Flujo de trabajo basado en la combinación de trazador isotópico experimentos para investigar el metabolismo microbiano de múltiples fuentes de nutrientes

Summary

Este protocolo describe un procedimiento experimental cuantitativa y comprensivo investigar el metabolismo de múltiples fuentes de nutrientes. Este flujo de trabajo, basado en una combinación de experimentos de trazador isotópico y de un procedimiento analítico permite el destino de los nutrientes consumidos y el origen metabólico de moléculas sintetizado por microorganismos a determinar.

Abstract

Estudios en el campo de la microbiología se basan en la aplicación de una amplia gama de metodologías. En particular, el desarrollo de métodos adecuados substancialmente contribuye a proporcionar amplios conocimientos sobre el metabolismo de los microorganismos crecen en medios químicamente definidos que contiene fuentes de carbono y nitrógeno único. En cambio, la gestión a través de múltiples fuentes de nutrientes, a pesar de su amplia presencia en ambientes naturales o industriales, permanece prácticamente inexplorada. Esta situación se debe principalmente a la falta de metodologías adecuadas, que dificulta las investigaciones.

Divulgamos una estrategia experimental cuantitativa y comprensivo explorar cómo metabolismo funciona cuando un alimento se suministra como una mezcla de diferentes moléculas, es decir, un recurso complejo. Aquí, Describimos su aplicación para la evaluación de la partición de múltiples fuentes de nitrógeno a través de la red metabólica de la levadura. El flujo de trabajo combina la información obtenida durante experimentos de trazalíneas de isótopos estables usando las ¹³C – o sustratos marcados con N ¹⁵. Primero consiste en fermentaciones paralelas y reproducibles en el mismo medio, que incluye una mezcla de moléculas que contiene N; sin embargo, una fuente de nitrógeno seleccionado se etiqueta cada vez. Se implementa una combinación de procedimientos analíticos (HPLC, GC-MS) para evaluar los patrones Etiquetadoras de compuestos específicos y cuantificar el consumo y la recuperación de sustratos en otros metabolitos. Un análisis integrado del conjunto completo de datos proporciona una visión general del destino de sustratos consumidos dentro de las células. Este enfoque requiere un protocolo preciso para la recolección de las muestras – facilitado por un sistema asistido por robot para monitoreo en línea de fermentaciones- y la realización de numerosos análisis desperdiciador de tiempo. A pesar de estas limitaciones, permitió entender por primera vez, la partición de múltiples fuentes de nitrógeno a través de la red metabólica de la levadura. Había aclarada la redistribución del nitrógeno de las fuentes más abundantes hacia otros compuestos de N y determinar el origen metabólico de proteinogenic aminoácidos y moléculas volátiles.

Introduction

Entender cómo funciona el metabolismo microbiano es una cuestión clave para el diseño de estrategias eficientes para mejorar los procesos de fermentación y modulan la producción de compuestos fermentativos. Avances en genómica y genómica funcional en estas dos últimas décadas contribuidas en gran medida a ampliar los conocimientos de la topología de redes metabólicas en muchos microorganismos. Acceso a esta información condujo al desarrollo de enfoques que buscan un panorama completo de la función celular¹. Estas metodologías dependen a menudo de una interpretación basada en modelos de parámetros mensurables. Estos datos experimentales incluyen, por un lado, las tasas de captación y producción de metabolitos y, por otro lado, experimentos cuantitativo información intracelular que se obtiene del trazalíneas de isótopos. Estos datos proporcionan información esencial para la deducción de la actividad en vivo de las diferentes vías en una red metabólica definida^2,3,4. Actualmente, las técnicas analíticas disponibles sólo permiten la detección precisa de etiquetado patrones de moléculas cuando se utiliza un solo elemento isótopo y posiblemente al conjunto de etiquetado con dos elementos isotópicos. Por otra parte, en la mayoría de las condiciones de crecimiento, la fuente de carbono sólo se compone de uno o dos compuestos. En consecuencia, los enfoques basados en marcadores isotópicos de C ¹³de substratos de carbón ampliamente y con éxito se aplicaron para desarrollar una comprensión completa de carbono red metabólica operaciones^{5,6,7 ,8}.

Por el contrario, en muchos ambientes naturales e industriales, el recurso de nitrógeno disponible que apoya crecimiento microbiano se compone a menudo de una amplia gama de moléculas. Por ejemplo, durante la fermentación del vino o la cerveza, nitrógeno se presenta como una mezcla de 18 aminoácidos y amonio en concentraciones variables⁹. Este conjunto de compuestos de N que son accesibles para el anabolismo hace estas condiciones medios complejos considerablemente diferentes de las utilizadas para estudios fisiológicos, como este último se logra mediante una fuente única de nitrógeno, por lo general amonio.

En general, internalizado nitrógeno compuestos pueden ser incorporados en las proteínas directamente o catabolizados. La estructura de la red del metabolismo de nitrógeno en muchos microorganismos, incluyendo la levadura Saccharomyces cerevisiae, es muy compleja según la diversidad de sustratos. Esquemáticamente, este sistema se basa en la combinación del núcleo central del metabolismo de nitrógeno que cataliza la interconversión de glutamina, glutamato y el α-cetoglutarato^10,11, con las aminotransferasas y Desaminasas. A través de esta red, se reúnen grupos de Amina de amonio o de otros aminoácidos y α-ceto ácidos liberados. Estos productos intermedios son también sintetizado a carbón central metabolismo (CCM)^12,13. Este gran número de reacciones ramificadas y productos intermedios, involucrados en el catabolismo de las fuentes de nitrógeno exógeno y el anabolismo de aminoácidos proteinogenic, cumple con los requisitos anabólicos de las células. También resultados de la actividad a través de estas diferentes rutas interconectadas en la excreción de metabolitos. En particular, α-ceto ácidos pueden ser redirigidos a través de la vía de Ehrlich a producir alcoholes superiores y sus derivados de éster de acetato de¹⁴, que son contribuidores esenciales a los perfiles sensoriales de los productos. Posteriormente, cómo funciona el metabolismo del nitrógeno juega un papel clave en la producción de biomasa y la formación de moléculas volátiles (aroma).

Las reacciones, las enzimas y genes implicados en el metabolismo del nitrógeno son ampliamente descritos en la literatura. Sin embargo, la cuestión de la distribución de múltiples fuentes de nitrógeno a través de una red metabólica ha no aún abordada. Hay dos razones principales que explican esta falta de información. En primer lugar, dada la importante complejidad de la red de metabolismo del nitrógeno, una gran cantidad de datos cuantitativos se requiere para una comprensión completa de su funcionamiento que no estaba disponible hasta ahora. Segundo, muchas limitaciones experimentales y limitaciones de los métodos analíticos impidieron la aplicación de métodos que fueron utilizados previamente para la aclaración de la función CCM.

Para superar estos problemas, decidimos desarrollar un enfoque de nivel de sistema que se basa en la reconciliación de los datos de una serie de experimentos de trazador isotópico. El flujo de trabajo incluye:
-Una serie de fermentaciones realizadas bajo las mismas condiciones ambientales, mientras que otra fuente nutrientes seleccionada (sustrato) se etiqueta cada vez.
-Una combinación de procedimientos analíticos (HPLC, GC-MS) para una determinación precisa, en diferentes etapas de la fermentación, de la concentración residual de sustrato marcado y la concentración y el enriquecimiento isotópico de compuestos que se derivan de el catabolismo de la molécula marcada, incluida la derivada de la biomasa.
-Un cálculo del equilibrio isotópico y masa para cada uno consume molécula marcada y un posterior análisis integrado del conjunto de datos para obtener una visión global de la gestión de múltiples fuentes de nutrientes por los microorganismos a través de la determinación de coeficientes de flujo .

Para aplicar esta metodología, debe prestarse atención al comportamiento reproducible del microorganismo y la tensión entre culturas. Además, deben tomarse muestras de diferentes culturas durante el progreso mismo de fermentación bien definidos. En el trabajo experimental en este manuscrito, un sistema de robótica se utiliza para el monitoreo en línea de las fermentaciones para tener en cuenta estas limitaciones.

Además, es esencial elegir un conjunto de sustratos marcados (compuesto, naturaleza y posición de las etiquetas) que es apropiado para abordar el problema científico del estudio. Aquí, arginina, glutamina y ¹⁵marcado con el N amonio fueron seleccionados como las tres fuentes de nitrógeno más importantes encontradas en el jugo de uva. Esto permitió evaluar el patrón de redistribución del nitrógeno de compuestos consumidos a los aminoácidos proteinogenic. También se intentó investigar el destino de la columna vertebral de carbono de los aminoácidos consumidos y su contribución a la producción de moléculas volátiles. Para cumplir con este objetivo, uniformemente leucina marcada con C ¹³, isoleucina, treonina y valina fueron incluidos en el estudio como aminoácidos que se derivan de importantes intermediarios de la vía de los Ehrlich.

En general, exploramos cuantitativamente cómo levadura gestiona un recurso complejo nitrógeno por redistribución de fuentes exógenas de nitrógeno para cumplir con sus requerimientos anabólicos a través Fermentación mientras que además quita el exceso de precursores de carbono como moléculas volátiles. El procedimiento experimental reportado en este trabajo puede aplicarse para investigar otras múltiples fuentes de nutrientes utilizadas por cualquier otro microorganismo. Parece ser un enfoque apropiado para el análisis del impacto de la genética o las condiciones ambientales en el comportamiento metabólico de los microorganismos.

Protocol

1. fermentación y toma de muestras Preparación de medios de comunicación y fermentadoresNota: Todas las fermentaciones son llevadas a cabo en paralelo, con la misma tensión y en el mismo químicamente definición medio sintético (SM, composición proporcionada en la tabla 1), que incluye una mezcla de amonio y aminoácidos como fuentes de nitrógeno15. Para cada fermentación, un compuesto de nitrógeno solo se proporciona exclusivamente en un …

Representative Results

Figura 3 presenta un diagrama esquemático del flujo de trabajo que llevó a cabo para investigar la gestión de las múltiples fuentes de nitrógeno que se encuentran durante la fermentación la levadura.Para diferentes puntos de muestreo, las características de los parámetros biológicos, crecimiento, patrones de consumo de nitrógeno y el perfil de aminoácidos proteinogenic-muestran una alta reproducibilidad entre las fermentaciones (<strong class="…

Discussion

Cuantificación de la partición de los compuestos a través de redes metabólicas experimentos de trazador isotópico es un enfoque prometedor para entender el funcionamiento del metabolismo microbiano. Esta metodología, mientras que aplica con éxito con uno o dos sustratos etiquetados, no puede ser implementada actualmente para estudiar el metabolismo de varias fuentes usando múltiples etiquetados isótopos elementales (es decir, más de dos substratos). De hecho, las técnicas analíticas disponibles permi…

Materials

D-Glucose	PanReac	141341.0416
D-Fructose	PanReac	142728.0416
DL-Malic acid	Sigma Aldrich	M0875
Citric acid monohydrate	Sigma Aldrich	C7129
Potassium phosphate monobasic	Sigma Aldrich	P5379
Potassium sulfate	Sigma Aldrich	P0772
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma Aldrich	230391
Calcium chloride dihydrate	Sigma Aldrich	C7902
Sodium chloride	Sigma Aldrich	S9625
Ammonium chloride	Sigma Aldrich	A4514
Sodium hydroxide	Sigma Aldrich	71690
Manganese sulfate monohydrate	Sigma Aldrich	M7634
Zinc sulfate heptahydrate	Sigma Aldrich	Z4750
Copper (II) sulfate pentahydrate	Sigma Aldrich	C7631
Potassium iodine	Sigma Aldrich	P4286
Cobalt (II) chloride hexahydrate	Sigma Aldrich	C3169
Boric acid	Sigma Aldrich	B7660
Ammonium heptamolybdate	Sigma Aldrich	A7302
Myo-inositol	Sigma Aldrich	I5125
D-Pantothenic acid hemicalcium salt	Sigma Aldrich	21210
Thiamine, hydrochloride	Sigma Aldrich	T4625
Nicotinic acid	Sigma Aldrich	N4126
Pyridoxine	Sigma Aldrich	P5669
Biotine	Sigma Aldrich	B4501
Ergostérol	Sigma Aldrich	E6510
Tween 80	Sigma Aldrich	P1754
Ethanol absolute	VWR Chemicals	101074F
Iron (III) chloride hexahydrate	Sigma Aldrich	236489
L-Aspartic acid	Sigma Aldrich	A9256
L-Glutamic acid	Sigma Aldrich	G1251
L-Alanine	Sigma Aldrich	A7627
L-Arginine	Sigma Aldrich	A5006
L-Cysteine	Sigma Aldrich	C7352
L-Glutamine	Sigma Aldrich	G3126
Glycine	Sigma Aldrich	G7126
L-Histidine	Sigma Aldrich	H8000
L-Isoleucine	Sigma Aldrich	I2752
L-Leucine	Sigma Aldrich	L8000
L-Lysine	Sigma Aldrich	L5501
L-Methionine	Sigma Aldrich	M9625
L-Phenylalanine	Sigma Aldrich	P2126
L-Proline	Sigma Aldrich	P0380
L-Serine	Sigma Aldrich	S4500
L-Threonine	Sigma Aldrich	T8625
L-Tryptophane	Sigma Aldrich	T0254
L-Tyrosine	Sigma Aldrich	T3754
L-Valine	Sigma Aldrich	V0500
13C5-L-Valine	Eurisotop	CLM-2249-H-0.25
13C6-L-Leucine	Eurisotop	CLM-2262-H-0.25
15N-Ammonium chloride	Eurisotop	NLM-467-1
ALPHA-15N-L-Glutamine	Eurisotop	NLM-1016-1
U-15N4-L-Arginine	Eurisotop	NLM-396-PK
Ethyl acetate	Sigma Aldrich	270989
Ethyl propanoate	Sigma Aldrich	112305
Ethyl 2-methylpropanoate	Sigma Aldrich	246085
Ethyl butanoate	Sigma Aldrich	E15701
Ethyl 2-methylbutanoate	Sigma Aldrich	306886
Ethyl 3-methylbutanoate	Sigma Aldrich	8.08541.0250
Ethyl hexanoate	Sigma Aldrich	148962
Ethyl octanoate	Sigma Aldrich	W244910
Ethyl decanoate	Sigma Aldrich	W243205
Ethyl dodecanoate	Sigma Aldrich	W244112
Ethyl lactate	Sigma Aldrich	W244015
Diethyl succinate	Sigma Aldrich	W237701
2-methylpropyl acetate	Sigma Aldrich	W217514
2-methylbutyl acetate	Sigma Aldrich	W364401
3-methyl butyl acetate	Sigma Aldrich	287725
2-phenylethyl acetate	Sigma Aldrich	290580
2-methylpropanol	Sigma Aldrich	294829
2-methylbutanol	Sigma Aldrich	133051
3-methylbutanol	Sigma Aldrich	309435
Hexanol	Sigma Aldrich	128570
2-phenylethanol	Sigma Aldrich	77861
Propanoic acid	Sigma Aldrich	94425
Butanoic acid	Sigma Aldrich	19215
2-methylpropanoic acid	Sigma Aldrich	58360
2-methylbutanoic acid	Sigma Aldrich	193070
3-methylbutanoic acid	Sigma Aldrich	W310212
Hexanoic acid	Sigma Aldrich	153745
Octanoic acid	Sigma Aldrich	W279900
Decanoic acid	Sigma Aldrich	W236403
Dodecanoic acid	Sigma Aldrich	L556
Fermentor 1L	Legallais	AT1357	Fermenter handmade for fermentation
Disposable vacuum filtration system	Dominique Deutscher	029311
Fermenters (250 ml)	Legallais	AT1352	Fermenter handmade for fermentation
Sterile tubes	Sarstedt	62.554.502
Fermentation locks	Legallais	AT1356	Fermetation locks handmade for fermentation
BactoYeast Extract	Becton, Dickinson and Company	212750
BactoPeptone	Becton, Dickinson and Company	211677
Incubator shaker	Infors HT
Particle Counter	Beckman Coulter	6605697	Multisizer 3 Coulter Counter
Centrifuge	Jouan		GR412
Plate Butler Robotic system	Lab Services BV	PF0X-MA	Automatic instrument
Plate Butler Software	Lab Services BV		Robot monitor software
RobView			In-house developed calculation software
My SQL			International source database
Cimarec i Telesystem Multipoint Stirrers	Thermo Fisher Scientific	50088009	String Drive 60
BenchBlotter platform rocker	Dutscher	60903
Ammonia enzymatic kit	R-Biopharm AG	5390
Spectrophotometer cuvettes	VWR	634-0678
Spectrophotometer UviLine 9400	Secomam
Amino acids standards physiological – acidics and neutrals	Sigma Aldrich	A6407
Amino acids standards physiological – basics	Sigma Aldrich	A6282
Citrate lithium buffers – Ultra ninhydrin reagent	Biochrom	BC80-6000-06
Sulfosalycilic acid	Sigma Aldrich	S2130
Norleucine	Sigma Aldrich	N1398
Biochrom 30 AAA	Biochrom
EZChrom Elite	Biochrom		Instrument control and Data analysis software
Ultropac 8 resin Lithium	Biochrom	BC80-6002-47	Lithium High Resolution Physiological Column
Filter Millex GV	Merck Millipore	SLGVX13NL	Millex GV 13mm (pore size 0.22 µm)
Membrane filter PALL	VWR	514-4157	Supor-450 47mm 0.45µm
Vacuum pump Millivac Mini	Millipore	XF5423050
Aluminium smooth weigh dish 70mm	VWR	611-1380
Precision balance	Mettler		Specifications AE163
Dimethyl sulfoxid dried	Merck	1029310161	(max. 0.025% H2O) SeccoSolv
Combustion oven	Legallais
Pierce BCA protein assay kit	Interchim	UP40840A
Formic acid	Fluka	94318
Hydrogen peroxide	Sigma Aldrich	H1009
Hydrochloric Acid Fuming 37% Emsure	Merck	1003171000	Grade ACS,ISO,Reag. Ph Eur
Lithium acetate buffer	Biochrom	80-2038-10
Commercial solution of hydrolyzed amino acids	Sigma Aldrich	AAS18
L-Methionine sulfone	Sigma Aldrich	M0876
L-Cysteic acid monohydrate	Sigma Aldrich	30170
Pyrex glass culture tubes	Sigma Aldrich	Z653586
Pyridine	Acros Organics	131780500	99% Extrapure
Ethyl chloroformate	Sigma Aldrich	23131
Dichloromethane	Sigma Aldrich	32222
Vials	Sigma Aldrich	854165
Microinserts for 1.5ml vials	Sigma Aldrich	SU860066
GC/MS	Agilent Technologies	5890 GC/5973 MS
Chemstation	Agilent Technologies		Instrument control and data analysis software
Methanol	Sigma Aldrich	34860	Chromasolv, for HPLC
Acetonitrile	Sigma Aldrich	34998	ChromasolvPlus, for HPLC
N,N-Dimethylformamide dimethyl acetal	Sigma Aldrich	394963
BSTFA	Sigma Aldrich	33024
DB-17MS column	Agilent Technologies	122-4731	30m*0.25mm*0.15µm
Sodium sulfate, anhydrous	Sigma Aldrich	238597
Technical nitrogen	Air products	14629
Zebron ZB-WAX column	Phenomenex	7HG-G007-11	30m*0.25mm*0.25µm
Helium BIP	Air products	26699
Glass Pasteur pipettes	VWR	612-1702