Dit protocol beschrijft een experimentele procedure voor het kwantitatief en uitgebreid onderzoek naar het metabolisme van meerdere nutriënten bronnen. Deze werkstroom, gebaseerd op een combinatie van isotopische tracerproeven en een analytische procedure, kan het lot van verbruikte voedingsstoffen en de metabole oorsprong van moleculen synthetized door micro-organismen te bepalen.
Studies op het gebied van de microbiologie, is afhankelijk van de uitvoering van een breed scala aan methoden. In het bijzonder bijdraagt de ontwikkeling van geschikte methoden aanzienlijk aan het verstrekken van uitgebreide kennis van het metabolisme van micro-organismen groeien in chemisch welbepaalde media met unieke stikstof en koolstof bronnen. Daarentegen blijft het beheer via metabolisme van meerdere nutriënten bronnen, ondanks hun grote aanwezigheid in natuurlijke of industriële omgevingen, vrijwel onontdekte. Deze situatie is voornamelijk te wijten aan het gebrek aan geschikte methoden, die onderzoek belemmert.
Wij rapporteren een experimentele strategie kwantitatief en grondig verkennen hoe metabolisme werkt als een nutriënt wordt geleverd als een mengsel van verschillende moleculen, dat wil zeggen, een complexe bron. Hier beschrijven we de toepassing ervan voor de beoordeling van het partitioneren van meerdere bronnen van stikstof via het metabolische netwerk van gist. De werkstroom combineert informatie verkregen tijdens stabiele isotoop tracerproeven met geselecteerde 13C- of 15N-geëtiketteerden substraten. Het eerste bestaat uit parallel en reproduceerbare fermentatie in hetzelfde medium, waarin een mengsel van N-bevattende moleculen; een geselecteerde stikstofbron heet echter elke keer. Een combinatie van analytische procedures (HPLC, GC-MS) wordt uitgevoerd om te beoordelen van de labeling patronen van gerichte verbindingen en te kwantificeren van de consumptie en het herstel van substraten in andere metabolieten. Een geïntegreerde analyse van de volledige dataset geeft een overzicht van het lot van verbruikte substraten binnen cellen. Deze aanpak vereist een nauwkeurige protocol voor het verzamelen van monsters – vergemakkelijkt door een robot-assisted systeem voor online bewaking van fermentatie- en de verwezenlijking van talrijke tijdrovende analyses. Ondanks deze beperkingen toegestaan het begrip, voor de eerste keer, het partitioneren van meerdere bronnen van stikstof tijdens het metabolische netwerk van gist. Wij toegelicht van de herverdeling van stikstof uit meer overvloedige bronnen naar andere N-verbindingen en de metabole oorsprong van vluchtige moleculen en Proteïnogeen aminozuren bepaald.
Begrip is hoe microbiële metabolisme werkt een belangrijke kwestie voor het ontwerp van efficiënte strategieën ter verbetering van fermentatieprocessen en het moduleren van de productie van fermenterende verbindingen. Ontwikkelingen in de genomica en functionele genomica in deze laatste twee decennia in belangrijke mate bijgedragen tot het verruimen van de kennis van de topologie van metabole netwerken in vele micro-organismen. Toegang tot deze informatie heeft geleid tot de ontwikkeling van onderwijsleermethoden die tot doel voor een uitgebreid overzicht van cellulaire functie1 hebben. Deze methodologieën is vaak afhankelijk van een model-gebaseerde interpretatie van meetbare parameters. Deze experimentele gegevens omvatten, aan de ene kant metaboliet opname en productie, en aan de andere kant, kwantitatieve intracellulaire informatie die wordt verkregen uit de isotoop tracer experimenten. Deze gegevens, verschaffen essentiële informatie voor de aftrek van de in-vivo -activiteit van verschillende routes in een gedefinieerde metabolische netwerk2,3,4. Op dit moment de beschikbare analytische technieken alleen inschakelen voor de nauwkeurige detectie van labeling patronen van moleculen bij het gebruik van een isotoop van één element en eventueel wanneer mede labelen met twee isotopische elementen. Bovendien onder de meeste omstandigheden van de groei bestaat de koolstofbron alleen uit één of twee-verbindingen. Bijgevolg waren benaderingen gebaseerd op de C-isotopische traceurs 13uit koolstof ondergronden breed en met succes toegepast voor de ontwikkeling van een compleet begrip van de koolstof metabolische netwerk operaties5,6,7 ,8.
Daarentegen in veel natuurlijke en industriële omgevingen, de beschikbare stikstof resource dat microbiële groei ondersteunt vaak bestaat uit een breed scala van moleculen. Bijvoorbeeld, tijdens de wijn of bier gisting, wordt stikstof geleverd als een mengsel van 18 aminozuren en ammonium bij variabele concentraties9. Deze array van N-verbindingen die toegankelijk voor anabolism zijn maakt deze complexe media voorwaarden sterk verschilt van de gangbare waarden voor fysiologische studies, zoals de laatste worden bereikt met behulp van een unieke bron van stikstof, meestal ammonium.
Over het geheel genomen geïnternaliseerd stikstof verbindingen kunnen direct worden opgenomen in eiwitten of catabolized. De structuur van het netwerk van stikstof metabolisme in vele micro-organismen, met inbegrip van de gist Saccharomyces cerevisiae, is zeer complex overeenkomstig de diversiteit van substraten. Schematisch, is dit systeem gebaseerd op de combinatie van de centrale kern van stikstof metabolisme die de interconversion van glutamine, glutamaat en α-ketoglutarate10,11, met transaminases en deaminases katalyseert. Via dit netwerk, amine groepen uit ammonium of andere aminozuren worden verzameld en α-keto zuren uitgebracht. Deze tussenproducten zijn ook synthetized via centrale koolstof metabolisme (CCM)12,13. Dit groot aantal vertakte reacties en tussenproducten, betrokken bij zowel het katabolisme van exogene stikstof bronnen en het anabolisme van Proteïnogeen aminozuren, vervult de anabole eisen van de cellen. De activiteit via deze verschillende met elkaar verbonden routes resulteert ook in de uitscheiding van metabolieten. In het bijzonder, kunnen α-keto zuren worden omgeleid via de Ehrlich pathway hogere alcoholen en hun acetaat ester derivaten14, die essentiële bijdragen aan de zintuiglijke profielen van producten te produceren. Vervolgens, speelt de werking van stikstof metabolisme een belangrijke rol in de productie van biomassa en de vorming van vluchtige moleculen (aroma).
De reacties, enzymen en genen die betrokken zijn in stikstof metabolisme zijn uitvoerig beschreven in de literatuur. Echter heeft de kwestie van de verdeling van meerdere bronnen van stikstof tijdens een metabolische netwerk nog niet aangepakt. Er zijn twee belangrijke redenen die dit gebrek aan informatie verklaren. Ten eerste, gezien de belangrijke complexiteit van het netwerk van stikstof metabolisme, een grote hoeveelheid van de kwantitatieve gegevens is vereist voor een compleet begrip van de werking ervan die niet beschikbaar was tot nu toe. Ten tweede, vele experimentele beperkingen en beperkingen van analytische methoden voorkomen de uitvoeringvan benaderingen die voorheen werden gebruikt voor de opheldering van CCM functie.
Om deze problemen, kozen we voor een systeem-niveau-aanpak die is gebaseerd op het combineren van gegevens uit een groot aantal isotopische tracerproeven te ontwikkelen. De workflow omvat:
-Een set van fermentatie uitgevoerd onder de dezelfde milieu-omstandigheden, terwijl een andere geselecteerde nutriënten bron (substraat) telkens heet.
-Een combinatie van analytische procedures (HPLC, GC-MS) voor een nauwkeurige bepaling, in de verschillende stadia van de gisting, van de resterende concentratie van gelabelde substraat en de concentratie en de isotopische verrijking van stoffen die zijn afgeleid van het katabolisme van het gelabelde molecuul, met inbegrip van afgeleide biomassa.
-Een berekening van het saldo van het massale en isotopische voor elk verbruikt gelabelde molecuul en een verder geïntegreerde analyse van de dataset te verkrijgen van een globaal overzicht van het beheer van meerdere nutriënten bronnen door micro-organismen door middel van de bepaling van flux ratio ‘s .
Voor de toepassing van deze methode, moet aandacht worden besteed aan het reproduceerbare gedrag van de stam/micro-organisme tussen culturen. Monsters uit verschillende culturen moeten bovendien worden genomen tijdens de dezelfde welomschreven gisting vooruitgang. In de experimentele werk die zijn gerapporteerd in dit manuscript, wordt een robot-assisted-systeem gebruikt voor online bewaking van fermentatie ter verantwoording voor deze beperkingen.
Bovendien is het essentieel om een reeks van gelabelde substraten (samengestelde aard en positie van het label) die geschikt is om het wetenschappelijke probleem van de studie te kiezen. Hier, 15N-geëtiketteerden ammonium, glutamine en arginine uitgekozen als de drie grote stikstof bronnen gevonden in druivensap. Hierdoor konden beoordelen van het patroon van stikstof herverdeling van verbruikte verbindingen naar de Proteïnogeen aminozuren. Wij ook gericht op het onderzoeken van het lot van de ruggengraat van de koolstof van de verbruikte aminozuren en hun bijdrage aan de productie van vluchtige moleculen. Om te voldoen aan deze doelstelling, uniform 13C-gelabeld leucine, werden isoleucine, threonine en valine opgenomen in de studie als aminozuren die zijn afgeleid van grote tussenproducten van het leertraject Ehrlich.
Over het geheel genomen verkenden we kwantitatief hoe gist beheert een complexe stikstof resource door herverdeling van exogene stikstof bronnen om te voldoen aan haar anabole eisen hele gisting tijdens het bovendien het verwijderen van de overdaad aan koolstof precursoren als vluchtige moleculen. De experimentele procedure gemeld in dit document kan worden toegepast om te onderzoeken van andere meerdere nutriënten bronnen gebruikt door een andere micro-organismen. Het lijkt een adequate aanpak voor de analyse van de gevolgen van genetische achtergrond of omgevingsfactoren op de metabolische gedrag van micro-organismen.
Kwantificeren van compartimentering van de verbindingen via metabole netwerken met isotopische tracerproeven is een veelbelovende aanpak voor het begrip van de werking van het microbiële metabolisme. Deze methodiek, niet kan terwijl succesvol toegepast met één of twee gelabelde substraten, momenteel worden uitgevoerd om te studeren metabolisme van verschillende bronnen met behulp van meerdere gelabelde elemental isotopen (dat wil zeggen, meer dan twee substraten). Inderdaad, de beschikbare analytische technie…
The authors have nothing to disclose.
Wij danken Jean-Roch Mouret, Sylvie Dequin en Jean-Marie Sabalyrolles bij te dragen tot de opvatting van het systeem van de Robot-assisted gisting en Martine Pradal, Nicolas Bouvier en Pascale Brial voor hun technische ondersteuning. Financiering voor dit project werd verstrekt door de Ministère de l’Education Nationale, de la Recherche et de la Technologie.
D-Glucose | PanReac | 141341.0416 | |
D-Fructose | PanReac | 142728.0416 | |
DL-Malic acid | Sigma Aldrich | M0875 | |
Citric acid monohydrate | Sigma Aldrich | C7129 | |
Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P5379 | |
Potassium sulfate | Sigma Aldrich | P0772 | |
Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | 230391 | |
Calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C7902 | |
Sodium chloride | Sigma Aldrich | S9625 | |
Ammonium chloride | Sigma Aldrich | A4514 | |
Sodium hydroxide | Sigma Aldrich | 71690 | |
Manganese sulfate monohydrate | Sigma Aldrich | M7634 | |
Zinc sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | Z4750 | |
Copper (II) sulfate pentahydrate | Sigma Aldrich | C7631 | |
Potassium iodine | Sigma Aldrich | P4286 | |
Cobalt (II) chloride hexahydrate | Sigma Aldrich | C3169 | |
Boric acid | Sigma Aldrich | B7660 | |
Ammonium heptamolybdate | Sigma Aldrich | A7302 | |
Myo-inositol | Sigma Aldrich | I5125 | |
D-Pantothenic acid hemicalcium salt | Sigma Aldrich | 21210 | |
Thiamine, hydrochloride | Sigma Aldrich | T4625 | |
Nicotinic acid | Sigma Aldrich | N4126 | |
Pyridoxine | Sigma Aldrich | P5669 | |
Biotine | Sigma Aldrich | B4501 | |
Ergostérol | Sigma Aldrich | E6510 | |
Tween 80 | Sigma Aldrich | P1754 | |
Ethanol absolute | VWR Chemicals | 101074F | |
Iron (III) chloride hexahydrate | Sigma Aldrich | 236489 | |
L-Aspartic acid | Sigma Aldrich | A9256 | |
L-Glutamic acid | Sigma Aldrich | G1251 | |
L-Alanine | Sigma Aldrich | A7627 | |
L-Arginine | Sigma Aldrich | A5006 | |
L-Cysteine | Sigma Aldrich | C7352 | |
L-Glutamine | Sigma Aldrich | G3126 | |
Glycine | Sigma Aldrich | G7126 | |
L-Histidine | Sigma Aldrich | H8000 | |
L-Isoleucine | Sigma Aldrich | I2752 | |
L-Leucine | Sigma Aldrich | L8000 | |
L-Lysine | Sigma Aldrich | L5501 | |
L-Methionine | Sigma Aldrich | M9625 | |
L-Phenylalanine | Sigma Aldrich | P2126 | |
L-Proline | Sigma Aldrich | P0380 | |
L-Serine | Sigma Aldrich | S4500 | |
L-Threonine | Sigma Aldrich | T8625 | |
L-Tryptophane | Sigma Aldrich | T0254 | |
L-Tyrosine | Sigma Aldrich | T3754 | |
L-Valine | Sigma Aldrich | V0500 | |
13C5-L-Valine | Eurisotop | CLM-2249-H-0.25 | |
13C6-L-Leucine | Eurisotop | CLM-2262-H-0.25 | |
15N-Ammonium chloride | Eurisotop | NLM-467-1 | |
ALPHA-15N-L-Glutamine | Eurisotop | NLM-1016-1 | |
U-15N4-L-Arginine | Eurisotop | NLM-396-PK | |
Ethyl acetate | Sigma Aldrich | 270989 | |
Ethyl propanoate | Sigma Aldrich | 112305 | |
Ethyl 2-methylpropanoate | Sigma Aldrich | 246085 | |
Ethyl butanoate | Sigma Aldrich | E15701 | |
Ethyl 2-methylbutanoate | Sigma Aldrich | 306886 | |
Ethyl 3-methylbutanoate | Sigma Aldrich | 8.08541.0250 | |
Ethyl hexanoate | Sigma Aldrich | 148962 | |
Ethyl octanoate | Sigma Aldrich | W244910 | |
Ethyl decanoate | Sigma Aldrich | W243205 | |
Ethyl dodecanoate | Sigma Aldrich | W244112 | |
Ethyl lactate | Sigma Aldrich | W244015 | |
Diethyl succinate | Sigma Aldrich | W237701 | |
2-methylpropyl acetate | Sigma Aldrich | W217514 | |
2-methylbutyl acetate | Sigma Aldrich | W364401 | |
3-methyl butyl acetate | Sigma Aldrich | 287725 | |
2-phenylethyl acetate | Sigma Aldrich | 290580 | |
2-methylpropanol | Sigma Aldrich | 294829 | |
2-methylbutanol | Sigma Aldrich | 133051 | |
3-methylbutanol | Sigma Aldrich | 309435 | |
Hexanol | Sigma Aldrich | 128570 | |
2-phenylethanol | Sigma Aldrich | 77861 | |
Propanoic acid | Sigma Aldrich | 94425 | |
Butanoic acid | Sigma Aldrich | 19215 | |
2-methylpropanoic acid | Sigma Aldrich | 58360 | |
2-methylbutanoic acid | Sigma Aldrich | 193070 | |
3-methylbutanoic acid | Sigma Aldrich | W310212 | |
Hexanoic acid | Sigma Aldrich | 153745 | |
Octanoic acid | Sigma Aldrich | W279900 | |
Decanoic acid | Sigma Aldrich | W236403 | |
Dodecanoic acid | Sigma Aldrich | L556 | |
Fermentor 1L | Legallais | AT1357 | Fermenter handmade for fermentation |
Disposable vacuum filtration system | Dominique Deutscher | 029311 | |
Fermenters (250 ml) | Legallais | AT1352 | Fermenter handmade for fermentation |
Sterile tubes | Sarstedt | 62.554.502 | |
Fermentation locks | Legallais | AT1356 | Fermetation locks handmade for fermentation |
BactoYeast Extract | Becton, Dickinson and Company | 212750 | |
BactoPeptone | Becton, Dickinson and Company | 211677 | |
Incubator shaker | Infors HT | ||
Particle Counter | Beckman Coulter | 6605697 | Multisizer 3 Coulter Counter |
Centrifuge | Jouan | GR412 | |
Plate Butler Robotic system | Lab Services BV | PF0X-MA | Automatic instrument |
Plate Butler Software | Lab Services BV | Robot monitor software | |
RobView | In-house developed calculation software | ||
My SQL | International source database | ||
Cimarec i Telesystem Multipoint Stirrers | Thermo Fisher Scientific | 50088009 | String Drive 60 |
BenchBlotter platform rocker | Dutscher | 60903 | |
Ammonia enzymatic kit | R-Biopharm AG | 5390 | |
Spectrophotometer cuvettes | VWR | 634-0678 | |
Spectrophotometer UviLine 9400 | Secomam | ||
Amino acids standards physiological – acidics and neutrals | Sigma Aldrich | A6407 | |
Amino acids standards physiological – basics | Sigma Aldrich | A6282 | |
Citrate lithium buffers – Ultra ninhydrin reagent | Biochrom | BC80-6000-06 | |
Sulfosalycilic acid | Sigma Aldrich | S2130 | |
Norleucine | Sigma Aldrich | N1398 | |
Biochrom 30 AAA | Biochrom | ||
EZChrom Elite | Biochrom | Instrument control and Data analysis software | |
Ultropac 8 resin Lithium | Biochrom | BC80-6002-47 | Lithium High Resolution Physiological Column |
Filter Millex GV | Merck Millipore | SLGVX13NL | Millex GV 13mm (pore size 0.22 µm) |
Membrane filter PALL | VWR | 514-4157 | Supor-450 47mm 0.45µm |
Vacuum pump Millivac Mini | Millipore | XF5423050 | |
Aluminium smooth weigh dish 70mm | VWR | 611-1380 | |
Precision balance | Mettler | Specifications AE163 | |
Dimethyl sulfoxid dried | Merck | 1029310161 | (max. 0.025% H2O) SeccoSolv |
Combustion oven | Legallais | ||
Pierce BCA protein assay kit | Interchim | UP40840A | |
Formic acid | Fluka | 94318 | |
Hydrogen peroxide | Sigma Aldrich | H1009 | |
Hydrochloric Acid Fuming 37% Emsure | Merck | 1003171000 | Grade ACS,ISO,Reag. Ph Eur |
Lithium acetate buffer | Biochrom | 80-2038-10 | |
Commercial solution of hydrolyzed amino acids | Sigma Aldrich | AAS18 | |
L-Methionine sulfone | Sigma Aldrich | M0876 | |
L-Cysteic acid monohydrate | Sigma Aldrich | 30170 | |
Pyrex glass culture tubes | Sigma Aldrich | Z653586 | |
Pyridine | Acros Organics | 131780500 | 99% Extrapure |
Ethyl chloroformate | Sigma Aldrich | 23131 | |
Dichloromethane | Sigma Aldrich | 32222 | |
Vials | Sigma Aldrich | 854165 | |
Microinserts for 1.5ml vials | Sigma Aldrich | SU860066 | |
GC/MS | Agilent Technologies | 5890 GC/5973 MS | |
Chemstation | Agilent Technologies | Instrument control and data analysis software | |
Methanol | Sigma Aldrich | 34860 | Chromasolv, for HPLC |
Acetonitrile | Sigma Aldrich | 34998 | ChromasolvPlus, for HPLC |
N,N-Dimethylformamide dimethyl acetal | Sigma Aldrich | 394963 | |
BSTFA | Sigma Aldrich | 33024 | |
DB-17MS column | Agilent Technologies | 122-4731 | 30m*0.25mm*0.15µm |
Sodium sulfate, anhydrous | Sigma Aldrich | 238597 | |
Technical nitrogen | Air products | 14629 | |
Zebron ZB-WAX column | Phenomenex | 7HG-G007-11 | 30m*0.25mm*0.25µm |
Helium BIP | Air products | 26699 | |
Glass Pasteur pipettes | VWR | 612-1702 |