تقنية جديدة لعرض مستضد السريع على سطح البكتيريا يرد، الذي ينطوي على سطح بيوتينيليشن يليه التعرض للبروتينات ذات الاهتمام في الانصهار مع عبدين أحادي. تحميل بي سي جي مع المستضدات المحدد بنجاح يحسن به الاستمناع، مما يوحي بأن الزخرفة السطحية يمكن استبدال النهج الوراثية التقليدية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
التعبير عن "المستضدات خارجية المنشأ" في لقاح BCG متفطره bovis عبر "زخرفة سطح" عدم الوراثية مع نظام عبدين-البيوتين
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الدرن (السل) هو مرض معد خطير وعصية M. bovis لقاح متوفر فقط لقاح السل (BCG) هو آمنة وفعالة للحماية ضد شديدة السل التهاب السحايا الأطفال وبعض أشكال السل نشرها، ولكن فشل لحماية ضد السل الرئوي، الذي هو الشكل الأكثر شيوعاً للمرض. استراتيجيات واعدة لتحسين BCG حاليا تعتمد أما على تحولها مع الجينات ترميز إيمونودومينانت م. السل (Mtb)-المستضدات محددة و/أو التكامل مع الجينات ترميز المشارك من العوامل التي تحفز مستضد عرض الخلايا. وتشمل القيود الرئيسية لهذه النهج كفاءة منخفضة ومنخفضة الاستقرار ومستوى سلامة ناقلات التعبير غير مؤكد. في هذه الدراسة، نقدم نهج بديل لتحسين اللقاح، الذي يتألف من التكامل بي سي جي مع البروتينات الخارجية ذات الاهتمام على سطح البكتيريا، بدلاً من التحول مع البلازميدات ترميز الجينات المقابلة. أولاً، يتم التعبير عن البروتينات ذات الاهتمام في الانصهار مع عبدين أحادي في معيار كولاي نظم التعبير وتستخدم بعد ذلك لتزيين سطح بيوتينيلاتيد بي سي جي. استخدام سطح BCG مزينة مستضد ovalbumin مركب التجارب على الحيوانات تبين أن بكتيريا معدلة مكسبه تماما وقادرة على استحثاث استجابات محددة T الخلية. بالإجمال، دعم البيانات المعروضة هنا بشدة الرواية والأسلوب كفاءة لإعادة تشكيل لقاح BCG الحالي الذي يحل محل النهج التقليدي شاقة للتكامل مع الأحماض النووية الخارجية.
المقدمة
واقترحت استراتيجيات مختلفة ليحل محل لقاح السل الحالية ضد السل، بما في ذلك البروتين adjuvant النظم والتكنولوجيات فيكتوريد الفيروسية والموهنة الحية سلالات M.tb وسلالات السل المحورة وراثيا، أما إدخال جينات الإفراط معربا عن المستضدات السل التي لا يتم التعبير عنها بما فيه الكفاية خلال العدوى1 أو المواضيع المتميزة-المستضدات المحددة غير موجودة في البي سي جي2. الهندسة الوراثية، مع ذلك، يواجه العديد من العوائق، بما في ذلك مستوى السلامة وعملية تستغرق وقتاً طويلاً، وانخفاض كفاءة التعبير ناقلات4،5غير مؤكد. فيما يتعلق بتحسين BCG، مطلوب نهج بديلة لتحسين الاست....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وأبقى على جميع الحيوانات وفقا للبروتوكولات المعتمدة برعاية الحيوان واستخدام اللجان في جامعة كولومبيا البريطانية. تجارب وافق عليها العناية بالحيوان واستخدام اللجان وتنفيذها وفقا "المجلس الكندي للمبادئ التوجيهية لرعاية الحيوان". هو عدد رعاية الحيوان ضمان A11-0247.
1-جيل بروتينات الانصهار Avidin أحادي التعبير عن البلازميدات
- دون استنساخ avidin أحادي التسلسل12 إلى بلازميد pDEST17 بين مواقع "مكافحة الإرهاب" و "جا" الذي يتوافق مع 133-134bp. (أيبين 6-هيستاج وموقع جزئ Attr1 pDEST17) للحصول على p17-أفي.
ملاحظة: يتم عرض تسلسل الحمض النووي أحادي عبدين أدناه. تظهر الطفرات الثلاث في البرية من نوع أفي....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
مع الإجراءات العامة المذكورة أعلاه، تم بحث جدوى BCG بيوتينيليشن السطحية والديكور مع مستضد مركب البويضات. كان الاستمناع للسل تم التعديل ثم اختبارها في فيفو. سطح البكتيرية وصفت بسهولة مع البيوتين للعرض السريع المستضدات عبدين تشيميريك دون أي تغييرات يمكن اكتشافها في تعمل البكتيريا. BCG المعدلة الناتجة عن كفاءة بلعها قبل العرض التقديمي مستضد خلايا ويمكن أن تحدث استجابة مناعية محددة البويضات في الفئران.
جيل والبلازمي.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
أبلغنا في هذه الدراسة نهجاً غير وراثية للعرض السريع والفعال للبروتينات الخارجية على سطح BCG لإضافة مولدات معينة أو محددة الخصائص الفنية التي من المتوقع أن يحسن كفاءة الاستمناع للبكتيريا. أظهرنا أن سطح الخلية BCG يمكن بسهولة بيوتينيلاتيد للزخرفة السطحية لحظية مع عبدين الانصهار البروتينات. يمكن تنفيذ الإجراء المجموع ضمن ح 2، بينما التحول الوراثي وانتقاء الحيوانات المستنسخة إيجابية تتطلب 2 إلى 3 أشهر للفاصل الزمني. تعديل السطح لا يؤثر على النمو البكتيري والبقاء على قيد الحياة. البكتيريا مزينة بمركب مستضد البويضات وتمكنت من .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
شكر وتقدير
ونحن نشكر الدكتور R ستوكس لسلالة البي سي جي باستير وطلال أ للدعم التقني. ونشكر أيضا جينسكريبت للمساعدة في تركيب الجينات.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
تقنية الداخليةالثقافة
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| RPMI 1640 StemCell Technologies الخالية من السموم | 36750 | ||
| Sulfo-NHS SS البيوتين | ثيرمو فيشر | 21328 | |
| الستربتافيدين المترافق | FITC سيجما-ألدريتش | S3762 | |
| فيكوريثرين (PE) المترافق I-Ab-OVA323-339 tetramer | MBL International | TS-M710-1 | |
| 7-AAD | BD Pharmingen | 559925 | |
| راتنج تنقية TALON polyhistidine-Tag ؛ | Clontech | 635501 | |
| Alexa Fluor (AF) 647 الفئران المترافقة المضادة للفأر CD4 | BD Bioscience | 557681 | |
| AF647 الفئران المضادة للفأر IFN-g | BD Bioscience | 557735 | |
| AF647 الفئران المضادة للفأر I-A / I-E | BD Bioscience | 562367 | |
| PeCy7 الفئران المضادة للفأر CD4 | BD Bioscience | 552775 | |
| PE الفئران المضادة للفأر CD8 Ab | BD Bioscience | 561095 | |
| AF 647 الفئران المضادة للفأر H-2k < sup > b < / sup> BD | Bioscience | 562832 | |
| الماعز المترافق FITC الأجسام المضادة للأرانب | Thermo Fisher | 31635 | |
| AF 647 الفئران المضادة للفأر CD4 | BD Bioscience ؛ | 557681 | |
| الماعز المترافق بالذهب صغير جدا مضاد للأرانب IgG | علوم المجهر | الإلكتروني 25100 | |
| Middlebrook 7H9 | مرق BD أنظمة التشخيص | 271310 | |
| أنظمة تشخيص OADC | BD B11886 | ||
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| RAW 264.7 خطوط خلايا البلاعم الفئران | من النوع الأمريكي مجموعة | ||
| pDEST17 البلازميد | Invitrogen | 11803012 | |
| pUC57-OVA البلازميد | GenScript | SD1176 | |
| BP clonase | Invitrogen | 11789020 | |
| LR clonase | Invitrogen | 11791043 | |
| pDONR221 البلازميد | Invitrogen | 12536017 | |
| أعمدة Ni-NTA | Qiagen | 31014 | |
| مكثفات البروتين بيرس | ثيرمو فيشر | 88527 | |
| Flurosave | Calbiochem-Novabiochem | 345789 | |
| Axioplan II مجهر التألق | كارل زايس شركة | ||
| CCD الكاميرا الرقمية | Retiga EX ، QImaging | ||
| Tecnai G2 200kV المجهر الإلكتروني | FEI Company | G2 200Kv | |
| 70 و مو ؛ م مصفاة خلية الصقر | ثيرمو فيشر | 87712 | |
| EasyStep مجموعة اختيار البيوتين الإيجابية للماوس | StemCell | 18556 | |
| البيوتين-Ter119 / خلايا Ertyroid الجسم المضاد | BioLegend | 116203 | |
| Brefeldin A | BD Pharmingen | 555029 | |
| Cytofix / Cytoperm kit | BD Pharmingen | 554714 | |
| نظام فحص Bright-Glo Luciferase | Promega | e2620 | |
| Turner Biosystem luminometer | Promega | TD-20/20 | |
| Leica EM UC6 microtome | مجفف التجميد Leica Microsystems | UC6 | |
| Novalyphe NL 500 | Savant Instruments | NL 50 | |
| قوارير زجاجية Wheaton boroscilicate | Wheaton | VWR 66011-675 |
المراجع
- Horwitz, M. A., Harth, G. A new vaccine against tuberculosis affords greater survival after challenge than the current vaccine in the guinea pig model of pulmonary tuberculosis. Infect. Immun. 71 (4), 1672-1679 (2003).
- Pym, A. S., et al.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
