Flusso di lavoro basato sulla combinazione di tracciante isotopico esperimenti per studiare il metabolismo microbico di più fonti di nutrienti

Summary

Questo protocollo descrive una procedura sperimentale per in modo completo e quantitativamente studiare il metabolismo di più fonti di nutrienti. Questo flusso di lavoro, basato su una combinazione di tracciante isotopico esperimenti e una procedura analitica, permette il destino dei nutrienti consumati e l’origine metabolica delle molecole sintetizzate da microrganismi deve essere determinato.

Abstract

Studi nel campo della microbiologia si basano sull’attuazione di una vasta gamma di metodologie. In particolare, lo sviluppo di metodi appropriati sostanzialmente contribuisce a fornire una vasta conoscenza del metabolismo dei microrganismi crescono in media chimicamente definite che contengono azoto unico e fonti di carbonio. Al contrario, la gestione attraverso il metabolismo di più fonti di nutrienti, nonostante la loro ampia presenza in ambienti naturali o industriali, rimane praticamente inesplorata. Questa situazione è dovuto principalmente alla mancanza di metodologie, che ostacola le indagini.

Segnaliamo una strategia sperimentale in modo completo e quantitativamente esplorare come metabolismo opera quando una sostanza nutriente è fornito come una miscela di molecole diverse, vale a dire, una risorsa complessa. Qui, descriviamo la sua applicazione per valutare il partizionamento di molteplici fonti di azoto attraverso la rete metabolica di lievito. Il flusso di lavoro combina le informazioni ottenute durante gli esperimenti di tracciante isotopo stabile utilizzando selezionati ¹³C – o ¹⁵N-etichettati substrati. In primo luogo è costituito da fermentazioni parallele e riproducibile sullo stesso supporto, che include una miscela di molecole contenenti N; Tuttavia, una fonte di azoto selezionato è etichettata ogni volta. Una combinazione di procedure analitiche (HPLC, GC-MS) è implementata per valutare i modelli di etichettatura di composti mirati e per quantificare il consumo e il recupero dei substrati in altri metaboliti. Un’analisi integrata del dataset completo fornisce una panoramica del destino di substrati consumati all’interno delle cellule. Questo approccio richiede un preciso protocollo per la raccolta di campioni – agevolato da un sistema di robot-assistita per il monitoraggio online delle fermentazioni – e il raggiungimento di numerose analisi che richiede tempo. Nonostante questi vincoli, essa ha consentito di comprendere, per la prima volta, il partizionamento di molteplici fonti di azoto in tutta la rete metabolica di lievito. Abbiamo determinato le origini metaboliche di molecole volatili e gli aminoacidi proteinogenici e delucidato la ridistribuzione di azoto da fonti più abbondanti verso altri N-composti.

Introduction

Intesa come opera di metabolismo microbico è una questione chiave per la progettazione di strategie efficienti per migliorare i processi di fermentazione e modulano la produzione di composti fermentativi. I progressi nella genomica e genomica funzionale in questi ultimi due decenni in gran parte contribuito ad estendere la conoscenza della topologia delle reti metaboliche in molti microrganismi. Accesso a queste informazioni hanno portato allo sviluppo di approcci che mirano per una panoramica completa della funzione cellulare¹. Queste metodologie si basano spesso su un’interpretazione basata su modello di parametri misurabili. Questi dati sperimentali comprendono, da un lato, tassi di produzione e l’assorbimento di metabolita e, d’altra parte, esperimenti di informazioni quantitative intracellulare che sono ottenuti dal tracciante isotopico. Questi dati forniscono informazioni essenziali per la deduzione dell’attività in vivo di diversi percorsi in una rete metabolica definita^2,3,4. Attualmente, le tecniche analitiche disponibili solo attivare la rilevazione accurata di modelli di molecole di etichettatura quando si utilizza un elemento singolo isotopo e possibilmente quando co-etichettatura con due elementi isotopici. Inoltre, sotto la maggior parte delle condizioni di crescita, la fonte di carbonio consiste solo di uno o due-composti. Di conseguenza, approcci basati su ¹³C-isotopica traccianti da substrati di carbonio sono stati ampiamente e correttamente applicati per sviluppare una comprensione completa del carbonio reti metaboliche operazioni^{5,6,7 ,8}.

Al contrario, in molti ambienti naturali ed industriali, la risorsa di azoto disponibile che supporta la crescita microbica è spesso composto di una vasta gamma di molecole. Ad esempio, durante la fermentazione di vino o birra, azoto viene fornito come una miscela di 18 aminoacidi e ammonio alle concentrazioni variabili⁹. Questa matrice di composti N che sono accessibili per anabolismo rende queste condizioni supporti complessi notevolmente diversi da quelli comunemente utilizzati per gli studi fisiologici, in quanto quest’ultimo si ottiene utilizzando un’unica fonte di azoto, in genere di ammonio.

Nel complesso, interiorizzato azoto composti possono essere direttamente incorporati nelle proteine o catabolizzate. La struttura della rete del metabolismo dell’azoto in molti microrganismi, tra cui il lievito Saccharomyces cerevisiae, è molto complessa, secondo la diversità dei substrati. Schematicamente, questo sistema si basa sulla combinazione del nucleo centrale del metabolismo dell’azoto che catalizza l’interconversione di glutamina, glutammato e α-chetoglutarato^10,11, con transaminasi e deaminasi. Attraverso questa rete, sono riuniti gruppi amminici da ammonio o altri aminoacidi e acidi α-cheto rilasciato. Questi intermedi sono anche sintetizzati attraverso il carbonio centrale metabolismo (CCM)^12,13. Questo gran numero di reazioni ramificate e intermedi, coinvolti nel catabolismo di fonti esogene di azoto sia l’anabolismo degli amminoacidi proteinogenici, soddisfa i requisiti anabolizzanti delle cellule. L’attività attraverso questi diversi percorsi interconnessi comporta anche l’escrezione dei metaboliti. In particolare, α-chetoacidi possono essere reindirizzati attraverso il pathway di Ehrlich per la produzione di alcoli superiori e loro acetato estere derivati¹⁴, che contribuiscono in maniera essenziale ai profili sensoriali dei prodotti. Successivamente, come funziona il metabolismo dell’azoto svolge un ruolo chiave nella produzione di biomassa e la formazione di molecole volatili (aroma).

Le reazioni, enzimi e geni coinvolti nel metabolismo dell’azoto sono ampiamente descritti nella letteratura. Tuttavia, il problema della distribuzione delle molteplici fonti di azoto attraverso una rete metabolica non è ancora stato risolto. Ci sono due ragioni principali che spiegano questa mancanza di informazioni. In primo luogo, alla luce della complessità importante della rete di metabolismo dell’azoto, una grande quantità di dati quantitativi è richiesta per una completa comprensione del suo funzionamento che non era disponibile fino ad ora. Secondo, molti vincoli sperimentali e le limitazioni dei metodi analitici ha impedito l’attuazione di approcci che sono stati precedentemente utilizzati per la delucidazione della funzione CCM.

Per superare questi problemi, abbiamo scelto di sviluppare un approccio di livello di sistema che si basa sulla riconciliazione dei dati da una serie di esperimenti di tracciante isotopico. Il flusso di lavoro comprende:
-Una serie di fermentazioni effettuate nelle stesse condizioni ambientali, mentre una diversa fonte di nutrienti selezionata (substrato) è etichettata ogni volta.
-Una combinazione di procedure analitiche (HPLC, GC-MS) per una determinazione accurata, nelle diverse fasi della fermentazione, la concentrazione residua di substrato con etichetta e la concentrazione e l’arricchimento isotopico di composti che sono derivati da il catabolismo della molecola con etichetta, compresa la biomassa derivata.
-Un calcolo del saldo massa ed isotopico per ciascuno consumati con etichetta molecola e un’ulteriore analisi integrata del set di dati per ottenere una panoramica globale della gestione delle molteplici fonti di nutrienti da parte dei microrganismi attraverso la determinazione dei coefficienti di flusso .

Per applicare questa metodologia, si deve prestare attenzione al comportamento riproducibile del ceppo/microrganismo tra culture. Inoltre, si devono prelevare campioni da diverse culture durante lo stesso progresso di fermentazione ben definito. Nel lavoro sperimentale segnalato in questo manoscritto, un sistema robot-assistita è utilizzato per il monitoraggio online delle fermentazioni per rappresentare questi vincoli.

Inoltre, è fondamentale scegliere un set di substrati con etichettate (composto, natura e posizione di etichettatura) che è opportuno affrontare il problema scientifico dello studio. Qui, arginina, glutamina e ¹⁵N-labeled ammonio sono stati selezionati come le tre fonti principali azoto trovate in succo d’uva. Questo ha permesso di valutare il modello di ridistribuzione di azoto dai composti consumati per gli aminoacidi proteinogenici. Abbiamo anche il compito di indagare sulla sorte della spina dorsale del carbonio di aminoacidi consumati e il loro contributo alla produzione di molecole volatili. Per soddisfare questo obiettivo, uniformemente ¹³C-etichetta leucina, isoleucina, treonina e valina sono stati inclusi nello studio come gli aminoacidi che sono derivati da importanti intermedi del pathway di Ehrlich.

Nel complesso, abbiamo esplorato quantitativamente come lievito gestisce una risorsa complessa azoto ridistribuendo le fonti di azoto esogene per soddisfare le proprie esigenze anabolizzanti per tutta la fermentazione mentre inoltre rimuovono l’eccesso di precursori di carbonio come molecole volatili. La procedura sperimentale riferita in questa carta può essere applicata per studiare altre fonti di nutrienti più utilizzati da qualsiasi altro microrganismo. Sembra essere un approccio adeguato per l’analisi dell’impatto del background genetico o condizioni ambientali sul comportamento metabolico dei microrganismi.

Protocol

1. fermentazione e campionamento Preparazione dei media e fermentatoriNota: Tutte le fermentazioni vengono svolte in parallelo, utilizzando lo stesso sforzo e nello stesso chimicamente definite mezzo sintetico (SM, composizione indicati nella tabella 1), che include una miscela di ammonio e gli aminoacidi come fonti di azoto15. Per ogni fermentazione, un composto unico azoto viene fornito esclusivamente in un uniformemente con etichetta 13</sup…

Representative Results

Figura 3 presenta un diagramma schematico del flusso di lavoro che è stato implementato per studiare la gestione da lievito delle molteplici sorgenti di azoto che si trovano durante la fermentazione del vino.Per i diversi punti di campionamento, le caratteristiche di parametri – crescita biologica, modelli di consumo di azoto e il profilo di aminoacidi proteinogenici – Visualizza un’elevata riproducibilità tra fermentazioni (Fig…

Discussion

Quantificare il partizionamento di composti attraverso reti metaboliche mediante esperimenti di tracciante isotopico è un promettente approccio per capire il funzionamento del metabolismo microbico. Questa metodologia, mentre applicato con successo con uno o due substrati con etichettati, attualmente non può essere implementata per studiare il metabolismo di varie fonti utilizzando multipli con etichettati elementali isotopi (cioè, più di due substrati). Infatti, le tecniche analitiche disponibili consentono…

Materials

D-Glucose	PanReac	141341.0416
D-Fructose	PanReac	142728.0416
DL-Malic acid	Sigma Aldrich	M0875
Citric acid monohydrate	Sigma Aldrich	C7129
Potassium phosphate monobasic	Sigma Aldrich	P5379
Potassium sulfate	Sigma Aldrich	P0772
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma Aldrich	230391
Calcium chloride dihydrate	Sigma Aldrich	C7902
Sodium chloride	Sigma Aldrich	S9625
Ammonium chloride	Sigma Aldrich	A4514
Sodium hydroxide	Sigma Aldrich	71690
Manganese sulfate monohydrate	Sigma Aldrich	M7634
Zinc sulfate heptahydrate	Sigma Aldrich	Z4750
Copper (II) sulfate pentahydrate	Sigma Aldrich	C7631
Potassium iodine	Sigma Aldrich	P4286
Cobalt (II) chloride hexahydrate	Sigma Aldrich	C3169
Boric acid	Sigma Aldrich	B7660
Ammonium heptamolybdate	Sigma Aldrich	A7302
Myo-inositol	Sigma Aldrich	I5125
D-Pantothenic acid hemicalcium salt	Sigma Aldrich	21210
Thiamine, hydrochloride	Sigma Aldrich	T4625
Nicotinic acid	Sigma Aldrich	N4126
Pyridoxine	Sigma Aldrich	P5669
Biotine	Sigma Aldrich	B4501
Ergostérol	Sigma Aldrich	E6510
Tween 80	Sigma Aldrich	P1754
Ethanol absolute	VWR Chemicals	101074F
Iron (III) chloride hexahydrate	Sigma Aldrich	236489
L-Aspartic acid	Sigma Aldrich	A9256
L-Glutamic acid	Sigma Aldrich	G1251
L-Alanine	Sigma Aldrich	A7627
L-Arginine	Sigma Aldrich	A5006
L-Cysteine	Sigma Aldrich	C7352
L-Glutamine	Sigma Aldrich	G3126
Glycine	Sigma Aldrich	G7126
L-Histidine	Sigma Aldrich	H8000
L-Isoleucine	Sigma Aldrich	I2752
L-Leucine	Sigma Aldrich	L8000
L-Lysine	Sigma Aldrich	L5501
L-Methionine	Sigma Aldrich	M9625
L-Phenylalanine	Sigma Aldrich	P2126
L-Proline	Sigma Aldrich	P0380
L-Serine	Sigma Aldrich	S4500
L-Threonine	Sigma Aldrich	T8625
L-Tryptophane	Sigma Aldrich	T0254
L-Tyrosine	Sigma Aldrich	T3754
L-Valine	Sigma Aldrich	V0500
13C5-L-Valine	Eurisotop	CLM-2249-H-0.25
13C6-L-Leucine	Eurisotop	CLM-2262-H-0.25
15N-Ammonium chloride	Eurisotop	NLM-467-1
ALPHA-15N-L-Glutamine	Eurisotop	NLM-1016-1
U-15N4-L-Arginine	Eurisotop	NLM-396-PK
Ethyl acetate	Sigma Aldrich	270989
Ethyl propanoate	Sigma Aldrich	112305
Ethyl 2-methylpropanoate	Sigma Aldrich	246085
Ethyl butanoate	Sigma Aldrich	E15701
Ethyl 2-methylbutanoate	Sigma Aldrich	306886
Ethyl 3-methylbutanoate	Sigma Aldrich	8.08541.0250
Ethyl hexanoate	Sigma Aldrich	148962
Ethyl octanoate	Sigma Aldrich	W244910
Ethyl decanoate	Sigma Aldrich	W243205
Ethyl dodecanoate	Sigma Aldrich	W244112
Ethyl lactate	Sigma Aldrich	W244015
Diethyl succinate	Sigma Aldrich	W237701
2-methylpropyl acetate	Sigma Aldrich	W217514
2-methylbutyl acetate	Sigma Aldrich	W364401
3-methyl butyl acetate	Sigma Aldrich	287725
2-phenylethyl acetate	Sigma Aldrich	290580
2-methylpropanol	Sigma Aldrich	294829
2-methylbutanol	Sigma Aldrich	133051
3-methylbutanol	Sigma Aldrich	309435
Hexanol	Sigma Aldrich	128570
2-phenylethanol	Sigma Aldrich	77861
Propanoic acid	Sigma Aldrich	94425
Butanoic acid	Sigma Aldrich	19215
2-methylpropanoic acid	Sigma Aldrich	58360
2-methylbutanoic acid	Sigma Aldrich	193070
3-methylbutanoic acid	Sigma Aldrich	W310212
Hexanoic acid	Sigma Aldrich	153745
Octanoic acid	Sigma Aldrich	W279900
Decanoic acid	Sigma Aldrich	W236403
Dodecanoic acid	Sigma Aldrich	L556
Fermentor 1L	Legallais	AT1357	Fermenter handmade for fermentation
Disposable vacuum filtration system	Dominique Deutscher	029311
Fermenters (250 ml)	Legallais	AT1352	Fermenter handmade for fermentation
Sterile tubes	Sarstedt	62.554.502
Fermentation locks	Legallais	AT1356	Fermetation locks handmade for fermentation
BactoYeast Extract	Becton, Dickinson and Company	212750
BactoPeptone	Becton, Dickinson and Company	211677
Incubator shaker	Infors HT
Particle Counter	Beckman Coulter	6605697	Multisizer 3 Coulter Counter
Centrifuge	Jouan		GR412
Plate Butler Robotic system	Lab Services BV	PF0X-MA	Automatic instrument
Plate Butler Software	Lab Services BV		Robot monitor software
RobView			In-house developed calculation software
My SQL			International source database
Cimarec i Telesystem Multipoint Stirrers	Thermo Fisher Scientific	50088009	String Drive 60
BenchBlotter platform rocker	Dutscher	60903
Ammonia enzymatic kit	R-Biopharm AG	5390
Spectrophotometer cuvettes	VWR	634-0678
Spectrophotometer UviLine 9400	Secomam
Amino acids standards physiological – acidics and neutrals	Sigma Aldrich	A6407
Amino acids standards physiological – basics	Sigma Aldrich	A6282
Citrate lithium buffers – Ultra ninhydrin reagent	Biochrom	BC80-6000-06
Sulfosalycilic acid	Sigma Aldrich	S2130
Norleucine	Sigma Aldrich	N1398
Biochrom 30 AAA	Biochrom
EZChrom Elite	Biochrom		Instrument control and Data analysis software
Ultropac 8 resin Lithium	Biochrom	BC80-6002-47	Lithium High Resolution Physiological Column
Filter Millex GV	Merck Millipore	SLGVX13NL	Millex GV 13mm (pore size 0.22 µm)
Membrane filter PALL	VWR	514-4157	Supor-450 47mm 0.45µm
Vacuum pump Millivac Mini	Millipore	XF5423050
Aluminium smooth weigh dish 70mm	VWR	611-1380
Precision balance	Mettler		Specifications AE163
Dimethyl sulfoxid dried	Merck	1029310161	(max. 0.025% H2O) SeccoSolv
Combustion oven	Legallais
Pierce BCA protein assay kit	Interchim	UP40840A
Formic acid	Fluka	94318
Hydrogen peroxide	Sigma Aldrich	H1009
Hydrochloric Acid Fuming 37% Emsure	Merck	1003171000	Grade ACS,ISO,Reag. Ph Eur
Lithium acetate buffer	Biochrom	80-2038-10
Commercial solution of hydrolyzed amino acids	Sigma Aldrich	AAS18
L-Methionine sulfone	Sigma Aldrich	M0876
L-Cysteic acid monohydrate	Sigma Aldrich	30170
Pyrex glass culture tubes	Sigma Aldrich	Z653586
Pyridine	Acros Organics	131780500	99% Extrapure
Ethyl chloroformate	Sigma Aldrich	23131
Dichloromethane	Sigma Aldrich	32222
Vials	Sigma Aldrich	854165
Microinserts for 1.5ml vials	Sigma Aldrich	SU860066
GC/MS	Agilent Technologies	5890 GC/5973 MS
Chemstation	Agilent Technologies		Instrument control and data analysis software
Methanol	Sigma Aldrich	34860	Chromasolv, for HPLC
Acetonitrile	Sigma Aldrich	34998	ChromasolvPlus, for HPLC
N,N-Dimethylformamide dimethyl acetal	Sigma Aldrich	394963
BSTFA	Sigma Aldrich	33024
DB-17MS column	Agilent Technologies	122-4731	30m*0.25mm*0.15µm
Sodium sulfate, anhydrous	Sigma Aldrich	238597
Technical nitrogen	Air products	14629
Zebron ZB-WAX column	Phenomenex	7HG-G007-11	30m*0.25mm*0.25µm
Helium BIP	Air products	26699
Glass Pasteur pipettes	VWR	612-1702