Summary

基于同位素示踪实验结合的工作流研究多营养源的微生物代谢

Published: January 22, 2018
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Summary

本议定书描述了一个实验过程, 定量和全面地研究多种营养来源的代谢。这一工作流程, 基于同位素示踪实验和分析程序的结合, 使被消耗的营养素的命运和由微生物综合的分子的新陈代谢的起源被确定。

Abstract

微生物学领域的研究依赖于各种方法的实施。特别是, 适当的方法的发展大大有助于提供广泛的知识代谢的微生物生长在化学定义的媒体含有独特的氮和碳源。相比之下, 通过多种营养来源的新陈代谢的管理, 尽管它们在自然或工业环境中的广泛存在, 仍然几乎未被探索。这种情况主要是由于缺乏适当的方法, 妨碍了调查工作。

我们报告一个实验策略, 以定量和全面地探讨新陈代谢是如何运作的, 当一个营养素作为不同的分子,, 一个复杂的资源的混合物提供。在这里, 我们描述了它的应用, 通过酵母代谢网络评估多氮源的划分。该工作流结合了稳定同位素示踪实验中所获得的信息, 使用选定的13C 或15N 标记基板。它首先包括平行和可再生的发酵在同一个媒介, 包括 N 包含分子的混合物;但是, 每次选定的氮源都被标记。结合分析程序 (HPLC, gc-ms), 以评估目标化合物的标记模式, 并量化的消耗和回收的基质在其他代谢物。完整的数据集的综合分析提供了在细胞内消耗的基质的命运的概述。这种方法需要一个精确的协议, 收集 samples–facilitated 的机器人辅助系统的在线监测 fermentations–and 实现了大量的耗时分析。尽管有这些限制, 它还是第一次允许对酵母代谢网络中的多个氮源进行划分。我们阐明了从更丰富的来源向其他 n-化合物的氮的再分配, 并确定了挥发性分子和 proteinogenic 氨基酸的代谢来源。

Introduction

了解微生物代谢如何运作是一个关键问题的设计有效的战略, 以改善发酵过程和调节生产的发酵化合物。在过去的二十年中, 基因组学和功能基因组学的进步, 在很大程度上促进了许多微生物代谢网络拓扑的知识的扩展。对此信息的访问导致了旨在全面概述蜂窝功能1的方法的发展。这些方法通常依赖于基于模型的可测量参数的解释。这些实验数据一方面包括代谢物的吸收率和生产率, 另一方面, 从同位素示踪实验中获得的定量的细胞内信息。这些数据提供了在定义的新陈代谢网络中的不同通路的体内活动的扣除的基本信息2,3,4。目前, 可用的分析技术只能够准确地检测分子在使用单元素同位素时的标记模式, 并可能在两个同位素元素的共同标记下。此外, 在大多数生长条件下, 碳源只由一个或两个化合物组成。因此, 基于碳基板上的13C 同位素示踪剂的方法得到了广泛和成功的应用, 以全面了解碳代谢网络的运行情况5,6,7 ,8

相比之下, 在许多自然和工业环境中, 支持微生物生长的可用氮资源通常由广泛的分子组成。例如, 在葡萄酒或啤酒发酵过程中, 氮气作为18种氨基酸和铵的混合物提供, 在可变浓度下为9。这一系列的 N 类化合物, 可用于代谢使这些复杂的媒体条件大大不同于那些通常用于生理学研究, 因为后者是通过使用独特的氮源, 典型的铵。

总的来说, 内化的氮化合物可以直接纳入蛋白质或 catabolized。许多微生物的氮代谢网络结构, 包括酵母的酿酒酵母, 是非常复杂的根据基板的多样性。示意性地, 这个系统是基于氮代谢中心核心的组合, 它催化谷氨酰胺、谷氨酸和α-二的转换10,11, 具有转氨酶和 deaminases。通过这个网络, 胺基团从铵或其他氨基酸收集和α-酮酸释放。这些中间体也综合通过中央碳代谢 (CCM)12,13。这种大量的分支反应和中间体, 参与了外源氮源的分解和 proteinogenic 氨基酸的代谢, 满足了细胞的合成代谢要求。通过这些不同的相互连接的路线的活动也导致代谢物的排泄。特别是α-酮酸可以通过艾氏通路重定向产生更高的醇及其乙酸酯衍生物14, 这是产品感官图谱的重要贡献。随后, 氮代谢如何运作在生物质生产和挥发性分子 (香气) 的形成中起着关键作用。

有关氮代谢的反应、酶和基因在文献中有广泛的描述。然而, 在整个代谢网络中分配多种氮源的问题尚未得到解决。解释这种缺乏信息有两个主要原因。首先, 鉴于氮代谢网络的重要复杂性, 需要大量的定量数据才能完全了解它的运作, 直到现在。其次, 许多实验性的约束和分析方法的局限性阻碍了以前用于解释 CCM 函数的方法的实现。

为了克服这些问题, 我们选择了一种系统级的方法, 它是基于对一系列同位素示踪实验数据的核对。该工作流包括:
-在相同环境条件下进行的一组发酵, 而不同的营养源 (基质) 每次都被标记。
-结合分析程序 (HPLC、gc-ms), 在发酵的不同阶段, 对被标记的基质的残留浓度和化合物的浓度和同位素富集进行精确测定。标记分子的分解代谢, 包括衍生生物质。
-计算每个被消耗标记的分子的质量和同位素平衡, 并对数据集进行进一步的综合分析, 以获得全球对微生物通过测定通量比值管理多种营养源的概览.

要应用这种方法, 必须注意培养菌株/微生物的可再生行为。此外, 在相同的发酵过程中, 必须采取不同文化的样品。在这篇手稿中所报道的实验工作中, 一个机器人辅助系统用于在线监测发酵, 以此来解释这些限制。

此外, 必须选择一套标签的基板 (化合物, 性质, 和位置的标签), 这是适当的, 以解决科学问题的研究。在这里, 15N 标记铵、谷氨酰胺和精氨酸被选为葡萄汁中发现的三主要氮源。这就允许评估从消耗化合物到 proteinogenic 氨基酸的氮再分配模式。我们还研究了被消耗的氨基酸的碳骨架的命运及其对挥发性分子生产的贡献。为了实现这一目标, 在研究中加入了一致的13C 标记亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸和缬氨酸, 这些氨基酸是从艾氏通路的主要中间体中获得的。

总的来说, 我们定量地探讨了酵母如何管理一个复杂的氮资源, 通过重新分配外源氮源, 以满足其合成代谢的要求, 在整个发酵, 而另外消除过剩的碳前体挥发性分子。本文所报道的实验方法可用于研究其他微生物所使用的多种营养源。这似乎是分析遗传背景或环境条件对微生物代谢行为的影响的适当方法。

Protocol

1. 发酵和取样 培养基和发酵的制备注: 所有的发酵都是并行进行的, 使用相同的应变和相同的化学定义的合成介质 (SM, 在表 1中提供的成分), 其中包括铵和氨基酸的混合物作为氮源的15。对于每种发酵, 一个单一的氮化合物只提供一个统一标记的13C 或15N 形式 (100%), 而其余的则保持未标记。对于在实验组中使用的每个标记的氮源 …

Representative Results

图 3提供了工作流的示意图, 该流程图是为了调查在葡萄酒发酵过程中发现的多种氮源的酵母的管理情况而实施的。对于不同的取样点, 生物 parameters–growth 特性、氮耗形态和 proteinogenic 氨基 acids–show 的剖面在发酵中具有很高的重现性 (图 4)。这种一致性根据在一组14独立发酵中生成的数据的组合来验证方法的相关性。 <p c…

Discussion

利用同位素示踪实验, 通过代谢网络定量化化合物, 是了解微生物代谢操作的一种很有前途的方法。这种方法, 虽然成功地应用于一个或两个标记的基板, 目前不能实施研究的代谢各种来源使用多重标记元素同位素 (, 超过两个基板)。事实上, 可用的分析技术能够准确地确定 proteinogenic 氨基酸和分子的标记模式, 仅当使用单一元素的同位素时, 并且可能时用两个元素进行联合标记。因此, 为了?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

我们感谢让-Roch Mouret, 西尔维亚 Dequin 和吉恩-玛丽 Sabalyrolles 为帮助的概念, 机器人辅助发酵系统和马丁 Pradal, 尼古拉布维尔和帕斯卡尔 Brial 为他们的技术支持。这一项目的经费由全国 Ministère 教育、de la 研究等技术提供。

Materials

D-Glucose PanReac 141341.0416
D-Fructose PanReac 142728.0416
DL-Malic acid Sigma Aldrich M0875
Citric acid monohydrate Sigma Aldrich C7129
Potassium phosphate monobasic Sigma Aldrich P5379
Potassium sulfate Sigma Aldrich P0772
Magnesium sulfate heptahydrate Sigma Aldrich 230391
Calcium chloride dihydrate Sigma Aldrich C7902
Sodium chloride Sigma Aldrich S9625
Ammonium chloride Sigma Aldrich A4514
Sodium hydroxide Sigma Aldrich 71690
Manganese sulfate monohydrate Sigma Aldrich M7634
Zinc sulfate heptahydrate Sigma Aldrich Z4750
Copper (II) sulfate pentahydrate Sigma Aldrich C7631
Potassium iodine Sigma Aldrich P4286
Cobalt (II) chloride hexahydrate Sigma Aldrich C3169
Boric acid Sigma Aldrich B7660
Ammonium heptamolybdate Sigma Aldrich A7302
Myo-inositol Sigma Aldrich I5125
D-Pantothenic acid hemicalcium salt Sigma Aldrich 21210
Thiamine, hydrochloride Sigma Aldrich T4625
Nicotinic acid Sigma Aldrich N4126
Pyridoxine Sigma Aldrich P5669
Biotine Sigma Aldrich B4501
Ergostérol Sigma Aldrich E6510
Tween 80 Sigma Aldrich P1754
Ethanol absolute VWR Chemicals 101074F
Iron (III) chloride hexahydrate Sigma Aldrich 236489
L-Aspartic acid Sigma Aldrich A9256
L-Glutamic acid Sigma Aldrich G1251
L-Alanine Sigma Aldrich A7627
L-Arginine Sigma Aldrich A5006
L-Cysteine Sigma Aldrich C7352
L-Glutamine Sigma Aldrich G3126
Glycine Sigma Aldrich G7126
L-Histidine Sigma Aldrich H8000
L-Isoleucine Sigma Aldrich I2752
L-Leucine Sigma Aldrich L8000
L-Lysine Sigma Aldrich L5501
L-Methionine Sigma Aldrich M9625
L-Phenylalanine Sigma Aldrich P2126
L-Proline Sigma Aldrich P0380
L-Serine Sigma Aldrich S4500
L-Threonine Sigma Aldrich T8625
L-Tryptophane Sigma Aldrich T0254
L-Tyrosine Sigma Aldrich T3754
L-Valine Sigma Aldrich V0500
13C5-L-Valine Eurisotop CLM-2249-H-0.25
13C6-L-Leucine Eurisotop CLM-2262-H-0.25
15N-Ammonium chloride Eurisotop NLM-467-1
ALPHA-15N-L-Glutamine Eurisotop NLM-1016-1
U-15N4-L-Arginine Eurisotop NLM-396-PK
Ethyl acetate Sigma Aldrich 270989
Ethyl propanoate Sigma Aldrich 112305
Ethyl 2-methylpropanoate Sigma Aldrich 246085
Ethyl butanoate Sigma Aldrich E15701
Ethyl 2-methylbutanoate Sigma Aldrich 306886
Ethyl 3-methylbutanoate Sigma Aldrich 8.08541.0250
Ethyl hexanoate Sigma Aldrich 148962
Ethyl octanoate Sigma Aldrich W244910
Ethyl decanoate Sigma Aldrich W243205
Ethyl dodecanoate Sigma Aldrich W244112
Ethyl lactate Sigma Aldrich W244015
Diethyl succinate Sigma Aldrich W237701
2-methylpropyl acetate Sigma Aldrich W217514
2-methylbutyl acetate Sigma Aldrich W364401
3-methyl butyl acetate Sigma Aldrich 287725
2-phenylethyl acetate Sigma Aldrich 290580
2-methylpropanol Sigma Aldrich 294829
2-methylbutanol Sigma Aldrich 133051
3-methylbutanol Sigma Aldrich 309435
Hexanol Sigma Aldrich 128570
2-phenylethanol Sigma Aldrich 77861
Propanoic acid Sigma Aldrich 94425
Butanoic acid Sigma Aldrich 19215
2-methylpropanoic acid Sigma Aldrich 58360
2-methylbutanoic acid Sigma Aldrich 193070
3-methylbutanoic acid Sigma Aldrich W310212
Hexanoic acid Sigma Aldrich 153745
Octanoic acid Sigma Aldrich W279900
Decanoic acid Sigma Aldrich W236403
Dodecanoic acid Sigma Aldrich L556
Fermentor 1L Legallais AT1357 Fermenter handmade for fermentation
Disposable vacuum filtration system Dominique Deutscher 029311
Fermenters (250 ml) Legallais AT1352 Fermenter handmade for fermentation
Sterile tubes Sarstedt 62.554.502
Fermentation locks Legallais AT1356 Fermetation locks handmade for fermentation
BactoYeast Extract Becton, Dickinson and Company 212750
BactoPeptone Becton, Dickinson and Company 211677
Incubator shaker Infors HT
Particle Counter Beckman Coulter 6605697 Multisizer 3 Coulter Counter
Centrifuge Jouan GR412
Plate Butler Robotic system Lab Services BV PF0X-MA Automatic instrument
Plate Butler Software Lab Services BV Robot monitor software
RobView In-house developed calculation software
My SQL International source database
Cimarec i Telesystem Multipoint Stirrers Thermo Fisher Scientific 50088009 String Drive 60
BenchBlotter platform rocker Dutscher 60903
Ammonia enzymatic kit R-Biopharm AG 5390
Spectrophotometer cuvettes VWR 634-0678
Spectrophotometer UviLine 9400 Secomam
Amino acids standards physiological – acidics and neutrals Sigma Aldrich A6407
Amino acids standards physiological – basics Sigma Aldrich A6282
Citrate lithium buffers – Ultra ninhydrin reagent Biochrom BC80-6000-06
Sulfosalycilic acid Sigma Aldrich S2130
Norleucine Sigma Aldrich N1398
Biochrom 30 AAA Biochrom
EZChrom Elite Biochrom Instrument control and Data analysis software
Ultropac 8 resin Lithium Biochrom BC80-6002-47 Lithium High Resolution Physiological Column
Filter Millex GV Merck Millipore SLGVX13NL Millex GV 13mm (pore size 0.22 µm)
Membrane filter PALL VWR 514-4157 Supor-450 47mm 0.45µm
Vacuum pump Millivac Mini Millipore XF5423050
Aluminium smooth weigh dish 70mm VWR 611-1380
Precision balance Mettler Specifications AE163
Dimethyl sulfoxid dried Merck 1029310161 (max. 0.025% H2O) SeccoSolv
Combustion oven Legallais
Pierce BCA protein assay kit Interchim UP40840A
Formic acid Fluka 94318
Hydrogen peroxide Sigma Aldrich H1009
Hydrochloric Acid Fuming 37% Emsure Merck 1003171000 Grade ACS,ISO,Reag. Ph Eur
Lithium acetate buffer Biochrom 80-2038-10
Commercial solution of hydrolyzed amino acids Sigma Aldrich AAS18
L-Methionine sulfone Sigma Aldrich M0876
L-Cysteic acid monohydrate Sigma Aldrich 30170
Pyrex glass culture tubes Sigma Aldrich Z653586
Pyridine Acros Organics 131780500 99% Extrapure
Ethyl chloroformate Sigma Aldrich 23131
Dichloromethane Sigma Aldrich 32222
Vials Sigma Aldrich 854165
Microinserts for 1.5ml vials Sigma Aldrich SU860066
GC/MS Agilent Technologies 5890 GC/5973 MS
Chemstation Agilent Technologies Instrument control and data analysis software
Methanol Sigma Aldrich 34860 Chromasolv, for HPLC
Acetonitrile Sigma Aldrich 34998 ChromasolvPlus, for HPLC
N,N-Dimethylformamide dimethyl acetal Sigma Aldrich 394963
BSTFA Sigma Aldrich 33024
DB-17MS column Agilent Technologies 122-4731 30m*0.25mm*0.15µm
Sodium sulfate, anhydrous Sigma Aldrich 238597
Technical nitrogen Air products 14629
Zebron ZB-WAX column Phenomenex 7HG-G007-11 30m*0.25mm*0.25µm
Helium BIP Air products 26699
Glass Pasteur pipettes VWR 612-1702

References

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Cite This Article
Bloem, A., Rollero, S., Seguinot, P., Crépin, L., Perez, M., Picou, C., Camarasa, C. Workflow Based on the Combination of Isotopic Tracer Experiments to Investigate Microbial Metabolism of Multiple Nutrient Sources. J. Vis. Exp. (131), e56393, doi:10.3791/56393 (2018).

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