Summary
Ny teknik för snabb antigen visning på en bakteriell yta presenteras, som innebär att ytan biotinylation följt av exponering för proteiner av intresse i fusion med monomer metoden. Laddar BCG med valda antigener framgångsrikt förbättrar dess immunogenicitet, vilket tyder på att ytan dekoration kan ersätta traditionella genetiska metoder.
Abstract
Tuberkulos (tbc) är en allvarlig infektionssjukdom och den enda tillgängliga vaccin M. bovis bacillus Calmette-Guérin (BCG) är säkra och effektiva skyddsåtgärder mot barnens svåra TB meningit och vissa former av disseminerad TB, men misslyckas med att skydda mot pulmonell tuberkulos, som är den vanligaste formen av sjukdomen. Lovande strategier för att förbättra BCG för närvarande förlitar sig antingen på sin omvandling med gener som kodar för immundominant M. tuberkulos (Mtb)-specifika antigener eller komplettering med gener som kodar för co-faktorer som skulle stimulera antigen presenterande celler. Stora begränsningar för dessa metoder inkluderar låg effektivitet, låg stabilitet och den osäkra säkerhetsnivån av uttrycket vektorer. I denna studie presenterar vi ett alternativ till vaccin förbättring, som består av BCG komplettering med exogena proteiner av intresse på ytan av bakterier, i stället för transformation med plasmider kodning motsvarande gener. Först, proteiner av intresse uttrycks i fusion med monomer metoden i standard E. coli uttryck system och sedan används för att dekorera ytan av biotinylerade BCG. Djurförsök med BCG surface dekorerad med surrogat äggalbumin antigen Visa att den modifierade bakterien fullt immunogent och kan framkalla specifika T-cell svar. Sammantaget stöder de data som presenteras här starkt en ny och effektiv metod för att omforma den nuvarande BCG-vaccination som ersätter den mödosamma konventionell metoden av komplettering med exogena nukleinsyror.
Introduction
Olika strategier har föreslagits att ersätta nuvarande TB Vaccinet BCG, inklusive protein adjuvant system, viral vektoriserade teknik, försvagat levande M.tb stammar och genetiskt modifierade BCG stammar, antingen för att introducera gener över uttrycker BCG antigener som inte uttrycks tillräckligt under infektion1 eller Mtb-specifika antigener inte förekommer i BCG2. Genteknik, står dock inför många hinder inklusive osäker nivå av säkerhet, tidsödande och låga effektivitet av uttrycket vektorer4,5. När det gäller att förbättra BCG, behövs en alternativ metod att förbättra immunogenicitet utan behov av osäkra genetiska växlingen.
I denna studie introducerar vi en ny strategi för visning av rekombinanta proteiner av intresse på BCG cellytan som baseras på välkända hög affinitet metoden interaktionen med biotin. Denna metod tillåter snabba och reproducerbara fastsättning av rekombinant avidinen fusionsproteiner på ytan av biotinylerade BCG, vilket underlättar bred manipulationer av BCG att uppnå maximal förbättring av dess effektivitet samtidigt som dess utmärkt säkerhet rekord, observerade under decennier av användning.
Avidinen affinitet för biotin är extremt hög (Kd = 10−15 M) och en gång bildats, biotin-avidinen komplexet är mycket stabil och kan endast störas under denatureringen villkor6. För denna typ av interaktion att fungera som en gen överföring metod alternativ, krävs dock långsiktigt men reversibel visning av rekombinanta proteiner. Således, introducerade vi här en låg affinitet monomer metoden (Kd = 10−7 M) som leder till reversibel frisläppandet av protein från ytan inredda BCG intas en gång inuti antigenpresenterande celler. För att ge ett proof of concept, testade vi denna metod använder en monomer metoden chimära protein motsvarar ett surrogat antigen härrör från äggalbumin (OVA)7,8. Resultaten visade att BCG cellens yta kan vara snabbt och enkelt dekorerad med monomer metoden fusionsproteinerna och att denna bindning till BCG ytan är stabila och reproducerbara utan påvisbara förändringar i bakteriell tillväxt och överlevnad. Också, Vi hittade att BCG dekorerad med monomer avidinen smält med ägg (AviOVA) kan framkalla ett immunsvar som liknar den som induceras av BCG genetiskt uttrycker samma antigen både in vitro- och in vivo. Denna teknik av vändbar display av proteiner av intresse på bakteriell ytan är därför en effektiv ersättning av traditionella gen överföring tillvägagångssätt och kan tillhandahålla en plattform för bred manipulationer av BCG och mer ytterligare applikationer i vaccin utveckling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djur var underhålls i enlighet med protokoll som godkänts av djur vård och användning kommittéer vid University of British Columbia. Experiment godkändes av djur vård och användning kommittéer och utförs enligt kanadensiska rådet om Animal Care riktlinjer. Antalet djur assurance välfärd är A11-0247.
1. generering av monomer metoden fusionsproteinerna uttrycker plasmider
- Sub klona monomer avidinen sekvens12 in i pDEST17 plasmid mellan platser ”CTC” och ”GAA” vilket motsvarar 133-134bp. (dvs.mellan den 6-histag och webbplatsen pDEST17 Attr1 rekombination) att få p17-Avi.
Obs: Monomer avidinen DNA-sekvensen nedan. De tre mutationer som infördes i vildtyps-metoden att få monomer metoden visas i fetstil tecken.
gccagaaagtgctcg ctgactggga aatggaccaa cgatctgggc tccATCatga ccatcggggc tgtgaacagc
agaggtgaat tcacaggcac ctacatcaca gccgtaacag ccacatcaaa tgagatcaaa gagtcaccac tgcatgggac
ACAAGCTacc atcaacaaga ggacccagcc cacctttggc ttcaccgtca attggaagtt ttcagagtcc accactgtct
tcacgggcca gtgcttcata gacaggaatg ggaaggaggt cctgaagacc atgtggctgc tgcggtcaag tgttaatgac
attggtgatg acAAAaaagc taccagggtc ggcatcaaca tcttcactcg cctgcgcaca cagaaggagt ga - Utforma grundfärger flankerad med AttB1 och AttB2 platser motsvarar OVA polypeptid757-1035 (I-Ab- och H-2_Kb-begränsad epitoper) DNA-sekvens. Primer-sekvenser är: Attb1-ägg
GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCCTTGAGCAGCTTGAGAGTAT och Attb2-ägg
GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGTTACCCTACCACCTCTCTGC. (Attb1 och Attb2 sekvenser är fetstil).- PCR-Förstärk OVA polypeptid757-1035 DNA-sekvens med primers ovan med pUC57-OVA plasmiden som en mall.
- Klona de PCR-produkterna i pDONR-221 genom en platsspecifik i vitro rekombination reaktion (t.ex., BP Clonase) att få pDONR-ägg.
- Överföra genen sevärdheter i p17-Avi med LR Clonase reaktionen för att erhålla p17-Avi-ägg.
Anmärkning: För Detaljer för BP och LR rekombination kloning, se tillverkarens handbok.
2. monomer avidinen Fusion proteinuttryck, rening och vika
- Förvandla E. coli BL21 p17-Avi-OVA plasmid och inducera 250 mL av E. coli BL21 kultur med IPTG (0,1 M) för 3 h vid 37 ° C.
-
Lys av bakterier och inkludering organ lösbarhet
- Pellet 250 mL av inducerad BL21 kultur med 30 min av centrifugering vid 4000 x g och vid 4 ° C.
- Samla in pellets i 10 mL lyseringsbuffert (50 mM Tris-HCL, 150 mM NaCl, 6 M guanidin-HCL, pH 1,5-2,5) och inkubera i 15 min på 95 ° C. Inkubera över natten i rumstemperatur på en rotator.
- Centrifugera 30 min på 15 000 x g och 4 ° C och samla supernatanten.
-
Rena Avi-ägg från supernatanten (Solubilized organ i inkludering fraktion) använder Ni-NTA kolumner.
- Späd inkludering organ 1:2 med lyseringsbuffert.
- Använd 4 mL av Ni-NTA harts per 250 mL kultur-derived inkludering organ.
- Tvätta 3 x med 10 mL lyseringsbuffert (pH 7,0).
- Eluera med 10 mL eluering buffert (lysis buffert pH 7.0 med 250 mM Imidazol).
- Refold eluerade protein genom successiv utspädning (1:10) och snabba vortexa i Tris buffert (pH 7,5) innehållande 1 mM DTT, 200 mM NDSB256 (3-(Benzyldimethylammonio)propanesulfonate), 0,5 mM Tween 80, 500 mM arginin och 200 mM NaCl i 30 min i rumstemperatur.
- De salta och buffert exchange refolded protein från Tris buffert i PBS med protein koncentratorer enligt tillverkarens protokollen.
- Ta bort aggregat genom centrifugering i 30 min på 3 500 x g och vid 4 ° C och förvara alikvoter av lösligt protein vid-20 ° C.
3. Biotinylation av BCG cellytan
- Växa BCG i Middlebrook 7H 9 buljong med 10% OADC (oljesyra, albumin och glukos lösning) och 0,05% Tween 80 vid 37 ° C i en shaker plattform vid 50 rpm tills OD = 0.5-1.
Obs: BCG är en biosäkerhet nivå 2 patogen och alla experiment om BCG bör göras i en biosäkerhet skåp med lämplig personlig skyddsutrustning. - Tvätta 109 BCG 3 gånger med 500 µL av iskall endotoxin gratis PBS plus 0,1% Tween80 (PBST) (pH 8,0). Uppslamma BCG koncentrerade extraktet i steril endotoxin gratis PBS.
-
Omedelbart före användningen, Förbered 1 mL 10 mM Sulfo-NHS SS biotin i sterila filtrerat vatten.
- Inkubera bakterier med 1 mL 0,5 mM av Sulfo-NHS SS biotin i rumstemperatur i 30 min.
-
Tvätta märkta bakterier 3 gånger med 500 µL av iced kalla PBST ta bort icke-reagerade biotinylation reagens.
- Resuspendera pelleten i 1 mL PBST.
-
För att utvärdera biotinylation effektivitet, fläcken 108 biotinylerade BCG med streptividin-FITC (1: 100, 25 µL) i rumstemperatur i 20 min.
- Inkubera färgade bakterier i 1 mL 2% PFA i 20 min i rumstemperatur och sedan undersöka nivåerna av biotinylation av flödescytometri Flödesanalys.
4. fenotyp av biotinylerade mykobakterier: tillväxt och överlevnad
-
Växa BCG stammar i Middlebrook 7H 9 buljong med 10% OADC (oljesyra, albumin och glukos lösning) och 0,05% Tween 80 vid 37 ° C i en shaker plattform vid 50 rpm.
- Spela in den optiska densiteten (OD600) av den bakteriella kulturen under en 8-dagars period.
-
Använda BCG-Luc (tidigare beskrivna9) för att upptäcka överlevnad av bakterier i makrofager.
- Infektera RAW264.7 celler med biotinylerade BCG-Luc (MOI 10:1) eller obehandlade BCG-Luc (kontroll) och inkuberas vid 37 ° C under en 48 h tidsperiod.
- Tvätta cell enskiktslager och sedan lyse med 0,025% SDS att släppa intas bakterier.
- Mäta Mareld produktion med luciferas analyssystem och luminometern.
Obs: Luminiscens signal är vägledande för bakteriell bärkraft. Se tillverkarens bruksanvisning för detaljer om luciferas-analysen.
5. bindning av monomer avidinen-Fusion Protein biotinylerade BCG ytan
- Blanda 5 x 108 biotinylerade BCG med Avi-protein (10 μg/mL final i PBS-T) för 1 h i rumstemperatur på shaker plattform.
- Tvätta bakterier 3 gånger med 500 µL av iced kalla PBST och fläcken med kanin-anti avidinen antikropp (Ab) (1: 100 utspädning, tidigare beskrivna10) i 20 min i rumstemperatur och sedan med FITC konjugerad get anti-kanin IgG Ab på samma villkor.
- Tvätta bakterier 3 gånger med PBST 500 µL och analysera genom flödescytometri att utvärdera omfattningen av yta dekoration.
6. frystorka den av mykobakterier
- Biotinylate bakterier enligt steg 3.1-3.4 och coat biotinylerade bakterier med Avi-OVA enligt steg 5.1.
- Alikvotens biotinylerade och belagda bakterier (108), tvätta med PBS och resuspendera i 0,5 mL frystorka den media (25% Sauton medium, 75% H2O och 1,5% Na-glutamat).
- Överföra bakterier till glasampuller och frysa i-80 ° C frys över natten.
- Lyophilize fylld och frysta injektionsflaskor för 24 h med en frysning torktumlare.
- Lagra torkade proverna vid rumstemperatur och Beredes i PBS när det behövs.
- Upprepa steg 3.5 att utvärdera biotinylation och ytbeläggning stabilitet.
7. fagocytos Assay
- Växa RAW 264,7 makrofagceller i 10 cm diameter kultur rätter i DMEM medium som innehåller 5% FCS, 1% vardera av L-glutamin, HEPES, icke-essentiella aminosyror, och penicillin och streptomycin fram till 70-80% konfluens.
- Utsäde 2 x 106 RAW 264,7 makrofagceller i en 6-bra platta. Tillåta celler att följa över natten vid 37 ° C och 5% CO2.
- Generera DsRed BCG (tidigare beskrivna9) dekorerad med Avi-OVA (DsRed BCG-Avi-ägg) enligt steg 3.1-3.4 och 5.1.
- Infektera RAW celler med DsRed BCG-Avi-ägg eller obehandlade DsRed BCG på MOI 20:1 för 24 timmar vid 37 ° C.
- Tvätta cellerna tre gånger och trypsinize med 1 mL av 0,25% trypsin vid 37 ° C i ca 10 min bort delvis fristående bakterier.
- Fixa i 2,5% PFA i PBS i 20 min i rumstemperatur.
- Tvätta 3 x med PBS och analysera genom flödescytometri.
8. intracellulära handel med ÄGGCELLER inredda biotinylerade BCG i makrofager
-
Fluorescensmikroskopi
- Seed 3 x 105 RAW 264,7 makrofagceller på coverslips i en 24-bra platta. Tillåta celler att följa över natten vid 37 ° C och 5% CO2.
- Infektera makrofagceller med mykobakterier (MOI 10:1) i underhållsmassmedia utan antibiotika vid 37 ° C och 5% CO2 för 4 till 24 h.
- Tvätta cellerna och trypsinize för att ta bort ytan bifogade, icke-intas bakterier som i steg 7,5.
- Fix infekterade celler i 2,5% PFA i PBS i 20 min i rumstemperatur följt av 3 tvättar med PBS.
- Permeabilize celler i blockering/permeabilisering buffert (0,1% Triton x-100, 3% BSA i PBS) i 20 min i rumstemperatur.
- Använd specifika antikroppen av intresse (t.ex., kanin anti avidinen Ab) på 10 μg/mL i permeabilisering buffert för 20 min i rumstemperatur följt av sekundär antikropp (t.ex., FITC-get anti-kanin IgG) i 20 min.
- Tvätta cellerna 3 x med PBS, en gång med vatten och montera på bilderna i 10 μL av vattenhaltigt monteringsmedium att minimera fluorescens fotoblekning.
- Granska bilder av digitala konfokalmikroskopi använder ett epifluorescensmikroskop utrustade med 63 x / 1.4 Plan-Apochromat mål. Spela in bilder med en digitalkamera kopplad till Mikroskop mjukvaran.
-
Immunogold färgning och elektronmikroskopi
- Utsäde 2 x 106 RAW 264,7 makrofagceller i 6 brunnar.
- Fixa BCG infekterade makrofager med 4% PFA för 4 h i rumstemperatur.
- Tvätta prov två gånger med PBS.
- Bädda in prover i 4% låg smältpunkt agaros, och torka ut i 70% etanol.
- Överföra prover till akrylharts och polymerisera vid 50 ° C.
- Klipp ut 60 nm avsnitt med en mikrotom och samla sektioner på nickel rutnät.
- Märk proverna med 10 μg/mL avidinen antikropp för 1 h i rumstemperatur eller 4 ° C över natten i inkubation lösning (PBS och 0,1% BSA) och tvätta sedan med inkubation lösning guld-konjugerad F(ab')2 Ultra-liten get-anti-kanin IgG (1/20) för 1 h på rummet temperaturen i inkubation lösning.
- Tvätta sektioner i destillerat vatten, fläcken i 2% glutaraldehyd, tvätta igen, torka och undersöka med elektronmikroskop.
9. djurens immunisering och orgel bearbetning
Obs: Alla åtgärder bör göras i en biosäkerhet skåp.
- Passera biotinylerade och protein belagda bakterier genom 271/2G nål 10 gånger att göra enstaka cellsuspension.
-
Ta 1 x 106 bakterier i 100 μL av endotoxinfria PBS och vaccinera en kvinnlig C57BL/6 möss (I-Ab, H - 2 Kb, 5-6 vecka gammal) subkutant i kragen i nacken.
- Injicera 100 μL av PBS ensam kontroll möss.
-
Euthanize immuniserade mössen 20 dagar efter immunisering av CO2 inandning följt av cervikal dislokation.
- Isolera mjälte och överför det till RPMI media.
-
Mosa mjälte genom en sil med 70 µm i cellen med en 5 mL sprutkolven.
- Tvätta med 5 mL RPMI. Centrifugera (800 x g, 3 min) för att isolera en enda cellsuspension.
- Bryter ned RBC med musen biotin positivt urval kit med biotin-Ter119/erytroid celler Ab.
- Centrifugera och resuspendera cellerna i 10 mL komplett RPMI (10% FCS, 1% L-glutamin, 1% penicillin, 1% streptomycin och 50 μM 2-ME).
10. I-Ab tetramer färgning till avgöra den frekvenser av Antigen-specifika CD4+ T-celler och intracellulära cytokin färgning att bestämma frekvenserna av Antigen-specifika T celler släppa cytokiner i immuniserats djur
-
Tetramer färgning
- Färga splenocytes från kontroll och immuniserade mössen (~ 20 x 106 celler) med PE-konjugerad I-Ab-OVA323-339 tetramers (1/12,5 utspädning) för 1 h vid 37 ° C i bindande buffert (PBS med 2% FCS och 0,1% NaN3).
- Lägga till AF647 CD4 Ab (1:25) och 7-AAD (för att upptäcka döda celler) i splenocytes för 20 min i rumstemperatur.
- Analysera prover av flödescytometri.
- Förvärva 500.000 händelser i regionen CD4 positiva att bestämma frekvensen av tetramer positiva händelser.
Obs: Total splenocytes definieras av SSC/FSC dot blot, levande celler genom uteslutning av 7-AAD positiva händelser och CD4 delmängder av gating AF647 positiva händelser.
-
Frekvensen av Antigen specifika intracellulära cytokin släppa T-celler
- Överföring cirka 1 × 107 splenocytes till 4 mL komplett RPMI medium i sex brunnar med eller utan rekombinant OVA (10 µg/mL) och inkubera i 16 h.
- Behandla celler med Brefeldin A (1:1, 000) för en ytterligare 5 h.
- Tvätta med PBS och omfattas av intracellulära cytokin färgning enligt följande:
- Fläcken cellprover med PE-CD8 eller PE-Cy7-CD4 Ab (1:50 i bindande buffert) i rumstemperatur i 30 min.
- Fixa i 4% PFA i rumstemperatur i 20 min.
- Permeabilize med permeabilisering lösning, enligt tillverkarens instruktioner.
- Tvätta cellerna och etikett med AF647-konjugerad IFN-γ Ab (1:50) i 20 min i rumstemperatur.
- Tvätta cellerna och föremål för flödescytometri Flödesanalys som beskrivs ovan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med de allmänna förfaranden som beskrivs ovan, undersöktes genomförbarheten av BCG ytan biotinylation och dekoration med surrogat antigen OVA. Immunogeniciteten för den modifierade BCG var sedan testas i vivo. Bakteriella ytan var enkelt märkt med biotin för snabb visning av metoden chimära antigener utan påvisbara förändringar i bakteriell fenotyper. Den resulterande modifierade BCG förtärs effektivt av antigen-presentation celler och kan framkalla en OVA-specifikt immunsvar hos möss.
Generation av monomer avidinen fusion plasmider och proteiner
Ett uttryck plasmid p17-Avi genererades för att vara kompatibla med Gateway metodik som används för att producera monomer avidinen fusionsproteiner. OVA klonades i p17-Avi och uttryckt i E. coli, då renas och refolded som beskrivits ovan (figur 1).
Biotin fäster effektivt bakterie ytan och påverkar inte bakterietillväxt eller överlevnad
Bakterier var märkt med olika koncentrationer (0-1 mM) av biotin och färgade att undersöka effektiviteten av surface biotinylation enligt protokoll ovan. Flödescytometri Flödesanalys visade en total förändring av fluorescens histogram i bakterier märkt med 0,5 mM biotin (figur 2), och denna koncentration användes i denna studie för att generera biotinylerade bakterier. Nästa, vi undersökte effekten av bakteriell ytmodifiering på bakteriell fenotyp och hittade att biotinylerade och kontroll obehandlad BCG visas en liknande tillväxt profil under en 8-dagars period (figur 3A). BCG uttrycker luciferas (BCG-Luc)9 användes för att undersöka bakteriell överlevnad i makrofager. Luminiscens signaler tyder på bakteriell livskraft spelades över 48 h. Resultaten visade liknande profiler av gradvis livskraft minskning mellan biotinylerade och kontroll bakterier (figur 3B). Sammanfattningsvis, indikerar dessa data tydligt att bakteriella surface biotinylation inte påverkar antingen bakterietillväxt eller överlevnad inuti makrofager, vilket är viktigt eftersom ökad överlevnad i makrofager kan innebära en ökning i bakteriell virulens.
Effektivitet av bakteriella surface dekoration
Biotinylerade bakterier var belagda med OVA antigen peptid i fusion med monomer metoden, enligt protokoll ovan. Flödescytometri Flödesanalys visade minimal nivåer av OVA bindning till icke-biotinylerade bakterier (MFI = 8,31 ± 0,42, figur 4A, övre panelen) och betydande halter av ägg bindande biotinylerade bakterier (MFI = 54.67 ± 4,98) jämfört med kontroll bakterier (MFI = 5.92 ± 0,22, figur 4A, lägre panel).
Stabilitet av BCG yta dekoration
Eftersom konventionella levande BCG-vacciner är formulerade som torkade pulver, var en viktig fråga som uppkom under denna studie stabiliteten i modifierad BCG efter frystorkning, beredning och lagring i kyl eller rumstemperatur. Därför, vi undersökte surface-skärmen av Avi-ägg i frystorkad BCG Avi-OVA (yta dekorerad med Avi-ägg) och i fräscha bakteriella preparat. Resultaten (figur 4B) visade att nivåer av Avi-ägg på bakteriell ytan förblev stabil och påvisbara en månad efter frystorka den och lagring i rumstemperatur jämfört med färska BCG Avi-OVA-preparat, som visade att denna yta dekoration metod är lämplig för utvecklingen av vaccin.
Makrofag fenotyp påverkas inte av bakteriella surface dekoration
För att se om denna yta dekoration metod stör bakterie trätt i värdceller, använde vi RAW264.7 celler och DsRed bakterier9 för att utföra en fagocytos-analysen som beskrivs i protokollet ovan. Figur 4 c visade att bakteriella surface inredda BCG hade inte betydande interferens med bakteriell inträde (22,5 ± 1,57%) jämfört med obelagda vildtyp BCG (24.47 ± 1,18%) vilket indikerar att surface dekoration av BCG har ingen effekt på makrofag fenotyp.
Metoden fusionsproteinerna resa intracellulärt och samtidig lokalisera med MHC molekyler
För att undersöka Avi-OVA-inredda BCGS öde inom makrofager, var vidhäftande RAW celler smittade och undersökas genom fluorescensmikroskopi, enligt beskrivningen i protokollet ovan. Bilder tagna (figur 5A) visade att Avi-OVA var inte bara närvarande på bakteriell ytan, utan även fristående och flyttade till cytoplasman avlägsen att bakterierna. För att ytterligare verifiera detta resultat, vi utfört en immunogold färgning experiment och de bilder som erhållits visade tydligt att Avi-OVA antigener finns inte bara på BCG ytan, men kan också lossna från BCG ytan, korsa phagosomal membranet, och resor mot cytosolen (figur 5B). För att ytterligare undersöka om Avi-OVA inredda bakterierna var kapabla att leverera deras yta protein Last till antigen-presentation vägen, var makrofager smittade med Avi-OVA BCG, som beskrivs i protokollet, och utsätts för confocal analyser. Resultat (figur 6A) visade att det fanns colocalization Avi-ägg med I-A molekyler, tyder på att metoden fusionsprotein lossnat och flyttad till antigen-presentation fack där de lastades på MHC II molekyler. Resultaten visade också att Avi-OVA peptid Co lokaliserar med klass I molekyler inom BCG phagosomes när färgas för H-2_kb (figur 6B), som visat att det finns potentiella presentation av Avi-OVA antigenet CD8+ T celler av den makrofag. Dessa data indikerar att när ytan inredda bakterier in makrofager, antigenerna kan trafik mot antigen presentation vägar.
Ytan inredda bakterier är fullt immunogena
Att undersöka huruvida ytan inredda BCG kan inducera en specifika immunsvar i vivo, C57BL/6 möss vaccinerades med PBS ensam (kontroll), vildtyp BCG, Avi-OVA inredda BCG och BCG genetiskt förändrat med en plasmid att uttrycka en liknande OVA antigen. Immuniserade mössen var offrade 20 dagar senare och frekvenserna av OVA-specifika CD4+ T celler och OVA-specifika T-celler släppa cytokiner upptäcktes, enligt protokollet. Resultaten (figur 7A-B) visade en större andel av OVA-specifika CD4+T cellssvar hos djur som immuniserats med BCG belagd med Avi-ägg jämfört med BCG WT. BCG genetiskt modifierad för express OVA visade en liknande immunsvar för BCG AVI-OVA (figur 7). Dessa data visade att metoden bakteriella surface dekoration är kunna inducera en betydande expansion av antigen specifika CD4+ T celler och graden av T-cell svar induktion är jämförbar med BCG genetiskt manipulerade för att uttrycka en liknande OVA antigen.
Eftersom intracellulära cytokiner är också viktiga indikatorer av antigen specifika T-cell svar, utfördes intracellulära cytokiner färgning (ICS) experiment för att ytterligare bedöma T cell immunsvaret genom fastställande av uttryck och frekvenser Effector cytokiner i djur som immuniserats med ägg-inredda bakterier och bakterier genetiskt förvandlas med ett ägg som uttrycker plasmid. Vi har granskat nivåer av IFN-γ release, vilket är en känd indikator på skyddande svar mot intracellulära bakterier11. Vi visade att vi kunde upptäcka liknande nivåer av OVA-specifika IFN-γ släppa CD4 celler+ i djur som immuniserats med bakterier yta dekorerad med ägg (BCG-Avi-OVA och BCG-p19-Avi-ägg) jämfört med djur som immuniserats med bakterier genetiskt uttrycker OVA (BCG-p19-ägg) (figur 8A). Ännu viktigare, kunde vi också upptäcka betydligt högre frekvenser av IFN-γ producerar CD8+ T celler hos djur som immuniserats med BCG-Avi-ägg jämfört med djur som immuniserats med BCG genetiskt uttrycker OVA (figur 8B-C) som visar att den biotin-metoden medierad yta display antigen metod kan effektivt ersätta BCG omvandling med nukleinsyror.
Figur 1: byggandet av en rekombination kloning plasmid för produktion av metoden fusionsproteinerna. (A) ett gen segment kodning för monomer metoden var syntetiseras med begränsning platser NdeI och NotI och subcloned i pDEST17 mellan de 6 x histidin och gateway kassett att generera p17-Avi plasmid. OVA peptid252-345 DNA sekvenser som avslutas med attB platser var klonade in pDONR221. Därefter var OVA gener subcloned i p17-Avi. Bild redigerad och återges med tillstånd från PLOS ONE12. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: effektivitet av BCG biotinylation. BCG var biotinylerade med olika koncentration av NHS-SS-biotin i 30 min i rumstemperatur, sedan märkt med FITC-streptividin, och analyseras med flödescytometri. Resultaten presenteras som histogram av grön fluorescensintensitet och infoga diagrammet representerar de medelvärde ± SEM av genomsnittlig fluorescens stödnivåer (MFI) dras av från 3 oberoende experiment. * P < 0,05; ** P < 0,01; P < 0,001. Bild redigerad och återges med tillstånd från PLOS ONE12. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Biotinylation av BCG yta inte påverkade dess tillväxt eller dess överlevnad i makrofag. (A) Biot-BCG och kontroll omärkt vildtyp BCG odlades i komplett 7 H 9 media och replikering övervakades under en 8-dagars period. Resultaten uttrycks som tillväxtkurvor, dvsmenar absorbansen vid 600 nm som funktion av tid ± SEM från 3 oberoende experiment. (B) makrofager var infekterade med Biot-BCG-Luc eller styra omärkt BCG-Luc för angivna tidsperioder och sedan cell lysates utarbetades och analyseras för Mareld att upptäcka livskraftiga bakterier. Resultaten uttrycks som betyder relativa ljus enheter (RLU) ± SEM från 3 oberoende experiment. Bild redigerad och återges med tillstånd från PLOS ONE12. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Avi-OVA bindning till Biot-BCG och dess stabilitet. (A) Biot-dsRed-BCG (bakterier som uttrycker röd fluorescens, tidigare beskrivits9) och kontroll icke-biotinylerade dsRed-BCG blandades med Avi-ägg i rumstemperatur i 1 h och omfattningen av ägg bindande utvärderades genom ytan färgning med kanin-anti avidinen-antikropp och FITC-get anti-kanin IgG (FL1). Proverna var tvättas och analyseras med flödescytometri. Resultaten presenteras som histogram av grön fluorescensintensitet och värden är medelvärde ± SEM av MFI av Biot-BCG-AviOVA bindande erhållits från tre oberoende experiment. (B) frystorkade Biot-BCG belagd med Avi-OVA och nygjorda Avi-OVA-Biot-BCG var märkt och analyseras med flödescytometri som beskrivs i A. Data som visas är representativa för tre oberoende experiment och värden är medelvärde ± SEM av MFI av Avi-OVA-Biot-BCG bindande erhållits från tre oberoende experiment. (C) RAW makrofager var infekterade med DsRed BCG-Avi-OOVA eller DsRed-BCG för 24 timmar vid 37 ° C. Proverna var sedan tvättas, behandlas med trypsin, fast och analyseras av FACS. Resultaten uttrycks som röd fluorescens histogram, som speglar omfattningen av fagocytos. Värden anger genomsnittliga procentuella ± SEM celler intag av BCG erhållits från tre oberoende experiment. Bild redigerad och återges med tillstånd från PLOS ONE12. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Avi-ägg lösgörs från BCG yta och korsade det phagosomal membranet mot cytosolen. (A) anhängare RAW celler på täckglas var infekterade med ägg-inredda dsRed-BCG i 24 timmar vid 37 ° C och sedan fast/permeabilized och färgas med kanin anti avidinen antikropp och FITC-get anti-kanin IgG. Proverna var monterad på objektglas och analyseras av digitala konfokalmikroskopi. Röda signaler ange positionen för BCG och gröna signaler återspeglar localizationen av Avi-ägg. Den streckade linjen visar makrofag cellkanten och längst ned till höger panel är en 4 X förstoring av insatsen visas i vänstra panelen. (B) tunnslip av BCG-AviOVA infekterade råa celler var fast med PARAFORMALDEHYD och inkuberas sekventiellt med anti avidinen antikropp och guld-konjugerad get anti-kanin IgG att visualisera Avi-OVA och undersökt med ett elektronmikroskop. Förstoring av 12,000 X visas. Pilspetsar visar Avi-ägg separerade från BCG yta och exporteras utöver phagosome membranet. Bilderna som visas är företrädare för två oberoende experiment. Bild redigerad och återges med tillstånd från PLOS ONE12. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: avidinen-fusion antigen Co lokaliserade med MHC klass II och klass I molekyler. Vidhäftande BMA3.1A7 celler, en mus makrofag cell fodrar, var infekterade med OVA inredda GFP-BCG (som uttrycker grön fluorescerande, tidigare beskrivna9) för 4 h och sedan stimuleras med IFN-γ för 24 h. cellerna var sedan fast/permeabilized och färgas med kanin-anti avidinen-antikropp, Alexa 594 anti-kanin IgG och Alexa 647 råtta antimus-A (A) eller Alexa 647 råtta antimus H-2_kb (B). Proverna var monterad på objektglas och analyseras av digitala konfokalmikroskopi. Gröna signaler ange positionen för BCG-GFP och röda signaler återspeglar localizationen av Avi-ägg. Blå signaler ange positionen för MHC klass II eller klass I molekyler. Den streckade linjen visar området av intresse. Pilspetsar visar Avi-OVA colocalization med MHC molekyler. Bilderna som visas är företrädare för två oberoende experiment. Bild redigerad och återges med tillstånd från PLOS ONE12. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: In vivo CD4+ T-cellssvar på OVA-inredda BCG. C57BL/6 möss var injiceras subkutant med BCG yta dekorerad med ägg, omodifierade BCG vildtyp, PBS (kontroll), BCG genetiskt förändrat för att uttrycka OVA (BCG-p19-ägg), eller omvandlas med kontroll plasmid och ytan inredda med Avi-OVA ( BCG-p19-AviOVA). Efter en 20-dagars period, splenocytes preparerades från mjälte euthanized djur och färgas med PE-konjugerad I-Ab-OVA323-339 tetramers (A) följt av AF647-CD4 antikropp och 7-AAD. Proverna analyserades sedan av flödescytometri. Resultaten uttrycks som två-parametern dot tomter som visar den genomsnittliga frekvenser ± SEM av tetramer positiva händelser i CD4+ befolkningen från två djur/grupp. Data som visas är representativa för tre oberoende experiment (totalt sex möss undersöktes med cellprover från varje mus som utvärderats i tre exemplar). Data i diagram (B) uttrycks som menar värde ± SEM av det absoluta antalet (sammanlagt 500.000 händelser) OVA tetramer specifika CD4+ celler i från två djur/grupp och tre oberoende experiment. * P < 0,05; ** P < 0,01; P < 0,001. Bild redigerad och återges med tillstånd från PLOS ONE12. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8: frekvenser av T-celler släppa cytokiner som svar på Avi-OVA coated BCG-immunisering. Splenocytes från immuniserade mössen med PBS, BCG-vildtyp, BCG WT ytan dekorerad med Avi-ägg, BCG-p19-OVA och BCG-p19-AviOVA var stimuleras med rekombinant ägg protein för 16 h följt av en 5 h-period behandling med Brefeldin A. Cells var då tvättas och färgas först med PE-Cy7 anti-CD4 (A) eller PE anti-CD8 antikropp (B) sedan AF647 anti-IFN-γ antikropp. Cellerna var sedan tvättas och analyseras med flödescytometri. Resultaten uttrycks som två-parametern dot tomter att visa den genomsnittliga frekvenser ± SEM av IFN-γ producerande cell delmängder i CD4+ och CD8+ populationer från två djur/grupp. Data som visas är representativa för tre oberoende experiment (totalt sex möss undersöktes med cellprover från varje mus som utvärderats i tre exemplar). Data i diagram (C) uttrycks som medelvärdet av absoluta antalet ± SEM av IFN-γ+ T släppa CD4-celler (vänster graf) eller IFN-γ släppa CD8+ T cells (höger diagram) från två djur/grupp och tre oberoende experiment. * P < 0,05; ** P < 0,01; P < 0,001. Bild redigerad och återges med tillstånd från PLOS ONE12. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denna studie rapporterade vi en icke-genetiska strategi för snabb och effektiv visning av exogena proteiner på BCG yta att lägga till antingen specifika antigener eller specifika funktionella egenskaper förväntas effektivt förbättra bakteriens immunogenicitet. Vi visat att BCG cellytan kunde vara enkelt biotinylerade för momentana yta dekoration med metoden fusionsproteinerna. Den totala proceduren kan utföras inom 2 h, medan genetisk transformation och urval av positiva kloner kräver 2 till 3 månaders eftersläpning. Ytmodifiering påverkar inte bakteriell tillväxt och överlevnad. Bakterier dekorerad med surrogat antigen ägg skulle kunna leverera antigenet i antigen-presentation vägen och inducerade specifika immunsvar in vivo som utvärderades av flödescytometri analyser inklusive MHC tetramer färgning och intracellulära cytokin färgning (ICS). Viktigare, visade in-vivo studier tydligt att ytdekorerat bakterier kunde framkalla liknande nivåer av immunsvar jämfört med BCG genetiskt manipulerade express liknande antigener.
Metoden biotin interaktion är den starkaste icke-kovalenta interaktion känd i naturen med en K-d 10−15 M13. Det är inte bara ett användbart verktyg som ofta används i biologisk forskning14, men också nyligen visat sig vara tillämpliga i cancer behandling15,16. I denna studie en trippel mutation (N54A, W110K och N17I) tillämpades till vildtyp metoden att omvandla tetrameriskt metoden till en form av monomer metoden som avsevärt minskat avidinen-biotin affinitet (Kd= 10−7 M) och binder reversibelt till biotin. Detta monomer metoden användes för att utveckla en p17-Avi plasmid som är kompatibel med Gateway rekombination kloning (Invitrogen) för en one-step snabba uttryck av ett protein av intresse. Denna nya version av monomer metoden har flera fördelar inklusive att förebygga stora bakteriell dunge aggregering och övergående/reversibel bakteriella surface-skärmen av proteiner av intresse. Därför, när förtäras av värdcellen, Avi-fusion proteiner kan lossna från ytan av biotinylerade bakterier och trafik intracellulärt. Slutligen konvertera mutationerna avidinen till en icke-glykosylerad form som kan vara tillämplig i jäst eller transgena växter17,18 för produktion av stora mängder avidinen fusionsproteinerna i eukaryota system. Denna form av monomer metoden valdes i stället för en version av monomer streptividin (mSA)19, som har både streptividin och rhizavidin sekvenser och hade en högre affinitet (Kd 10−9 M) jämfört med mAvidin. Med Preliminär testning, hade mSA chimera protein mycket lägre bindande effektivitet att biotinylerade bakterier jämfört med mAvidin chimera protein. Denna studie baserades därför på mAvidin, men monomer streptividin eller andra former av streptividin/metoden skulle också vara en möjlighet för andra program.
Framgångsrik implementering av protokollen beskrivs beror på kvaliteten på proteinet genererade fusion och effektivitet av den bakteriella surface biotinylation. Eluerade Avi-taggade protein bör de saltade och buffert utbyts i PBS med ordentlig molekylvikt protein koncentratorn. Utfällning kan inträffa vid hög koncentration faktorer för vissa proteiner, därför koncentrationsfaktor bör testas och fastställs med hjälp av små volymer av eluerade protein på första, t.ex., 0,5 till 1 mL solubilized inkludering kroppen spädas i 20 mL PBS och sedan koncentrerat. Det är också viktigt att hålla temperaturen av proteinet omkring 4 ° C under hela processen för att undvika utfällning.
För att förbättra effektiviteten i bakteriella surface biotinylation, ska Sulfo-NHS SS biotin förvaras i sin originalförpackning i mörker vid 4 ° C. Reagenset är extremt fukt känsliga; injektionsflaskor innehållande reagens bör därför vara utjämnad rumstemperatur före öppning. Också, biotin stamlösning (10 mM) bör göras omedelbart före användning som en NHS-ester biexponentiellt hydrolyserar och bli icke-reaktivt mycket snabbt. Biotin stamlösning inte kan lagras och återanvändas; en ny injektionsflaska av biotin behövs för varje biotinylation experiment. För bästa resultat rekommenderas färsk kulturer av BCG, färska media, samt färska buffertar. Som nämns i protokollet, kan biotinylerade och belagda BCG frystorkade och bevaras i minst 30 dagar utan att påverka kvaliteten i ytbeläggningen. Detta är särskilt användbart när du skickar eller överför prover från en plats till en annan eller när du utför lång kurs experiment.
Denna BCG yta dekoration metod erbjuder också andra spännande möjligheter att analysera och utvärdera immunogeniciteten för nyutvecklade vaccinkandidater på ett snabbt och korrekt sätt. Det primära målet för romanen TB vacciner är att framkalla TH1 typ celler såsom CD4+ och CD8+ T celler att spela viktiga roller i skydd mot tbc. Avidinen-biotin systemet har utvecklats i denna studie erbjuder ett mycket användbart verktyg för att bedöma dessa T-celler svaren. Denna nya teknik för att snabbt Visa rekombinanta proteiner/antigener på BCG yta representerar ett bra verktyg att utvärdera snabbt och korrekt skyddseffekten av många immunogent proteiner (t.ex., utsöndras specifika M.tb proteiner), och således kan översättas till utveckling av effektiva vacciner.
Genom att justera och variera koncentrationen av Avi-fusionsproteinerna på bakteriell yta, kan en annan fördel med denna metod vara att samtidigt visa olika antigener av intresse på bakteriell ytan för att maximera effektiviteten hos vaccinet. Eftersom studier har visat att BCG stör viktiga makrofag funktioner såsom phagosome mognad20,21 och antigen-presentation21, kan en möjlighet att ytterligare förbättra BCG dekorera BCG yta med en kombination av faktorer som är kända att påskynda phagosome mognad tillsammans med antigener av intresse.
Vissa begränsningar av denna teknik omfattar kravet på storskalig produktion av rekombinanta proteiner, som kan vara utmanande och dyra i låginkomstområden. Dessutom skulle producerar hårt att rena proteiner kräva felsökning och optimering. Dessa begränsningar kan emellertid kringgås med förbättringen av rekombinant protein produktionsteknik. En annan begränsning omfattar möjligheten att naturligt förekommande anti avidinen-antikroppar som är vanliga i laboratorium djur och människor22 kan hämma användningen av metoden för terapeutiska ändamål. Dock andra labb har testat säkerheten och effekten av avidinen terapi och har visat att metodens säkerhet och effekt inte påverkades signifikant av dess immunogenicitet23. Intressant, minskade konvertera den vildtyp tetrameriskt metoden till monomera form betydligt dess immunogenicitet24.
Sammanfattningsvis, kan denna nya teknik utnyttja en avidinen-biotin-system för att förbättra BCGS immunogenicitet via en snabba och reproducerbara icke-genetiska bakteriell ytmodifiering med proteiner av intresse framgångsrikt ersätta traditionella omvandling av BCG med antigen-encoding plasmider. Dessutom denna nya metod kan inte bara underlätta förbättring av det nuvarande BCG-vaccinet, men kan också ge en ny plattform för snabb utvärdering av praktiskt taget alla potentiella antigen eller proteiner normalt svårt att uttrycka genetiskt i BCG, med breda applikationer i TB vaccinutveckling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Dr. R Stokes för BCG Pasteur stammen och A. Talal för teknisk support. Vi tackar också GenScript för hjälp med gen syntes.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Endotoxin-free RPMI 1640 | StemCell Technologies | 36750 | |
| Sulfo-NHS SS biotin | Thermo Fisher | 21328 | |
| FITC-conjugated streptavidin | Sigma-Aldrich | S3762 | |
| Phycoerythrin (PE)-conjugated I-Ab-OVA323-339 tetramer | MBL International | TS-M710-1 | |
| 7-AAD | BD Pharmingen | 559925 | |
| TALON polyhistidine-Tag purification resin | Clontech | 635501 | |
| Alexa Fluor (AF) 647 conjugated rat anti-mouse CD4 | BD Bioscience | 557681 | |
| AF647 rat anti-mouse IFN-g | BD Bioscience | 557735 | |
| AF647 rat anti-mouse I-A/I-E | BD Bioscience | 562367 | |
| PeCy7 rat anti-mouse CD4 | BD Bioscience | 552775 | |
| PE rat anti-mouse CD8 Ab | BD Bioscience | 561095 | |
| AF 647 rat anti-mouse H-2kb | BD Bioscience | 562832 | |
| FITC-conjugated goat anti rabbit antibody | Thermo Fisher | 31635 | |
| AF 647 rat anti-mouse CD4 | BD Bioscience | 557681 | |
| Ultra-small gold-conjugated goat anti-rabbit IgG | Electron Microscopy Sciences | 25100 | |
| Middlebrook 7H9 broth | BD Diagnostic Systems | 271310 | |
| OADC | BD Diagnostic Systems | B11886 | |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| RAW 264.7 murine macrophage cell lines | American Type Culture Collection | ||
| pDEST17 plasmid | Invitrogen | 11803012 | |
| pUC57-OVA plasmid | GenScript | SD1176 | |
| BP clonase | Invitrogen | 11789020 | |
| LR clonase | Invitrogen | 11791043 | |
| pDONR221 plasmid | Invitrogen | 12536017 | |
| Ni-NTA columns | Qiagen | 31014 | |
| Pierce protein concentrators | Thermo Fisher | 88527 | |
| Flurosave | Calbiochem-Novabiochem | 345789 | |
| Axioplan II epifluorescence microscope | Carl Zeiss Inc | ||
| CCD digital camera | Retiga EX, QImaging | ||
| Tecnai G2 200kV electron microscope | FEI Company | G2 200Kv | |
| 70μm Falcon cell strainer | Thermo Fisher | 87712 | |
| EasyStep mouse biotin positive selection kit | StemCell | 18556 | |
| biotin-Ter119/Ertyroid cells antibody | BioLegend | 116203 | |
| Brefeldin A | BD Pharmingen | 555029 | |
| Cytofix/Cytoperm kit | BD Pharmingen | 554714 | |
| Bright-Glo Luciferase assay system | Promega | e2620 | |
| Turner Biosystem luminometer | Promega | TD-20/20 | |
| Leica EM UC6 microtome | Leica Microsystems | UC6 | |
| Novalyphe NL 500 freeze dryer | Savant Instruments | NL 50 | |
| Wheaton boroscilicate glass vials | Wheaton | VWR 66011-675 |
References
- Horwitz, M. A., Harth, G. A new vaccine against tuberculosis affords greater survival after challenge than the current vaccine in the guinea pig model of pulmonary tuberculosis. Infect. Immun. 71 (4), 1672-1679 (2003).
- Pym, A. S., et al. Recombinant BCG exporting ESAT-6 confers enhanced protection against tuberculosis. Nat Med. 9 (5), 548-553 (2003).
- Grode, L., et al. Increased vaccine efficacy against tuberculosis of recombinant Mycobacterium bovis bacille Calmette-Guerin mutants that secrete listeriolysin. The J Clin Invest. 115 (9), 2472-2479 (2005).
- Bastos, R. G., Borsuk, S., Seixas, F. K., Dellagostin, O. A.
- Mederle, I., et al. Plasmidic versus insertional cloning of heterologous genes in Mycobacterium bovis BCG: impact on in vivo antigen persistence and immune responses. Infect Immun. 70 (1), 303-314 (2002).
- Singh, N. P., et al. A Novel Approach to Cancer Immunotherapy Tumor Cells Decorated with CD80 Generate Effective Antitumor Immunity A Novel Approach to Cancer Immunotherapy Tumor Cells Decorated with CD80 Generate Effective Antitumor Immunity. Cancer Res. 63 (14), 4067-4073 (2003).
- Oizumi, S., Strbo, N., Pahwa, S., Deyev, V., Podack, E. R. Molecular and cellular requirements for enhanced antigen cross-presentation to CD8 cytotoxic T lymphocytes. J Immunol. 179 (4), 2310-2317 (2007).
- Sharif-Paghaleh, E., et al. Monitoring the efficacy of dendritic cell vaccination by early detection of (99m) Tc-HMPAO-labelled CD4(+) T cells. Eur J Immunol. 44 (7), 2188-2191 (2014).
- Sun, J., et al. A broad-range of recombination cloning vectors in mycobacteria. Plasmid. 62 (3), 158-165 (2009).
- Laitinen, O. H., et al. Rational design of an active avidin monomer. J. Biol. Chem. 278 (6), 4010-4014 (2003).
- Flynn, J. L., Chan, J., Triebold, K. J., Dalton, D. K., Stewart, T. A., Bloom, B. R. An essential role for interferon gamma in resistance to Mycobacterium tuberculosis infection. J Exp Med. 178 (6), 2249-2254 (1993).
- Liao, T. Y. A., Lau, A., Joseph, S., Hytonen, V., Hmama, Z. Improving the immunogenicity of the Mycobacterium bovis BCG vaccine by non-genetic bacterial surface decoration using the avidin-biotin system. PLoS ONE. 10 (12), e0145833 (2015).
- Green, N. M.
- Howarth, M., Takao, K., Hayashi, Y., Ting, A. Y. Targeting quantum dots to surface proteins in living cells with biotin ligase. PNAS. 102 (21), 7583-7588 (2005).
- Lesch, H. P., Kaikkonen, M. U., Pikkarainen, J. T., Yla-Herttuala, S.
- Paganelli, G., Bartolomei, M., Grana, C., Ferrari, M., Rocca, P., Chinol, M.
- Cummings, J. F., et al. Safety and immunogenicity of a plant-produced recombinant monomer hemagglutinin-based influenza vaccine derived from influenza A (H1N1)pdm09 virus: a Phase 1 dose-escalation study in healthy adults. Vaccine. 32 (19), 2251-2259 (2014).
- Kolotilin, I., et al. Plant-based solutions for veterinary immunotherapeutics and prophylactics. Vet Res. 45, 114-117 (2014).
- Demonte, D., Drake, E. J., Lim, K. H., Gulick, A. M., Park, S. Structure-based engineering of streptavidin monomer with a reduced biotin dissociation rate. Proteins. 81 (9), 1621-1633 (2013).
- Deghmane, A. E., et al. Lipoamide dehydrogenase mediates retention of coronin-1 on BCG vacuoles, leading to arrest in phagosome maturation. J Cell Sci. 120 (19), 3489-3489 (2007).
- Soualhine, H., et al. Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guerin secreting active cathepsin S stimulates expression of mature MHC class II molecules and antigen presentation in human macrophages. J Immunol. 179 (8), 5137-5145 (2007).
- Bubb, M. O., Green, F., Conradie, J. D., Tchernyshev, B., Bayer, E. A., Wilchek, M. Natural antibodies to avidin in human serum. ImmunolLett. 35 (3), 277-280 (1993).
- Petronzelli, F., et al. Therapeutic use of avidin is not hampered by antiavidin antibodies in humans. Cancer Biother Radiopharm. 25 (5), 563-570 (2010).
- Bigini, P., et al. In vivo fate of avidin-nucleic acid nanoassemblies as multifunctional diagnostic tools. ACS Nano. 8 (1), 175-187 (2014).
