Summary
Bakteriyel bir yüzey hızlı antijen görüntülemek için yeni bir teknik olan yüzey biotinylation proteinler füzyon monomeric avidin ile ilgi maruz takip içerir sunulur. BCG seçili antijenleri ile başarıyla yükleme yüzey dekorasyon geleneksel genetik yaklaşımlar yerine düşündüren onun immünojenisite geliştirir.
Abstract
Tüberküloz (TB) ciddi bir bulaşıcı hastalık ve biricik elde edilebilir aşı M. bovis bacillus Calmette-Guerin (BCG) çocuk şiddetli TB menenjit ve Dissemine TB bazı türlerinin karşı koruma için güvenli ve etkili ama başaramamak-e doğru korumak olduğunu Akciğer TB karşı hangi hastalığın en yaygın biçimidir. Şu anda BCG geliştirmek için umut verici stratejileri ya dönüştürmenin immunodominant M. tuberculosis (Mtb)kodlama genlerimizle itimat-belirli antijenleri ve/veya tamamlayıcı antijen teşvik etkenler kodlama genler ile hücreleri sunulması. Bu yaklaşımlara büyük sınırlamalar düşük verimlilik, düşük istikrar ve güvenliğini ifade vektörel çizimler belirsiz düzeyini içerir. Bu çalışmada, BCG uluslara bakteri, tercihan--dan dönüştürme yüzeyinde ilgi eksojen proteinler ile ilgili genlerin kodlama Plasmid'ler ile oluşur aşı geliştirme için alternatif bir yaklaşım sunuyoruz. İlk olarak, proteinler ilgi erime içinde standart E. coli monomeric avidin ile ifade edilir ifade sistemleri ve biotinylated BCG yüzeyine süslemek için kullandı. Hayvan deneyleri BCG yüzey yedek ovalbumin antijen ile dekore edilmiş kullanarak değiştirilmiş bakteri tamamen immunojenik ve belirli T hücre yanıt ikna yeteneğine sahip olduğunu göstermektedir. Tamamen, kesinlikle burada sunulan veri uluslara zahmetli geleneksel yaklaşım eksojen nükleik asitler ile değiştirir geçerli BCG aşısı yeniden şekillendirilmesi için bir roman ve verimli yöntem destekler.
Introduction
Çeşitli stratejileri geçerli TB aşı BCG protein adjuvan sistemleri, viral vektörlü teknolojileri, zayıflatılmış canlı M.tb suşları ve genetiği değiştirilmiş BCG suşları, ya genlerinin tanıtmak için de dahil olmak üzere, eski yerine koymak için önerilen yeterince enfeksiyon1 ya da Mtbsırasında gösterilir değil BCG antijenleri aşırı ifade-belirli antijenleri BCG2' mevcut değil. Genetik mühendisliği, ancak, birçok engeller Emanet, zaman alan işlem ve düşük verimlilik ifade vektörel çizimler4,5belirsiz düzey de dahil olmak üzere karşı karşıya. BCG iyileştirilmesi açısından, alternatif bir yaklaşım immünojenisite belirsiz genetik değişiklikler için gerek kalmadan geliştirmek için gereklidir.
Bu çalışmada, biotin tanınmış yüksek afinite avidin etkileşim dayanır BCG hücre yüzeyi ilgi rekombinant proteinlerin görüntü için yeni bir strateji tanıtmak. Bu yaklaşım hızlı ve tekrarlanabilir eki rekombinant avidin füzyon proteinlerin biotinylated maksimal iyileştirme onun etkinliğinin onun mükemmel emniyet koruyarak ulaşmak için BCG geniş işlemler kolaylaştırır BCG yüzeyi sağlar kayıt, kullanım yılda gözlenen.
Biotin için avidin ilgi son derece yüksektir (Kd 10−15 M =) ve bir kez kurulan, biotin avidin karmaşık çok kararlı ve yalnızca koşullar6denaturing altında bozulmuş. Ancak, bu tür bir gen transferi yöntemi alternatif olarak hizmet için etkileşim için uzun vadeli ama geri döndürülebilir ekran rekombinant proteinlerin gereklidir. Böylece, biz burada bir düşük benzeşme monomeric avidin tanıttı (Kd 10−7 M =) protein tersinir sürümü götürür yüzey hücreleri sunulması antijen içinde bir kez yutulur BCG dekore edilmiştir. Kavramının bir kanıtı olarak sağlamak için bu yöntem ovalbumin (OVA)7,8' den türetilmiş bir vekil antijen karşılık gelen bir monomeric avidin chimeric protein kullanarak test ettik. BCG hücre yüzeyine kolayca ve hızla monomeric avidin füzyon proteinler ile dekore edilebilir olduğunu ve bu bağlama BCG yüzeye istikrarlı ve bakteriyel büyüme ve hayatta kalma tespit değişiklikler olmadan tekrarlanabilir sonuçlar gösterdi. Ayrıca, monomeric avidin OVA (AviOVA) ile erimiş süslenmiş BCG BCG tarafından indüklenen için benzer bir bağışıklık yanıtı tetikleyebilir genetik olarak aynı antijen ifade bulduk vitro ve içinde vivo. Bu teknoloji bakteri yüzeyindeki ilgi proteinlerin geri döndürülebilir ekran bu nedenle geleneksel gen transferi yaklaşımlar etkili bir yerini ve BCG geniş işlemler ve daha fazla aşı uygulamaları için bir platform sağlayabilir geliştirme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bütün hayvanlar hayvan bakımı ve kullanımı Komiteler British Columbia Üniversitesi tarafından onaylanmış protokoller uyarınca muhafaza. Deneyler hayvan bakımı ve kullanımı Komiteler tarafından onaylanmış ve hayvan bakım kuralları Kanada Konseyi göre gerçekleştirilen. Hayvan güvence refah A11-0247 sayıdır.
1. nesil Monomeric Avidin füzyon protein plazmid ifade
- Alt monomeric avidin sıra12 pDEST17 plazmid 133 için karşılık gelen "CTC" ve "Tanrııı" siteler arasında içine clone-134bp. (Yani, 6-histag ve pDEST17 Attr1 rekombinasyon sitesi arasında) p17-AVI elde etmek için.
Not: Monomeric avidin DNA dizisi aşağıda gösterilmiştir. Monomeric avidin elde etmek için vahşi tipi Avidin içinde sunulan üç mutasyonlar kalın karakter gösterilir.
gccagaaagtgctcg ctgactggga aatggaccaa cgatctgggc tccATCatga ccatcggggc tgtgaacagc
agaggtgaat tcacaggcac ctacatcaca gccgtaacag ccacatcaaa tgagatcaaa gagtcaccac tgcatgggac
acaaGCTacc atcaacaaga ggacccagcc cacctttggc ttcaccgtca attggaagtt ttcagagtcc accactgtct
tcacgggcca gtgcttcata gacaggaatg ggaaggaggt cctgaagacc atgtggctgc tgcggtcaag tgttaatgac
attggtgatg acAAAaaagc taccagggtc ggcatcaaca tcttcactcg cctgcgcaca cagaaggagt ga - Tasarım OVA polipeptid757-1035 için karşılık gelen AttB1 ve B2 Attsiteleri ile çevrili astar (ı-Ab- ve H-2_Kb-sınırlı epitopları) DNA dizisi. Astar sıraları şunlardır: Attb1-OVA
GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCCTTGAGCAGCTTGAGAGTAT ve Attb2-OVA
GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGTTACCCTACCACCTCTCTGC. (Attb1 ve Attb2 dizileri kalın olan).- PCR yükseltmek OVA polipeptit757-1035 DNA dizisi ile pUC57-OVA plazmid şablon olarak kullanıp yukarıda astar.
- PCR ürünleri pDONR-221 pDONR-OVA elde etmek için bir siteye özel vitro Rekombinasyon tepkimesi (örneğin, BP Clonase) aracılığıyla içine kopyalayın.
- Faiz gen LR Clonase reaksiyon p17-AVI-OVA elde etmek için kullanarak p17-AVI içine aktarın.
Not: kan basıncı ve LR rekombinasyon klonlama ayrıntıları için üreticinin el kitabına bakın.
2. monomeric Avidin füzyon Protein ifade, arıtma ve Refolding
- E. coli BL21 p17-AVI-OVA plazmid dönüştürmek ve E. coli BL21 kültür IPTG (0,1 M) ile 37 ° C'de 3 h için 250 mL teşvik
-
Bakteri ve dahil organları Solubilization lizis
- Santrifüjü 4000 g x ve 4 ° C'de 30 dk tarafından indüklenen BL21 kültür 250 mL cips
- Granül lizis arabellek 10 ml toplamak (50 mM Tris-HCL, 150 mM NaCl, 6 M guanidin-HCL, pH 1,5-2,5) ve 95 ° C'de 15 dakika kuluçkaya Gecede, oda sıcaklığında bir rotator üzerinde kuluçkaya.
- 15.000 x g ve 4 ° C ve toplamak süpernatant, 30 dk santrifüj kapasitesi.
-
AVI-OVA Ni-NTA sütunları kullanarak süpernatant (çözündürüldükten dahil organları kesir) üzerinden arındırmak.
- Dahil organları 1:2 ile lizis arabellek sulandırmak.
- Ni-NTA reçine kültür kaynaklı dahil organlarının 250 mL başına 4 mL kullanın.
- 3 x 10 mL lizis arabelleği (pH 7,0) ile yıkayın.
- 10 mL elüsyon arabelleği (lizis tampon pH 7,0 ile 250 mM imidazole) ile elute.
- Eluted protein kademeli seyreltme (1:10) tarafından refold ve hızlı vortexing Tris arabelleği (pH 7.5) içeren 1 mM DTT, 200 mM NDSB256 (3-(Benzyldimethylammonio)propanesulfonate), 0,5 mM ara 80, 500 mM arginin ve 200 mM NaCl, oda sıcaklığında 30 dakika.
- De-tuz ve arabellek Satım Tris arabellek protein PBS protein yoğunlaştırıcıları göre üreticinin iletişim kuralları ile refolded.
- Santrifüjü 3.500 x g ve 4 ° C'de 30 dk için toplamları kaldırmak ve aliquots çözünür protein-20 ° C'de depolayın
3. Biotinylation BCG hücre yüzey
- BCG Middlebrook 7 H içinde büyümek 9 suyu 10 ile % OADC (oleik asit, albümin ve dekstroz çözüm) ve %0,05 37 ° C kadar OD 50 RPM bir shaker platformda Tween 80 = 0,5-1.
Not: BCG Biyogüvenlik seviye 2 patojen ve BCG ile ilgili tüm deneylerin bir biyogüvenlik uygun kişisel koruyucu ekipman ile kabine içinde yapılmalıdır. - 109 BCG 3 kat 500 µL buz gibi endotoksin ücretsiz PBS artı % 0,1 Tween80 (PBST) (pH 8.0) ile yıkayın. BCG Pelet steril endotoksin ücretsiz PBS askıya alma.
-
Kullanımdan hemen önce 1 mL steril süzülmüş su 10 mM Sulfo-NHS SS biotin hazırlayın.
- 1 mL 0.5 mm Sulfo-NHS SS biotin, oda sıcaklığında 30 dakika ile bakteri kuluçkaya.
-
3 kez ile sigara tepki biotinylation reaktif kaldırmak için buzlu soğuk PBST 500 µL etiketli bakteri yıkayın.
- Pelet 1 mL PBST yeniden askıya alma.
-
Biotinylation etkinliğini değerlendirmek için 20 dakika oda sıcaklığında 108 biotinylated BCG Streptavidin-FITC (1: 100, 25 µL) ile leke.
- 1 mL % 2 lekeli bakteri kuluçkaya PFA oda sıcaklığında 20 dakika ve biotinylation düzeyde Akış Sitometresi Analizi ile inceleyin.
4. Biotinylated mikobakteriler fenotip: büyüme ve hayatta kalma
-
BCG suşları Middlebrook 7 H içinde büyümek 9 suyu 10 ile % OADC (oleik asit, albümin ve dekstroz çözüm) ve %0,05 37 ° C 50 RPM bir shaker platformda Tween 80.
- Bakteriyel kültür optik yoğunluk (OD600) 8 günlük süre içinde kaydedin.
-
BCG-Luc (yukarıda açıklanan9) makrofajlar içinde bakteri yaşama algılamak için kullanır.
- RAW264.7 hücre biotinylated BCG-Luc (MOI 10:1) ile enfekte veya tedavi edilmezse BCG-Luc (kontrol) ve zaman dilimi üzerinde 48 h 37 ° C'de inkübe.
- Hücre monolayers yıkama ve % 0,025 SDS ile alınan bakteriler serbest bırakmak için koşullar.
- Tedbir bioluminescence üretim Luciferase tahlil sistemi ve luminometer.
Not: Işıldama sinyal bakteriyel canlılığı göstergesidir. Lütfen üreticinin kullanım kılavuzu luciferase testin bakın.
5. Biotinylated BCG yüzeye Monomeric Avidin-füzyon proteinin bağlama
- 5 x 108 biotinylated BCG shaker platformda oda sıcaklığında 1 h için AVI-protein (PBS-T finalde 10 μg/mL) ile karıştırın.
- 3 kez ile buzlu soğuk PBST ve leke tavşan Anti-avidin antikor (Ab) (1: 100 seyreltme, yukarıda açıklanan10) oda sıcaklığında 20 dakika ve sonra FITC ile 500 µL yıkama bakteri keçi Anti-tavşan IgG Ab aynı koşullarda Birleşik.
- 3 kez ile PBST 500 µL bakteri yıkama ve yüzey dekorasyon ölçüde değerlendirmek için Akış Sitometresi tarafından analiz.
6. mikobakteriler lyophilization
- Biotinylate göre adım 3.1-3.4 ve kat biotinylated bakteri ile bakteri AVI-OVA adım 5.1 göre.
- Aliquot biotinylated ve kaplamalı bakteri (108), yıkama ile PBS ve 0.5 mL lyophilization medyada yeniden askıya alma (% 25 Sauton orta, % 75 H2O ve % 1.5 Na-Glutamat).
- Cam Şişeler için bakteri transfer ve gecede-80 ° C dondurucuda dondurma.
- Dolu ve dondurulmuş cam şişeleri için 24 saat bir donma kurutma makinesi kullanarak lyophilize.
- Kurutulmuş örnekleri, oda sıcaklığında saklamak ve gerektiğinde PBS sulandırmak.
- Biotinylation ve istikrar kaplama yüzeyi değerlendirmek için 3.5 arasındaki adımları yineleyin.
7. fagositoz tahlil
- 10 cm çapında kültür yemekleri DMEM orta içeren % 5 FCS, % 1'i her L-glutamine, HEPES, non-gerekli amino asitler ve penisilin ve streptomisin ham 264.7 makrofaj hücreleri % 70-80 confluency kadar büyür.
- 2 x 106 ham 264.7 makrofaj hücreleri bir 6-şey plaka tohum. Hücreleri gecede 37 ° C ve % 5 CO2' de bağlı kalmak izin verir.
- DsRed BCG oluşturmak (yukarıda açıklanan9) AVI-OVA ile (DsRed BCG-AVI-OVA) adımları 3.1-3,4 ve 5. 1 göre dekore edilmiş.
- DsRed BCG-AVI-OVA veya tedavi edilmemiş DsRed BCG MOI 20:1 37 ° C'de 24 h için ham hücreleri enfekte
- Hücreleri üç kez yıkama ve kısmen müstakil bakteri kaldırmak için 10 dk 37 ° C'de % 0.25 tripsin 1 mL kullanarak trypsinize.
- %2.5 düzeltmek PFA PBS için oda sıcaklığında 20 dakika içinde.
- 3 x PBS ile yıkama ve Akış Sitometresi tarafından analiz.
8. hücre içi OVA kaçakçılığı Biotinylated BCG makrofajlar içinde dekore edilmiş
-
Floresans mikroskobu
- 3 x 105 çiğ 264.7 makrofaj hücreleri coverslips 24-şey plaka üzerinde tohum. Hücreleri gecede 37 ° C ve % 5 CO2' de bağlı kalmak izin verir.
- Makrofaj hücreleri mikobakteriler (MOI 10:1) bakım medya olmadan antibiyotik 37 ° C ve 4-24 h için % 5 CO2 ile enfekte.
- Hücreleri yıkama ve yüzey ekli, Sigara yutulur bakteri olduğu gibi adım 7.5 kaldırmak için trypsinize.
- Düzeltme enfekte hücrelerde % 2.5 PBS ile 3 yıkar PFA PBS için oda sıcaklığında 20 dk içinde izledi.
- Engelleme/permeabilization arabellek hücrelerde permeabilize (% 0,1 Triton X-100, PBS % 3 BSA) oda sıcaklığında 20 dakika.
- Kullanım spesifik antikor ilgi (örneğin, Anti-avidin Ab tavşan) oda sıcaklığında 20 dk için arabellek permeabilization 10 μg/mL devam 20 dk için ikincil antikor (örneğin, FITC-keçi Anti-tavşan IgG) tarafından.
- Yıkama su ve sulu montaj orta floresan photobleaching en aza indirmek için 10 μL slaytlarda bağlama ile bir kez PBS ile 3 x hücreleri.
- Slayt 63 x ile donatılmış bir epifluorescence mikroskop kullanarak dijital confocal mikroskobu tarafından incelemek / 1.4 planı-Apochromat amaç. Kayıt görüntüleri kullanarak bir dijital fotoğraf makinesi için belgili tanımlık mikroskop bilgisayar yazılımı birleştiğinde.
-
Immunogold boyama ve elektron mikroskobu
- 2 x 106 ham 264.7 makrofaj hücreleri 6-şey tabak içinde tohum.
- %4 ile enfekte BCG makrofajlar düzeltmek PFA oda sıcaklığında 4 h için.
- Örnekleri iki kez PBS ile yıkayın.
- % 4 düşük erime noktası özel örnekleri katıştır ve % 70 etanol kurutmak.
- Akrilik Reçine için örnekler aktarmak ve 50 ° C'de polimerize
- 60 nm bölümleri ile bir microtome kesmek ve bölümler nikel Izgaralar üzerinde toplamak.
- Etiket örnekleri 10 μg/mL avidin antikor için 1 h, oda sıcaklığında veya 4 ° C'de gecede kuluçka çözüm (PBS ve % 0.1 BSA) ile ve sonra yıkayın kuluçka çözüm altın Birleşik F(ab')2 ultra-küçük keçi-anti-tavşan ile Oda 1 h için IgG (1/20) Kuluçka çözüm sıcaklığında.
- Distile su bölümlerde yıkama, % 2 oxazolidin leke, yine, hava kuru yıkama ve elektron mikroskobu ile inceleyin.
9. hayvan bağışıklama ve Organ işlemi
Not: Tüm adımları bir biyogüvenlik kabini yapılmalıdır.
- Pass biotinylated ve protein kaplı bakteri 271/2G iğne ile 10 kat tek hücre süspansiyon yapmak.
-
1 x 106 bakterilerde endotoksin-Alerjik PBS 100 μL al ve bir kadın C57BL/6 fareler (ı-Ab, H - 2 Kb, 5-6 haftalık) subkutan boyun scruff bağışıklık.
- Denetim fare PBS yalnız 100 μL ile enjekte.
-
Servikal çıkığı tarafından takip CO2 Solunduğunda aşılı fareler 20 gün sonrası aşılama ötenazi.
- Dalak yalıtmak ve RPMI medya içine aktarın.
-
Dalak 70 µm hücre süzgeç aracılığıyla 5 mL şırınga pompası ile püre.
- RPMI 5 mL ile yıkayın. Santrifüj (800 x g, 3 dk) bir tek hücre süspansiyon yalıtmak için.
- RBC ile fare biotin pozitif seçim teçhizat biotin-Ter119/Erythroid hücreleri Ab ile tüketmek.
- Santrifüj ve yeniden askıya hücrelerinde (% 10 FCS, %1 L-glutamine, % 1 penisilin, % 1 streptomisin ve 50 μm kalınlığında 2-ME) tam RPMI 10 mL.
10. ı-Ab tetramer antijen spesifik CD4 frekansları+ T hücreleri ve hücre içi sitokin boyama belirlemek Frekanslar, antijen spesifik T hücreleri serbest sitokinler hayvanlarda aşı için karar vermek için boyama
-
Tetramer boyama
- Splenocytes kontrol ve aşılı fareler (~ 20 x 106 hücreler) PE Birleşik ı-Abile leke-OVA323-339 tetramers (1/12,5 seyreltme) bağlama arabellek (PBS % 2 FCS ve %0,1 NaN3ile) 37 ° C'de 1 h için.
- AF647 CD4 Ab (1:25) ve (ölü hücreleri bulmak için) 7-AAD splenocytes oda sıcaklığında 20 dakika için ekleyin.
- Örnekleri Akış Sitometresi tarafından analiz.
- 500.000 etkinliklere tetramer olumlu olayları sıklığını belirlemek için CD4 pozitif elde etmek.
Not: Toplam splenocytes SSC/FSC dot blot tarafından canlı hücreleri tarafından 7-AAD olumlu olaylar dışlanması ve CD4 alt kümeleri AF647 olumlu olaylar çoğunluğuna tarafından tanımlanır.
-
T hücreleri serbest antijen belirli hücre içi sitokin sıklığı
- Transfer yaklaşık 1 × 107 splenocytes içine altı-şey plakaları veya rekombinant OVA olmadan tam RPMI ortamda 4 mL (10 µg/mL) ve 16 h için kuluçkaya.
- Ek bir 5 h için Brefeldin A (1:1, 000) ile hücreleri tedavi.
- Yıkama ile PBS ve hücre içi sitokin aşağıdaki gibi boyama tabi:
- PE-CD8 veya PE-Cy7-CD4 Ab (1:50 bağlama arabellek) ile hücre örneklerinde oda sıcaklığında 30 dakika leke.
- %4 oranında tamir PFA, oda sıcaklığında 20 dakika.
- Permeabilization çözüm, kullanarak üreticinin yönergelerine göre permeabilize.
- Hücreleri ve AF647 Birleşik IFN γ Ab (1:50) 20 dk için etiketle oda sıcaklığında yıkayın.
- Hücreleri yıkayın ve Akış Sitometresi Analizi için yukarıda açıklandığı gibi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yukarıda açıklanan genel yordamlar ile fizibilite BCG yüzey biotinylation ve vekil antijen OVA ile dekorasyon incelenmiştir. Sonra değiştirilmiş BCG immünojenisite oldu test içinde vivo. Bakteriyel yüzey kolayca avidin chimeric antijenleri bakteriyel fenotipleri tespit herhangi bir değişiklik olmadan hızlı ekran için biotin ile etiketli oldu. Elde edilen değiştirilmiş BCG verimli antijen sunumu hücreleri tarafından yutulur ve OVA özgü bağışıklık yanıtının farelerde tetikleyebilir.
Nesil monomeric avidin füzyon Plazmid ve proteinler
Bir ifade plazmid p17-AVI monomeric avidin füzyon proteinleri üretmek için kullanılacak ağ geçidi metodoloji ile uyumlu olacak şekilde oluşturuldu. OVA p17-AVI içine kopyalanmış ve E. coli, ifade sonra saf ve refolded (şekil 1) açıklandığı gibi.
Biotin verimli bakteriyel yüzeye ekler ve bakteriyel büyüme ve hayatta kalma etkilemez
Bakteri ile çeşitli konsantrasyonları etiketli (0-1 mM) biotin ve yüzey biotinylation göre iletişim kurallarını yukarıdaki verimliliğini incelemeye lekeli. Akış Sitometresi Analizi ile 0,5 mM biotin (Şekil 2) etiketli bakteri Floresans çubuk grafik bir toplam kayma gösterdi ve bu konsantrasyon biotinylated bakteri oluşturmak için bu çalışma kullanıldı. Ardından, bakteriyel yüzey modifikasyonu bakteriyel fenotip üzerindeki etkisi incelenmiştir ve biotinylated ve kontrol tedavi edilmezse bulundu BCG görüntülenen benzer bir büyüme profil 8 gün boyunca (şekil 3A). Luciferase (BCG-Luc)9 ifade BCG makrofajlar bakteriyel hayatta kalma incelemek için kullanıldı. Bakteriyel canlılık gösterge üzerinde 48 h. elde edilen sonuçlar kaydedildi ışıldama sinyalleri yavaş yavaş canlılığı azalma benzer profiller biotinylated ve denetim bakteriler arasında (3B rakam) gösterdi. Sonuç olarak, bu verileri bu bakteri yüzey biotinylation Bakteriyel büyüme ya da hayatta kalma makrofajlar içinde artan makrofajlar hayatta bakteriyel virülans bir artış anlamına gelebilir bu yana önemli olduğu etkilemez açıkça belirtmek.
Bakteriyel yüzey dekorasyon verimliliğini
Biotinylated bakteri OVA antijen peptid Fusion monomeric avidin ile protokolleri göre yukarıdaki kaplı. Akış Sitometresi Analizi gösterdi OVA en az düzeyde sigara biotinylated bakteri için bağlama (MFI = 8,31 ± 0,42, şekil 4A, üst panel) ve OVA önemli düzeyde biotinylated bakteri için bağlama (MFI = 54.67 ± 4.98) denetim bakteri ile karşılaştırıldığında (MFI = 5.92 ± 0,22, şekil 4A, alt paneli).
İstikrar BCG yüzey dekorasyon
Geleneksel canlı BCG aşıları kurutulmuş tozlar formüle edilmiştir, bu çalışma sırasında ortaya çıkan önemli bir soru dağılması, sulandırma ve depolama, buzdolabında sonra değiştirilmiş BCG veya oda sıcaklığında kararlılığını alınmaya başlanmıştır. Bu nedenle, biz AVI-OVA içinde liyofilize BCG AVI-OVA (AVI-OVA ile dekore edilmiş yüzey) yüzey görüntüsünü inceledi ve bakteriyel hazırlıklar taze dekore edilmiş. AVI-OVA düzeyde bakteri yüzeyindeki istikrarlı ve algılanabilir bir ay kaldı lyophilization ve depolama kanıtladı taze için BCG AVI-OVA hazırlıklar, karşılaştırıldığında oda sıcaklığında sonra sonuçları (şekil 4B) gösterdi kadar bu yüzey Dekorasyon yöntem aşı geliştirme için uygundur.
Makrofaj fenotip bakteriyel yüzey dekorasyon tarafından etkilenmez
Bu yüzey dekorasyon metodoloji bakteriyel konak hücreleri girdiği engelleyen olup olmadığını görmek için biz RAW264.7 hücreleri ve DsRed bakteri9 Protokolü yukarıda açıklanan fagositoz tahlil gerçekleştirmek için kullanılır. Bu bakteri yüzey BCG dekore gösterdi şekil 4 c bakteriyel giriş (%1.57 22,5 ±) kaplamasız vahşi BCG yüzey dekorasyon makrofaj üzerinde hiçbir etkisi gösteren türü BCG (%1,18 24.47 ±) göre ile önemli etkileşim yoktu fenotip.
Avidin füzyon protein intracellularly seyahat ve MHC molekülleri ile birlikte Yerelleştir
AVI-OVA dekore edilmiş BCG'ın kader makrofajlar içinde incelemek için yapisan ham hücreleri enfekte ve iletişim kuralı yukarıda açıklandığı gibi Floresans mikroskobu tarafından incelenir. (Şekil 5A) elde edilen görüntüleri AVI-OVA olduğunu sadece bakteriyel yüzeyinde mevcut, aynı zamanda müstakil ve translocated sonra sitoplazmaya uzak bakteri için gösterdi. Daha fazla bu sonucu görmek üzere, biz deneme boyama bir immunogold gerçekleştirilen ve elde edilen görüntüler phagosomal membran çapraz AVI-OVA antijenleri sadece BCG yüzeyinde mevcut değildir, ama aynı zamanda BCG yüzeyden ayırabilirsiniz açıkça gösterdi ve seyahat sitozol (şekil 5B) doğru. Daha fazla AVI-OVA dekore edilmiş bakteri için antijen sunumu yol onların yüzey proteini kargo sunma yeteneğine sahip olup olmadığını incelemek için makrofajlar iletişim kuralında tanımlandığı gibi AVI-OVA BCG ile enfekte ve confocal analizler için tabi. Sonuçları (şekil 6A) AVI-OVA colocalization-A molekülleri, telkin avidin füzyon protein müstakil ve antijen sunumu bölmeleri MHC II molekülleri üstünde-e doğru dolu olduğu için translocated ile olduğunu gösterdi. Sonuçları da AVI-OVA peptid ile birlikte yerelleştirir olduğunu gösterdi sınıf ı molekülleri ne zaman hangi potansiyel CD8 için AVI-OVA antijen sunumunu gösterdi H-2_kb (şekil 6B), lekeli BCG phagosomes içinde+ T hücreleri tarafından makrofaj. Bu verileri belirtmek yüzey dekore edilmiş bir kez bakteri makrofajlar girin, antijenler antijen sunumu yolları yönelik trafik edebiliyoruz.
Yüzey dekore edilmiş bakteri tam immünojenik
Yüzey dekore edilmiş BCG belirli bağışıklık yanıtı içinde vivo, C57BL/6 fareler inducing yeteneğine sahip olup olmadığını incelemek için PBS ile yalnız (kontrol), yaban tipi BCG aşı, AVI-OVA dekore BCG ve genetik olarak dönüştürülmüş bir plazmid ile BCG ifade etmek için bir benzer OVA antijen. Kurban 20 gün sonra ve OVA özgü CD4 frekansları aşılı fareler vardı+ T hücreleri ve OVA özgü T hücreler sitokinler bırakmadan algılandı, protokole göre. Sonuçlar (şekil 7A-B) gösterdi OVA özgü CD4 daha büyük bir oranda+T hücre yanıt ile AVI-OVA BCG WT BCG için genetik olarak karşılaştırıldığında kaplamalı BCG aşı hayvanlar olarak değiştiren BCG için benzer bir bağışıklık yanıtı gösterdi OVA ifade etmek için AVI-OVA (Şekil 7). Bu veriler bakteriyel yüzey dekorasyon yöntemi antijen önemli bir genişleme ikna etmek mümkün olduğunu gösterdi belirli CD4+ T hücreleri ve T hücre yanıt indüksiyon derecesini benzer bir OVA ifade etmek için genetik olarak BCG karşılaştırılabilir antijen.
Hücre içi sitokinler Ayrıca antijen belirli T hücre tepkilerin önemli göstergeler olduğundan, hücre içi sitokinler (ICS) deneyler boyama daha fazla ifade ve frekansları belirlenerek T hücre bağışıklık yanıtı değerlendirmek için yapılmıştır efektör sitokinler OVA dekore edilmiş bakteri ve genetik olarak plazmid ifade bir OVA ile dönüştürülmüş bakteri ile aşı hayvanlarda. Hücre içi bakteri11karşı koruyucu yanıt, bilinen bir göstergedir IFN γ yayın düzeyleri incelenmiştir. OVA özgü IFN γ benzer düzeyde tespit başardık gösterdi CD4 serbest+ hayvanlarda hayvanlar ile bakteri aşı göre OVA (BCG-AVI-OVA ve BCG-p19-AVI-OVA) ile dekore edilmiş bakteri yüzey ile bağışıklık hücreleri genetik olarak OVA (BCG-p19-OVA) (şekil 8A) ifade ediyorum. Önemlisi, ayrıca IFN γ anlamlı olarak daha yüksek frekanslarda algılamak başardık CD8 üreten hayvanlarda BCG-AVI-OVA hayvanlar genetik olarak ifade OVA (şekil 8B-C) BCG aşı karşılaştırıldığında ile aşı+ T hücre hangi biotin avidin yüzey ekranı antigen metodolojisi aracılı gösterir etkili BCG dönüştürme nükleik asitler ile değiştirebilirsiniz.
Şekil 1: plazmid avidin füzyon protein üretimi için klonlama rekombinasyon inşaatı. (A) için monomeric avidin kodlama bir gen segment kısıtlama siteleri NdeI ve NotI sentezlenmiş ve 6 x histidin ve p17-AVI plazmid oluşturmak için ağ geçidi kaset arasında pDEST17 içine subcloned. OVA peptid252-345 DNA dizileri attB siteleri ile sona pDONR221 klonlanmış. Bundan sonra OVA genler p17-AVI içine subcloned. Görüntü düzenlenmiş ve PLOS bir12izni ile yayımlanmaktadır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: BCG biotinylation verimliliğini. BCG biotinylated NHS-SS-biotin 30 dk oda sıcaklığında, FITC-streptavidin ile etiketli ve Akış Sitometresi tarafından analiz için çeşitli konsantrasyon ile yapıldı. Sonuçlar yeşil floresan yoğunluğu histogramlar sunulur ve INSERT grafik ortalama ± SEM 3 bağımsız deneylerden mahsup ortalama Floresans yoğunluklarını (MFI) temsil eder. * P < 0,05; ** P < 0,01; P < 0,001. Görüntü düzenlenmiş ve PLOS bir12izni ile yayımlanmaktadır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: BCG yüzey Biotinylation etkilemez büyümesini veya onun hayatta makrofaj. (A)Biot-BCG ve vahşi-türü BCG etiketsiz kontrol 9 medya tam 7 H yetiştirilen ve çoğaltma bir 8-gün boyunca sınıf başkanı. 600 Absorbans büyüme eğrileri, Yani, demek gibi sonuçları ifade edilir nm 3 bağımsız deneyler üzerinden zaman ± SEM fonksiyonu olarak. (B) makrofajlar Biot-BCG-Luc ile enfekte veya etiketlenmemiş BCG-Luc için belirtilen süreler ve sonra lysates hazırlanan ve canlı bakteri tespit etmek için bioluminescence denetlesinler hücre kontrol. Sonuçları göreli ışık birimleri demek gibi (RLU) ± SEM 3 bağımsız deneyler üzerinden ifade edilir. Görüntü düzenlenmiş ve PLOS bir12izni ile yayımlanmaktadır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: AVI-OVA Biot-BCG ve istikrarı için bağlama. (A)Biot-dsRed-BCG (kırmızı Floresans, ifade bakteri daha önce açıklanan9) ve kontrol biotinylated dsRed-BCG karışık AVI-OVA, oda sıcaklığında 1 h ve OVA ölçüde ile bağlama ile yüzey boyama tarafından değerlendirilmiştir tavşan Anti-avidin antikor ve FITC-keçi Anti-tavşan IgG (FL1). Örnekleri yıkanmış ve Akış Sitometresi tarafından analiz. Sonuçlar yeşil floresan yoğunluğu histogramlar sunulur ve üç bağımsız deneylerden elde edilen ortalama ± SEM bir MFI, Biot-BCG-AviOVA bağlama değerlerdir. (B) liyofilize Biot-BCG AVI-OVA ile kaplı ve taze yapılmış AVI-OVA-Biot-BCG etiketli ve A. içinde açıklandığı gibi Akış Sitometresi tarafından analiz Gösterilen veriler üç bağımsız deneyler temsilcisi, ve üç bağımsız deneylerden elde edilen ortalama ± SEM bir MFI, AVI-OVA-Biot-BCG bağlama değerleri vardır. (C) ham makrofajlar 37 ° C'de 24 h için DsRed BCG-Avi-OOVA veya DsRed-BCG ile bulaşmış Örnekler sonra yıkanmış, tripsin ile tedavi, sabit ve FACS tarafından analiz. Sonuçları fagositoz kapsamını yansıtmak kırmızı Floresans histogramlar ifade edilir. Değerleri, ortalama yüzde ± SEM üç bağımsız deneylerden elde edilen BCG sindirerek hücre belirtir. Görüntü düzenlenmiş ve PLOS bir12izni ile yayımlanmaktadır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: AVI-OVA BCG yüzeyden ilişkisi kesildi ve phagosomal membran sitozol doğru geçti. (A)kapak paket fişi yapışık ham hücre OVA dekore edilmiş dsRed-BCG 37 ° C'de 24 h ile enfekte ve sonra sabit/permeabilized ve tavşan Anti-avidin antikor ve FITC-keçi Anti-tavşan IgG ile lekeli. Örnekleri mikroskop slaytlar üzerine monte edilmiş ve dijital confocal mikroskobu tarafından analiz edildi. Kırmızı Sinyalleri BCG konumunu belirtmek ve yeşil sinyalleri AVI-OVA lokalizasyonu yansıtmaktadır. Noktalı çizgi makrofaj hücre sınırını ve bir 4 X büyütme sol panel gösterilen ucun paneldir sağ alt gösterir. (B) ince kesitler BCG-AviOVA enfekte ham hücre paraformaldehyde ile sabit ve sıralı olarak anti-avidin antikor ve altın Birleşik keçi Anti-tavşan AVI-OVA görselleştirmek için IgG ile inkübe ve bir elektron mikroskobu ile incelenir. 12.000 X büyütme gösterilir. Ok uçları AVI-OVA BCG yüzeyden ayrışmış ve phagosome membran verilen gösterir. Gösterilen iki bağımsız deney temsilcileri görüntülerdir. Görüntü düzenlenmiş ve PLOS bir12izni ile yayımlanmaktadır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6: MHC ile birlikte lokalize Avidin-füzyon antijen sınıf II ve sınıf ı molekülleri. Yapisan BMA3.1A7 hücreleri, bir fare makrofaj hücre satırı ile enfekte OVA dekore GFP-BCG (yeşil flüoresan, yukarıda açıklanan9ifade) için 4 h sonra 24 h için IFN γ ile uyarılan hücreleri sonra ve sabit/permeabilized ile lekeli tavşan Anti-avidin antikor, Alexa 594 Anti-tavşan IgG ve Alexa 647 fare Anti-fare ı-A (A) veya Alexa 647 fare Anti-fare H-2_kb (B). Örnekleri mikroskop slaytlar üzerine monte edilmiş ve dijital confocal mikroskobu tarafından analiz edildi. Yeşil Sinyalleri BCG-GFP konumunu belirtmek ve kırmızı sinyalleri AVI-OVA lokalizasyonu yansıtmaktadır. Mavi sinyalleri MHC sınıf II konumunu gösteren veya sınıf ı molekülleri. Noktalı çizgi ilgi alanı gösterir. Ok uçları MHC molekülleri ile AVI-OVA colocalization gösterir. Gösterilen resimler iki bağımsız deney temsilcileri vardır. Görüntü düzenlenmiş ve PLOS bir12izni ile yayımlanmaktadır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 7: In vivo CD4+ T hücre yanıt-e doğru OVA dekore edilmiş BCG. C57BL/6 fareler subkutan OVA, değiştirilmemiş BCG vahşi-türü, PBS (kontrol), genetik olarak OVA (BCG-p19-OVA) hızlı ölçülere BCG ile dekore edilmiş BCG yüzeyi ile enjekte veya denetimle dönüştürülmüş Plazmid ve yüzey dekore AVI-OVA () ile BCG-p19-AviOVA). 20 günlük bir süre sonra splenocytes hayvanlar euthanized dalağı kurumlara ve PE-Birleşik ı-Abile lekeli-OVA323-339 tetramers(a)AF647-CD4 antikor ve 7-AAD tarafından takip etti. Örnekleri sonra Akış Sitometresi tarafından analiz edildi. Sonuçları tetramer ortalama Frekanslar ± SEM CD4 pozitif olayları göstermek iki parametre nokta araziler olarak ifade edilen+ nüfus iki hayvanlar/grubundan. Gösterilen veriler (Toplam altı fareler incelendiğinde her fare nüsha değerlendirilen hücre örnekleri ile) üç bağımsız deneyler temsilcisi vardır. (B) grafiklerde veri değeri ± SEM OVA tetramer mutlak sayısı (500.000 olayların bir toplamda) demek gibi ifade edilir belirli CD4+ iki hayvanlar/grup ve üç bağımsız deneyler hücreleri. * P < 0,05; ** P < 0,01; P < 0,001. Görüntü düzenlenmiş ve PLOS bir12izni ile yayımlanmaktadır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 8: frekansları sitokinler AVI-OVA karşılık olarak serbest T hücrelerinin kaplamalı BCG aşı. PBS, BCG vahşi-türü, AVI-OVA, BCG-p19-OVA ve BCG-p19-AviOVA ile dekore edilmiş BCG WT yüzeyi ile aşılı fareler gelen Splenocytes bir 5 h-dönem tedavi Brefeldin A. hücrelerle ardından 16 s vardı için rekombinant OVA protein ile uyarılmış sonra yıkanmış ve ilk PE-Cy7 anti-CD4(a)veya PE anti-CD8 antikor (B) sonra AF647 anti-IFN-γ antikor ile lekeli. Hücreleri sonra yıkanmış ve Akış Sitometresi tarafından analiz. Sonuçları ifade IFN γ üreten hücre alt kümeleri ortalama Frekanslar ± SEM CD4 içinde göstermek iki parametre nokta çizer gibi+ ve CD8+ iki hayvanlar/grup veri gruplarından. Gösterilen veriler (Toplam altı fareler incelendiğinde her fare nüsha değerlendirilen hücre örnekleri ile) üç bağımsız deneyler temsilcisi vardır. (C) grafiklerde veri mutlak sayı ± SEM IFN γ, ortalama ifade edilir CD4 serbest+ T hücreleri (sol grafik) ya da IFN γ CD8 serbest+ T (doğru grafik) iki hayvanlar/grup ve üç bağımsız deneyler hücreleri. * P < 0,05; ** P < 0,01; P < 0,001. Görüntü düzenlenmiş ve PLOS bir12izni ile yayımlanmaktadır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
BCG yüzeyinde belirli antijenleri veya bakteri'nın immünojenisite verimli bir şekilde geliştirmek için beklenen belirli fonksiyonel özellikler eklemek için hızlı ve etkili görüntü eksojen proteinlerin için genetik olmayan bir yaklaşım bu çalışmada bildirdi. BCG hücre yüzeyine kolayca biotinylated avidin füzyon protein ile anlık yüzey dekorasyon için olabilir gösterdi. Genetik dönüşümü ve olumlu klonlar yelpazesi gerektirir iken 2-3 ay zaman lag toplam yordam içinde 2 h, gerçekleştirilebilir. Yüzey modifikasyonu Bakteriyel büyüme ve hayatta kalma etkilemez. OVA antijen antijen sunumu yolu teslim etmek mümkün ve hangi Akış Sitometresi deneyleri MHC tetramer boyama da dahil olmak üzere tarafından değerlendirildiğinde belirli bağışıklık yanıtı içinde vivo indüklenen vekil antijen ile dekore edilmiş bakteri ve Hücre içi sitokin (ICS) boyama. Daha da önemlisi, in vivo çalışmalar açıkça yüzey dekore edilmiş bakteriler bağışıklık yanıtı BCG ifade benzer antijenleri için genetik olarak karşılaştırıldığında benzer düzeyde ikna etmek mümkün olduğunu gösterdi.
Avidin biotin etkileşimi 10−15 M13Kd ile doğada bilinen en güçlü kovalent olmayan etkileşim olduğunu. Yaygın olarak kullanılan Biyolojik araştırma14' te, yalnızca yararlı bir araç değil ama zamanda kanser tedavisi15,16' uygulanabilir olduğu gösterilmiştir. Bu çalışmada, üç kişilik bir mutasyon (N54A, W110K ve N17I) tetrameric avidin avidin-biotin ilgi önemli ölçüde azalttı monomeric avidin bir forma dönüştürmek için vahşi tipi avidin uygulandı (Kd= 10−7 M) ve bağlar geri dönülebilir olarak biotin. Bu monomeric avidin ağ geçidi rekombinasyon (Invitrogen) tek adımlı bir hızlı ifade ilgi bir protein için klonlama ile uyumlu bir p17-AVI plazmid geliştirmek için kullanıldı. Bu yeni yorum-in monomeric avidin büyük bakteriyel yığın toplama ve geçici/tersinir bakteriyel yüzey ekran ilgi proteinlerin önleme dahil olmak üzere çeşitli avantajları vardır. Bu nedenle, bir kez ev sahibi hücre tarafından yutulur, AVI-füzyon protein biotinylated bakteri ve trafik yüzeyinden intracellularly bağlantısını kesin. Son olarak, mutasyonlar ökaryotik sistemlerinde Maya veya transgenik bitkiler17,18 avidin füzyon protein büyük miktarlarda üretim için uygun olabilir bir glikozile olmayan form avidin dönüştürün. Bu tür monomeric avidin streptavidin ve rhizavidin diziler ve daha yüksek bir bağlama yakınlık (Kd 10−9 M) vardı monomeric streptavidin (mSA)19, bir sürümü yerine seçildi mAvidin için karşılaştırıldı. Ön test ile mSA chimera protein mAvidin chimera protein karşılaştırıldığında biotinylated bakteri için bir çok daha düşük bağlama verimliliği vardı. Bu çalışma, bu nedenle, mAvidin dayanıyordu, ama monomeric streptavidin veya diğer şekillerde streptavidin/avidin bir olasılık başka uygulamalar için de olacaktır.
Açıklanan protokoller başarılı uygulanması oluşturulan füzyon protein kalitesini ve verimliliğini bakteriyel yüzey biotinylation bağlıdır. Eluted AVI öğesini protein de-tuzlu olmalı ve arabellek uygun molekül ağırlığı protein dar kurutma başlığını kullanarak PBS değiş tokuş. Yağış bazı proteinler için yüksek konsantrasyon etkenler de oluşabilir bu nedenle, konsantrasyon faktörü test edilmelidir ve ilk, örneğin, 0.5-1 mL çözündürüldükten dahil 20 mL PBS seyreltilmiş vücut, eluted protein küçük birimleri kullanarak kararlı ve sonra yoğunlaştı. Protein yaklaşık 4 ° C sıcaklık yağış önlemek için tüm süreci sırasında korumak önemlidir.
Bakteriyel yüzey biotinylation verimliliğini artırmak için Sulfo-NHS SS biotin karanlıkta 4 ° C'de orijinal kabında depolanması gereken Reaktif son derece nem duyarlı bir özellik; Bu nedenle, reaktif içeren şişeleri açmadan önce oda sıcaklığına equilibrated. Ayrıca, biotin hisse senedi çözüm (10 mM) NHS-ester yan hidrolize olarak kullanımdan hemen önce yapılan ve çok hızlı bir şekilde non-reaktif olmak. Biotin hisse senedi çözüm depolanan ve yeniden; yeni bir biotin şişe her biotinylation deneme için gereklidir. En iyi sonuçlar için BCG, taze medya yanı sıra taze arabellekleri taze kültürleri tavsiye edilir. İletişim kuralında belirtildiği gibi biotinylated ve kaplamalı BCG olabilir liyofilize ve yüzey kaplama kalitesini etkilemeden en az 30 gün boyunca korunmuş. Bu gönderirken veya örnekleri bir konumdan diğerine aktarılmasını veya uzun ders deneyler yaparken özellikle kullanışlıdır.
Bu BCG yüzey dekorasyon yöntemi analiz etmek ve yeni geliştirilen aşı adayların immünojenisite hızlı ve doğru bir şekilde değerlendirmek için diğer heyecan verici olanaklar sunuyor. Roman TB aşılar birincil amacı TH1 türü hücreleri CD4 gibi teşvik etmektir+ ve CD8+ T hücreleri bu oyun önemli rollerde TB karşı koruma. Bu çalışmada geliştirilen avidin-biotin sistemi bu T hücreleri yanıtları değerlendirmek için çok yararlı bir araç sunar. Roman bu teknoloji hızla rekombinant proteinler/antijenleri BCG yüzeyinde görüntülemenin hızlı bir şekilde değerlendirmek için harika bir araç ve doğru bir şekilde (örneğin, belirli M.tb salgılanan birçok immünojenik protein koruyucu etkinliği temsil eder proteinler) ve bu nedenle etkili aşıların geliştirilmesi tercüme edilebilir.
Ayarlama ve AVI-füzyon protein konsantrasyonu bakteriyel yüzeyi değişen, bu yöntemin bir diğer avantajı aynı anda farklı antijenler ilgi aşı etkinliğini en üst düzeye çıkarmak için bakteriyel yüzeyinde görüntülemek için olabilir. Bu yana çalışmalar BCG phagosome olgunlaşma20,21 ve antijen sunumu21gibi önemli makrofaj işlevleri ile müdahale göstermiştir, BCG daha da geliştirmek için bir olasılık ile BCG yüzey dekorasyon faktörleri ile birlikte antijenleri phagosome olgunlaşma faiz hızlandırmak için bilinen bir arada.
Bazı sınırlamalar bu teknolojinin düşük gelirli yerlerde zor ve pahalı olabilir rekombinant proteinlerin büyük ölçekli üretim şartı bulunmaktadır. Ayrıca, sert protein arındırmak için üreten sorun giderme ve en iyi duruma getirme gerekir. Ancak, bu sınırlamalar rekombinant protein üretim teknolojileri geliştirme ile atlatılabilir. Başka bir sınırlama doğal olarak meydana gelen anti-avidin antikorlar laboratuvar insan ve hayvanlar22 ' ortak tedavi amacıyla avidin kullanımına engel olasılığını içerir. Ancak, diğer labs avidin tedavisinin etkinliği ve güvenliği test ettik ve avidin'ın güvenlik ve etkinliğini önemli ölçüde kendi immünojenisite23tarafından etkilenen değil olduğunu göstermiştir. İlginçtir, vahşi tipli tetrameric avidin önemli ölçüde monomeric forma dönüştürme onun immünojenisite24azalmıştır.
Özetlemek gerekirse, bir hızlı ve tekrarlanabilir genetik olmayan bakteriyel yüzey modifikasyonu proteinler ile faiz üzerinden BCG'ın immünojenisite geliştirmek için bir avidin-biotin sistemi kullanan bu yeni teknoloji başarıyla BCG geleneksel dönüşüm değiştirebilirsiniz antijen-encoding Plasmid'ler ile. Ayrıca, bu roman yöntemi yalnızca geçerli BCG aşısı geliştirilmesi kolaylaştırmak değil ama aynı zamanda bir roman platform herhangi bir potansiyel antijen veya proteinler karıyla BCG, genetik olarak ifade etmek normalde zor hızlı değerlendirilmesi için sağlayabilir TB aşı geliştirme uygulamaları.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Biz Dr R Stokes BCG Pasteur zorlanma için ve A. Talal teknik destek için teşekkür ederiz. Ayrıca GenScript gen sentezi ile yardım için teşekkür.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Endotoxin-free RPMI 1640 | StemCell Technologies | 36750 | |
| Sulfo-NHS SS biotin | Thermo Fisher | 21328 | |
| FITC-conjugated streptavidin | Sigma-Aldrich | S3762 | |
| Phycoerythrin (PE)-conjugated I-Ab-OVA323-339 tetramer | MBL International | TS-M710-1 | |
| 7-AAD | BD Pharmingen | 559925 | |
| TALON polyhistidine-Tag purification resin | Clontech | 635501 | |
| Alexa Fluor (AF) 647 conjugated rat anti-mouse CD4 | BD Bioscience | 557681 | |
| AF647 rat anti-mouse IFN-g | BD Bioscience | 557735 | |
| AF647 rat anti-mouse I-A/I-E | BD Bioscience | 562367 | |
| PeCy7 rat anti-mouse CD4 | BD Bioscience | 552775 | |
| PE rat anti-mouse CD8 Ab | BD Bioscience | 561095 | |
| AF 647 rat anti-mouse H-2kb | BD Bioscience | 562832 | |
| FITC-conjugated goat anti rabbit antibody | Thermo Fisher | 31635 | |
| AF 647 rat anti-mouse CD4 | BD Bioscience | 557681 | |
| Ultra-small gold-conjugated goat anti-rabbit IgG | Electron Microscopy Sciences | 25100 | |
| Middlebrook 7H9 broth | BD Diagnostic Systems | 271310 | |
| OADC | BD Diagnostic Systems | B11886 | |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| RAW 264.7 murine macrophage cell lines | American Type Culture Collection | ||
| pDEST17 plasmid | Invitrogen | 11803012 | |
| pUC57-OVA plasmid | GenScript | SD1176 | |
| BP clonase | Invitrogen | 11789020 | |
| LR clonase | Invitrogen | 11791043 | |
| pDONR221 plasmid | Invitrogen | 12536017 | |
| Ni-NTA columns | Qiagen | 31014 | |
| Pierce protein concentrators | Thermo Fisher | 88527 | |
| Flurosave | Calbiochem-Novabiochem | 345789 | |
| Axioplan II epifluorescence microscope | Carl Zeiss Inc | ||
| CCD digital camera | Retiga EX, QImaging | ||
| Tecnai G2 200kV electron microscope | FEI Company | G2 200Kv | |
| 70μm Falcon cell strainer | Thermo Fisher | 87712 | |
| EasyStep mouse biotin positive selection kit | StemCell | 18556 | |
| biotin-Ter119/Ertyroid cells antibody | BioLegend | 116203 | |
| Brefeldin A | BD Pharmingen | 555029 | |
| Cytofix/Cytoperm kit | BD Pharmingen | 554714 | |
| Bright-Glo Luciferase assay system | Promega | e2620 | |
| Turner Biosystem luminometer | Promega | TD-20/20 | |
| Leica EM UC6 microtome | Leica Microsystems | UC6 | |
| Novalyphe NL 500 freeze dryer | Savant Instruments | NL 50 | |
| Wheaton boroscilicate glass vials | Wheaton | VWR 66011-675 |
References
- Horwitz, M. A., Harth, G. A new vaccine against tuberculosis affords greater survival after challenge than the current vaccine in the guinea pig model of pulmonary tuberculosis. Infect. Immun. 71 (4), 1672-1679 (2003).
- Pym, A. S., et al. Recombinant BCG exporting ESAT-6 confers enhanced protection against tuberculosis. Nat Med. 9 (5), 548-553 (2003).
- Grode, L., et al. Increased vaccine efficacy against tuberculosis of recombinant Mycobacterium bovis bacille Calmette-Guerin mutants that secrete listeriolysin. The J Clin Invest. 115 (9), 2472-2479 (2005).
- Bastos, R. G., Borsuk, S., Seixas, F. K., Dellagostin, O. A. Recombinant Mycobacterium bovis BCG. Vaccine. 27 (47), 6495-6503 (2009).
- Mederle, I., et al. Plasmidic versus insertional cloning of heterologous genes in Mycobacterium bovis BCG: impact on in vivo antigen persistence and immune responses. Infect Immun. 70 (1), 303-314 (2002).
- Singh, N. P., et al. A Novel Approach to Cancer Immunotherapy Tumor Cells Decorated with CD80 Generate Effective Antitumor Immunity A Novel Approach to Cancer Immunotherapy Tumor Cells Decorated with CD80 Generate Effective Antitumor Immunity. Cancer Res. 63 (14), 4067-4073 (2003).
- Oizumi, S., Strbo, N., Pahwa, S., Deyev, V., Podack, E. R. Molecular and cellular requirements for enhanced antigen cross-presentation to CD8 cytotoxic T lymphocytes. J Immunol. 179 (4), 2310-2317 (2007).
- Sharif-Paghaleh, E., et al. Monitoring the efficacy of dendritic cell vaccination by early detection of (99m) Tc-HMPAO-labelled CD4(+) T cells. Eur J Immunol. 44 (7), 2188-2191 (2014).
- Sun, J., et al. A broad-range of recombination cloning vectors in mycobacteria. Plasmid. 62 (3), 158-165 (2009).
- Laitinen, O. H., et al. Rational design of an active avidin monomer. J. Biol. Chem. 278 (6), 4010-4014 (2003).
- Flynn, J. L., Chan, J., Triebold, K. J., Dalton, D. K., Stewart, T. A., Bloom, B. R. An essential role for interferon gamma in resistance to Mycobacterium tuberculosis infection. J Exp Med. 178 (6), 2249-2254 (1993).
- Liao, T. Y. A., Lau, A., Joseph, S., Hytonen, V., Hmama, Z. Improving the immunogenicity of the Mycobacterium bovis BCG vaccine by non-genetic bacterial surface decoration using the avidin-biotin system. PLoS ONE. 10 (12), e0145833 (2015).
- Green, N. M. Avidin and streptavidin. Methods Enzymol. 184, 51-67 (1990).
- Howarth, M., Takao, K., Hayashi, Y., Ting, A. Y. Targeting quantum dots to surface proteins in living cells with biotin ligase. PNAS. 102 (21), 7583-7588 (2005).
- Lesch, H. P., Kaikkonen, M. U., Pikkarainen, J. T., Yla-Herttuala, S. Avidin-biotin technology in targeted therapy. Expert Opin Drug Deliv. 7 (5), 551-564 (2010).
- Paganelli, G., Bartolomei, M., Grana, C., Ferrari, M., Rocca, P., Chinol, M. Radioimmunotherapy of brain tumor. Neurol Res. 28 (5), 518-522 (2006).
- Cummings, J. F., et al. Safety and immunogenicity of a plant-produced recombinant monomer hemagglutinin-based influenza vaccine derived from influenza A (H1N1)pdm09 virus: a Phase 1 dose-escalation study in healthy adults. Vaccine. 32 (19), 2251-2259 (2014).
- Kolotilin, I., et al. Plant-based solutions for veterinary immunotherapeutics and prophylactics. Vet Res. 45, 114-117 (2014).
- Demonte, D., Drake, E. J., Lim, K. H., Gulick, A. M., Park, S. Structure-based engineering of streptavidin monomer with a reduced biotin dissociation rate. Proteins. 81 (9), 1621-1633 (2013).
- Deghmane, A. E., et al. Lipoamide dehydrogenase mediates retention of coronin-1 on BCG vacuoles, leading to arrest in phagosome maturation. J Cell Sci. 120 (19), 3489-3489 (2007).
- Soualhine, H., et al. Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guerin secreting active cathepsin S stimulates expression of mature MHC class II molecules and antigen presentation in human macrophages. J Immunol. 179 (8), 5137-5145 (2007).
- Bubb, M. O., Green, F., Conradie, J. D., Tchernyshev, B., Bayer, E. A., Wilchek, M. Natural antibodies to avidin in human serum. ImmunolLett. 35 (3), 277-280 (1993).
- Petronzelli, F., et al. Therapeutic use of avidin is not hampered by antiavidin antibodies in humans. Cancer Biother Radiopharm. 25 (5), 563-570 (2010).
- Bigini, P., et al. In vivo fate of avidin-nucleic acid nanoassemblies as multifunctional diagnostic tools. ACS Nano. 8 (1), 175-187 (2014).
