Workflow gebaseerd op de combinatie van isotopische tracerproeven te onderzoeken van de microbiële metabolisme van meerdere nutriënten bronnen

Summary

Dit protocol beschrijft een experimentele procedure voor het kwantitatief en uitgebreid onderzoek naar het metabolisme van meerdere nutriënten bronnen. Deze werkstroom, gebaseerd op een combinatie van isotopische tracerproeven en een analytische procedure, kan het lot van verbruikte voedingsstoffen en de metabole oorsprong van moleculen synthetized door micro-organismen te bepalen.

Abstract

Studies op het gebied van de microbiologie, is afhankelijk van de uitvoering van een breed scala aan methoden. In het bijzonder bijdraagt de ontwikkeling van geschikte methoden aanzienlijk aan het verstrekken van uitgebreide kennis van het metabolisme van micro-organismen groeien in chemisch welbepaalde media met unieke stikstof en koolstof bronnen. Daarentegen blijft het beheer via metabolisme van meerdere nutriënten bronnen, ondanks hun grote aanwezigheid in natuurlijke of industriële omgevingen, vrijwel onontdekte. Deze situatie is voornamelijk te wijten aan het gebrek aan geschikte methoden, die onderzoek belemmert.

Wij rapporteren een experimentele strategie kwantitatief en grondig verkennen hoe metabolisme werkt als een nutriënt wordt geleverd als een mengsel van verschillende moleculen, dat wil zeggen, een complexe bron. Hier beschrijven we de toepassing ervan voor de beoordeling van het partitioneren van meerdere bronnen van stikstof via het metabolische netwerk van gist. De werkstroom combineert informatie verkregen tijdens stabiele isotoop tracerproeven met geselecteerde ¹³C- of ¹⁵N-geëtiketteerden substraten. Het eerste bestaat uit parallel en reproduceerbare fermentatie in hetzelfde medium, waarin een mengsel van N-bevattende moleculen; een geselecteerde stikstofbron heet echter elke keer. Een combinatie van analytische procedures (HPLC, GC-MS) wordt uitgevoerd om te beoordelen van de labeling patronen van gerichte verbindingen en te kwantificeren van de consumptie en het herstel van substraten in andere metabolieten. Een geïntegreerde analyse van de volledige dataset geeft een overzicht van het lot van verbruikte substraten binnen cellen. Deze aanpak vereist een nauwkeurige protocol voor het verzamelen van monsters – vergemakkelijkt door een robot-assisted systeem voor online bewaking van fermentatie- en de verwezenlijking van talrijke tijdrovende analyses. Ondanks deze beperkingen toegestaan het begrip, voor de eerste keer, het partitioneren van meerdere bronnen van stikstof tijdens het metabolische netwerk van gist. Wij toegelicht van de herverdeling van stikstof uit meer overvloedige bronnen naar andere N-verbindingen en de metabole oorsprong van vluchtige moleculen en Proteïnogeen aminozuren bepaald.

Introduction

Begrip is hoe microbiële metabolisme werkt een belangrijke kwestie voor het ontwerp van efficiënte strategieën ter verbetering van fermentatieprocessen en het moduleren van de productie van fermenterende verbindingen. Ontwikkelingen in de genomica en functionele genomica in deze laatste twee decennia in belangrijke mate bijgedragen tot het verruimen van de kennis van de topologie van metabole netwerken in vele micro-organismen. Toegang tot deze informatie heeft geleid tot de ontwikkeling van onderwijsleermethoden die tot doel voor een uitgebreid overzicht van cellulaire functie^{1 hebben}. Deze methodologieën is vaak afhankelijk van een model-gebaseerde interpretatie van meetbare parameters. Deze experimentele gegevens omvatten, aan de ene kant metaboliet opname en productie, en aan de andere kant, kwantitatieve intracellulaire informatie die wordt verkregen uit de isotoop tracer experimenten. Deze gegevens, verschaffen essentiële informatie voor de aftrek van de in-vivo -activiteit van verschillende routes in een gedefinieerde metabolische netwerk^2,3,4. Op dit moment de beschikbare analytische technieken alleen inschakelen voor de nauwkeurige detectie van labeling patronen van moleculen bij het gebruik van een isotoop van één element en eventueel wanneer mede labelen met twee isotopische elementen. Bovendien onder de meeste omstandigheden van de groei bestaat de koolstofbron alleen uit één of twee-verbindingen. Bijgevolg waren benaderingen gebaseerd op de C-isotopische traceurs ¹³uit koolstof ondergronden breed en met succes toegepast voor de ontwikkeling van een compleet begrip van de koolstof metabolische netwerk operaties^{5,6,7 ,8}.

Daarentegen in veel natuurlijke en industriële omgevingen, de beschikbare stikstof resource dat microbiële groei ondersteunt vaak bestaat uit een breed scala van moleculen. Bijvoorbeeld, tijdens de wijn of bier gisting, wordt stikstof geleverd als een mengsel van 18 aminozuren en ammonium bij variabele concentraties⁹. Deze array van N-verbindingen die toegankelijk voor anabolism zijn maakt deze complexe media voorwaarden sterk verschilt van de gangbare waarden voor fysiologische studies, zoals de laatste worden bereikt met behulp van een unieke bron van stikstof, meestal ammonium.

Over het geheel genomen geïnternaliseerd stikstof verbindingen kunnen direct worden opgenomen in eiwitten of catabolized. De structuur van het netwerk van stikstof metabolisme in vele micro-organismen, met inbegrip van de gist Saccharomyces cerevisiae, is zeer complex overeenkomstig de diversiteit van substraten. Schematisch, is dit systeem gebaseerd op de combinatie van de centrale kern van stikstof metabolisme die de interconversion van glutamine, glutamaat en α-ketoglutarate^10,11, met transaminases en deaminases katalyseert. Via dit netwerk, amine groepen uit ammonium of andere aminozuren worden verzameld en α-keto zuren uitgebracht. Deze tussenproducten zijn ook synthetized via centrale koolstof metabolisme (CCM)^12,13. Dit groot aantal vertakte reacties en tussenproducten, betrokken bij zowel het katabolisme van exogene stikstof bronnen en het anabolisme van Proteïnogeen aminozuren, vervult de anabole eisen van de cellen. De activiteit via deze verschillende met elkaar verbonden routes resulteert ook in de uitscheiding van metabolieten. In het bijzonder, kunnen α-keto zuren worden omgeleid via de Ehrlich pathway hogere alcoholen en hun acetaat ester derivaten¹⁴, die essentiële bijdragen aan de zintuiglijke profielen van producten te produceren. Vervolgens, speelt de werking van stikstof metabolisme een belangrijke rol in de productie van biomassa en de vorming van vluchtige moleculen (aroma).

De reacties, enzymen en genen die betrokken zijn in stikstof metabolisme zijn uitvoerig beschreven in de literatuur. Echter heeft de kwestie van de verdeling van meerdere bronnen van stikstof tijdens een metabolische netwerk nog niet aangepakt. Er zijn twee belangrijke redenen die dit gebrek aan informatie verklaren. Ten eerste, gezien de belangrijke complexiteit van het netwerk van stikstof metabolisme, een grote hoeveelheid van de kwantitatieve gegevens is vereist voor een compleet begrip van de werking ervan die niet beschikbaar was tot nu toe. Ten tweede, vele experimentele beperkingen en beperkingen van analytische methoden voorkomen de uitvoeringvan benaderingen die voorheen werden gebruikt voor de opheldering van CCM functie.

Om deze problemen, kozen we voor een systeem-niveau-aanpak die is gebaseerd op het combineren van gegevens uit een groot aantal isotopische tracerproeven te ontwikkelen. De workflow omvat:
-Een set van fermentatie uitgevoerd onder de dezelfde milieu-omstandigheden, terwijl een andere geselecteerde nutriënten bron (substraat) telkens heet.
-Een combinatie van analytische procedures (HPLC, GC-MS) voor een nauwkeurige bepaling, in de verschillende stadia van de gisting, van de resterende concentratie van gelabelde substraat en de concentratie en de isotopische verrijking van stoffen die zijn afgeleid van het katabolisme van het gelabelde molecuul, met inbegrip van afgeleide biomassa.
-Een berekening van het saldo van het massale en isotopische voor elk verbruikt gelabelde molecuul en een verder geïntegreerde analyse van de dataset te verkrijgen van een globaal overzicht van het beheer van meerdere nutriënten bronnen door micro-organismen door middel van de bepaling van flux ratio ‘s .

Voor de toepassing van deze methode, moet aandacht worden besteed aan het reproduceerbare gedrag van de stam/micro-organisme tussen culturen. Monsters uit verschillende culturen moeten bovendien worden genomen tijdens de dezelfde welomschreven gisting vooruitgang. In de experimentele werk die zijn gerapporteerd in dit manuscript, wordt een robot-assisted-systeem gebruikt voor online bewaking van fermentatie ter verantwoording voor deze beperkingen.

Bovendien is het essentieel om een reeks van gelabelde substraten (samengestelde aard en positie van het label) die geschikt is om het wetenschappelijke probleem van de studie te kiezen. Hier, ¹⁵N-geëtiketteerden ammonium, glutamine en arginine uitgekozen als de drie grote stikstof bronnen gevonden in druivensap. Hierdoor konden beoordelen van het patroon van stikstof herverdeling van verbruikte verbindingen naar de Proteïnogeen aminozuren. Wij ook gericht op het onderzoeken van het lot van de ruggengraat van de koolstof van de verbruikte aminozuren en hun bijdrage aan de productie van vluchtige moleculen. Om te voldoen aan deze doelstelling, uniform ¹³C-gelabeld leucine, werden isoleucine, threonine en valine opgenomen in de studie als aminozuren die zijn afgeleid van grote tussenproducten van het leertraject Ehrlich.

Over het geheel genomen verkenden we kwantitatief hoe gist beheert een complexe stikstof resource door herverdeling van exogene stikstof bronnen om te voldoen aan haar anabole eisen hele gisting tijdens het bovendien het verwijderen van de overdaad aan koolstof precursoren als vluchtige moleculen. De experimentele procedure gemeld in dit document kan worden toegepast om te onderzoeken van andere meerdere nutriënten bronnen gebruikt door een andere micro-organismen. Het lijkt een adequate aanpak voor de analyse van de gevolgen van genetische achtergrond of omgevingsfactoren op de metabolische gedrag van micro-organismen.

Protocol

1. gisting en bemonstering Voorbereiding van de media en fermentorenOpmerking: Alle de fermentatie zijn uitgevoerd in parallel, met behulp van dezelfde stam en hetzelfde chemisch gedefinieerde synthetische medium (SM, samenstelling in tabel 1gegeven), waarin een mengsel van ammonium en aminozuren zoals stikstof15 bronnen. Voor elke gisting, een enkele stikstof samenstelling vindt u uitsluitend in een uniform gelabelde 13C of 15…

Representative Results

Figuur 3 geeft een schematisch diagram van de workflow die werd uitgevoerd voor het onderzoek naar het beheer door de gist van de meerdere bronnen van stikstof die zijn gevonden tijdens de wijn gisting.Voor verschillende punten van de bemonstering, de kenmerken van de biologische parameters – groei, stikstof consumptiepatronen en het profiel van Proteïnogeen aminozuren – Toon een hoge reproduceerbaarheid onder fermentatie (Figuur…

Discussion

Kwantificeren van compartimentering van de verbindingen via metabole netwerken met isotopische tracerproeven is een veelbelovende aanpak voor het begrip van de werking van het microbiële metabolisme. Deze methodiek, niet kan terwijl succesvol toegepast met één of twee gelabelde substraten, momenteel worden uitgevoerd om te studeren metabolisme van verschillende bronnen met behulp van meerdere gelabelde elemental isotopen (dat wil zeggen, meer dan twee substraten). Inderdaad, de beschikbare analytische technie…

Materials

D-Glucose	PanReac	141341.0416
D-Fructose	PanReac	142728.0416
DL-Malic acid	Sigma Aldrich	M0875
Citric acid monohydrate	Sigma Aldrich	C7129
Potassium phosphate monobasic	Sigma Aldrich	P5379
Potassium sulfate	Sigma Aldrich	P0772
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma Aldrich	230391
Calcium chloride dihydrate	Sigma Aldrich	C7902
Sodium chloride	Sigma Aldrich	S9625
Ammonium chloride	Sigma Aldrich	A4514
Sodium hydroxide	Sigma Aldrich	71690
Manganese sulfate monohydrate	Sigma Aldrich	M7634
Zinc sulfate heptahydrate	Sigma Aldrich	Z4750
Copper (II) sulfate pentahydrate	Sigma Aldrich	C7631
Potassium iodine	Sigma Aldrich	P4286
Cobalt (II) chloride hexahydrate	Sigma Aldrich	C3169
Boric acid	Sigma Aldrich	B7660
Ammonium heptamolybdate	Sigma Aldrich	A7302
Myo-inositol	Sigma Aldrich	I5125
D-Pantothenic acid hemicalcium salt	Sigma Aldrich	21210
Thiamine, hydrochloride	Sigma Aldrich	T4625
Nicotinic acid	Sigma Aldrich	N4126
Pyridoxine	Sigma Aldrich	P5669
Biotine	Sigma Aldrich	B4501
Ergostérol	Sigma Aldrich	E6510
Tween 80	Sigma Aldrich	P1754
Ethanol absolute	VWR Chemicals	101074F
Iron (III) chloride hexahydrate	Sigma Aldrich	236489
L-Aspartic acid	Sigma Aldrich	A9256
L-Glutamic acid	Sigma Aldrich	G1251
L-Alanine	Sigma Aldrich	A7627
L-Arginine	Sigma Aldrich	A5006
L-Cysteine	Sigma Aldrich	C7352
L-Glutamine	Sigma Aldrich	G3126
Glycine	Sigma Aldrich	G7126
L-Histidine	Sigma Aldrich	H8000
L-Isoleucine	Sigma Aldrich	I2752
L-Leucine	Sigma Aldrich	L8000
L-Lysine	Sigma Aldrich	L5501
L-Methionine	Sigma Aldrich	M9625
L-Phenylalanine	Sigma Aldrich	P2126
L-Proline	Sigma Aldrich	P0380
L-Serine	Sigma Aldrich	S4500
L-Threonine	Sigma Aldrich	T8625
L-Tryptophane	Sigma Aldrich	T0254
L-Tyrosine	Sigma Aldrich	T3754
L-Valine	Sigma Aldrich	V0500
13C5-L-Valine	Eurisotop	CLM-2249-H-0.25
13C6-L-Leucine	Eurisotop	CLM-2262-H-0.25
15N-Ammonium chloride	Eurisotop	NLM-467-1
ALPHA-15N-L-Glutamine	Eurisotop	NLM-1016-1
U-15N4-L-Arginine	Eurisotop	NLM-396-PK
Ethyl acetate	Sigma Aldrich	270989
Ethyl propanoate	Sigma Aldrich	112305
Ethyl 2-methylpropanoate	Sigma Aldrich	246085
Ethyl butanoate	Sigma Aldrich	E15701
Ethyl 2-methylbutanoate	Sigma Aldrich	306886
Ethyl 3-methylbutanoate	Sigma Aldrich	8.08541.0250
Ethyl hexanoate	Sigma Aldrich	148962
Ethyl octanoate	Sigma Aldrich	W244910
Ethyl decanoate	Sigma Aldrich	W243205
Ethyl dodecanoate	Sigma Aldrich	W244112
Ethyl lactate	Sigma Aldrich	W244015
Diethyl succinate	Sigma Aldrich	W237701
2-methylpropyl acetate	Sigma Aldrich	W217514
2-methylbutyl acetate	Sigma Aldrich	W364401
3-methyl butyl acetate	Sigma Aldrich	287725
2-phenylethyl acetate	Sigma Aldrich	290580
2-methylpropanol	Sigma Aldrich	294829
2-methylbutanol	Sigma Aldrich	133051
3-methylbutanol	Sigma Aldrich	309435
Hexanol	Sigma Aldrich	128570
2-phenylethanol	Sigma Aldrich	77861
Propanoic acid	Sigma Aldrich	94425
Butanoic acid	Sigma Aldrich	19215
2-methylpropanoic acid	Sigma Aldrich	58360
2-methylbutanoic acid	Sigma Aldrich	193070
3-methylbutanoic acid	Sigma Aldrich	W310212
Hexanoic acid	Sigma Aldrich	153745
Octanoic acid	Sigma Aldrich	W279900
Decanoic acid	Sigma Aldrich	W236403
Dodecanoic acid	Sigma Aldrich	L556
Fermentor 1L	Legallais	AT1357	Fermenter handmade for fermentation
Disposable vacuum filtration system	Dominique Deutscher	029311
Fermenters (250 ml)	Legallais	AT1352	Fermenter handmade for fermentation
Sterile tubes	Sarstedt	62.554.502
Fermentation locks	Legallais	AT1356	Fermetation locks handmade for fermentation
BactoYeast Extract	Becton, Dickinson and Company	212750
BactoPeptone	Becton, Dickinson and Company	211677
Incubator shaker	Infors HT
Particle Counter	Beckman Coulter	6605697	Multisizer 3 Coulter Counter
Centrifuge	Jouan		GR412
Plate Butler Robotic system	Lab Services BV	PF0X-MA	Automatic instrument
Plate Butler Software	Lab Services BV		Robot monitor software
RobView			In-house developed calculation software
My SQL			International source database
Cimarec i Telesystem Multipoint Stirrers	Thermo Fisher Scientific	50088009	String Drive 60
BenchBlotter platform rocker	Dutscher	60903
Ammonia enzymatic kit	R-Biopharm AG	5390
Spectrophotometer cuvettes	VWR	634-0678
Spectrophotometer UviLine 9400	Secomam
Amino acids standards physiological – acidics and neutrals	Sigma Aldrich	A6407
Amino acids standards physiological – basics	Sigma Aldrich	A6282
Citrate lithium buffers – Ultra ninhydrin reagent	Biochrom	BC80-6000-06
Sulfosalycilic acid	Sigma Aldrich	S2130
Norleucine	Sigma Aldrich	N1398
Biochrom 30 AAA	Biochrom
EZChrom Elite	Biochrom		Instrument control and Data analysis software
Ultropac 8 resin Lithium	Biochrom	BC80-6002-47	Lithium High Resolution Physiological Column
Filter Millex GV	Merck Millipore	SLGVX13NL	Millex GV 13mm (pore size 0.22 µm)
Membrane filter PALL	VWR	514-4157	Supor-450 47mm 0.45µm
Vacuum pump Millivac Mini	Millipore	XF5423050
Aluminium smooth weigh dish 70mm	VWR	611-1380
Precision balance	Mettler		Specifications AE163
Dimethyl sulfoxid dried	Merck	1029310161	(max. 0.025% H2O) SeccoSolv
Combustion oven	Legallais
Pierce BCA protein assay kit	Interchim	UP40840A
Formic acid	Fluka	94318
Hydrogen peroxide	Sigma Aldrich	H1009
Hydrochloric Acid Fuming 37% Emsure	Merck	1003171000	Grade ACS,ISO,Reag. Ph Eur
Lithium acetate buffer	Biochrom	80-2038-10
Commercial solution of hydrolyzed amino acids	Sigma Aldrich	AAS18
L-Methionine sulfone	Sigma Aldrich	M0876
L-Cysteic acid monohydrate	Sigma Aldrich	30170
Pyrex glass culture tubes	Sigma Aldrich	Z653586
Pyridine	Acros Organics	131780500	99% Extrapure
Ethyl chloroformate	Sigma Aldrich	23131
Dichloromethane	Sigma Aldrich	32222
Vials	Sigma Aldrich	854165
Microinserts for 1.5ml vials	Sigma Aldrich	SU860066
GC/MS	Agilent Technologies	5890 GC/5973 MS
Chemstation	Agilent Technologies		Instrument control and data analysis software
Methanol	Sigma Aldrich	34860	Chromasolv, for HPLC
Acetonitrile	Sigma Aldrich	34998	ChromasolvPlus, for HPLC
N,N-Dimethylformamide dimethyl acetal	Sigma Aldrich	394963
BSTFA	Sigma Aldrich	33024
DB-17MS column	Agilent Technologies	122-4731	30m*0.25mm*0.15µm
Sodium sulfate, anhydrous	Sigma Aldrich	238597
Technical nitrogen	Air products	14629
Zebron ZB-WAX column	Phenomenex	7HG-G007-11	30m*0.25mm*0.25µm
Helium BIP	Air products	26699
Glass Pasteur pipettes	VWR	612-1702