Summary

ביטוי של אנטיגנים אקסוגני חיסון ה-BCG Mycobacterium חיידקי סטרפטקוקוס בוביס דרך קישוט משטח שאינו גנטי עם מערכת אבידין-ביוטין

Published: January 31, 2018
doi:

Summary

טכניקה הרומן לתצוגה מהירה אנטיגן על משטח חיידקי מוצג, שיכלול משטח biotinylation ואחריו חשיפה חלבונים עניין בפיוז’ן עם אבידין monomeric. טעינת BCG עם אנטיגנים שנבחר בהצלחה משפר את immunogenicity שלה, רומז כי הקליגרפיות יכול להחליף את הגישות המסורתיות גנטי.

Abstract

השחפת (TB) היא מחלה זיהומית קשה, חיסון זמין רק מ חיידקי סטרפטקוקוס בוביס bacillus Calmette-Guérin (BCG) הינו בטוח ויעיל להגנה נגד חמור טרה-בתים דלקת קרום המוח ילדים, כמה צורות של המופץ טרה-בתים, אך אינו מצליח להגן נגד שחפת, וזו הצורה השכיחה ביותר של המחלה. מבטיח אסטרטגיות לשיפור BCG כעת להסתמך גם על השינוי שלה עם הגנים קידוד immunodominant מ. שחפת (Mtb)-אנטיגנים ספציפיים ו/או קומפלמנטציה עם הגנים קידוד שיתוף גורמים המעודדים אנטיגן הצגת תאים. מגבלות הגדולות גישות אלה כוללים יעילות נמוכה, יציבות נמוכה לרמת הבטיחות של וקטורים ביטוי לא בטוח. במחקר זה, אנו מציגים גישה אלטרנטיבית לשיפור החיסון, אשר מורכב קומפלמנטציה BCG עם חלבונים אקסוגני של עניין על פני השטח של חיידקים, במקום טרנספורמציה עם פלסמידים קידוד הגנים המתאימים. ראשית, חלבונים עניין באים לידי ביטוי פיוז’ן עם אבידין monomeric ב רגיל e. coli מערכות ביטוי אז נהגו לקשט את פני השטח של biotinylated ה-BCG. ניסויים בבעלי חיים באמצעות משטח BCG מעוטרים עם הפונדקאית אובלבומין אנטיגן מדגימים כי החיידק ששונה הוא מלא immunogenic, מסוגל גרימת תגובות תא T ספציפי. בסך הכל, הנתונים המוצגים כאן בחום תמיכה של הרומן שיטה יעילה לשינוי הצורה של החיסון BCG הנוכחי מחליף את הגישה המקובלת מפרך של קומפלמנטציה עם חומצות גרעין אקסוגני.

Introduction

אסטרטגיות שונות הוצעו כדי להחליף את החיסון הנוכחי שחפת BCG, כולל חלבון אדג’וונט מערכות, טכנולוגיות הווקטורי ויראלי, זנים M.tb בשידור חי הקלוש של זנים מהונדסים BCG, גם להחדיר גנים יתר ביטוי אנטיגנים BCG באים לא מספיק לידי ביטוי במהלך זיהום1 או שחרור מהיר למוט אוכף-אנטיגנים ספציפיים מציג BCG2. עם זאת, הנדסה גנטית, פונה מחסומים רבים כולל רמת לא בטוח בטיחות התהליך זמן רב, יעילות נמוכה של הביטוי וקטורים4,5. לגבי שיפור BCG, גישה חלופית יש צורך לשפר את immunogenicity ללא צורך מסעה גנטי לא בטוח.

במחקר זה, נסקור אסטרטגיה הרומן לתצוגה של חומרים מעניינים על פני תא ה-BCG מבוססת על האינטראקציה ידועים אבידין גבוהה-זיקה עם ביוטין. גישה זו מאפשרת מצורף מהיר ולא לשחזור של recombinant אבידין פיוז’ן חלבונים על פני השטח של biotinylated BCG, אשר מקלה על מניפולציות רחבה של BCG כדי להשיג שיפור מקסימלי של יעילותה תוך שמירה על בטיחות מעולה שלה שיא, שנצפה במשך עשרות שנים של שימוש.

אבידין אהדה ביוטין הוא גבוה מאוד (Kd = 10−15 מ’), לאחר שהוקמה, המתחם ביוטין-אבידין יציב מאוד, רק יכול להיות משובשות תחת denaturing תנאים6. עם זאת, עבור סוג זה של אינטראקציה לשמש חלופה שיטה של העברת גנים, התצוגה לטווח ארוך אבל הפיכה של חומרים נדרש. לפיכך, הצגנו כאן אבידין monomeric של זיקה נמוכה (Kd = 10−7 ז) כי הפניות שחרור הפיך של חלבון מהמשטח מעוצבים BCG בלע פעם אחת בתוך אנטיגן הצגת תאים. כדי לספק הוכחה של המושג, בדקנו בשיטה זו באמצעות חלבון chimeric monomeric אבידין המתאים אנטיגן הפונדקאית נגזר אובלבומין (פשוט)7,8. התוצאות הראו כי השטח תא BCG ניתן בקלות, במהירות מעוטר אבידין monomeric פיוז’ן חלבונים, כי איגוד זה השטח BCG הינה יציב לשחזור וללא שינוי לזיהוי התפתחות חיידקים והישרדות. בנוסף, מצאנו BCG מעוטר monomeric אבידין התמזגו עם ביצית (AviOVA) יכול לגרום תגובה חיסונית הדומה לזה הנגרם על ידי BCG גנטית לבטא אותו אנטיגן גם במבחנה וגם בתוך vivo. טכנולוגיה זו תצוגה הפיך של חלבונים עניין על פני חיידקי ולכן הוא תחליף יעיל של גישות העברת גנים מסורתיים, מספקים פלטפורמה מניפולציות רחבה של BCG ויישומים נוספים בחיסון פיתוח.

Protocol

כל בעלי החיים היו נשמרים על פי פרוטוקולים אושרה על ידי חיה אכפת ועדות שימוש ב אוניברסיטת בריטיש קולומביה. הניסויים היו אושרה על ידי חיה אכפת לי להשתמש ועדות, שבוצעה על פי המועצה הקנדית על הנחיות טיפול בעלי חיים. המספר רווחת בעלי חיים אבטחת הוא A11-0247. 1. דור של חלבונים פיוז’ן אביד…

Representative Results

עם כללי בהליכים המתוארים לעיל, נבחנה הכדאיות של biotinylation משטח BCG וקישוט עם אנטיגן הפונדקאית ביצית. Immunogenicity של BCG שהשתנה היה אז נבדק בתוך vivo. השטח חיידקי סומן בקלות עם ביוטין לתצוגה מהירה של אנטיגנים chimeric אבידין ללא כל שינוי לזיהוי פנוטיפים חיידקי. BCG ששונה וכתוצאה מכך ב?…

Discussion

אנחנו דיווחו במחקר זה בגישה הלא גנטי לתצוגה מהירה ויעילה של חלבונים אקסוגני במשטח BCG להוסיף אנטיגנים ספציפיים או מאפיין פונקציונלי מסוים צפוי לשיפור ביעילות immunogenicity של החיידק. להדגים כי השטח תא BCG יכול להיות בקלות biotinylated לקישוט משטח מיידי עם אבידין פיוז’ן חלבונים. ניתן לבצע את ההליך הכולל …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים ד ר סטוקס R לזן של פסטר BCG ו א טלאל לקבלת תמיכה טכנית. אנו מודים גם GenScript על העזרה עם ג’ין סינתזה.

Materials

Endotoxin-free RPMI 1640 StemCell Technologies  36750
Sulfo-NHS SS biotin Thermo Fisher  21328
FITC-conjugated streptavidin Sigma-Aldrich S3762
Phycoerythrin (PE)-conjugated I-Ab-OVA323-339 tetramer  MBL International  TS-M710-1
7-AAD  BD Pharmingen 559925
TALON polyhistidine-Tag purification resin  Clontech 635501
Alexa Fluor (AF) 647 conjugated rat anti-mouse CD4 BD Bioscience  557681
AF647 rat anti-mouse IFN-g BD Bioscience  557735
AF647 rat anti-mouse I-A/I-E BD Bioscience  562367
PeCy7 rat anti-mouse CD4 BD Bioscience  552775
PE rat anti-mouse CD8 Ab BD Bioscience  561095
AF 647 rat anti-mouse H-2kb  BD Bioscience  562832
FITC-conjugated goat anti rabbit antibody Thermo Fisher 31635
AF 647 rat anti-mouse CD4 BD Bioscience  557681
Ultra-small gold-conjugated goat anti-rabbit IgG  Electron Microscopy Sciences  25100
Middlebrook 7H9 broth  BD Diagnostic Systems 271310
OADC BD Diagnostic Systems B11886
Tween 80 Sigma-Aldrich P1379
RAW 264.7 murine macrophage cell lines  American Type Culture Collection
pDEST17 plasmid  Invitrogen 11803012
pUC57-OVA plasmid  GenScript SD1176
BP clonase  Invitrogen 11789020
LR clonase  Invitrogen 11791043
pDONR221 plasmid Invitrogen 12536017
Ni-NTA columns  Qiagen 31014
Pierce protein concentrators  Thermo Fisher  88527
Flurosave Calbiochem-Novabiochem 345789
Axioplan II epifluorescence microscope Carl Zeiss Inc
CCD digital camera  Retiga EX, QImaging
Tecnai G2 200kV electron microscope  FEI Company G2 200Kv 
70μm Falcon cell strainer  Thermo Fisher  87712
EasyStep mouse biotin positive selection kit  StemCell 18556
biotin-Ter119/Ertyroid cells antibody BioLegend 116203
Brefeldin A BD Pharmingen 555029
Cytofix/Cytoperm kit  BD Pharmingen 554714
Bright-Glo Luciferase assay system Promega e2620
Turner Biosystem luminometer  Promega TD-20/20
Leica EM UC6 microtome  Leica Microsystems UC6
Novalyphe NL 500 freeze dryer Savant Instruments  NL 50
Wheaton boroscilicate glass vials Wheaton  VWR 66011-675

References

  1. Horwitz, M. A., Harth, G. A new vaccine against tuberculosis affords greater survival after challenge than the current vaccine in the guinea pig model of pulmonary tuberculosis. Infect. Immun. 71 (4), 1672-1679 (2003).
  2. Pym, A. S., et al. Recombinant BCG exporting ESAT-6 confers enhanced protection against tuberculosis. Nat Med. 9 (5), 548-553 (2003).
  3. Grode, L., et al. Increased vaccine efficacy against tuberculosis of recombinant Mycobacterium bovis bacille Calmette-Guerin mutants that secrete listeriolysin. The J Clin Invest. 115 (9), 2472-2479 (2005).
  4. Bastos, R. G., Borsuk, S., Seixas, F. K., Dellagostin, O. A. Recombinant Mycobacterium bovis BCG. Vaccine. 27 (47), 6495-6503 (2009).
  5. Mederle, I., et al. Plasmidic versus insertional cloning of heterologous genes in Mycobacterium bovis BCG: impact on in vivo antigen persistence and immune responses. Infect Immun. 70 (1), 303-314 (2002).
  6. Singh, N. P., et al. A Novel Approach to Cancer Immunotherapy Tumor Cells Decorated with CD80 Generate Effective Antitumor Immunity A Novel Approach to Cancer Immunotherapy Tumor Cells Decorated with CD80 Generate Effective Antitumor Immunity. Cancer Res. 63 (14), 4067-4073 (2003).
  7. Oizumi, S., Strbo, N., Pahwa, S., Deyev, V., Podack, E. R. Molecular and cellular requirements for enhanced antigen cross-presentation to CD8 cytotoxic T lymphocytes. J Immunol. 179 (4), 2310-2317 (2007).
  8. Sharif-Paghaleh, E., et al. Monitoring the efficacy of dendritic cell vaccination by early detection of (99m) Tc-HMPAO-labelled CD4(+) T cells. Eur J Immunol. 44 (7), 2188-2191 (2014).
  9. Sun, J., et al. A broad-range of recombination cloning vectors in mycobacteria. Plasmid. 62 (3), 158-165 (2009).
  10. Laitinen, O. H., et al. Rational design of an active avidin monomer. J. Biol. Chem. 278 (6), 4010-4014 (2003).
  11. Flynn, J. L., Chan, J., Triebold, K. J., Dalton, D. K., Stewart, T. A., Bloom, B. R. An essential role for interferon gamma in resistance to Mycobacterium tuberculosis infection. J Exp Med. 178 (6), 2249-2254 (1993).
  12. Liao, T. Y. A., Lau, A., Joseph, S., Hytonen, V., Hmama, Z. Improving the immunogenicity of the Mycobacterium bovis BCG vaccine by non-genetic bacterial surface decoration using the avidin-biotin system. PLoS ONE. 10 (12), e0145833 (2015).
  13. Green, N. M. Avidin and streptavidin. Methods Enzymol. 184, 51-67 (1990).
  14. Howarth, M., Takao, K., Hayashi, Y., Ting, A. Y. Targeting quantum dots to surface proteins in living cells with biotin ligase. PNAS. 102 (21), 7583-7588 (2005).
  15. Lesch, H. P., Kaikkonen, M. U., Pikkarainen, J. T., Yla-Herttuala, S. Avidin-biotin technology in targeted therapy. Expert Opin Drug Deliv. 7 (5), 551-564 (2010).
  16. Paganelli, G., Bartolomei, M., Grana, C., Ferrari, M., Rocca, P., Chinol, M. Radioimmunotherapy of brain tumor. Neurol Res. 28 (5), 518-522 (2006).
  17. Cummings, J. F., et al. Safety and immunogenicity of a plant-produced recombinant monomer hemagglutinin-based influenza vaccine derived from influenza A (H1N1)pdm09 virus: a Phase 1 dose-escalation study in healthy adults. Vaccine. 32 (19), 2251-2259 (2014).
  18. Kolotilin, I., et al. Plant-based solutions for veterinary immunotherapeutics and prophylactics. Vet Res. 45, 114-117 (2014).
  19. Demonte, D., Drake, E. J., Lim, K. H., Gulick, A. M., Park, S. Structure-based engineering of streptavidin monomer with a reduced biotin dissociation rate. Proteins. 81 (9), 1621-1633 (2013).
  20. Deghmane, A. E., et al. Lipoamide dehydrogenase mediates retention of coronin-1 on BCG vacuoles, leading to arrest in phagosome maturation. J Cell Sci. 120 (19), 3489-3489 (2007).
  21. Soualhine, H., et al. Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guerin secreting active cathepsin S stimulates expression of mature MHC class II molecules and antigen presentation in human macrophages. J Immunol. 179 (8), 5137-5145 (2007).
  22. Bubb, M. O., Green, F., Conradie, J. D., Tchernyshev, B., Bayer, E. A., Wilchek, M. Natural antibodies to avidin in human serum. ImmunolLett. 35 (3), 277-280 (1993).
  23. Petronzelli, F., et al. Therapeutic use of avidin is not hampered by antiavidin antibodies in humans. Cancer Biother Radiopharm. 25 (5), 563-570 (2010).
  24. Bigini, P., et al. In vivo fate of avidin-nucleic acid nanoassemblies as multifunctional diagnostic tools. ACS Nano. 8 (1), 175-187 (2014).

Play Video

Cite This Article
Liao, T. A., Lau, A., Sunil, J., Hytönen, V., Hmama, Z. Expression of Exogenous Antigens in the Mycobacterium bovis BCG Vaccine via Non-genetic Surface Decoration with the Avidin-biotin System. J. Vis. Exp. (131), e56421, doi:10.3791/56421 (2018).

View Video