Summary

Workflow gebaseerd op de combinatie van isotopische tracerproeven te onderzoeken van de microbiële metabolisme van meerdere nutriënten bronnen

Published: January 22, 2018
doi:

Summary

Dit protocol beschrijft een experimentele procedure voor het kwantitatief en uitgebreid onderzoek naar het metabolisme van meerdere nutriënten bronnen. Deze werkstroom, gebaseerd op een combinatie van isotopische tracerproeven en een analytische procedure, kan het lot van verbruikte voedingsstoffen en de metabole oorsprong van moleculen synthetized door micro-organismen te bepalen.

Abstract

Studies op het gebied van de microbiologie, is afhankelijk van de uitvoering van een breed scala aan methoden. In het bijzonder bijdraagt de ontwikkeling van geschikte methoden aanzienlijk aan het verstrekken van uitgebreide kennis van het metabolisme van micro-organismen groeien in chemisch welbepaalde media met unieke stikstof en koolstof bronnen. Daarentegen blijft het beheer via metabolisme van meerdere nutriënten bronnen, ondanks hun grote aanwezigheid in natuurlijke of industriële omgevingen, vrijwel onontdekte. Deze situatie is voornamelijk te wijten aan het gebrek aan geschikte methoden, die onderzoek belemmert.

Wij rapporteren een experimentele strategie kwantitatief en grondig verkennen hoe metabolisme werkt als een nutriënt wordt geleverd als een mengsel van verschillende moleculen, dat wil zeggen, een complexe bron. Hier beschrijven we de toepassing ervan voor de beoordeling van het partitioneren van meerdere bronnen van stikstof via het metabolische netwerk van gist. De werkstroom combineert informatie verkregen tijdens stabiele isotoop tracerproeven met geselecteerde 13C- of 15N-geëtiketteerden substraten. Het eerste bestaat uit parallel en reproduceerbare fermentatie in hetzelfde medium, waarin een mengsel van N-bevattende moleculen; een geselecteerde stikstofbron heet echter elke keer. Een combinatie van analytische procedures (HPLC, GC-MS) wordt uitgevoerd om te beoordelen van de labeling patronen van gerichte verbindingen en te kwantificeren van de consumptie en het herstel van substraten in andere metabolieten. Een geïntegreerde analyse van de volledige dataset geeft een overzicht van het lot van verbruikte substraten binnen cellen. Deze aanpak vereist een nauwkeurige protocol voor het verzamelen van monsters – vergemakkelijkt door een robot-assisted systeem voor online bewaking van fermentatie- en de verwezenlijking van talrijke tijdrovende analyses. Ondanks deze beperkingen toegestaan het begrip, voor de eerste keer, het partitioneren van meerdere bronnen van stikstof tijdens het metabolische netwerk van gist. Wij toegelicht van de herverdeling van stikstof uit meer overvloedige bronnen naar andere N-verbindingen en de metabole oorsprong van vluchtige moleculen en Proteïnogeen aminozuren bepaald.

Introduction

Begrip is hoe microbiële metabolisme werkt een belangrijke kwestie voor het ontwerp van efficiënte strategieën ter verbetering van fermentatieprocessen en het moduleren van de productie van fermenterende verbindingen. Ontwikkelingen in de genomica en functionele genomica in deze laatste twee decennia in belangrijke mate bijgedragen tot het verruimen van de kennis van de topologie van metabole netwerken in vele micro-organismen. Toegang tot deze informatie heeft geleid tot de ontwikkeling van onderwijsleermethoden die tot doel voor een uitgebreid overzicht van cellulaire functie1 hebben. Deze methodologieën is vaak afhankelijk van een model-gebaseerde interpretatie van meetbare parameters. Deze experimentele gegevens omvatten, aan de ene kant metaboliet opname en productie, en aan de andere kant, kwantitatieve intracellulaire informatie die wordt verkregen uit de isotoop tracer experimenten. Deze gegevens, verschaffen essentiële informatie voor de aftrek van de in-vivo -activiteit van verschillende routes in een gedefinieerde metabolische netwerk2,3,4. Op dit moment de beschikbare analytische technieken alleen inschakelen voor de nauwkeurige detectie van labeling patronen van moleculen bij het gebruik van een isotoop van één element en eventueel wanneer mede labelen met twee isotopische elementen. Bovendien onder de meeste omstandigheden van de groei bestaat de koolstofbron alleen uit één of twee-verbindingen. Bijgevolg waren benaderingen gebaseerd op de C-isotopische traceurs 13uit koolstof ondergronden breed en met succes toegepast voor de ontwikkeling van een compleet begrip van de koolstof metabolische netwerk operaties5,6,7 ,8.

Daarentegen in veel natuurlijke en industriële omgevingen, de beschikbare stikstof resource dat microbiële groei ondersteunt vaak bestaat uit een breed scala van moleculen. Bijvoorbeeld, tijdens de wijn of bier gisting, wordt stikstof geleverd als een mengsel van 18 aminozuren en ammonium bij variabele concentraties9. Deze array van N-verbindingen die toegankelijk voor anabolism zijn maakt deze complexe media voorwaarden sterk verschilt van de gangbare waarden voor fysiologische studies, zoals de laatste worden bereikt met behulp van een unieke bron van stikstof, meestal ammonium.

Over het geheel genomen geïnternaliseerd stikstof verbindingen kunnen direct worden opgenomen in eiwitten of catabolized. De structuur van het netwerk van stikstof metabolisme in vele micro-organismen, met inbegrip van de gist Saccharomyces cerevisiae, is zeer complex overeenkomstig de diversiteit van substraten. Schematisch, is dit systeem gebaseerd op de combinatie van de centrale kern van stikstof metabolisme die de interconversion van glutamine, glutamaat en α-ketoglutarate10,11, met transaminases en deaminases katalyseert. Via dit netwerk, amine groepen uit ammonium of andere aminozuren worden verzameld en α-keto zuren uitgebracht. Deze tussenproducten zijn ook synthetized via centrale koolstof metabolisme (CCM)12,13. Dit groot aantal vertakte reacties en tussenproducten, betrokken bij zowel het katabolisme van exogene stikstof bronnen en het anabolisme van Proteïnogeen aminozuren, vervult de anabole eisen van de cellen. De activiteit via deze verschillende met elkaar verbonden routes resulteert ook in de uitscheiding van metabolieten. In het bijzonder, kunnen α-keto zuren worden omgeleid via de Ehrlich pathway hogere alcoholen en hun acetaat ester derivaten14, die essentiële bijdragen aan de zintuiglijke profielen van producten te produceren. Vervolgens, speelt de werking van stikstof metabolisme een belangrijke rol in de productie van biomassa en de vorming van vluchtige moleculen (aroma).

De reacties, enzymen en genen die betrokken zijn in stikstof metabolisme zijn uitvoerig beschreven in de literatuur. Echter heeft de kwestie van de verdeling van meerdere bronnen van stikstof tijdens een metabolische netwerk nog niet aangepakt. Er zijn twee belangrijke redenen die dit gebrek aan informatie verklaren. Ten eerste, gezien de belangrijke complexiteit van het netwerk van stikstof metabolisme, een grote hoeveelheid van de kwantitatieve gegevens is vereist voor een compleet begrip van de werking ervan die niet beschikbaar was tot nu toe. Ten tweede, vele experimentele beperkingen en beperkingen van analytische methoden voorkomen de uitvoeringvan benaderingen die voorheen werden gebruikt voor de opheldering van CCM functie.

Om deze problemen, kozen we voor een systeem-niveau-aanpak die is gebaseerd op het combineren van gegevens uit een groot aantal isotopische tracerproeven te ontwikkelen. De workflow omvat:
-Een set van fermentatie uitgevoerd onder de dezelfde milieu-omstandigheden, terwijl een andere geselecteerde nutriënten bron (substraat) telkens heet.
-Een combinatie van analytische procedures (HPLC, GC-MS) voor een nauwkeurige bepaling, in de verschillende stadia van de gisting, van de resterende concentratie van gelabelde substraat en de concentratie en de isotopische verrijking van stoffen die zijn afgeleid van het katabolisme van het gelabelde molecuul, met inbegrip van afgeleide biomassa.
-Een berekening van het saldo van het massale en isotopische voor elk verbruikt gelabelde molecuul en een verder geïntegreerde analyse van de dataset te verkrijgen van een globaal overzicht van het beheer van meerdere nutriënten bronnen door micro-organismen door middel van de bepaling van flux ratio ‘s .

Voor de toepassing van deze methode, moet aandacht worden besteed aan het reproduceerbare gedrag van de stam/micro-organisme tussen culturen. Monsters uit verschillende culturen moeten bovendien worden genomen tijdens de dezelfde welomschreven gisting vooruitgang. In de experimentele werk die zijn gerapporteerd in dit manuscript, wordt een robot-assisted-systeem gebruikt voor online bewaking van fermentatie ter verantwoording voor deze beperkingen.

Bovendien is het essentieel om een reeks van gelabelde substraten (samengestelde aard en positie van het label) die geschikt is om het wetenschappelijke probleem van de studie te kiezen. Hier, 15N-geëtiketteerden ammonium, glutamine en arginine uitgekozen als de drie grote stikstof bronnen gevonden in druivensap. Hierdoor konden beoordelen van het patroon van stikstof herverdeling van verbruikte verbindingen naar de Proteïnogeen aminozuren. Wij ook gericht op het onderzoeken van het lot van de ruggengraat van de koolstof van de verbruikte aminozuren en hun bijdrage aan de productie van vluchtige moleculen. Om te voldoen aan deze doelstelling, uniform 13C-gelabeld leucine, werden isoleucine, threonine en valine opgenomen in de studie als aminozuren die zijn afgeleid van grote tussenproducten van het leertraject Ehrlich.

Over het geheel genomen verkenden we kwantitatief hoe gist beheert een complexe stikstof resource door herverdeling van exogene stikstof bronnen om te voldoen aan haar anabole eisen hele gisting tijdens het bovendien het verwijderen van de overdaad aan koolstof precursoren als vluchtige moleculen. De experimentele procedure gemeld in dit document kan worden toegepast om te onderzoeken van andere meerdere nutriënten bronnen gebruikt door een andere micro-organismen. Het lijkt een adequate aanpak voor de analyse van de gevolgen van genetische achtergrond of omgevingsfactoren op de metabolische gedrag van micro-organismen.

Protocol

1. gisting en bemonstering Voorbereiding van de media en fermentorenOpmerking: Alle de fermentatie zijn uitgevoerd in parallel, met behulp van dezelfde stam en hetzelfde chemisch gedefinieerde synthetische medium (SM, samenstelling in tabel 1gegeven), waarin een mengsel van ammonium en aminozuren zoals stikstof15 bronnen. Voor elke gisting, een enkele stikstof samenstelling vindt u uitsluitend in een uniform gelabelde 13C of 15…

Representative Results

Figuur 3 geeft een schematisch diagram van de workflow die werd uitgevoerd voor het onderzoek naar het beheer door de gist van de meerdere bronnen van stikstof die zijn gevonden tijdens de wijn gisting.Voor verschillende punten van de bemonstering, de kenmerken van de biologische parameters – groei, stikstof consumptiepatronen en het profiel van Proteïnogeen aminozuren – Toon een hoge reproduceerbaarheid onder fermentatie (Figuur…

Discussion

Kwantificeren van compartimentering van de verbindingen via metabole netwerken met isotopische tracerproeven is een veelbelovende aanpak voor het begrip van de werking van het microbiële metabolisme. Deze methodiek, niet kan terwijl succesvol toegepast met één of twee gelabelde substraten, momenteel worden uitgevoerd om te studeren metabolisme van verschillende bronnen met behulp van meerdere gelabelde elemental isotopen (dat wil zeggen, meer dan twee substraten). Inderdaad, de beschikbare analytische technie…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wij danken Jean-Roch Mouret, Sylvie Dequin en Jean-Marie Sabalyrolles bij te dragen tot de opvatting van het systeem van de Robot-assisted gisting en Martine Pradal, Nicolas Bouvier en Pascale Brial voor hun technische ondersteuning. Financiering voor dit project werd verstrekt door de Ministère de l’Education Nationale, de la Recherche et de la Technologie.

Materials

D-Glucose PanReac 141341.0416
D-Fructose PanReac 142728.0416
DL-Malic acid Sigma Aldrich M0875
Citric acid monohydrate Sigma Aldrich C7129
Potassium phosphate monobasic Sigma Aldrich P5379
Potassium sulfate Sigma Aldrich P0772
Magnesium sulfate heptahydrate Sigma Aldrich 230391
Calcium chloride dihydrate Sigma Aldrich C7902
Sodium chloride Sigma Aldrich S9625
Ammonium chloride Sigma Aldrich A4514
Sodium hydroxide Sigma Aldrich 71690
Manganese sulfate monohydrate Sigma Aldrich M7634
Zinc sulfate heptahydrate Sigma Aldrich Z4750
Copper (II) sulfate pentahydrate Sigma Aldrich C7631
Potassium iodine Sigma Aldrich P4286
Cobalt (II) chloride hexahydrate Sigma Aldrich C3169
Boric acid Sigma Aldrich B7660
Ammonium heptamolybdate Sigma Aldrich A7302
Myo-inositol Sigma Aldrich I5125
D-Pantothenic acid hemicalcium salt Sigma Aldrich 21210
Thiamine, hydrochloride Sigma Aldrich T4625
Nicotinic acid Sigma Aldrich N4126
Pyridoxine Sigma Aldrich P5669
Biotine Sigma Aldrich B4501
Ergostérol Sigma Aldrich E6510
Tween 80 Sigma Aldrich P1754
Ethanol absolute VWR Chemicals 101074F
Iron (III) chloride hexahydrate Sigma Aldrich 236489
L-Aspartic acid Sigma Aldrich A9256
L-Glutamic acid Sigma Aldrich G1251
L-Alanine Sigma Aldrich A7627
L-Arginine Sigma Aldrich A5006
L-Cysteine Sigma Aldrich C7352
L-Glutamine Sigma Aldrich G3126
Glycine Sigma Aldrich G7126
L-Histidine Sigma Aldrich H8000
L-Isoleucine Sigma Aldrich I2752
L-Leucine Sigma Aldrich L8000
L-Lysine Sigma Aldrich L5501
L-Methionine Sigma Aldrich M9625
L-Phenylalanine Sigma Aldrich P2126
L-Proline Sigma Aldrich P0380
L-Serine Sigma Aldrich S4500
L-Threonine Sigma Aldrich T8625
L-Tryptophane Sigma Aldrich T0254
L-Tyrosine Sigma Aldrich T3754
L-Valine Sigma Aldrich V0500
13C5-L-Valine Eurisotop CLM-2249-H-0.25
13C6-L-Leucine Eurisotop CLM-2262-H-0.25
15N-Ammonium chloride Eurisotop NLM-467-1
ALPHA-15N-L-Glutamine Eurisotop NLM-1016-1
U-15N4-L-Arginine Eurisotop NLM-396-PK
Ethyl acetate Sigma Aldrich 270989
Ethyl propanoate Sigma Aldrich 112305
Ethyl 2-methylpropanoate Sigma Aldrich 246085
Ethyl butanoate Sigma Aldrich E15701
Ethyl 2-methylbutanoate Sigma Aldrich 306886
Ethyl 3-methylbutanoate Sigma Aldrich 8.08541.0250
Ethyl hexanoate Sigma Aldrich 148962
Ethyl octanoate Sigma Aldrich W244910
Ethyl decanoate Sigma Aldrich W243205
Ethyl dodecanoate Sigma Aldrich W244112
Ethyl lactate Sigma Aldrich W244015
Diethyl succinate Sigma Aldrich W237701
2-methylpropyl acetate Sigma Aldrich W217514
2-methylbutyl acetate Sigma Aldrich W364401
3-methyl butyl acetate Sigma Aldrich 287725
2-phenylethyl acetate Sigma Aldrich 290580
2-methylpropanol Sigma Aldrich 294829
2-methylbutanol Sigma Aldrich 133051
3-methylbutanol Sigma Aldrich 309435
Hexanol Sigma Aldrich 128570
2-phenylethanol Sigma Aldrich 77861
Propanoic acid Sigma Aldrich 94425
Butanoic acid Sigma Aldrich 19215
2-methylpropanoic acid Sigma Aldrich 58360
2-methylbutanoic acid Sigma Aldrich 193070
3-methylbutanoic acid Sigma Aldrich W310212
Hexanoic acid Sigma Aldrich 153745
Octanoic acid Sigma Aldrich W279900
Decanoic acid Sigma Aldrich W236403
Dodecanoic acid Sigma Aldrich L556
Fermentor 1L Legallais AT1357 Fermenter handmade for fermentation
Disposable vacuum filtration system Dominique Deutscher 029311
Fermenters (250 ml) Legallais AT1352 Fermenter handmade for fermentation
Sterile tubes Sarstedt 62.554.502
Fermentation locks Legallais AT1356 Fermetation locks handmade for fermentation
BactoYeast Extract Becton, Dickinson and Company 212750
BactoPeptone Becton, Dickinson and Company 211677
Incubator shaker Infors HT
Particle Counter Beckman Coulter 6605697 Multisizer 3 Coulter Counter
Centrifuge Jouan GR412
Plate Butler Robotic system Lab Services BV PF0X-MA Automatic instrument
Plate Butler Software Lab Services BV Robot monitor software
RobView In-house developed calculation software
My SQL International source database
Cimarec i Telesystem Multipoint Stirrers Thermo Fisher Scientific 50088009 String Drive 60
BenchBlotter platform rocker Dutscher 60903
Ammonia enzymatic kit R-Biopharm AG 5390
Spectrophotometer cuvettes VWR 634-0678
Spectrophotometer UviLine 9400 Secomam
Amino acids standards physiological – acidics and neutrals Sigma Aldrich A6407
Amino acids standards physiological – basics Sigma Aldrich A6282
Citrate lithium buffers – Ultra ninhydrin reagent Biochrom BC80-6000-06
Sulfosalycilic acid Sigma Aldrich S2130
Norleucine Sigma Aldrich N1398
Biochrom 30 AAA Biochrom
EZChrom Elite Biochrom Instrument control and Data analysis software
Ultropac 8 resin Lithium Biochrom BC80-6002-47 Lithium High Resolution Physiological Column
Filter Millex GV Merck Millipore SLGVX13NL Millex GV 13mm (pore size 0.22 µm)
Membrane filter PALL VWR 514-4157 Supor-450 47mm 0.45µm
Vacuum pump Millivac Mini Millipore XF5423050
Aluminium smooth weigh dish 70mm VWR 611-1380
Precision balance Mettler Specifications AE163
Dimethyl sulfoxid dried Merck 1029310161 (max. 0.025% H2O) SeccoSolv
Combustion oven Legallais
Pierce BCA protein assay kit Interchim UP40840A
Formic acid Fluka 94318
Hydrogen peroxide Sigma Aldrich H1009
Hydrochloric Acid Fuming 37% Emsure Merck 1003171000 Grade ACS,ISO,Reag. Ph Eur
Lithium acetate buffer Biochrom 80-2038-10
Commercial solution of hydrolyzed amino acids Sigma Aldrich AAS18
L-Methionine sulfone Sigma Aldrich M0876
L-Cysteic acid monohydrate Sigma Aldrich 30170
Pyrex glass culture tubes Sigma Aldrich Z653586
Pyridine Acros Organics 131780500 99% Extrapure
Ethyl chloroformate Sigma Aldrich 23131
Dichloromethane Sigma Aldrich 32222
Vials Sigma Aldrich 854165
Microinserts for 1.5ml vials Sigma Aldrich SU860066
GC/MS Agilent Technologies 5890 GC/5973 MS
Chemstation Agilent Technologies Instrument control and data analysis software
Methanol Sigma Aldrich 34860 Chromasolv, for HPLC
Acetonitrile Sigma Aldrich 34998 ChromasolvPlus, for HPLC
N,N-Dimethylformamide dimethyl acetal Sigma Aldrich 394963
BSTFA Sigma Aldrich 33024
DB-17MS column Agilent Technologies 122-4731 30m*0.25mm*0.15µm
Sodium sulfate, anhydrous Sigma Aldrich 238597
Technical nitrogen Air products 14629
Zebron ZB-WAX column Phenomenex 7HG-G007-11 30m*0.25mm*0.25µm
Helium BIP Air products 26699
Glass Pasteur pipettes VWR 612-1702

References

  1. Osterlund, T., Nookaew, I., Nielsen, J. Fifteen years of large scale metabolic modeling of yeast: developments and impacts. Biotechnol Adv. 30, 979-988 (2012).
  2. Gombert, A. K., Moreirados Santos, M., Christensen, B., Nielsen, J. Network identification and flux quantification in the central metabolism of Saccharomyces cerevisiae under different conditions of glucose repression. J Bacteriol. 183, 1441-1451 (2001).
  3. Wiechert, W. 13C metabolic flux analysis. Metab Eng. 3, 195-206 (2001).
  4. Fischer, E., Zamboni, N., Sauer, U. High-throughput metabolic flux analysis based on gas chromatography-mass spectrometry derived 13C constraints. Anal Biochem. 325, 308-316 (2004).
  5. Rantanen, A., Rousu, J., Jouhten, P., Zamboni, N., Maaheimo, H., Ukkonen, E. An analytic and systematic framework for estimating metabolic flux ratios from 13C tracer experiments. BMC Bioinformatics. 9, 266 (2008).
  6. Zamboni, N. 13C metabolic flux analysis in complex systems. Curr Opin Biotechnol. 22, 103-108 (2011).
  7. Kruger, N. J., Ratcliffe, R. G. Insights into plant metabolic networks from steady-state metabolic flux analysis. Biochimie. 91, 697-702 (2009).
  8. Quek, L. -. E., Dietmair, S., Krömer, J. O., Nielsen, L. K. Metabolic flux analysis in mammalian cell culture. Metab Eng. 12, 161-171 (2010).
  9. Perpete, P., Santos, G., Bodart, E., Collin, S. Uptake of amino acids during beer production: The concept of a critical time value. J Am Soc Brew Chem. 63, 23-27 (2005).
  10. Magasanik, B., Kaiser, C. A. Nitrogen regulation in Saccharomyces cerevisiae. Gene. 290, 1-18 (2002).
  11. Ljungdahl, P. O., Daignan-Fornier, B. Regulation of amino acid, nucleotide, and phosphate metabolism in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 190, 885-929 (2012).
  12. Cooper, T. G., Strathern, J. N., Jones, E. W., Broach, J. R. Nitrogen metabolism in Saccharomyces cerevisiae. The molecular biology of the yeast Saccharomyces: Metabolism and gene expression. , 39-99 (1982).
  13. Jones, E. W., Fink, G. R., Strathern, J. N., Jones, E. W., Broach, J. R. Regulation of amino acid and nucleotide biosynthesis in yeast. The molecular biology of the yeast Saccharomyces: Metabolism and gene expression. , 182-299 (1982).
  14. Hazelwood, L. A., Daran, J. -. M., van Maris, A. J. A., Pronk, J. T., Dickinson, J. R. The Ehrlich pathway for fusel alcohol production: a century of research on Saccharomyces cerevisiae metabolism. Appl Environ Microbiol. 74, 2259-2266 (2008).
  15. Bely, M., Sablayrolles, J. M., Barre, P. Automatic detection of assimilable nitrogen deficiencies during alcoholic fermentation in oenological conditions. J Ferment Bioeng. 70, 246-252 (1990).
  16. Forster, J., Famili, I., Fu, P., Palsson, B. O., Nielsen, J. Genome-scale reconstruction of the Saccharomyces cerevisiae metabolic network. Genome Res. 13, 244-253 (2003).
  17. Millard, P., Letisse, F., Sokol, S., Portais, J. C. IsoCor: correcting MS data in isotope labeling experiments. Bioinformatics. 28, 1294-1296 (2012).

Play Video

Cite This Article
Bloem, A., Rollero, S., Seguinot, P., Crépin, L., Perez, M., Picou, C., Camarasa, C. Workflow Based on the Combination of Isotopic Tracer Experiments to Investigate Microbial Metabolism of Multiple Nutrient Sources. J. Vis. Exp. (131), e56393, doi:10.3791/56393 (2018).

View Video