 |
| DMFDMAb | 12.75 | 111, 112, 113, 114, 115, 116 | |
| DMFDMAb | 12.75 | 143, 144, 145, 146, 147, 148 | |
| DMFDMAb | 12.75 | 230, 231, 232, 233, 234, 235 | |
| 페닐알라닌 | ECF는는 | 9.53 | 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201 |
| DMFDMAb | 13.67 | 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152 | |
| Lysine | ECF는는 | 11.95 | 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162 |
| 히스티딘 | ECF는는 | 12.54 | 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333 |
| 아르기닌 | BSTFAc | 18.8 | 174, 175, 176, 177, 178, 179 |
| 는 ECF, 에틸 chloroformate; b DMFDMA, (N, N)-dimethylformamide 틸 아 세 탈; c BSTFA, (N,O-bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide). | |||
테이블 3입니다. 선택 된 이온 감시 (SIM) 모드를 사용 하 여 아미노산의 동위 원소 풍부 결정에 대 한 사용 분석 매개 변수입니다. Derivatization, derivatized 화합물의 보존 기간 및 각 아미노산에 대 한 MS (전자 충격 모드)에서 얻은 이온의 클러스터에 사용 되는 화학 약품을 요약 한이 표.
| 아미노산 | Derivatizing 시 약 | RT (분) | 이온 클러스터 (m/z) |
| 알라닌 | ECF는는 | 3.86 | 116, 117, 118, 119 |
| DMFDMAb | 6.37 | 99, 100, 101, 102 | |
| DMFDMAb | 6.37 | 158, 159, 160, 161 | |
| 글리신 | ECF는는 | 4.19 | 102, 103, 104 |
| ECF는는 | 4.19 | 175, 176, 177 | |
| DMFDMAb | 6.61 | 85, 86, 87 | |
| DMFDMAb | 6.61 | 144, 145, 146 | |
| Valine | ECF는는 | 4.97 | 144, 145, 146, 147, 148, 149 |
| DMFDMAb | 7.37 | 127, 128, 129, 130, 131, 132 | |
| DMFDMAb | 7.37 | 143, 144, 145, 146, 147, 148 | |
| DMFDMAb | 7.37 | 186, 187, 188, 189, 190, 191 | |
| 신 | ECF는는 | 5.67 | 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164 |
| 이소류신 | ECF는는 | 5.85 | 158, 159, 160, 161, 162, 163, 165 |
| Threonin | ECF는는 | 6.48 | 146, 147, 148, 149, 150 |
| ECF는는 | 6.48 | 175, 176, 177, 178, 179 | |
| 떠들고 | ECF는는 | 6.53 | 132, 133, 134, 135 |
| ECF는는 | 6.53 | 175, 176, 177, 178 | |
| 프롤린 | ECF는는 | 6.83 | 142, 143, 144, 145, 146, 147 |
| Aspartate | ECF는는 | 7.89 | 188, 189, 190, 191, 192 |
| DMFDMAb | 11.77 | 115, 116, 117, 118, 119 | |
| DMFDMAb | 11.77 | 216, 217, 218, 219, 220 | |
| 조미료 | ECF는는 | 8.81 | 202, 203, 204, 205, 206, 207 |
| DMFDMAb | 12.75 | 111, 112, 113, 114, 115, 116 | |
| DMFDMAb | 12.75 | 143, 144, 145, 146, 147, 148 | |
| DMFDMAb | 12.75 | 230, 231, 232, 233, 234, 235 | |
| 페닐알라닌 | ECF는는 | 9.53 | 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201 |
| DMFDMAb | 13.67 | 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152 | |
| Lysine | ECF는는 | 11.95 | 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162 |
| 히스티딘 | ECF는는 | 12.54 | 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333 |
| 아르기닌 | BSTFAc | 18.8 | 174, 175, 176, 177, 178, 179 |
표 4입니다. 동위 원소 풍부 결정 하 고 선택 된 이온 감시 (SIM) 모드를 사용 하 여 휘발성 화합물의 정량화 사용 분석 매개 변수. 이 표에서 각 휘발성 화합물에 대 한 보존 기간 및 MS (전자 충격 모드)에서 얻은 이온의 클러스터를 요약 합니다.
표 5입니다. 잔여 아미노산의 정량화에서 얻은 원시 데이터의 처리 초기 및 잔여 아미노산의 측정에서 데이터를 포함 하는 데이터 집합. 이러한 값 (빼기)에 의해 소비 아미노산의 양을 계산 하는 데 사용 됩니다. 의미 및 표준 편차 계산 추가 계산 됩니다. 이 테이블을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
표 6입니다. Proteinogenic 아미노산의 정량화에서 얻은 원시 데이터의 처리. 바이오 매스 hydrolysates (A)와 바이오 매스 (B)에 있는 단백질의 일부의 아미노산에서 구성에 데이터를 포함 하는이 데이터 집합. 이러한 값은 (C) 단백질에서 각 아미노산의 대량 비율을 평가 하는 데 사용 됩니다. 의미 및 표준 편차 계산 추가 계산 됩니다. 이 테이블을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
표 7입니다. Proteinogenic 아미노산입니다. 이 스프레드시트 데이터 표 5 및 표 6에 요약에서 proteinogenic 아미노산 (mM)에 농도 계산 하는. 의미 및 표준 편차 계산 추가 계산 됩니다. 이 테이블을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
테이블 8입니다. 더 높은 알콜의 정량화에서 얻은 원시 데이터의 처리. 데이터 집합에서 휘발성 화합물 농도 (A)의 측정 데이터를 포함 하 고 µ m (B) mg/L의 단위로 표시 하는 데이터를 변환 합니다. 의미 및 표준 편차 계산 추가 계산 됩니다. 이 테이블을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
테이블 9입니다. 사용 하 여 proteinogenic 아미노산의 동위 원소 풍부 결정에서 얻은 원시 데이터의 처리 15N 표시 된 기판.
의미 및 표준 편차 계산 추가 계산 됩니다. 이 테이블을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
테이블 10입니다. Proteinogenic 아미노산의 휘발성 화합물을 사용 하 여 동위 원소 풍부 결정에서 얻은 원시 데이터의 처리 13C 표시 된 기판.
의미 및 표준 편차 계산 추가 계산 됩니다. 이 테이블을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
동위 원소 추적 실험을 사용 하 여 신진 대사 네트워크를 통해 화합물의 분할을 측정 하는 것은 미생물 물질 대사의 동작을 이해 하기 위한 유망한 접근 이다. 이 방법론, 하나 또는 두 개의 레이블된 기판, 성공적으로 적용 하는 동안 수 없습니다 현재 구현 여러 레이블이 원소 동위 원소 (즉, 두 개 이상의 기판)를 사용 하 여 다양 한 소스의 대사를 공부. 실제로, 사용할 수 있는 분석 기법 공동 두 요소와 라벨 때 단일 요소 및 동위 원소를 사용 하는 경우에 독점적으로 proteinogenic 아미노산의 분자 라벨 패턴의 정확한 결정을 사용 합니다. 따라서, 이러한 한계를 해결 하 고 미생물에 의해 여러 영양소 소스 관리를 평가, 우리 13C 또는 15 선택한 기판 라벨 동안 동일한 환경 조건 하에서 문화의 세트를 반복 하기로 N 동위 원소. 다음, 추가 각 13C 또는 15N 추적 실험에서 제공 하는 특정 정보의 조합을 여러 소스의 대사의 양적 확장된 보기를 제공 합니다.
보고 된 접근의 성과에서는 표준 조건 하에서 문화의 재현 시리즈의 구현에 모든 문화 (셀에 대 한 동일한 정의 된 생리 적 상태에 있는 세포의 인구에서 샘플의 컬렉션 성장, 기판 등의 소비). 독립적인 실험에서 얻은 데이터를 혼합 하 고 함께 분석 될 수 있도록 이러한 조건이 충족 되어야 합니다. 이러한 제약 조건을 정확 하 고 빈번한 실시 되었다 미생물 활동의 모니터링 요구 만족, 실험적인 작품에서 보고 여기, 효 모 발효 활동의 온라인 모니터링을 위한 로봇 기반 시스템을 사용 하 여. 그러나, 미생물 배양 및 모니터링, 광학 밀도 측정 하 여 세포 성장 결정 같은 더 전통적인 방법 샘플링 절차를 정상화 하 사용할 수 있습니다.
이 방법을 수행 하기 위한 또 다른 필수 조사를 네트워크에 관련 된 변화 통로의 명확한 비전을가지고 것입니다. 이 지식을 공부 하 고 문제를 처리 하기 위한 가장 적합 한 레이블된 기판의 세트를 선택 하기 위한 필수적입니다. 레이블이 지정 된 화합물으로 서 자연과 라벨 (13C, 15N, 또는 다른 사람)의 위치 분자 내에서 선택 해야 합니다 적절 한 순서로 나)에서 파생 되는 화합물에 기판에서 제공 하는 모든 라벨을 복구 그들의 놓을 고 추가 분석 절차 및 ii) 방법론의 정확성 및 결과의 타당성을 보여 주는 중복 데이터를 가져옵니다. 여기에 설명 된 절차는 또한 인간과 금융 자원에 비용과 시간이 많이 소요 될 수 있는 분석의 중요 한 수를 포함 한다. 또한, 일부 분석 제약이이 방법론의 사용을 제한할 수 있습니다. 첫째, 사용자는 모든 분석 방법 미생물 물질 대사 동안 생산 하는 화합물의 정량화에 대 한 필요 하 고 그들의 동위 원소 농축의 결정에 대 한 사용할 수 있습니다 확인 해야 합니다. 둘째,이 이렇게 화합물 충분 한 금액을 정확 하 게 측정할 수에서 생산 되는 모든 변환에 대 한 기판의 물질 대사를 평가에 적용 됩니다.
이 문서에서 우리는 와인 발효 하는 동안 효 모에 의해 여러 질소 소스의 관리를 탐험이 워크플로 적용. 이 보고서는 가장 소비 아미노산, 단백질, 그리고 선구자를 공급 추가 사용 되는 CCM의 주요 기여 금으로 그들의 낮은 직접 설립과 함께 상당한 놓을 포함 효 모 물질 대사에 대 한 새로운 통찰력을 제공 둘 다 proteinogenic 아미노산의 de novo 종합 및 휘발성 분자의 형성.
더 넓게, 여기 설명 된 방법은 어떤 미생물의 대사 네트워크를 통해 여러 기판의 분할 측정을 위해 사용할 수 있습니다. 그것은 연구원 그들은 셀 입력 후 모든 소비 화합물의 명료 하 고 선구자 및 제품의 신진 대사 원산지 식별 주소를 허용할 것 이다. 이 정보 다른 유전 배경에 있는 긴장의 신진 대사 활동을 비교 하는 데 유용할 수 있습니다 또는 다른 조건 하에서 그리고, 따라서, 발효 프로세스를 개선 하기 위해 합리적인 전략을 설계에 대 한 성장.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리 장 Roch Mouret, 실 비 Dequin 로봇 기반 발효 시스템의 개념에 기여에 대 한 장-마리 Sabalyrolles 마틴 Pradal, 니콜라 부 비 그리고 Pascale Brial 그들의 기술 지원에 대 한 감사 합니다. 이 프로젝트에서 제공한 Ministère 드 l'Education 회, 드 라 검색 외에 대 한 자금 드 라 Technologie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D-Glucose | PanReac | 141341.0416 | |
| D-Fructose | PanReac | 142728.0416 | |
| DL-Malic acid | Sigma Aldrich | M0875 | |
| Citric acid monohydrate | Sigma Aldrich | C7129 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P5379 | |
| Potassium sulfate | Sigma Aldrich | P0772 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | 230391 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C7902 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S9625 | |
| Ammonium chloride | Sigma Aldrich | A4514 | |
| Sodium hydroxide | Sigma Aldrich | 71690 | |
| Manganese sulfate monohydrate | Sigma Aldrich | M7634 | |
| Zinc sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | Z4750 | |
| Copper (II) sulfate pentahydrate | Sigma Aldrich | C7631 | |
| Potassium iodine | Sigma Aldrich | P4286 | |
| Cobalt (II) chloride hexahydrate | Sigma Aldrich | C3169 | |
| Boric acid | Sigma Aldrich | B7660 | |
| Ammonium heptamolybdate | Sigma Aldrich | A7302 | |
| Myo-inositol | Sigma Aldrich | I5125 | |
| D-Pantothenic acid hemicalcium salt | Sigma Aldrich | 21210 | |
| Thiamine, hydrochloride | Sigma Aldrich | T4625 | |
| Nicotinic acid | Sigma Aldrich | N4126 | |
| Pyridoxine | Sigma Aldrich | P5669 | |
| Biotine | Sigma Aldrich | B4501 | |
| Ergostérol | Sigma Aldrich | E6510 | |
| Tween 80 | Sigma Aldrich | P1754 | |
| Ethanol absolute | VWR Chemicals | 101074F | |
| Iron (III) chloride hexahydrate | Sigma Aldrich | 236489 | |
| L-Aspartic acid | Sigma Aldrich | A9256 | |
| L-Glutamic acid | Sigma Aldrich | G1251 | |
| L-Alanine | Sigma Aldrich | A7627 | |
| L-Arginine | Sigma Aldrich | A5006 | |
| L-Cysteine | Sigma Aldrich | C7352 | |
| L-Glutamine | Sigma Aldrich | G3126 | |
| Glycine | Sigma Aldrich | G7126 | |
| L-Histidine | Sigma Aldrich | H8000 | |
| L-Isoleucine | Sigma Aldrich | I2752 | |
| L-Leucine | Sigma Aldrich | L8000 | |
| L-Lysine | Sigma Aldrich | L5501 | |
| L-Methionine | Sigma Aldrich | M9625 | |
| L-Phenylalanine | Sigma Aldrich | P2126 | |
| L-Proline | Sigma Aldrich | P0380 | |
| L-Serine | Sigma Aldrich | S4500 | |
| L-Threonine | Sigma Aldrich | T8625 | |
| L-Tryptophane | Sigma Aldrich | T0254 | |
| L-Tyrosine | Sigma Aldrich | T3754 | |
| L-Valine | Sigma Aldrich | V0500 | |
| 13C5-L-Valine | Eurisotop | CLM-2249-H-0.25 | |
| 13C6-L-Leucine | Eurisotop | CLM-2262-H-0.25 | |
| 15N-Ammonium chloride | Eurisotop | NLM-467-1 | |
| ALPHA-15N-L-Glutamine | Eurisotop | NLM-1016-1 | |
| U-15N4-L-Arginine | Eurisotop | NLM-396-PK | |
| Ethyl acetate | Sigma Aldrich | 270989 | |
| Ethyl propanoate | Sigma Aldrich | 112305 | |
| Ethyl 2-methylpropanoate | Sigma Aldrich | 246085 | |
| Ethyl butanoate | Sigma Aldrich | E15701 | |
| Ethyl 2-methylbutanoate | Sigma Aldrich | 306886 | |
| Ethyl 3-methylbutanoate | Sigma Aldrich | 8.08541.0250 | |
| Ethyl hexanoate | Sigma Aldrich | 148962 | |
| Ethyl octanoate | Sigma Aldrich | W244910 | |
| Ethyl decanoate | Sigma Aldrich | W243205 | |
| Ethyl dodecanoate | Sigma Aldrich | W244112 | |
| Ethyl lactate | Sigma Aldrich | W244015 | |
| Diethyl succinate | Sigma Aldrich | W237701 | |
| 2-methylpropyl acetate | Sigma Aldrich | W217514 | |
| 2-methylbutyl acetate | Sigma Aldrich | W364401 | |
| 3-methyl butyl acetate | Sigma Aldrich | 287725 | |
| 2-phenylethyl acetate | Sigma Aldrich | 290580 | |
| 2-methylpropanol | Sigma Aldrich | 294829 | |
| 2-methylbutanol | Sigma Aldrich | 133051 | |
| 3-methylbutanol | Sigma Aldrich | 309435 | |
| Hexanol | Sigma Aldrich | 128570 | |
| 2-phenylethanol | Sigma Aldrich | 77861 | |
| Propanoic acid | Sigma Aldrich | 94425 | |
| Butanoic acid | Sigma Aldrich | 19215 | |
| 2-methylpropanoic acid | Sigma Aldrich | 58360 | |
| 2-methylbutanoic acid | Sigma Aldrich | 193070 | |
| 3-methylbutanoic acid | Sigma Aldrich | W310212 | |
| Hexanoic acid | Sigma Aldrich | 153745 | |
| Octanoic acid | Sigma Aldrich | W279900 | |
| Decanoic acid | Sigma Aldrich | W236403 | |
| Dodecanoic acid | Sigma Aldrich | L556 | |
| Fermentor 1L | Legallais | AT1357 | Fermenter handmade for fermentation |
| Disposable vacuum filtration system | Dominique Deutscher | 029311 | |
| Fermenters (250 ml) | Legallais | AT1352 | Fermenter handmade for fermentation |
| Sterile tubes | Sarstedt | 62.554.502 | |
| Fermentation locks | Legallais | AT1356 | Fermetation locks handmade for fermentation |
| BactoYeast Extract | Becton, Dickinson and Company | 212750 | |
| BactoPeptone | Becton, Dickinson and Company | 211677 | |
| Incubator shaker | Infors HT | ||
| Particle Counter | Beckman Coulter | 6605697 | Multisizer 3 Coulter Counter |
| Centrifuge | Jouan | GR412 | |
| Plate Butler Robotic system | Lab Services BV | PF0X-MA | Automatic instrument |
| Plate Butler Software | Lab Services BV | Robot monitor software | |
| RobView | In-house developed calculation software | ||
| My SQL | International source database | ||
| Cimarec i Telesystem Multipoint Stirrers | Thermo Fisher Scientific | 50088009 | String Drive 60 |
| BenchBlotter platform rocker | Dutscher | 60903 | |
| Ammonia enzymatic kit | R-Biopharm AG | 5390 | |
| Spectrophotometer cuvettes | VWR | 634-0678 | |
| Spectrophotometer UviLine 9400 | Secomam | ||
| Amino acids standards physiological - acidics and neutrals | Sigma Aldrich | A6407 | |
| Amino acids standards physiological - basics | Sigma Aldrich | A6282 | |
| Citrate lithium buffers - Ultra ninhydrin reagent | Biochrom | BC80-6000-06 | |
| Sulfosalycilic acid | Sigma Aldrich | S2130 | |
| Norleucine | Sigma Aldrich | N1398 | |
| Biochrom 30 AAA | Biochrom | ||
| EZChrom Elite | Biochrom | Instrument control and Data analysis software | |
| Ultropac 8 resin Lithium | Biochrom | BC80-6002-47 | Lithium High Resolution Physiological Column |
| Filter Millex GV | Merck Millipore | SLGVX13NL | Millex GV 13mm (pore size 0.22 µm) |
| Membrane filter PALL | VWR | 514-4157 | Supor-450 47mm 0.45µm |
| Vacuum pump Millivac Mini | Millipore | XF5423050 | |
| Aluminium smooth weigh dish 70mm | VWR | 611-1380 | |
| Precision balance | Mettler | Specifications AE163 | |
| Dimethyl sulfoxid dried | Merck | 1029310161 | (max. 0.025% H2O) SeccoSolv |
| Combustion oven | Legallais | ||
| Pierce BCA protein assay kit | Interchim | UP40840A | |
| Formic acid | Fluka | 94318 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma Aldrich | H1009 | |
| Hydrochloric Acid Fuming 37% Emsure | Merck | 1003171000 | Grade ACS,ISO,Reag. Ph Eur |
| Lithium acetate buffer | Biochrom | 80-2038-10 | |
| Commercial solution of hydrolyzed amino acids | Sigma Aldrich | AAS18 | |
| L-Methionine sulfone | Sigma Aldrich | M0876 | |
| L-Cysteic acid monohydrate | Sigma Aldrich | 30170 | |
| Pyrex glass culture tubes | Sigma Aldrich | Z653586 | |
| Pyridine | Acros Organics | 131780500 | 99% Extrapure |
| Ethyl chloroformate | Sigma Aldrich | 23131 | |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | 32222 | |
| Vials | Sigma Aldrich | 854165 | |
| Microinserts for 1.5ml vials | Sigma Aldrich | SU860066 | |
| GC/MS | Agilent Technologies | 5890 GC/5973 MS | |
| Chemstation | Agilent Technologies | Instrument control and data analysis software | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 34860 | Chromasolv, for HPLC |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 34998 | ChromasolvPlus, for HPLC |
| N,N-Dimethylformamide dimethyl acetal | Sigma Aldrich | 394963 | |
| BSTFA | Sigma Aldrich | 33024 | |
| DB-17MS column | Agilent Technologies | 122-4731 | 30m*0.25mm*0.15µm |
| Sodium sulfate, anhydrous | Sigma Aldrich | 238597 | |
| Technical nitrogen | Air products | 14629 | |
| Zebron ZB-WAX column | Phenomenex | 7HG-G007-11 | 30m*0.25mm*0.25µm |
| Helium BIP | Air products | 26699 | |
| Glass Pasteur pipettes | VWR | 612-1702 |
References
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