Arbejdsproces baseret på en kombination af isotopiske Tracer eksperimenter til at undersøge mikrobiel metabolisme af flere næringsstoffer kilder
Summary
Denne protokol beskriver en eksperimentel procedure kvantitativt og grundigt undersøge metabolismen af flere næringsstoffer kilder. Denne arbejdsproces, baseret på en kombination af isotopiske tracer eksperimenter og en analytisk procedure, tillader skæbnen af forbrugt næringsstoffer og metaboliske oprindelsen af molekyler synthetized af mikroorganismer skal fastlægges.
Abstract
Undersøgelser inden for Mikrobiologi stole på gennemførelsen af en bred vifte af metoder. Især bidrager udviklingen af hensigtsmæssige metoder væsentligt til at yde omfattende viden om metabolismen af mikroorganismer vokser i kemisk definerede medier indeholdende unikke kvælstof og kulstof kilder. Derimod forbliver forvaltning gennem metabolisme af flere næringsstoffer kilder, trods deres brede tilstedeværelse i naturlige eller industrielle miljøer, stort set uudforskede. Denne situation skyldes hovedsagelig manglen på hensigtsmæssige metoder, som hindrer undersøgelser.
Vi rapporterer en eksperimentel strategi at kvantitativt og grundigt undersøge hvordan stofskifte fungerer når et næringsstof er givet som en blanding af forskellige molekyler, dvs, en kompleks ressource. Her, beskriver vi sin ansøgning om vurdering af partitionering af flere kvælstof kilder gennem gær metaboliske netværk. Arbejdsprocessen kombinerer oplysninger indhentet under stabile isotop tracer eksperimenter ved hjælp af udvalgte 13C- eller 15N-mærket substrater. Den første består af parallelle og reproducerbare fermenteringer i det samme medium, som omfatter en blanding af N-holdige molekyler; imidlertid er valgte kvælstof kilde mærket hver gang. En kombination af analytiske procedurer (HPLC, GC-MS) er gennemført til at vurdere de mærkning mønstre af målrettede forbindelser og kvantificere forbrug og inddrivelse af substrater i andre metabolitter. En integreret analyse af det komplette datasæt indeholder en oversigt over skæbnen af forbrugt substrater i celler. Denne tilgang kræver en nøjagtig protokol for indsamling af prøver – lettet af en robot-assisteret system til online overvågning af fermenteringer – og opfyldelse af talrige tidskrævende analyser. Trods disse begrænsninger, er det tilladt forståelse, for første gang, en opdeling af flere kvælstof kilder hele gær metaboliske netværk. Vi belyst omfordeling af kvælstof fra mere rigelige kilder mod andre N-forbindelser og bestemmes de metaboliske oprindelsen af flygtige molekyler og proteinogeniske aminosyrer.
Introduction
Forståelse er hvordan mikrobiel metabolisme fungerer et nøglespørgsmål for udformningen af effektive strategier til at forbedre gæring processer og modulere produktion af Fermentativ forbindelser. Fremskridt inden for genomforskning og funktionel genomforskning i disse sidste to årtier i høj grad bidraget til at udvide kendskabet til topologien for metaboliske netværk i mange mikroorganismer. Adgang til disse oplysninger førte til udviklingen af strategier, der sigter til et samlet overblik over cellefunktion1. Disse metoder er ofte afhængige en modelbaseret fortolkning af målelige parametre. Disse eksperimentelle data omfatter på den ene side metabolit optagelsen og produktion priser, og på den anden side kvantitative intracellulære oplysninger, der er fremstillet af isotop tracer eksperimenter. Disse data giver væsentlige oplysninger for fradrag i vivo aktivitet af forskellige veje i en defineret metaboliske netværk2,3,4. I øjeblikket, de tilgængelige analytiske teknikker kun giver nøjagtig påvisning af mærkning mønstre af molekyler, når ved hjælp af et enkelt element isotop og eventuelt når Co mærkning med to isotopiske elementer. Desuden under de fleste vækstbetingelser består carbon kilde kun af én eller to-forbindelser. Derfor blev strategier baseret på 13C-isotopiske røbestoffer fra carbon substrater bredt og med succes anvendt til at udvikle en fuldstændig forståelse af kulstof metaboliske network operations5,6,7 ,8.
Derimod i mange naturlige og industrielle miljøer, er den tilgængelige kvælstof ressource, der understøtter mikrobiel vækst ofte sammensat af en lang række molekyler. For eksempel undergæring vin eller øl er kvælstof fastsat som en blanding af 18 aminosyrer og ammonium på varierende koncentrationer9. Denne vifte af N-forbindelser, der er tilgængelige for anabolisme gør disse komplekse medier betingelser meget forskellige fra dem, der almindeligvis anvendes til fysiologiske studier, som sidstnævnte er opnået ved hjælp af en unik kilde til kvælstof, typisk ammonium.
Samlet set internaliseret kvælstof forbindelser kan være direkte indarbejdet i proteiner eller kataboliseres. Netværksstruktur kvælstof metabolisme i mange mikroorganismer, herunder gær Saccharomyces cerevisiae, er meget kompliceret i overensstemmelse med mangfoldigheden af substrater. Skematisk, er dette system baseret på en kombination af den centrale kerne af kvælstof stofskifte, som katalyserer omdannelse af glutamin, glutamat, og α-ketoglutarat10,11, med transaminaser og deaminases. Gennem dette netværk, amine grupper fra ammonium eller andre aminosyrer er samlet og α-keto syrer frigivet. Disse mellemprodukter er også synthetized gennem central carbon stofskifte (CCM)12,13. Dette store antal forgrenede reaktioner og mellemprodukter, involveret i både katabolisme af eksogene kvælstof kilder og anabolisme proteinogeniske aminosyrer, opfylder de anabolske krav for cellerne. Aktivitet gennem disse forskellige indbyrdes forbundne veje medfører også udskillelsen af metabolitter. Især kan α-keto syrer blive omdirigeret gennem Ehrlich sti til at producere højere alkoholer og deres acetat ester derivater14, som er væsentlige bidragydere til sensoriske profiler af produkter. Efterfølgende, spiller hvordan kvælstof stofskifte fungerer en central rolle i produktion af biomasse og dannelsen af flygtige molekyler (aroma).
Reaktioner, enzymer og gener involveret i kvælstof stofskifte er udførligt beskrevet i litteraturen. Men spørgsmålet om fordelingen af flere kvælstof kilder hele en metabolisk netværk har endnu ikke blevet behandlet. Der er to hovedårsager til at forklarer denne manglende oplysninger. Først, i betragtning af kvælstof stofskifte netværk vigtigt kompleksitet, en stor mængde kvantitative data er nødvendige for en fuldstændig forståelse af dens drift, der var tilgængelige indtil nu. Andet, mange eksperimentelle begrænsninger og begrænsninger af analysemetoder forhindrede gennemførelse af tiltag, der tidligere blev brugt til belysning af CCM funktion.
For at overvinde disse problemer, valgte vi at udvikle en system-niveau tilgang, der bygger på forsoning af data fra en række isotopiske tracer eksperimenter. Arbejdsgangen indeholder:
-Et sæt af fermenteringer foretaget under samme miljøforhold, mens en anden valgte næringsstof kilde (substrat) er mærket hver gang.
-En kombination af analytiske procedurer (HPLC, GC-MS) for en nøjagtig bestemmelse, på forskellige stadier af gæring af restkoncentrationen af mærket substrat og koncentrationen og isotopiske berigelse af forbindelser, der er afledt fra katabolisme af det mærkede molekyle, herunder afledte biomasse.
-En beregning af den masse og isotopiske balance for hver forbrugt mærket molekyle og en yderligere integreret analyse af datasæt til at opnå en global oversigt over forvaltningen af flere næringsstoffer kilder af mikroorganismer gennem bestemmelse af flux nøgletal .
Hvis du vil anvende denne metode, skal være opmærksom reproducerbare funktionsmåden for stamme/mikroorganisme mellem kulturer. Derudover skal prøver fra forskellige kulturer tages under den samme veldefinerede gæring fremskridt. I det eksperimentelle arbejde rapporteret i dette manuskript, bruges en robot-assisteret system til online overvågning af fermenteringer at tage højde for disse begrænsninger.
Derudover er det vigtigt at vælge et sæt af mærket substrater (sammensatte, art og placering af mærkning), der er passende på videnskabelige problemet af undersøgelsen. Her, blev 15N-mærket ammonium, Glutamin og arginin udvalgt som de tre store kvælstof kilder fundet i druesaft. Dette gav mulighed for vurdering af mønstret af kvælstof omfordeling fra forbrugte forbindelser til proteinogeniske aminosyrer. Vi har også til formål at undersøge skæbnen af kulstof rygraden i de forbrugte aminosyrer og deres bidrag til produktionen af flygtige molekyler. For at opfylde denne målsætning, ensartet 13C-mærket leucin, blev isoleucin, threonin og valin inkluderet i undersøgelsen som aminosyrer, der er afledt af store mellemprodukter af Ehrlich sti.
Alt i alt udforsket vi kvantitativt hvordan gær administrerer en kompleks kvælstof ressource ved at omfordele eksogene kvælstof kilder for at opfylde dens anabolske krav i hele gæringen mens du derudover fjerner overskydende af kulstof prækursorer som flygtige molekyler. Forsøgsmetoden rapporteret i dette papir kan anvendes til at undersøge andre flere næringsstoffer kilder bruges af nogen andre mikroorganisme. Det synes at være en passende tilgang til analyse af virkningen af genetiske baggrund eller miljømæssige forhold på den metaboliske opførsel af mikroorganismer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kvantificering af partitionering af forbindelser gennem metaboliske netværk ved hjælp af isotopiske tracer eksperimenter er en lovende tilgang for at forstå driften af mikrobiel metabolisme. Denne metode, kan ikke mens anvendt med succes med én eller to mærket underlag, i øjeblikket være gennemført for at undersøge metaboliseringen af forskellige kilder ved hjælp af flere mærket elementært isotoper (dvs., mere end to substrater). Faktisk, de tilgængelige analytiske teknikker aktiverer den nøjagtige…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takke Jean Roch Mouret, Sylvie Dequin og Jean-Marie Sabalyrolles for at bidrage til udformningen af ordningen for robot-assisteret gæring og Martine Pradal, Nicolas Bouvier og Pascale Brial for deres tekniske support. Finansieringen af dette projekt blev leveret af Ministère de l’Education Nationale, de la Recherche et de la Technologie.
Materials
| D-Glucose | PanReac | 141341.0416 | |
| D-Fructose | PanReac | 142728.0416 | |
| DL-Malic acid | Sigma Aldrich | M0875 | |
| Citric acid monohydrate | Sigma Aldrich | C7129 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P5379 | |
| Potassium sulfate | Sigma Aldrich | P0772 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | 230391 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C7902 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S9625 | |
| Ammonium chloride | Sigma Aldrich | A4514 | |
| Sodium hydroxide | Sigma Aldrich | 71690 | |
| Manganese sulfate monohydrate | Sigma Aldrich | M7634 | |
| Zinc sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | Z4750 | |
| Copper (II) sulfate pentahydrate | Sigma Aldrich | C7631 | |
| Potassium iodine | Sigma Aldrich | P4286 | |
| Cobalt (II) chloride hexahydrate | Sigma Aldrich | C3169 | |
| Boric acid | Sigma Aldrich | B7660 | |
| Ammonium heptamolybdate | Sigma Aldrich | A7302 | |
| Myo-inositol | Sigma Aldrich | I5125 | |
| D-Pantothenic acid hemicalcium salt | Sigma Aldrich | 21210 | |
| Thiamine, hydrochloride | Sigma Aldrich | T4625 | |
| Nicotinic acid | Sigma Aldrich | N4126 | |
| Pyridoxine | Sigma Aldrich | P5669 | |
| Biotine | Sigma Aldrich | B4501 | |
| Ergostérol | Sigma Aldrich | E6510 | |
| Tween 80 | Sigma Aldrich | P1754 | |
| Ethanol absolute | VWR Chemicals | 101074F | |
| Iron (III) chloride hexahydrate | Sigma Aldrich | 236489 | |
| L-Aspartic acid | Sigma Aldrich | A9256 | |
| L-Glutamic acid | Sigma Aldrich | G1251 | |
| L-Alanine | Sigma Aldrich | A7627 | |
| L-Arginine | Sigma Aldrich | A5006 | |
| L-Cysteine | Sigma Aldrich | C7352 | |
| L-Glutamine | Sigma Aldrich | G3126 | |
| Glycine | Sigma Aldrich | G7126 | |
| L-Histidine | Sigma Aldrich | H8000 | |
| L-Isoleucine | Sigma Aldrich | I2752 | |
| L-Leucine | Sigma Aldrich | L8000 | |
| L-Lysine | Sigma Aldrich | L5501 | |
| L-Methionine | Sigma Aldrich | M9625 | |
| L-Phenylalanine | Sigma Aldrich | P2126 | |
| L-Proline | Sigma Aldrich | P0380 | |
| L-Serine | Sigma Aldrich | S4500 | |
| L-Threonine | Sigma Aldrich | T8625 | |
| L-Tryptophane | Sigma Aldrich | T0254 | |
| L-Tyrosine | Sigma Aldrich | T3754 | |
| L-Valine | Sigma Aldrich | V0500 | |
| 13C5-L-Valine | Eurisotop | CLM-2249-H-0.25 | |
| 13C6-L-Leucine | Eurisotop | CLM-2262-H-0.25 | |
| 15N-Ammonium chloride | Eurisotop | NLM-467-1 | |
| ALPHA-15N-L-Glutamine | Eurisotop | NLM-1016-1 | |
| U-15N4-L-Arginine | Eurisotop | NLM-396-PK | |
| Ethyl acetate | Sigma Aldrich | 270989 | |
| Ethyl propanoate | Sigma Aldrich | 112305 | |
| Ethyl 2-methylpropanoate | Sigma Aldrich | 246085 | |
| Ethyl butanoate | Sigma Aldrich | E15701 | |
| Ethyl 2-methylbutanoate | Sigma Aldrich | 306886 | |
| Ethyl 3-methylbutanoate | Sigma Aldrich | 8.08541.0250 | |
| Ethyl hexanoate | Sigma Aldrich | 148962 | |
| Ethyl octanoate | Sigma Aldrich | W244910 | |
| Ethyl decanoate | Sigma Aldrich | W243205 | |
| Ethyl dodecanoate | Sigma Aldrich | W244112 | |
| Ethyl lactate | Sigma Aldrich | W244015 | |
| Diethyl succinate | Sigma Aldrich | W237701 | |
| 2-methylpropyl acetate | Sigma Aldrich | W217514 | |
| 2-methylbutyl acetate | Sigma Aldrich | W364401 | |
| 3-methyl butyl acetate | Sigma Aldrich | 287725 | |
| 2-phenylethyl acetate | Sigma Aldrich | 290580 | |
| 2-methylpropanol | Sigma Aldrich | 294829 | |
| 2-methylbutanol | Sigma Aldrich | 133051 | |
| 3-methylbutanol | Sigma Aldrich | 309435 | |
| Hexanol | Sigma Aldrich | 128570 | |
| 2-phenylethanol | Sigma Aldrich | 77861 | |
| Propanoic acid | Sigma Aldrich | 94425 | |
| Butanoic acid | Sigma Aldrich | 19215 | |
| 2-methylpropanoic acid | Sigma Aldrich | 58360 | |
| 2-methylbutanoic acid | Sigma Aldrich | 193070 | |
| 3-methylbutanoic acid | Sigma Aldrich | W310212 | |
| Hexanoic acid | Sigma Aldrich | 153745 | |
| Octanoic acid | Sigma Aldrich | W279900 | |
| Decanoic acid | Sigma Aldrich | W236403 | |
| Dodecanoic acid | Sigma Aldrich | L556 | |
| Fermentor 1L | Legallais | AT1357 | Fermenter handmade for fermentation |
| Disposable vacuum filtration system | Dominique Deutscher | 029311 | |
| Fermenters (250 ml) | Legallais | AT1352 | Fermenter handmade for fermentation |
| Sterile tubes | Sarstedt | 62.554.502 | |
| Fermentation locks | Legallais | AT1356 | Fermetation locks handmade for fermentation |
| BactoYeast Extract | Becton, Dickinson and Company | 212750 | |
| BactoPeptone | Becton, Dickinson and Company | 211677 | |
| Incubator shaker | Infors HT | ||
| Particle Counter | Beckman Coulter | 6605697 | Multisizer 3 Coulter Counter |
| Centrifuge | Jouan | GR412 | |
| Plate Butler Robotic system | Lab Services BV | PF0X-MA | Automatic instrument |
| Plate Butler Software | Lab Services BV | Robot monitor software | |
| RobView | In-house developed calculation software | ||
| My SQL | International source database | ||
| Cimarec i Telesystem Multipoint Stirrers | Thermo Fisher Scientific | 50088009 | String Drive 60 |
| BenchBlotter platform rocker | Dutscher | 60903 | |
| Ammonia enzymatic kit | R-Biopharm AG | 5390 | |
| Spectrophotometer cuvettes | VWR | 634-0678 | |
| Spectrophotometer UviLine 9400 | Secomam | ||
| Amino acids standards physiological – acidics and neutrals | Sigma Aldrich | A6407 | |
| Amino acids standards physiological – basics | Sigma Aldrich | A6282 | |
| Citrate lithium buffers – Ultra ninhydrin reagent | Biochrom | BC80-6000-06 | |
| Sulfosalycilic acid | Sigma Aldrich | S2130 | |
| Norleucine | Sigma Aldrich | N1398 | |
| Biochrom 30 AAA | Biochrom | ||
| EZChrom Elite | Biochrom | Instrument control and Data analysis software | |
| Ultropac 8 resin Lithium | Biochrom | BC80-6002-47 | Lithium High Resolution Physiological Column |
| Filter Millex GV | Merck Millipore | SLGVX13NL | Millex GV 13mm (pore size 0.22 µm) |
| Membrane filter PALL | VWR | 514-4157 | Supor-450 47mm 0.45µm |
| Vacuum pump Millivac Mini | Millipore | XF5423050 | |
| Aluminium smooth weigh dish 70mm | VWR | 611-1380 | |
| Precision balance | Mettler | Specifications AE163 | |
| Dimethyl sulfoxid dried | Merck | 1029310161 | (max. 0.025% H2O) SeccoSolv |
| Combustion oven | Legallais | ||
| Pierce BCA protein assay kit | Interchim | UP40840A | |
| Formic acid | Fluka | 94318 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma Aldrich | H1009 | |
| Hydrochloric Acid Fuming 37% Emsure | Merck | 1003171000 | Grade ACS,ISO,Reag. Ph Eur |
| Lithium acetate buffer | Biochrom | 80-2038-10 | |
| Commercial solution of hydrolyzed amino acids | Sigma Aldrich | AAS18 | |
| L-Methionine sulfone | Sigma Aldrich | M0876 | |
| L-Cysteic acid monohydrate | Sigma Aldrich | 30170 | |
| Pyrex glass culture tubes | Sigma Aldrich | Z653586 | |
| Pyridine | Acros Organics | 131780500 | 99% Extrapure |
| Ethyl chloroformate | Sigma Aldrich | 23131 | |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | 32222 | |
| Vials | Sigma Aldrich | 854165 | |
| Microinserts for 1.5ml vials | Sigma Aldrich | SU860066 | |
| GC/MS | Agilent Technologies | 5890 GC/5973 MS | |
| Chemstation | Agilent Technologies | Instrument control and data analysis software | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 34860 | Chromasolv, for HPLC |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 34998 | ChromasolvPlus, for HPLC |
| N,N-Dimethylformamide dimethyl acetal | Sigma Aldrich | 394963 | |
| BSTFA | Sigma Aldrich | 33024 | |
| DB-17MS column | Agilent Technologies | 122-4731 | 30m*0.25mm*0.15µm |
| Sodium sulfate, anhydrous | Sigma Aldrich | 238597 | |
| Technical nitrogen | Air products | 14629 | |
| Zebron ZB-WAX column | Phenomenex | 7HG-G007-11 | 30m*0.25mm*0.25µm |
| Helium BIP | Air products | 26699 | |
| Glass Pasteur pipettes | VWR | 612-1702 |
References
- Osterlund, T., Nookaew, I., Nielsen, J. Fifteen years of large scale metabolic modeling of yeast: developments and impacts. Biotechnol Adv. 30, 979-988 (2012).
- Gombert, A. K., Moreirados Santos, M., Christensen, B., Nielsen, J. Network identification and flux quantification in the central metabolism of Saccharomyces cerevisiae under different conditions of glucose repression. J Bacteriol. 183, 1441-1451 (2001).
- Wiechert, W. 13C metabolic flux analysis. Metab Eng. 3, 195-206 (2001).
- Fischer, E., Zamboni, N., Sauer, U. High-throughput metabolic flux analysis based on gas chromatography-mass spectrometry derived 13C constraints. Anal Biochem. 325, 308-316 (2004).
- Rantanen, A., Rousu, J., Jouhten, P., Zamboni, N., Maaheimo, H., Ukkonen, E. An analytic and systematic framework for estimating metabolic flux ratios from 13C tracer experiments. BMC Bioinformatics. 9, 266 (2008).
- Zamboni, N. 13C metabolic flux analysis in complex systems. Curr Opin Biotechnol. 22, 103-108 (2011).
- Kruger, N. J., Ratcliffe, R. G. Insights into plant metabolic networks from steady-state metabolic flux analysis. Biochimie. 91, 697-702 (2009).
- Quek, L. -. E., Dietmair, S., Krömer, J. O., Nielsen, L. K. Metabolic flux analysis in mammalian cell culture. Metab Eng. 12, 161-171 (2010).
- Perpete, P., Santos, G., Bodart, E., Collin, S. Uptake of amino acids during beer production: The concept of a critical time value. J Am Soc Brew Chem. 63, 23-27 (2005).
- Magasanik, B., Kaiser, C. A. Nitrogen regulation in Saccharomyces cerevisiae. Gene. 290, 1-18 (2002).
- Ljungdahl, P. O., Daignan-Fornier, B. Regulation of amino acid, nucleotide, and phosphate metabolism in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 190, 885-929 (2012).
- Cooper, T. G., Strathern, J. N., Jones, E. W., Broach, J. R. Nitrogen metabolism in Saccharomyces cerevisiae. The molecular biology of the yeast Saccharomyces: Metabolism and gene expression. , 39-99 (1982).
- Jones, E. W., Fink, G. R., Strathern, J. N., Jones, E. W., Broach, J. R. Regulation of amino acid and nucleotide biosynthesis in yeast. The molecular biology of the yeast Saccharomyces: Metabolism and gene expression. , 182-299 (1982).
- Hazelwood, L. A., Daran, J. -. M., van Maris, A. J. A., Pronk, J. T., Dickinson, J. R. The Ehrlich pathway for fusel alcohol production: a century of research on Saccharomyces cerevisiae metabolism. Appl Environ Microbiol. 74, 2259-2266 (2008).
- Bely, M., Sablayrolles, J. M., Barre, P. Automatic detection of assimilable nitrogen deficiencies during alcoholic fermentation in oenological conditions. J Ferment Bioeng. 70, 246-252 (1990).
- Forster, J., Famili, I., Fu, P., Palsson, B. O., Nielsen, J. Genome-scale reconstruction of the Saccharomyces cerevisiae metabolic network. Genome Res. 13, 244-253 (2003).
- Millard, P., Letisse, F., Sokol, S., Portais, J. C. IsoCor: correcting MS data in isotope labeling experiments. Bioinformatics. 28, 1294-1296 (2012).
