Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

التعبير عن "المستضدات خارجية المنشأ" في لقاح BCG متفطره bovis عبر "زخرفة سطح" عدم الوراثية مع نظام عبدين-البيوتين

Published: January 31, 2018 doi: 10.3791/56421
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1
1Division of Infectious Diseases, Department of Medicine and Vancouver Costal Health Research Institute, University of British Columbia, 2Institute of Biomedical Technology, University of Tampere

Summary

تقنية جديدة لعرض مستضد السريع على سطح البكتيريا يرد، الذي ينطوي على سطح بيوتينيليشن يليه التعرض للبروتينات ذات الاهتمام في الانصهار مع عبدين أحادي. تحميل بي سي جي مع المستضدات المحدد بنجاح يحسن به الاستمناع، مما يوحي بأن الزخرفة السطحية يمكن استبدال النهج الوراثية التقليدية.

Abstract

الدرن (السل) هو مرض معد خطير وعصية M. bovis لقاح متوفر فقط لقاح السل (BCG) هو آمنة وفعالة للحماية ضد شديدة السل التهاب السحايا الأطفال وبعض أشكال السل نشرها، ولكن فشل لحماية ضد السل الرئوي، الذي هو الشكل الأكثر شيوعاً للمرض. استراتيجيات واعدة لتحسين BCG حاليا تعتمد أما على تحولها مع الجينات ترميز إيمونودومينانت م. السل (Mtb)-المستضدات محددة و/أو التكامل مع الجينات ترميز المشارك من العوامل التي تحفز مستضد عرض الخلايا. وتشمل القيود الرئيسية لهذه النهج كفاءة منخفضة ومنخفضة الاستقرار ومستوى سلامة ناقلات التعبير غير مؤكد. في هذه الدراسة، نقدم نهج بديل لتحسين اللقاح، الذي يتألف من التكامل بي سي جي مع البروتينات الخارجية ذات الاهتمام على سطح البكتيريا، بدلاً من التحول مع البلازميدات ترميز الجينات المقابلة. أولاً، يتم التعبير عن البروتينات ذات الاهتمام في الانصهار مع عبدين أحادي في معيار كولاي نظم التعبير وتستخدم بعد ذلك لتزيين سطح بيوتينيلاتيد بي سي جي. استخدام سطح BCG مزينة مستضد ovalbumin مركب التجارب على الحيوانات تبين أن بكتيريا معدلة مكسبه تماما وقادرة على استحثاث استجابات محددة T الخلية. بالإجمال، دعم البيانات المعروضة هنا بشدة الرواية والأسلوب كفاءة لإعادة تشكيل لقاح BCG الحالي الذي يحل محل النهج التقليدي شاقة للتكامل مع الأحماض النووية الخارجية.

Introduction

واقترحت استراتيجيات مختلفة ليحل محل لقاح السل الحالية ضد السل، بما في ذلك البروتين adjuvant النظم والتكنولوجيات فيكتوريد الفيروسية والموهنة الحية سلالات M.tb وسلالات السل المحورة وراثيا، أما إدخال جينات الإفراط معربا عن المستضدات السل التي لا يتم التعبير عنها بما فيه الكفاية خلال العدوى1 أو المواضيع المتميزة-المستضدات المحددة غير موجودة في البي سي جي2. الهندسة الوراثية، مع ذلك، يواجه العديد من العوائق، بما في ذلك مستوى السلامة وعملية تستغرق وقتاً طويلاً، وانخفاض كفاءة التعبير ناقلات4،5غير مؤكد. فيما يتعلق بتحسين BCG، مطلوب نهج بديلة لتحسين الاستمناع دون الحاجة للتغييرات الجينية غير مؤكد.

في هذه الدراسة، نقدم استراتيجية رواية لعرض بروتينات المؤتلف من الفائدة على سطح الخلية BCG يستند التفاعل المعروفة عالية تقارب avidin مع البيوتين. ويسمح هذا النهج مرفق السريع واستنساخه من عبدين المؤتلف الانصهار البروتينات على سطح بيوتينيلاتيد ضد السل، مما يسهل التلاعب الواسع للسل لتحقيق تحسين فعاليته القصوى مع الحفاظ على سلامتها ممتازة تسجيل، لوحظ على مدى عقود الاستخدام.

ألفه عبدين البيوتين مرتفعة للغاية (كد = 10−15 م) وحالما تتشكل، المجمع البيوتين-عبدين مستقرة جداً، ويمكن أن تتعطل فقط تحت ظروف6يشوه. ومع ذلك، لهذا النوع من التفاعل مثابة بديل أسلوب نقل جينات، عرض طويلة الأجل ولكن عكسها البروتينات المؤتلف مطلوب. وهكذا قدمنا هنا من عبدين أحادي تقارب منخفضة (كد = 10−7 م) أن يؤدي إلى الإفراج عن عكسها للبروتين من السطح زينت BCG بلعها مرة واحدة داخل مستضد عرض الخلايا. من أجل توفير دليل على المفهوم، قمنا باختبار هذا الأسلوب استخدام أحادي avidin بروتين تشيميريك تناظر مركب مستضد المستمدة من7،أوفالبومين (OVA)8. وأظهرت النتائج أن سطح الخلية BCG يمكن أن زينت بسهولة وسرعة مع البروتينات الانصهار avidin أحادي وأن هذا الربط إلى السطح BCG مستقرة واستنساخه بدون تغييرات لا يمكن اكتشافها في النمو البكتيري والبقاء على قيد الحياة. أيضا، وجدنا أن BCG مزينة avidin أحادي تنصهر مع البويضات (أفيوفا) يمكن أن تحدث استجابة مناعية مشابهة لتلك الناجمة عن السل وراثيا معربا عن مستضد نفسه على حد سواء في المختبر و في فيفو. هذه التكنولوجيا لعرض عكسها للبروتينات للفائدة على سطح البكتيريا ولذلك هو بديل فعال للنهج نقل الجينات التقليدية ويمكن أن توفر منبرا للتلاعب الواسع للسل ومزيد من التطبيقات في اللقاحات التنمية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وأبقى على جميع الحيوانات وفقا للبروتوكولات المعتمدة برعاية الحيوان واستخدام اللجان في جامعة كولومبيا البريطانية. تجارب وافق عليها العناية بالحيوان واستخدام اللجان وتنفيذها وفقا "المجلس الكندي للمبادئ التوجيهية لرعاية الحيوان". هو عدد رعاية الحيوان ضمان A11-0247.

1-جيل بروتينات الانصهار Avidin أحادي التعبير عن البلازميدات

  1. دون استنساخ avidin أحادي التسلسل12 إلى بلازميد pDEST17 بين مواقع "مكافحة الإرهاب" و "جا" الذي يتوافق مع 133-134bp. (أيبين 6-هيستاج وموقع جزئ Attr1 pDEST17) للحصول على p17-أفي.
    ملاحظة: يتم عرض تسلسل الحمض النووي أحادي عبدين أدناه. تظهر الطفرات الثلاث في البرية من نوع أفيدين للحصول على أفيدين أحادي في الأحرف التي باللون الغامق.
    جككاجااجتجكتكج كتجاكتججا آتجاككا كجاتكتججك tccالمنسوجات والملابسأتجا ككاتكجججك تجتجاكاجك
    تكاكاجكاك أجاجتجات كتاكاتكاكا ككاكاتكاا جككجتاكاج تجاجاتكاا تجكاتججاك جاجتكاككاك
    أكاةبنالجنة التنسيق الإدارية أتكاكاجا جاكككاجكك كاككتتجك تكاككجتكا أتتجاجتت تكاجاجتكك أككاكتجتكت
    جتجكتكاتا تكاكججككا جاكاجاتج ككتجاجاكك جاجاغت أتجتجكتجك تجتاتجاك تجكجتكاج
    أتجتجاتج acأأأأععجك تاككاججتك جكاتكاكا تكتكاكتكج ككتجكجكاكا كاجاجاجت ألجأ
  2. تصميم كبسولة تفجير محاط بمواقع توريB1 و B2 توريالمقابلة للبويضات ببتيد757-1035 (-أب--و H-2_Kب-قيدت [ابيتوبس]) تسلسل الحمض النووي. يتم تسلسل التمهيدي: b1-البويضات توري
    B2-البويضات جججأكاجتتجتاكاااااجكاجكتتككتجاجكاجكتجاجاجتات وتوري
    جججأككاكتتجتاكاجااجكتغغتجتاكككتاككاككتكتكتجك. (B1توريوتسلسل b2 توريبالغامق).
    1. [بكر] تضخيم البويضات ببتيد757-1035 تسلسل الحمض النووي مع الإشعال أعلاه باستخدام بلازميد البويضات pUC57 كقالب.
    2. استنساخ منتجات PCR إلى 221 بدونر من خلال مواقع محددة في المختبر جزئ فعل (مثلاً، كلوناسي شركة بريتيش بتروليوم) للحصول على بدونر البويضات.
  3. نقل جينات الفائدة في p17-وافي استخدام رد فعل كلوناسي LR للحصول على p17-أفي-البويضات.
    ملاحظة: للحصول على مزيد من التفاصيل BP و LR جزئ الاستنساخ، راجع الدليل الخاص بالشركة المصنعة.

2-أحادي عبدين الانصهار البروتين التعبير وتنقية ريفولدينج

  1. تحويل BL21 كولاي بلازميد p17-أفي-البويضات وحمل 250 مل ثقافة BL21 كولاي مع إيبتج (0.1 M) ح 3 في 37 درجة مئوية.
  2. تحلل البكتيريا وإدراج الهيئات سولوبيليزيشن
    1. بيليه 250 مل المستحث BL21 الثقافة قبل 30 دقيقة من استخدام الطرد المركزي في 4000 x ز وعند 4 درجة مئوية.
    2. جمع الكريات في 10 مل من تحلل المخزن المؤقت (50 مم تريس-HCL، 150 مم كلوريد الصوديوم، 6 م جوانيداين-HCL، الأس الهيدروجيني 1.5-2.5) واحتضانها لمدة 15 دقيقة عند 95 درجة مئوية. تبني بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة على دوار.
    3. أجهزة الطرد المركزي 30 دقيقة بمبلغ 000 15 × ز و 4 درجات مئوية وجمع المادة طافية.
  3. نق أفي-البويضات من المادة طافية (Solubilized إدراج الهيئات الكسر) باستخدام أعمدة ني-الإدارة الوطنية للسياحة.
    1. تمييع الهيئات إدراج 1:2 مع تحلل المخزن المؤقت.
    2. استخدام 4 مل راتنج ني-جاتا الواحدة 250 مل هيئات إدراج المستمدة من الثقافة.
    3. أغسل x 3 مع 10 مل من تحلل المخزن المؤقت (pH 7.0).
    4. الوتي مع 10 مل من شطف المخزن المؤقت (تحلل المخزن المؤقت pH 7.0 مع ايميدازول 250 ملم).
  4. ريفولد التيد البروتين بالتخفيف التدريجي (01:10) وفورتيكسينج السريع في تريس المخزن المؤقت (درجة الحموضة 7.5) الذي يحتوي على 1 مم DTT، 200 ملم NDSB256 (3-(Benzyldimethylammonio)propanesulfonate)، 0.5 مم توين 80، ارجينين 500 مم، ومم 200 كلوريد الصوديوم لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  5. إزالة الملح وتبادل المخزن المؤقت ريفولديد البروتين من المخزن المؤقت تريس في برنامج تلفزيوني مع مركزات البروتين وفقا للبروتوكولات الخاص بالشركة المصنعة.
  6. إزالة الركام عن طريق الطرد المركزي لمدة 30 دقيقة 3,500 ز خ وإلى 4 درجات مئوية، وتخزين مختبرين للبروتين للذوبان في-20 درجة مئوية.

3-بيوتينيليشن سطح الخلية BCG

  1. تنمو BCG في Middlebrook ح 7 مرق 9 مع 10% أوادك (حمض الأولييك، حل الزلال وسكر العنب) و 0.05% 80 توين في 37 درجة مئوية على منصة شاكر 50 لفة في الدقيقة حتى OD = 0.5-1.
    ملاحظة: BCG ممرض مستوى 2 السلامة البيولوجية وينبغي القيام بكل التجارب المتعلقة بالسل بالسلامة الأحيائية مجلس الوزراء مع معدات الحماية الشخصية المناسبة.
  2. أغسل 109 BCG 3 مرات مع 500 ميليلتر من الذيفان المثلج مجاناً برنامج تلفزيوني بالإضافة إلى 0.1% Tween80 (ببست) (pH 8.0). تعليق بيليه BCG في الذيفان معقمة مجاناً برنامج تلفزيوني.
  3. فورا قبل الاستخدام، إعداد 1 مل 10 ملم البيوتين SS سالفو--دائرة الصحة الوطنية في تعقيم المياه التي تمت تصفيتها.
    1. احتضان البكتيريا مع 1 مل من 0.5 مم بيوتين SS سالفو--دائرة الصحة الوطنية في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
  4. يغسل البكتيريا المسماة 3 مرات مع 500 ميليلتر من ببست البارد المثلج لإزالة بيوتينيليشن غير رد فعل كاشف.
    1. إعادة تعليق بيليه في 1 مل ببست.
  5. لتقييم كفاءة بيوتينيليشن، وصمة عار 108 بيوتينيلاتيد بي سي جي مع ستريبتافيدين-فيتك (1: 100، 25 ميليلتر) في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
    1. احتضان البكتيريا الملون في 1 مل 2% منهاج العمل لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ومن ثم اختبر مستويات بيوتينيليشن بتحليل التدفق الخلوي.

4-النمط الظاهري للبكتيريا بيوتينيلاتيد: النمو والبقاء على قيد الحياة

  1. زراعة سلالات السل في Middlebrook ح 7 مرق 9 مع 10% أوادك (حمض الأولييك، حل الزلال وسكر العنب) و 0.05% 80 توين في 37 درجة مئوية على منصة شاكر 50 لفة في الدقيقة.
    1. تسجيل الكثافة البصرية (OD600) ثقافة البكتيرية لمدة 8 أيام.
  2. استخدام البي سي جي-لوك (9تم وصفه مسبقاً) للكشف عن بقاء البكتيريا في الضامة.
    1. تصيب الخلايا RAW264.7 مع بيوتينيلاتيد بي سي جي-لوك (موي 10:1) أو دون علاج السل-لوك (تحكم) والمحتضنة في 37 درجة مئوية على مدى 48 ساعة الفترة الزمنية.
    2. أغسل مونولاييرس الخلية وثم مع الحزب الديمقراطي الصربي 0.025% على إطلاق سراح البكتيريا بلعها.
    3. قياس إنتاج الإضاءة الحيوية مع نظام الإنزيم لوسيفراس ولومينوميتير.
      ملاحظة: إشارة التﻷلؤ يدل على بقاء البكتيرية. الرجاء الرجوع إلى الدليل الخاص بالشركة المصنعة للحصول على تفاصيل من الإنزيم لوسيفراس.

5-ربط أحادي الانصهار Avidin البروتين على سطح BCG بيوتينيلاتيد

  1. مزيج 5 × 108 BCG بيوتينيلاتيد مع أفي-البروتين (10 ميكروغرام/مل النهائي في برنامج تلفزيوني-T) ح 1 في درجة حرارة الغرفة على منصة شاكر.
  2. البكتيريا الغسيل 3 مرات مع 500 ميليلتر ببست الباردة المثلجة ووصمة عار مع أرنب عبدين المضادة الأجسام المضادة (Ab) (تخفيف 1: 100، وصفه سابقا10) لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، ومن ثم مع فيتك مترافق الماعز الأرنب المضادة Ab مفتش في نفس الظروف.
  3. يغسل البكتيريا 3 مرات مع 500 ميليلتر من ببست وتحليلها بالتدفق الخلوي لتقييم مدى الزخرفة السطحية.

6-lyophilization Mycobacteria

  1. بيوتينيلاتي البكتيريا وفقا للخطوة 3، 1-3-4 ومعطف البكتيريا بيوتينيلاتيد مع أفي-البويضات وفقا للخطوة 5.1.
  2. بيوتينيلاتيد اليكووت والبكتيريا المغلفة (108) وتغسل ببرنامج تلفزيوني وإعادة تعليق في وسائل الإعلام ليوفيليزيشن 0.5 مل (المتوسطة ساوتون 25 ٪، 75 ٪ ح2س، و 1.5 في المائة غلوتامات Na).
  3. نقل البكتيريا إلى قارورة من الزجاج وتجميد في ثلاجة-80 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  4. ليوفيليزي قنينة الزجاج شغلها والمجمدة ح 24 استخدام تجميد مجفف.
  5. تخزين العينات المجففة في درجة حرارة الغرفة وإعادة تشكيل في برنامج تلفزيوني عند الحاجة.
  6. كرر الخطوة 3، 5 لتقييم بيوتينيليشن والسطح طلاء الاستقرار.

7-البلعمه بالانزيم

  1. تنمو خلايا بلعم 264.7 الخام في أطباق الثقافة قطرها 10 سم في دميم FCS 5% تحتوي على المتوسط، 1% لكل منهما للأم الجلوتامين والأحماض الأمينية غير الضرورية، والبنسلين وحبيس ستربتوميسين حتى كونفلوينسي 70-80%.
  2. البذور 2 × 106 264.7 الخام بلعم الخلايا في لوحة 6-جيدا. السماح بالالتزام بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية و 5% CO2الخلايا.
  3. توليد BCG دسريد مزينة (هو موضح سابقا9) أفي-البويضات (دسريد بي سي جي-أفي-البويضات) وفقا للخطوات 3.1 3.4 و 5.1.
  4. تصيب الخلايا الأولية مع دسريد بي سي جي-أفي-البويضات أو BCG دسريد غير المعالجة في وزارة الداخلية 20:1 عن 24 ساعة عند 37 درجة مئوية.
  5. يغسل خلايا ثلاث مرات وتريبسينيزي باستخدام 1 مل من 0.25% التربسين في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق لإزالة البكتيريا منفصلة جزئيا.
  6. إصلاح في 2.5% منهاج العمل في برنامج تلفزيوني لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  7. أغسل x 3 مع برنامج تلفزيوني وتحليلها بالتدفق الخلوي.

8-داخل الخلايا الاتجار بالبويضات مزينة بيوتينيلاتيد BCG في الضامة

  1. مجهر الأسفار
    1. البذور 3 × 105 264.7 الخام بلعم الخلايا على كوفيرسليبس في صفيحة 24-جيدا. السماح بالالتزام بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية و 5% CO2الخلايا.
    2. تصيب الخلايا بلعم مع المتفطرة (موي 10:1) في صيانة وسائل الإعلام دون المضادات الحيوية في 37 درجة مئوية و 5% CO2 لح 4 إلى 24.
    3. تغسل الخلايا وتريبسينيزي لإزالة البكتيريا المرفقة، وعدم بلعها السطحية كما هو الحال في الخطوة 7، 5.
    4. الخلايا المصابة فيكس في 2.5% تليها منهاج العمل في برنامج تلفزيوني لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة يغسل 3 مع برنامج تلفزيوني.
    5. بيرميبيليزي الخلايا الموجودة في المخزن المؤقت لحظر/بيرميبيليزيشن (0.1% X-100 تريتون، جيش صرب البوسنة 3% في برنامج تلفزيوني) لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
      1. استخدام جسم معين للفائدة (مثلاً، أرنب avidin المضادة Ab) في 10 ميكروغرام/مل في بيرميبيليزيشن تليها المخزن المؤقت لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة جسم الثانوية (مثلاً، مفتش أرنب المضادة فيتك-الماعز) لمدة 20 دقيقة.
    6. أغسل الخلايا x 3 مع برنامج تلفزيوني، مرة بالماء، وجبل على الشرائح في 10 ميكروليتر المتوسطة تصاعد مائي والتقليل من فوتوبليتشينج الأسفار.
    7. دراسة الشرائح برقمي مجهرية [كنفوكل] استخدام مجهر ابيفلوريسسينسي مجهزة 63 x/1.4 هدف الخطة--أبوتشرومات. تسجيل الصور باستخدام كاميرا رقمية بالإضافة إلى برنامج المجهر.
  2. تلوين Immunogold والمجهر الإلكتروني
    1. البذور 2 × 106 264.7 الخام بلعم الخلايا في لوحات 6-جيدا.
    2. إصلاح الضامة المصابة BCG مع 4% منهاج عمل بيجين ح 4 في درجة حرارة الغرفة.
    3. تغسل العينات مرتين مع برنامج تلفزيوني.
    4. تضمين عينات في 4% نقطة انصهار منخفضة [اغروس]، ويذوي في الإيثانول 70%.
    5. نقل العينات إلى راتنج اﻷكريليك وبلمره في 50 درجة مئوية.
    6. قطع 60 نانومتر المقاطع مع مبضع وجمع الأقسام في شبكات النيكل.
    7. تسمية عينات مع 10 ميكروغرام/مل عبدين جسم ح 1 في درجة حرارة الغرفة أو 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها في حضانة الحل (BSA PBS و 0.1 في المائة)، ويغسل مع الاحتضان الحل مترافق الذهب F(ab')2 صغيرة جداً الماعز-مكافحة-الأرنب مفتش (1/20) عن ح 1 في الغرفة درجة الحرارة في حضانة الحل.
    8. أغسل المقاطع في الماء المقطر ووصمة عار في جلوتارالديهيدي 2% وتغسل مرة أخرى، الهواء الجاف وتفحص بالمجهر الإلكتروني.

9-الحيوانات التحصين ومعالجة الجهاز

ملاحظة: جميع الخطوات، وينبغي أن يتم في مجال السلامة الأحيائية مجلس الوزراء.

  1. تمرير بيوتينيلاتيد وبروتين البكتيريا المغلفة من خلال 271/2ز إبرة 10 مرات لجعل تعليق خلية مفردة.
  2. 1 × 106 البكتيريا في 100 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني خالية من الذيفان وتحصين من فئران C57BL/6 الإناث (-أب، ح 2 كب، 5-6 الأسبوع القديمة) تحت الجلد في القفا العنق.
    1. حقن الفئران التحكم مع 100 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني وحدها.
  3. Euthanize الفئران تحصينهم التحصين بعد 20 يوما من استنشاق2 CO متبوعاً بخلع عنق الرحم.
    1. عزل الطحال وتحويلها إلى وسائط الإعلام ربمي.
  4. تهرس الطحال من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر مع المكبس حقنه 5 مل.
    1. يغسل مع 5 مل ربمي. أجهزة الطرد المركزي (800 x ز، 3 دقيقة) لعزل تعليق خلية مفردة.
    2. تستنفد ربك مع الماوس البيوتين التحديد إيجابية عدة مع البيوتين-Ter119/محمر خلايا Ab.
    3. أجهزة الطرد المركزي، وإعادة تعليق الخلايا في 10 مل ربمي كاملة (FCS 10% و 1% لام الجلوتامين، البنسلين 1%، ستربتوميسين 1% و 50 ميكرومتر 2-لي).

10-أنا-أب تيترامير تلطيخ لتحديد الترددات CD4 محددة مستضد+ "خلايا تي" وتلطيخ سيتوكين داخل الخلايا لتحديد الترددات من محددة مستضد "تي الخلايا الإفراج عن السيتوكينات" في "تحصين الحيوانات"

  1. تلوين تيترامير
    1. وصمة عار سبلينوسيتيس من التحكم والفئران المحصنين (~ 20 × 106 خلايا) مع PE مترافق-أب-البويضات323-339 tetramers (تمييع 1/12.5) ح 1 في 37 درجة مئوية في ربط المخزن المؤقت (برنامج تلفزيوني مع FCS 2% و 0.1% نان3).
    2. إضافة AF647 CD4 Ab (01:25)، وعاد 7 (للكشف عن الخلايا الميتة) إلى سبلينوسيتيس لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    3. تحليل العينات بالتدفق الخلوي.
    4. اكتساب 500,000 الأحداث في المنطقة CD4 إيجابية لتحديد تواتر الأحداث الإيجابية تيترامير.
      ملاحظة: مجموع سبلينوسيتيس تحددها بوصمة عار دوت SSC/منتدى التعاون الأمني، الخلايا الحية باستبعاد 7-عاد الأحداث الإيجابية، ومجموعات فرعية CD4 النابضة AF647 الأحداث الإيجابية.
  2. تواتر سيتوكين داخل الخلايا محددة مستضد الإفراج عن الخلايا T
    1. نقل نحو 1 × 107 سبلينوسيتيس إلى 4 مل متوسطة ربمي كاملة في اللوحات الست، حسنا مع أو بدون البويضات المؤتلف (10 ميكروغرام/مل) واحتضانها ح 16.
    2. علاج الخلايا مع بريفالدين أ (1:1، 000) 5 ساعات إضافية.
    3. يغسل مع برنامج تلفزيوني وتخضع سيتوكين داخل الخلايا تلطيخ كما يلي:
      1. وصمة عار عينات الخلايا مع PE-CD8 أو PE-Cy7-CD4 Ab (01:50 في المخزن المؤقت ملزم) في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
      2. إصلاح في 4% منهاج العمل في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
      3. بيرميبيليزي باستخدام حل بيرميبيليزيشن، وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
      4. غسل الخلايا والتسمية مع IFN-γ مترافق AF647 Ab (01:50) لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
      5. تغسل الخلايا وخاضعة لتحليل التدفق الخلوي كما هو موضح أعلاه.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

مع الإجراءات العامة المذكورة أعلاه، تم بحث جدوى BCG بيوتينيليشن السطحية والديكور مع مستضد مركب البويضات. كان الاستمناع للسل تم التعديل ثم اختبارها في فيفو. سطح البكتيرية وصفت بسهولة مع البيوتين للعرض السريع المستضدات عبدين تشيميريك دون أي تغييرات يمكن اكتشافها في تعمل البكتيريا. BCG المعدلة الناتجة عن كفاءة بلعها قبل العرض التقديمي مستضد خلايا ويمكن أن تحدث استجابة مناعية محددة البويضات في الفئران.

جيل والبلازميدات الانصهار عبدين أحادي والبروتينات
تعبير بلازميد p17-Avi تم إنشاؤها لتكون متوافقة مع العبارة منهجية يمكن استخدامها لإنتاج البروتينات الانصهار avidin أحادي. كان المستنسخة في p17-وافي البويضات وأعرب في كولاي، ثم تنقيته وريفولديد كما هو موضح أعلاه (الشكل 1).

البيوتين تعلق كفاءة على سطح البكتيريا ولا تؤثر في النمو البكتيري أو البقاء على قيد الحياة
كانت تسمية البكتيريا بتركيزات مختلفة (0-1 مم) من البيوتين والملون لفحص كفاءة بيوتينيليشن السطحية وفقا للبروتوكولات المذكورة أعلاه. تحليل التدفق الخلوي أظهرت تحولاً مجموع من الرسم البياني fluorescence في البكتيريا المسماة مع البيوتين 0.5 مم (الشكل 2)، واستخدمت هذا التركيز في جميع أنحاء هذه الدراسة لتوليد بكتيريا بيوتينيلاتيد. بعد ذلك، درسنا أثر تعديل السطح البكتيرية في النمط الظاهري البكتيرية ووجدت أن بيوتينيلاتيد والتحكم دون علاج BCG عرض ملف تعريف نمو مماثلة لمدة 8 أيام (الشكل 3A). واستخدمت BCG معربا عن لوسيفراس (بي سي جي-لوك)9 لبحث بقاء البكتيرية في الضامة. ضيائية إشارات تشير إلى بقاء البكتيرية وسجلت ما يزيد على 48 حاء النتائج التي تم الحصول عليها أظهر ملامح مماثلة للانخفاض التدريجي صلاحية بين البكتيريا بيوتينيلاتيد والتحكم (الشكل 3B). وفي الختام، هذه البيانات تشير بوضوح إلى أن بيوتينيليشن السطحية البكتيرية لا يؤثر على النمو البكتيري أو البقاء على قيد الحياة داخل الضامة، هو أمر مهم نظراً لزيادة البقاء على قيد الحياة في الضامة قد يعني زيادة في الفوعة الجرثومية.

الكفاءة لتزيين سطح البكتيرية
كانت مغلفة بالبكتيريا بيوتينيلاتيد مع الببتيد مستضد البويضات في الانصهار مع avidin أحادي، وفقا للبروتوكولات المذكورة أعلاه. تحليل التدفق الخلوي وأظهرت مستويات دنيا من البويضات ملزمة للبكتيريا غير بيوتينيلاتيد (مؤسسة مونتانيار = ± 8.31 0.42، الشكل 4A، أعلى اللوحة) ومستويات كبيرة من البويضات ملزمة للبكتيريا بيوتينيلاتيد (مؤسسة مونتانيار = 54.67 ± 4.98) مقارنة بالبكتيريا التحكم (مؤسسة مونتانيار = 5.92 ± انخفاض 0.22، الشكل 4A، الفريق).

الاستقرار لتزيين سطح BCG
حيث تصاغ لقاحات البي سي جي العيش التقليدية كالمساحيق المجففة، مسألة هامة التي نشأت خلال هذه الدراسة كان استقرار BCG معدلة بعد التجميد وإعادة تشكيل، والتخزين المبردة أو درجة حرارة الغرفة. ولذلك، درسنا العرض السطحي لافي-البويضات في المجففة بالتبريد BCG أفي-البويضات (سطح مزين بالبويضات Avi) وفي طازجة مزينة بالاستعدادات البكتيرية. وأظهرت النتائج (الشكل 4 باء) أن مستويات أفي-البويضات على سطح البكتيريا لا تزال مستقرة وقابلة للاكتشاف شهر واحد بعد ليوفيليزيشن والتخزين في درجة حرارة الغرفة مقارنة بالطازج BCG أفي-البويضات الاستعدادات، التي أثبتت أن هذا السطح أسلوب الديكور مناسبة لتطوير اللقاحات.

لا يتأثر النمط الظاهري بلعم زخرفة سطح البكتيرية
لمعرفة ما إذا كانت هذه المنهجية زخرفة سطح يتداخل مع دخول البكتيريا في الخلايا المضيفة، استخدمنا خلايا RAW264.7 و البكتيريا دسريد9 القيام مقايسة البلعمه الموصوفة في البروتوكول أعلاه. الشكل 4 أظهرت أن سطح البكتيرية زينت BCG لم يكن تدخلا كبيرا مع دخول البكتيرية (22.5 ± 1.57%) مقارنة بغير المصقول البرية نوع BCG (24.47 ± 1.18%) مما يشير إلى أن الزخرفة السطحية للسل ليس له تأثير على بلعم النمط الظاهري.

عبدين الانصهار البروتينات السفر إينتراسيلولارلي وتعريب يشترك مع جزيئات MHC
لبحث مصير البويضات أفي-زينت BCG داخل الضامة، إصابة الخلايا الخام ملتصقة ودرست بالفحص المجهري الأسفار، كما هو موضح في البروتوكول أعلاه. وأظهرت الصور التي تم الحصول عليها (الشكل 5A) أفي-البويضات أنه ليس فقط موجودة على السطح البكتيرية، ولكن أيضا فصل وذوبانها إلى السيتوبلازم البعيدة للبكتيريا. كذلك التحقق من هذه النتيجة، أجرينا immunogold تلطيخ التجربة والصور التي تم الحصول عليها أظهرت بوضوح أن المستضدات أفي-البويضات ليست موجودة على سطح BCG فقط، ولكن يمكن أيضا فصل من السطح BCG، عبر غشاء فاجوسومال، والسفر نحو سيتوسول (الشكل 5 (ب)). لمواصلة النظر في ما إذا كانت البكتيريا أفي-البويضات زينت القادرة على إيصال الشحنات البروتين السطحي لمسار العرض التقديمي مستضد، الضامة مصاب "السل" أفي-البويضات، كما هو موضح في البروتوكول، ويخضع لتحليلات [كنفوكل]. وأظهرت نتائج (الشكل 6A) أن هناك كولوكاليزاتيون لافي-البويضات مع جزيئات-ألف، مشيراً إلى أن avidin البروتين الانصهار منفصلة وذوبانها إلى مقصورات عرض مستضد حيث تم تحميله إلى جزيئات MHC الثاني. النتائج أظهرت أيضا أن الببتيد البويضات أفي يموضع اشتركت مع الفئة الأولى الجزيئات داخل فاجوسوميس بي سي جي عند الملون H-2_kب (الشكل 6B)، مما يدل على أن هناك إمكانية عرض مستضد أفي-البويضات إلى CD8+ تي الخلايا قبل بلعم. تشير هذه البيانات إلى أن مجرد تزيين سطح البكتيريا أدخل الضامة، ومولدات المضادات قادرة على السير نحو مسارات العرض التقديمي مستضد.

البكتيريا مزينة السطح مكسبه تماما
لفحص ما إذا كانت BCG مزينة السطح قادرة على استحثاث فئران C57BL/6 في فيفو، استجابة مناعية محددة تم تحصين مع PBS وحدها (مراقبة)، البرية من نوع بي سي جي، أفي-البويضات مزينة بالسل، و BCG تحولاً جينياً مع بلازميد للتعبير عن مستضد البويضات مماثلة. كانت الفئران المحصنين يضحي 20 يوما في وقت لاحق والترددات الخاصة بالبويضات CD4+ تي كشف الخلايا والخلايا التائية الخاصة بالبويضات إطلاق السيتوكينات، وفقا للبروتوكول. وأظهرت نتائج (الشكل 7 أ-ب) نسبة أكبر من خلايا CD4 البويضات الخاصة+استجابة الخلايا T في الحيوانات تحصين مع BCG المغلفة مع أفي-البويضات مقارنة بالوزن البي سي جي BCG وراثيا تعديل للتعبير عن البويضات أظهرت استجابة مناعية مشابهة للسل أفي-البويضات (الشكل 7). أظهرت هذه البيانات أن الأسلوب زخرفة سطح البكتيريا قادرة على حمل توسع ملحوظ في مستضد خلايا CD4 محددة+ تي الخلايا ودرجة الحث استجابة الخلية تي يماثل BCG المهندسة وراثيا للتعبير عن البويضات مماثلة مستضد.

منذ السيتوكينات داخل الخلايا أيضا مؤشرات هامة لاستجابات محددة T الخلية مستضد، السيتوكينات داخل الخلايا تلطيخ (ICS) تجارب أجريت لمواصلة تقييم الاستجابات المناعية T الخلية بتحديد التعبير والترددات من السيتوكينات المستجيب في الحيوانات تحصين مع زينت البويضات البكتيريا والبكتيريا وراثيا تحول مع البويضات الإعراب عن بلازميد. قمنا بفحص مستويات الإصدار IFN-γ، الذي مؤشر استجابة وقائية ضد البكتيريا داخل الخلايا11معروفة. أظهرنا أن كنا قادرين على الكشف عن مستويات مماثلة من البويضات الخاصة IFN-γ الإفراج عن خلايا CD4 خلايا+ في الحيوانات تحصين مع سطح البكتيريا مزينة بالبويضات (بي سي جي-أفي-البويضات والبي سي جي-p19-أفي-البويضات) مقارنة بالحيوانات تحصين مع البكتيريا وإذ تعرب عن وراثيا البويضات (بي سي جي-p19-OVA) (الشكل 8 أ). الأهم من ذلك، تمكنا أيضا من الكشف عن ترددات أعلى بكثير من IFN-γ المنتجة CD8+ تي الخلايا في الحيوانات تحصين مع البي سي جي-أفي-البويضات مقارنة بالحيوانات تحصين مع BCG وراثيا معربا عن البويضات (8B الشكل-C) الذي يوضح أن البيوتين-أفيدين بوساطة عرض سطح مستضد منهجية يمكن فعلياً استبدال التحول BCG بالأحماض النووية.

Figure 1
رقم 1: بناء جزئ استنساخ بلازميد لإنتاج البروتينات الانصهار عبدين. (أ) شريحة جينات ترميز لعبدين أحادي توليفها مع تقييد مواقع ندى و NotI وسوبكلونيد في pDEST17 بين الحامض الأميني 6 x وكاسيت بوابة لتوليد بلازميد p17-أفي. البويضات الببتيد252-345 الحمض النووي قد تم استنساخ تسلسل إنهاء مع مواقع توريب إلى pDONR221. وبعد ذلك، كانت سوبكلونيد الجينات البويضات في p17-وافي. الصورة تحريرها وطبعها بإذن من "أحد بلوس"12. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: كفاءة BCG بيوتينيليشن. وكان السل بيوتينيلاتيد مع تركيز مختلف لدائرة الصحة الوطنية--SS-البيوتين لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، ثم وصفت مع فيتك-streptavidin، وتحليلها بواسطة التدفق الخلوي. يتم عرض النتائج كرسوم بيانية لكثافة الفلورية الخضراء ويمثل الرسم البياني إدراج ± يعني SEM fluorescence يعني كثافات (مؤسسة مونتانيار) تخصم من 3 التجارب المستقلة. * ف < 0.05؛ * * ف < 0.01؛ ف < 0.001. الصورة تحريرها وطبعها بإذن من "أحد بلوس"12. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: بيوتينيليشن سطح BCG لم يؤثر على نموه أو بقائها في بلعم. (A) بيو-السل والسيطرة غير مسمى البرية من نوع بي سي جي كانت تزرع في الكامل 7 ح 9 وسائط الإعلام، وتم رصد النسخ المتماثل لمدة 8 أيام. يتم التعبير عن النتائج منحنيات النمو، أي، يعني امتصاص 600 نانومتر كدالة للوقت ± SEM من 3 التجارب المستقلة. الضامة (ب) كانوا مصابين بيو-بي سي جي-لوك أو السيطرة غير مسمى البي سي جي-لوك للفترات الزمنية المشار إليها، ومن ثم خلية وأعدت ليساتيس وجزيئي للإضاءة الحيوية للكشف عن البكتيريا قادرة على البقاء. يتم التعبير عن النتائج كما تعني وحدات خفيفة نسبيا (رلو) ± SEM من 3 التجارب المستقلة. الصورة تحريرها وطبعها بإذن من "أحد بلوس"12. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: أفي-البويضات ملزمة بيو-السل واستقراره. (أ) بيو-دسريد-بي سي جي (البكتيريا معربا عن ومضان أحمر، الموصوفة سابقا9) وعنصر تحكم غير بيوتينيلاتيد دسريد-السل كانت مختلطة مع أفي-البويضات في درجة حرارة الغرفة ح 1 وحجم البويضات وتم تقييم ملزم تلطيخ السطح مع أرنب عبدين المضادة الأجسام المضادة والماعز فيتك أرنب المضادة IgG (FL1). تغسل العينات وتحليلها بواسطة التدفق الخلوي. وترد نتائج كرسوم بيانية لكثافة الفلورية الخضراء، وقيم ملزمة يعني ± SEM لمؤسسة مونتانيار لبيوت-بي سي جي-أفيوفا التي تم الحصول عليها من ثلاث تجارب مستقلة. (ب) "المجففة بالتبريد" بيو-BCG المغلفة مع أفي-البويضات وطازجة أفي-البويضات-بيو-BCG المسمى وتحليلها بواسطة التدفق الخلوي كما هو موضح في ألف. البيانات المعروضة هي الممثل لثلاث تجارب مستقلة، والقيم ملزمة يعني ± SEM لمؤسسة مونتانيار لافي-البويضات-بيو-السل التي تم الحصول عليها من ثلاث تجارب مستقلة. (ج) الخام الضامة كانوا مصابين دسريد بي سي جي-أفي--أووفا أو دسريد-بي سي جي عن 24 ساعة عند 37 درجة مئوية. العينات ثم غسلها، وتعامل مع التربسين، ثابتة، وتحليلها من قبل نظام مراقبة الأصول الميدانية. يتم التعبير عن النتائج برسوم بيانية fluorescence الحمراء، التي تعكس مدى البلعمه. تشير القيم إلى متوسط النسبة المئوية ± SEM الخلايا تناول السل التي تم الحصول عليها من ثلاث تجارب مستقلة. الصورة تحريرها وطبعها بإذن من "أحد بلوس"12. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الرقم 5: أفي-البويضات منفصلة من سطح BCG وعبرت غشاء فاجوسومال تجاه سيتوسول- (أ) الخلايا "الخام ملتصقة" على تغطية كشوف المصابين BCG دسريد زينت البويضات عن 24 ساعة عند 37 درجة مئوية وبيرميبيليزيد ثابت ثم وملطخة بأرنب عبدين المضادة الأجسام المضادة والماعز فيتك المضادة أرنب مفتش. شنت على شرائح المجهر عينات وتحليلها بواسطة الفحص المجهري [كنفوكل] رقمية. إشارات حمراء تشير إلى موقف ضد السل وإشارات خضراء تعكس التعريب لافي-البويضات. خط منقط يشير إلى حدود الخلية بلعم، وأسفل اليمين من الفريق تكبير X 4 من إدراج سيظهر في اللوحة اليسرى. (ب) أقسام رقيقة من خلايا المصابين بالسل-أفيوفا الخام الثابتة مع بارافورمالدهيد والمحتضنة تسلسلياً مع عبدين المضادة الأجسام المضادة والماعز مترافق الذهب أرنب المضادة مفتش لتصور أفي-البويضات وبحث مع مجهر الإلكتروني. يتم إظهار التكبير 12000 X. رؤوس الأسهم تشير إلى فصلها عن سطح BCG أفي-البويضات وتصديرها خارج الغشاء يبلوع. الصور تظهر هم ممثلون لتجربتين مستقلة. الصورة تحريرها وطبعها بإذن من "أحد بلوس"12. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 6
رقم 6: مستضد عبدين-الانصهار المشترك المترجمة مع MHC من الدرجة الثانية والفئة الأولى الجزيئات. ملتصقة BMA3.1A7 الخلايا، خط خلية سنخية ماوس، مصابين بالبويضات زينت بروتينات فلورية خضراء-السل (التعبير عن أخضر نيون، سبق وصفها9) عن ح 4 وثم حفز مع IFN-γ ل 24 h. الخلايا ثم ثابت/بيرميبيليزيد وملطخة الأرنب أفيدين المضادة الأجسام المضادة، 594 أليكسا أرنب المضادة IgG وأما 647 أليكسا الفئران الماوس المضادة-ألف (A) أو 647 أليكسا الفئران الماوس المضادة H-2_kب (ب). شنت على شرائح المجهر عينات وتحليلها بواسطة الفحص المجهري [كنفوكل] رقمية. إشارات خضراء تشير إلى موقف البي سي جي-التجارة والنقل، وإشارات حمراء تعكس التعريب لافي-البويضات. الإشارات الزرقاء تشير إلى موقف MHC الدرجة الثانية أو الفئة الأولى الجزيئات. خط منقط يشير إلى مجال الاهتمام. تشير رؤوس الأسهم إلى كولوكاليزاتيون البويضات أفي مع جزيئات MHC. الصور تظهر هم ممثلون لتجربتين مستقلة. الصورة تحريرها وطبعها بإذن من "أحد بلوس"12. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 7
الشكل 7: في فيفو CD4+ خلية T ردا على BCG زينت البويضات. الفئران C57BL/6 تم حقن تحت الجلد مع سطح BCG مزينة بالبويضات، غير معدلة BCG البرية من نوع، وبرنامج تلفزيوني (مراقبة)، BCG وراثيا تحول إلى التعبير عن البويضات (بي سي جي-p19-OVA)، أو تحويلها مع التحكم بلازميد والسطح مزينة (أفي-البويضات BCG-p19-AviOVA). وبعد فترة 20 يوما، وأعدت من الطحال الحيوانات euthanized سبلينوسيتيس وملطخة مترافق PE-أب-البويضات323-339 تيتراميرس (A) متبوعاً بجسم AF647 CD4 وعاد 7. ثم تم تحليل عينات من التدفق الخلوي. يتم التعبير عن النتائج بالمؤامرات دوت اثنين-المعلمة التي تظهر الترددات المتوسط ± SEM من تيترامير الأحداث الإيجابية في خلايا CD4+ السكان من الحيوانات/مجموعة اثنين. البيانات المعروضة هي الممثل لثلاث تجارب مستقلة (مجموعة فئران الستة بحثت مع عينات الخلايا من الماوس كل تقييمها في ثلاث نسخ). يتم التعبير عن البيانات في الرسومات البيانية (ب) كما تعني قيمة ± SEM عدد مطلق (في مجموع الأحداث 500,000) تيترامير البويضات CD4 محددة+ الخلايا من الحيوانات/مجموعة اثنين وثلاث تجارب مستقلة. * ف < 0.05؛ * * ف < 0.01؛ ف < 0.001. الصورة تحريرها وطبعها بإذن من "أحد بلوس"12. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 8
الشكل 8: ترددات الخلايا T إطلاق السيتوكينات استجابة لافي-البويضات مغلفة بالتحصين ضد السل. كانت تحفز مع المؤتلف البويضات البروتين لكانت 16 ح متبوعاً بعلاج فترة ح 5 مع الخلايا أ بريفالدين سبلينوسيتيس من الفئران المحصنين مع برنامج تلفزيوني، البرية ضد السل، من نوع سطح BCG WT مزينة أفي-البويضات والبي سي جي-p19-البويضات والبي سي جي-p19-أفيوفا ثم غسلها و ملون أولاً مع PE-Cy7 مكافحة خلايا CD4 (A) أو جسم CD8 مكافحة PE (ب) ثم الأجسام المضادة-IFN-γ AF647. الخلايا ثم غسلها وتحليلها بواسطة التدفق الخلوي. يتم التعبير عن النتائج كما دوت المعلمة اثنين المؤامرات لإظهار الترددات المتوسط ± SEM من IFN-γ المنتجة الخلية مجموعات فرعية في خلايا CD4+ و CD8+ السكان من الحيوانات/مجموعة اثنين. البيانات المعروضة هي الممثل لثلاث تجارب مستقلة (مجموعة فئران الستة بحثت مع عينات الخلايا من الماوس كل تقييمها في ثلاث نسخ). يتم التعبير عن البيانات في الرسومات البيانية (ج) كالمتوسط ± الأرقام المطلقة SEM من IFN-γ الإفراج عن خلايا CD4 خلايا+ تي (الرسم البياني الأيسر) أو IFN-γ الإفراج عن CD8+ تي الخلايا (الرسم البياني الأيسر) من الحيوانات/مجموعة اثنين وثلاث تجارب مستقلة. * ف < 0.05؛ * * ف < 0.01؛ ف < 0.001. الصورة تحريرها وطبعها بإذن من "أحد بلوس"12. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

أبلغنا في هذه الدراسة نهجاً غير وراثية للعرض السريع والفعال للبروتينات الخارجية على سطح BCG لإضافة مولدات معينة أو محددة الخصائص الفنية التي من المتوقع أن يحسن كفاءة الاستمناع للبكتيريا. أظهرنا أن سطح الخلية BCG يمكن بسهولة بيوتينيلاتيد للزخرفة السطحية لحظية مع عبدين الانصهار البروتينات. يمكن تنفيذ الإجراء المجموع ضمن ح 2، بينما التحول الوراثي وانتقاء الحيوانات المستنسخة إيجابية تتطلب 2 إلى 3 أشهر للفاصل الزمني. تعديل السطح لا يؤثر على النمو البكتيري والبقاء على قيد الحياة. البكتيريا مزينة بمركب مستضد البويضات وتمكنت من تقديم antigen في المسار عرض مستضد الناجمين عن استجابة مناعية محددة الحية، التي تم تقييمها من قبل فحوصات التدفق الخلوي بما في ذلك MHC تيترامير تلطيخ و سيتوكين داخل الخلايا تلطيخ (ICS). الأهم من ذلك، في فيفو الدراسات أظهرت بوضوح أن تزيين سطح البكتيريا قادرة على حمل مستويات مماثلة من الاستجابة المناعية BCG المهندسة وراثيا إلى المستضدات صريحة مماثلة بالمقارنة.

عبدين البيوتين التفاعل هو التفاعل غير التساهمية أقوى المعروفة في الطبيعة مع أ كد 10−15 م13. أنها ليست فقط أداة مفيدة تستخدم عادة في البحوث البيولوجية14، ولكن أيضا في الآونة الأخيرة وقد تبين أن تكون قابلة للتطبيق في السرطان العلاج15،16. في هذه الدراسة، تم تطبيق طفرة ثلاثية (N54A و W110K و N17I) إلى البرية من نوع أفيدين تحويل أفيدين تيتراميريك شكل أحادي avidin التي خفضت إلى حد كبير تقارب avidin-البيوتين (كد= 10−7 م)، ويربط عكسية على البيوتين. واستخدمت هذا عبدين أحادي وضع بلازميد p17-أفي متوافق مع جزئ بوابة استنساخ ([اينفيتروجن]) لتعبير سريع خطوة واحدة من بروتين فائدة. هذا الإصدار الجديد من avidin أحادي له العديد من المزايا بما في ذلك منع أجمة البكتيرية كبيرة التجميع وعابرة/عكسها من عرض السطحية البكتيرية من البروتينات للفائدة. ولذلك، وبمجرد بلعها من الخلية المضيفة، البروتينات أفي-الانصهار يمكن فصل من على سطح البكتيريا بيوتينيلاتيد والمرور إينتراسيلولارلي. وأخيراً، تحويل الطفرات عبدين في نموذج غير الغليكوزيلاتي يمكن تطبيقها في الخميرة أو النباتات المعدلة وراثيا17،18 لإنتاج كميات كبيرة من البروتينات الانصهار عبدين في نظم حقيقية النواة. تم اختيار هذا الشكل من avidin أحادي بدلاً من إصدار streptavidin أحادي (mSA)19، الذي تسلسل ستريبتافيدين ورهيزافيدين وكان تقارب ملزم أعلى (كد من 10−9 متر) بالمقارنة مع مافيدين. مع الاختبارات الأولية، كان بدل الوهم البروتين من كفاءة ملزم أقل بكثير للبكتيريا بيوتينيلاتيد مقارنة بالبروتين الوهم مافيدين. هذه الدراسة، ولذلك، كان على أساس مافيدين، ولكن ستريبتافيدين أحادي أو أشكال أخرى من ستريبتافيدين/عبدين سيكون أيضا إمكانية لتطبيقات أخرى.

النجاح في تنفيذ البروتوكولات وصف يعتمد على نوعية البروتين الانصهار الذي تم إنشاؤه وكفاءة بيوتينيليشن السطحية البكتيرية. البروتين معلم أفي التيد ينبغي إزالة المملحة وتبادلت المخزن المؤقت في برنامج تلفزيوني استخدام مركزات البروتين السليم من الوزن الجزيئي. قد يحدث هطول الأمطار في عوامل تركيز عال لبعض البروتينات، ولذلك إلى معامل التركيز ينبغي اختبار وتحديد استخدام كميات صغيرة من البروتين التيد في الأولى، مثلاً، 0.5 إلى 1 مل هيئة إدراج solubilized المخفف في 20 مل من برنامج تلفزيوني وركزت بعد ذلك. من المهم أيضا للحفاظ على درجة حرارة البروتين حوالي 4 درجات مئوية خلال العملية بأكملها لتجنب سقوط الأمطار.

لتحسين كفاءة بيوتينيليشن السطحية البكتيرية، يجب تخزين البيوتين SS سالفو--دائرة الصحة الوطنية في الحاوية الأصلية الخاصة به في الظلام في 4 درجات مئوية. الكاشف هو الغاية الرطوبة الحساسة؛ ولذلك، ينبغي أن اكويليبراتيد قارورة تحتوي على الكاشف لدرجة حرارة الغرفة قبل فتح. أيضا، ينبغي أن أدلى فورا قبل الاستخدام كما moiety دائرة الصحة الوطنية--إستر هيدروليزيس حل الأسهم البيوتين (10 ملم) وتصبح غير القائم على رد الفعل بسرعة كبيرة. البيوتين الأسهم الحل لا يمكن تخزينها وإعادة استخدامها؛ قنينة بيوتين جديدة مطلوب لكل تجربة بيوتينيليشن. للحصول على أفضل النتائج، ينصح بثقافات جديدة من السل، ووسائط الإعلام الجديدة، فضلا عن مخازن جديدة. كما ورد في البروتوكول، بيوتينيلاتيد والسل المغلفة يمكن المجففة بالتبريد والحفاظ عليه لمدة 30 يوما على الأقل دون التأثير على نوعية طلاء السطح. وهذا مفيد بشكل خاص عند إرسال أو نقل عينات من موقع واحد إلى آخر أو عند إجراء تجارب طويلة بالطبع.

ويوفر هذا الأسلوب زخرفة سطح BCG أيضا إمكانيات مثيرة أخرى لتحليل وتقييم الاستمناع للمرشحين اللقاحات المطورة حديثا بطريقة سريعة ودقيقة. الهدف الأساسي للقاحات السل رواية لحمل TH1 نوع الخلايا مثل خلايا CD4+ و CD8+ تي الخلايا التي تلعب أدواراً هامة في الحماية ضد مرض السل. يوفر نظام avidin-البيوتين نمواً في هذه الدراسة أداة مفيدة جداً لتقييم استجابات هذه الخلايا T. هذه التكنولوجيا رواية من سرعة عرض المؤتلف البروتينات/المستضدات على سطح BCG يمثل أداة عظيمة لتقييم بسرعة ودقة فعالية الحماية من العديد من البروتينات مكسبه (مثلاً، يفرز محددة M.tb البروتينات)، وهكذا يمكن أن يترجم إلى تطوير لقاحات فعالة.

بضبط واختلاف تركيز البروتينات أفي-الانصهار على سطح البكتيريا، يمكن أن تكون هناك ميزة أخرى لهذا الأسلوب لعرض المستضدات المختلفة ذات الاهتمام في أن واحد على سطح البكتيريا لتعظيم فعالية اللقاحات. حيث أظهرت الدراسات أن BCG يتداخل مع وظائف بلعم هامة مثل يبلوع نضوج20،21 ومستضد العرض21، إمكانية واحدة لزيادة تحسين BCG يمكن أن يكون تزيين سطح BCG مع مزيج من العوامل المعروفة للتعجيل بنضج يبلوع جنبا إلى جنب مع المستضدات للفائدة.

وتشمل بعض القيود التي تفرضها هذه التكنولوجيا شرط الإنتاج الواسع النطاق للبروتينات المؤتلف، التي يمكن أن تكون صعبة ومكلفة في المناطق المنخفضة الدخل. أيضا، يتطلب إنتاج الجاد لتنقية البروتينات استكشاف الأخطاء وإصلاحها والتحسين. ومع ذلك، يمكن التحايل عليها هذه القيود مع تحسين تكنولوجيات إنتاج البروتين المؤتلف. يتضمن القيد آخر إمكانية أن تحدث عبدين المضادة الأجسام المضادة شيوعاً في البشر والحيوانات المختبرية22 وبطبيعة الحال قد يعوق استخدام عبدين لأغراض علاجية. ومع ذلك، مختبرات أخرى يكون اختبار سلامة وفعالية العلاج عبدين وأظهرت أن عبدين لسلامة وفعالية لم تتأثر إلى حد كبير ب الاستمناع في23. من المثير للاهتمام، تحويل avidin تيتراميريك البرية من نوع نموذج أحادي إلى حد كبير انخفضت به الاستمناع24.

خلاصة القول، يمكن بنجاح استبدال هذه التكنولوجيا الجديدة استخدام نظام بيوتين عبدين لتحسين الاستمناع للسل عن طريق السريع واستنساخه غير وراثية بكتيرية سطحية تعديل مع البروتينات للفائدة التقليدية تحول BCG مع ترميز مستضد والبلازميدات. وعلاوة على ذلك، هذا الأسلوب رواية يمكن ليس فقط تسهيل تحسين لقاح بي سي جي الحالية، ولكن أيضا يمكن أن توفر منبرا جديداً للتقييم السريع لأي مستضد المحتملة أو البروتينات عادة من الصعب التعبير عن وراثيا بالسل، مع قاعدة عريضة التطبيقات في تطوير لقاح السل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

ونحن نشكر الدكتور R ستوكس لسلالة البي سي جي باستير وطلال أ للدعم التقني. ونشكر أيضا جينسكريبت للمساعدة في تركيب الجينات.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Endotoxin-free RPMI 1640 StemCell Technologies  36750
Sulfo-NHS SS biotin Thermo Fisher  21328
FITC-conjugated streptavidin Sigma-Aldrich S3762
Phycoerythrin (PE)-conjugated I-Ab-OVA323-339 tetramer  MBL International  TS-M710-1
7-AAD BD Pharmingen 559925
TALON polyhistidine-Tag purification resin  Clontech 635501
Alexa Fluor (AF) 647 conjugated rat anti-mouse CD4 BD Bioscience  557681
AF647 rat anti-mouse IFN-g BD Bioscience  557735
AF647 rat anti-mouse I-A/I-E BD Bioscience  562367
PeCy7 rat anti-mouse CD4 BD Bioscience  552775
PE rat anti-mouse CD8 Ab BD Bioscience  561095
AF 647 rat anti-mouse H-2kb BD Bioscience 562832
FITC-conjugated goat anti rabbit antibody Thermo Fisher 31635
AF 647 rat anti-mouse CD4 BD Bioscience  557681
Ultra-small gold-conjugated goat anti-rabbit IgG Electron Microscopy Sciences 25100
Middlebrook 7H9 broth BD Diagnostic Systems 271310
OADC BD Diagnostic Systems B11886
Tween 80 Sigma-Aldrich P1379
RAW 264.7 murine macrophage cell lines American Type Culture Collection
pDEST17 plasmid  Invitrogen 11803012
pUC57-OVA plasmid  GenScript SD1176
BP clonase  Invitrogen 11789020
LR clonase  Invitrogen 11791043
pDONR221 plasmid Invitrogen 12536017
Ni-NTA columns  Qiagen 31014
Pierce protein concentrators  Thermo Fisher  88527
Flurosave Calbiochem-Novabiochem 345789
Axioplan II epifluorescence microscope Carl Zeiss Inc
CCD digital camera  Retiga EX, QImaging
Tecnai G2 200kV electron microscope  FEI Company G2 200Kv 
70μm Falcon cell strainer  Thermo Fisher  87712
EasyStep mouse biotin positive selection kit  StemCell 18556
biotin-Ter119/Ertyroid cells antibody BioLegend 116203
Brefeldin A BD Pharmingen 555029
Cytofix/Cytoperm kit  BD Pharmingen 554714
Bright-Glo Luciferase assay system Promega e2620
Turner Biosystem luminometer  Promega TD-20/20
Leica EM UC6 microtome  Leica Microsystems UC6
Novalyphe NL 500 freeze dryer Savant Instruments  NL 50
Wheaton boroscilicate glass vials Wheaton  VWR 66011-675

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Horwitz, M. A., Harth, G. A new vaccine against tuberculosis affords greater survival after challenge than the current vaccine in the guinea pig model of pulmonary tuberculosis. Infect. Immun. 71 (4), 1672-1679 (2003).
  2. Pym, A. S., et al. Recombinant BCG exporting ESAT-6 confers enhanced protection against tuberculosis. Nat Med. 9 (5), 548-553 (2003).
  3. Grode, L., et al. Increased vaccine efficacy against tuberculosis of recombinant Mycobacterium bovis bacille Calmette-Guerin mutants that secrete listeriolysin. The J Clin Invest. 115 (9), 2472-2479 (2005).
  4. Bastos, R. G., Borsuk, S., Seixas, F. K., Dellagostin, O. A. Recombinant Mycobacterium bovis BCG. Vaccine. 27 (47), 6495-6503 (2009).
  5. Mederle, I., et al. Plasmidic versus insertional cloning of heterologous genes in Mycobacterium bovis BCG: impact on in vivo antigen persistence and immune responses. Infect Immun. 70 (1), 303-314 (2002).
  6. Singh, N. P., et al. A Novel Approach to Cancer Immunotherapy Tumor Cells Decorated with CD80 Generate Effective Antitumor Immunity A Novel Approach to Cancer Immunotherapy Tumor Cells Decorated with CD80 Generate Effective Antitumor Immunity. Cancer Res. 63 (14), 4067-4073 (2003).
  7. Oizumi, S., Strbo, N., Pahwa, S., Deyev, V., Podack, E. R. Molecular and cellular requirements for enhanced antigen cross-presentation to CD8 cytotoxic T lymphocytes. J Immunol. 179 (4), 2310-2317 (2007).
  8. Sharif-Paghaleh, E., et al. Monitoring the efficacy of dendritic cell vaccination by early detection of (99m) Tc-HMPAO-labelled CD4(+) T cells. Eur J Immunol. 44 (7), 2188-2191 (2014).
  9. Sun, J., et al. A broad-range of recombination cloning vectors in mycobacteria. Plasmid. 62 (3), 158-165 (2009).
  10. Laitinen, O. H., et al. Rational design of an active avidin monomer. J. Biol. Chem. 278 (6), 4010-4014 (2003).
  11. Flynn, J. L., Chan, J., Triebold, K. J., Dalton, D. K., Stewart, T. A., Bloom, B. R. An essential role for interferon gamma in resistance to Mycobacterium tuberculosis infection. J Exp Med. 178 (6), 2249-2254 (1993).
  12. Liao, T. Y. A., Lau, A., Joseph, S., Hytonen, V., Hmama, Z. Improving the immunogenicity of the Mycobacterium bovis BCG vaccine by non-genetic bacterial surface decoration using the avidin-biotin system. PLoS ONE. 10 (12), e0145833 (2015).
  13. Green, N. M. Avidin and streptavidin. Methods Enzymol. 184, 51-67 (1990).
  14. Howarth, M., Takao, K., Hayashi, Y., Ting, A. Y. Targeting quantum dots to surface proteins in living cells with biotin ligase. PNAS. 102 (21), 7583-7588 (2005).
  15. Lesch, H. P., Kaikkonen, M. U., Pikkarainen, J. T., Yla-Herttuala, S. Avidin-biotin technology in targeted therapy. Expert Opin Drug Deliv. 7 (5), 551-564 (2010).
  16. Paganelli, G., Bartolomei, M., Grana, C., Ferrari, M., Rocca, P., Chinol, M. Radioimmunotherapy of brain tumor. Neurol Res. 28 (5), 518-522 (2006).
  17. Cummings, J. F., et al. Safety and immunogenicity of a plant-produced recombinant monomer hemagglutinin-based influenza vaccine derived from influenza A (H1N1)pdm09 virus: a Phase 1 dose-escalation study in healthy adults. Vaccine. 32 (19), 2251-2259 (2014).
  18. Kolotilin, I., et al. Plant-based solutions for veterinary immunotherapeutics and prophylactics. Vet Res. 45, 114-117 (2014).
  19. Demonte, D., Drake, E. J., Lim, K. H., Gulick, A. M., Park, S. Structure-based engineering of streptavidin monomer with a reduced biotin dissociation rate. Proteins. 81 (9), 1621-1633 (2013).
  20. Deghmane, A. E., et al. Lipoamide dehydrogenase mediates retention of coronin-1 on BCG vacuoles, leading to arrest in phagosome maturation. J Cell Sci. 120 (19), 3489-3489 (2007).
  21. Soualhine, H., et al. Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guerin secreting active cathepsin S stimulates expression of mature MHC class II molecules and antigen presentation in human macrophages. J Immunol. 179 (8), 5137-5145 (2007).
  22. Bubb, M. O., Green, F., Conradie, J. D., Tchernyshev, B., Bayer, E. A., Wilchek, M. Natural antibodies to avidin in human serum. ImmunolLett. 35 (3), 277-280 (1993).
  23. Petronzelli, F., et al. Therapeutic use of avidin is not hampered by antiavidin antibodies in humans. Cancer Biother Radiopharm. 25 (5), 563-570 (2010).
  24. Bigini, P., et al. In vivo fate of avidin-nucleic acid nanoassemblies as multifunctional diagnostic tools. ACS Nano. 8 (1), 175-187 (2014).

Tags

علم المناعة، 131 قضية، بكتريا السل، الضامة، الاستجابة المناعية، والبروتينات المؤتلف، خلايا تي، ومولدات المضادات، البيوتين، عبدين-البيوتين
التعبير عن "المستضدات خارجية المنشأ" في لقاح BCG <em>متفطره bovis</em> عبر "زخرفة سطح" عدم الوراثية مع نظام عبدين-البيوتين
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liao, T. Y. A., Lau, A., Sunil, J.,… More

Liao, T. Y. A., Lau, A., Sunil, J., Hytönen, V., Hmama, Z. Expression of Exogenous Antigens in the Mycobacterium bovis BCG Vaccine via Non-genetic Surface Decoration with the Avidin-biotin System. J. Vis. Exp. (131), e56421, doi:10.3791/56421 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter