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Neuroscience

Un enfoque Simple para inducir Neuritis Autoinmune Experimental en ratones C57BL/6 para las evaluaciones funcionales y Neuropathological

doi: 10.3791/56455 Published: November 9, 2017

Summary

Este informe describe un enfoque simple para inducir con éxito neuritis autoinmune experimental (EAN) utilizando la mielina proteína cero (P0)180-199 péptido en combinación con adyuvante completo de Freund y toxina del pertussis. Presentamos un paradigma sofisticado capaz de evaluar con precisión la magnitud de los déficits funcionales y neuropatología que ocurren en este EAN.

Abstract

Neuritis autoinmune experimental (EAN) es un bien apreciado modelo experimental de enfermedades desmielinizantes periféricas autoinmunes. Enfermedad EAN es inducida por inmunizar a ratones con péptidos neurogénicas para dirigir un ataque inflamatorio hacia los componentes del sistema nervioso periférico (PNS). Los avances recientes han permitido la inducción de la EAN en la línea de ratón C57BL/6 relativamente resistente utilizando mielina proteína cero (P0)106-125 o P0180-199 péptidos entregados en adyuvante combinada con la inyección de la Toxina pertussis. La capacidad de inducir la EAN en la cepa C57BL/6 permite el uso de las herramientas genéticas numerosos que existen en este fondo de ratón y permite así el sofisticado estudio de patogénesis de la enfermedad y el interrogatorio de la acción mecanicista de la nueva terapéutica en combinación con los enfoques de transgénicos. En este estudio, demostramos un enfoque simple para inducir con éxito EAN con el péptido de180-199 P0 en ratones C57BL/6. También describiremos un protocolo para la evaluación de los déficits funcionales que se producen en este modelo, acompañado por una serie de características de neuropathological. Así, este modelo es un potente modelo experimental para estudiar la patogenesia de neuropatías desmielinizantes periféricas humanas y determinar la eficacia de terapias potenciales que pretenden promover la reparación de la mielina y proteger contra el daño del nervio en autoinmune neuritis.

Introduction

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Neuropatías periféricas pueden ser genéticas en origen o adquirida, con neuropatías adquiridas teniendo ya sea metabólica, isquémico, precipitados inflamatorios o tóxicos. Estas enfermedades se clasifican también provechosamente como axonal o demyelinative en origen. El más común adquirida desmielinizante Neuropatías periféricas son la polineuropatía desmielinizante inflamatoria aguda (AIDP, también conocido como síndrome de Guillain-Barré, SGB) e inflamatoria desmielinizante polineuropatía crónica (CIDP)1, 2 , 3 , 4; ambos pathogenetically se caracterizan por una reacción autoinmune dirigida contra la mielina, provocando desmielinización de los nervios periféricos. En estas enfermedades, las células T activadas atraviesan la barrera del nervio y generan una reacción inmune en el PNS. Activación de los macrófagos dentro del nervio entonces causa desmielinización directamente a través de ataque fagocítico o indirectamente a través de mediadores inflamatorios secretados, dando por resultado clínicos incapacidades como parálisis y disfunción sensorial5. Mientras que los axones demyelinated conservan la capacidad de ser remyelinated después de desmielinización, remielinización se retrasa a menudo o incompleta, dando por resultado susceptibilidad de los axones desnudos a daño irreversible, que es la causa principal de la clínica permanente discapacidad. En la actualidad, los tratamientos más eficaces son inmunomoduladores, pero a pesar de su eficacia, en muchos casos la recuperación es a menudo lento y ~ 25% de los pacientes experimentarán déficits funcionales residuales que reducen significativamente su calidad de vida6, 7.

EAN es un modelo animal ampliamente utilizado de demyelinating de neuropatía periférica que ha proporcionado información valiosa en la patogenesia y a fin de evaluar nuevos agentes terapéuticos4. Este modelo puede ser inducido en diferentes especies tales como conejos, ratas, ratones y conejillos de Indias y es inducida por la vacunación con antígenos neurogénicas. Sin embargo, en última instancia la exitosa inducción EAN depende de una respuesta inmune apropiada para la enfermedad de que se produzca. Teniendo en cuenta las variaciones de la especie (y inter-especies/cepa) en la función inmune, se han desarrollado múltiples combinaciones de antígenos y adyuvantes para inducir con éxito el Código EAN. En términos de herramientas genéticas murinas, C57BL/6 es el más utilizado; sin embargo, el péptido de la proteína P2 tradicional 57-81 (P257-81) que resulta en la enfermedad en el ratón SJL susceptibles cepa8 es incapaz de patogenesia ilícito Conduce a déficits funcionales en la cepa C57BL/6. Afortunadamente, paradigmas de sensibilización mediante el P0106-125 o P0180-199 péptidos, se entregó en adyuvante combinada con la inyección de pertussis toxina puede superar esta barrera, que permiten sofisticadas herramientas genéticas ser utilizados en la modelo murino de EAN.

Aquí, se presenta un método simple para la inducción de la EAN en los ratones C57BL/6. Además, se proporciona un enfoque integral detallado por el cual evaluar los déficits funcionales y neuropathological asociados a la enfermedad. El P0180199 péptido9 fue elegida preferentemente a la alternativa de P057-81 10. El modelo de199 P0180se ha descrito para producir signos clínicos menos severos en comparación con la alternativa de P057-81 10y por lo tanto es probable que soportar potencialmente la introducción de perturbaciones genéticas deletéreas, recuperan de procedimientos quirúrgicos (como la implantación de la bomba osmótica) y es favorables a la función de paso de cinta de correr pruebas4. Sin embargo, la cinta de correr pruebas de la función de marcha y protocolos histológicos descritos aquí podrían fácilmente aplicarse al estudiar la enfermedad en una variante de57-81 inducida por P0.

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Protocol

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todos los procedimientos aquí descritos fueron aprobados por el Instituto de Florey de Neurociencia y Salud Mental (centro del cerebro de Melbourne) Comité de ética Animal y seguir el código australiano de prácticas para el uso de animales para la ciencia Efectos.

1. inducción de EAN

Nota: EAN puede ser inducida con éxito en ratones C57BL/6 machos de edades comprendidas entre 6-8 semanas. El protocolo de inducción lleva 9 días en total. Día 0 se refiere al día de la primera vacunación. De este protocolo, las inyecciones se realizaron bajo anestesia (ver paso siguiente 1.1.2).

  1. En el día -1:
    1. preparación de la toxina de Pertussis (véase Tabla de materiales) solución de 1.6 μg/mL con la estéril 0,1 M de fosfato ratón isotónica tamponada con solución salina (MT-PBS).
    2. Anestesia con isoflurano:
      1. Coloque el ratón (C57BL/6, hombre, 6-8 semanas) en la cámara de anestesia y ajustar el flujo de oxígeno a 1 L/min.
      2. Encienda el vaporizador de isoflurano, ajústelo al 2,5% para la anestesia y monitor de respiración y espera por 2 min, o hasta que los reflejos primarios (miembro de la córneo y posteriores) ya no responden
    3. Quitar el ratón de la cámara de anestesia y administre 250 μl de la solución anterior de la toxina del Pertussis mediante inyección intraperitoneal (i.p.) utilizando una jeringa de 0.5 mL con una aguja de 30 1/2 G.
    4. Preparar el inóculo inyectable para la inmunización:
      1. preparar Solución A solución 2 mg/mL de P0 180-199 péptido (con > 98% pureza, secuencia S-S-K-R-G-R-Q-T-P-V-L-Y-A-M-L-D-H-S-R-S) en solución salina al 0.9%.
      2. Preparar Solución B con 20 mg/mL solución de Mycobacterium tuberculosis (véase Tabla de materiales) en Freund ' coadyuvante completo de s (FCA, que comprende: mannide 15% monoolate + 85% de aceite de parafina y 0,5 mg/mL de desecado muertos y secos M Mycobacterium butyricum).
      3. Para hacer el inóculo final para inyectar, combinar partes de igual volumen de soluciones A y B en un batidor del grano y mezcla a velocidad máxima durante 1 min a temperatura ambiente.
        Nota: Soluciones A y B pueden ser mantenidas como acciones y almacenadas a 4 ° C por un máximo de un mes, pero el inóculo final combinado debe estar recién preparado en el día de la inyección de ratón.
  2. En el día 0, administrar 50 μl del inóculo (preparación descrito en el paso 1.1.4) en un ratón mediante una inyección subcutánea con una aguja de 23 G.
    Nota: La inyección puede colocarse entre los omóplatos, o entre las extremidades y la cola del dorso caudal.
  3. En día 1, la solución de la toxina del Pertussis de 1.2 μg/mL (en MT-PBS) y administrar 250 μL en un ratón vía la inyección i.p. utilizando una jeringa de 0.5 mL con una aguja de 30 1/2 G.
  4. Día 3, repetir paso anterior 1.3.
    Nota: Las soluciones Stock A y B pueden ser formadas y almacenadas a 4 ° c por un máximo de un mes. Sin embargo, el inóculo inyectable final, producido por la combinación de las soluciones madre A y B, debe hacerse en el día de la inyección.
  5. El día 8, administrar 50 μl del inóculo (preparación descrito en el paso 1.1.4) en un ratón mediante una inyección subcutánea (ver paso anterior 1.2), en el mismo sitio de inyección como en el paso 1.2 (para cada animal)

2. puntuación clínica

  1. realizar la puntuación clínica a diario a partir del día 0.
  2. Dar a cada ratón una puntuación de 0, 1, 2, 3 o 4 de acuerdo con los criterios publicados 4. Vea la tabla 1 para EAN puntuación clínica.
    Nota: Por consistencia, hacer un esfuerzo debe anotar ratones al mismo tiempo diariamente por el investigador mismo.

3. Evaluación de la función del motor

Nota: se evalúa el rendimiento del motor en paralelo con la puntuación clínica de la misma cohorte de animales. El aparato de evaluación de la función motora debe conectarse a un ordenador que cuenta con un sistema de proyección de imagen de la función de marcha (véase Tabla de materiales) instalado. También se recomienda que todos los ratones a evaluarse deben ser habituados a la tarea corriente antes de la inducción de la EAN. Para ello, pistas de práctica (2 funcionamientos de prueba por ratón) se llevan a cabo tres días antes de la inducción de la enfermedad (día -3).

  1. Encienda el aparato de evaluación de la función motora y encienda el botón de luz.
  2. Pescuezo el ratón firmemente y la tinta de sus pies bajando en un recipiente llenado de tinta roja mientras sostiene su cola.
    Nota: Este paso es necesario para la cepa C57BL/6, pero puede omitirse si se usa una cepa de ratón con un color de capa blanca.
  3. Coloque el ratón en el compartimiento de a pie y ajustar la velocidad de la cinta a 15 cm/s.
  4. Encienda la caminadora y haga clic en el " registro " botón para capturar el corriente movimiento del ratón mediante la función de paso sistema de imagen (véase Tabla de materiales).
  5. Usar un cronómetro y medir cada uno que funciona para 36 s. Después de 36 s, grabación de parada y parada de la caminadora.
    Nota: Los ratones que no se pueden completar la tarea corriente para este intervalo s 36 se consideran que han fracasado.
  6. Guardar el archivo de vídeo en la carpeta.
  7. Repetir los pasos anteriores para cada ratón a evaluarse. Los ratones con la misma tarea de ejecución de la prueba cada 3 días.
  8. Analizar los archivos de vídeo editados usando software para parámetros de la función de marcha (véase Tabla de materiales).
    Nota: Los detalles de cómo analizar los diferentes parámetros del motor varían entre software así que por favor, consulte al fabricante ' instrucción de s antes del análisis. Para obtener evidencia histológica de axonal y daño de la mielina mediante inmunohistoquímica o microscopia electrónica, los tejidos pueden tomarse en cualquier etapa post función motora evaluación dependiendo de los objetivos específicos de investigación animal.

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Representative Results

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P0180-199 péptido inducido EAN en plomos de ratones C57BL/6 a una enfermedad monofásica con puntuación clínica inicio de post 6 días primera inmunización (PPP) y la máxima puntuación severidad se observa desde dpi 25 seguido de un score clínico mejora de 40 dpi duración (figura 1)4,9. En cuanto a la función de la marcha, ratones empiezan a fracasar en una tarea simple de ejecución tan pronto como el PPP 6 y por los ratones dpi 35 tienen poca capacidad para completar una pista simple ejecución de tarea y no mejoran en capacidad de marcha incluso en dpi 554 (figura 1). Ratones se indujo con EAN progresivamente disminuido en su capacidad para realizar la tarea corriente con el tiempo. Corriente fallo de tarea se observa en el 80% de los ratones, pero además de esto, marcha de extremidades en caminadora funcionando es un déficit funcional clave que no resuelve sobre la duración de la enfermedad4.

Hay varias características claves de neuropathological en P0180-199 inducida EAN: daño a la vaina de mielina; estrés del axón; y nodo de mayor anchura y daño a las estructuras paranodal. La examinación de secciones semi-delgadas de nervios ciáticos revela áreas de desmielinización (figura 2B, flechas) en comparación con nervios ciáticos de controles sanos de edad comparable (figura 2A). Lo importante, es posible obtener ratios de G de imágenes capturadas de las secciones semi-delgadas del nervio ciático reflejadas en alta potencia con microscopía de luz4. Sin embargo, imágenes de microscopía electrónica (TEM) de transmisión de alta potencia se requieren para identificar características de neuropathological específicas como dysmyelinaton, daños en las láminas de mielina, y signos de axón estrés como hinchazón mitocondrial (desarreglo y distorsión de cristae y cristolysis parcial o total) (figura 22D). Consistente con la evidencia ultraestructural de la tensión del axón (figura 2-2D), el modelo EAN P0180-199 inducida también muestra daño axonal agudo, demostrada dramáticamente elevado precursor de β-amiloide expresión de la proteína (APP) en el nervios ciático (Figura 3A). Esto no se observa en los tejidos sanos de edad comparable del control (Figura 3A). Cambios neuropatológicos en los nodos y los paranodes han sido bien documentados en GBS; en particular, la AMAN variante11,12. En el modelo murino de la EAN, identificamos que la ampliación de los nodos y la interrupción de la paranode es características de neuropathological adicionales de P0180-199 inducida por EAN (figura 3B).

Figure 1
Figura 1: representación esquemática del paradigma EAN inducción, clínico puntuación evaluación y capacidad de corriente durante EAN. (A) Resumen de inducción EAN protocolo en ratones C57BL/6, a partir de 6-8 semanas de edad, con esquemas de (B) resultados clínicos esperados y (C) tiempos en marcha durante la enfermedad del curso (ver referencia4). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: ratones con EAN Mostrar la pérdida de mielina, myelin daños y signos de estrés axones. Imagen de campo brillante (A) A (menos de 100 aumentos) de secciones semi-delgadas de nervios ciáticos de edad comparable del control sano. (B) un campo brillante imagen (menos de 100 aumentos) de secciones semi-delgadas de nervios ciáticos de ratones inducidos con EAN en 55 días post vacunación primera (PPP). Las áreas que carecen de mielina rodeado de axones myelinated fino (flecha) indican remyelination; Esto no se observó en el tejido Obtenido de controles sanos pareados por edad (vea A). (C) A microscopia electrónica representativa imagen (bajo 5.000 aumentos) fromsciatic los nervios de panel B demostrando patología de mielina (flecha abierta) y estrés de axón (Plaza de enlace indicando las mitocondrias hinchadas a 55 PPP). (D) una imagen TEM de alta potencia (bounding box en C) que demostraba las mitocondrias hinchadas que son indicativas de axón estrés (cabezas de flecha), pero esto es ausencia de controles sanos pareados por edad (datos no mostrados). Barras de la escala = 10 μm (A, B) y 500 nm (C, D). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Axón estrés y patología ganglionar es una característica de P0180-199 inducida por EAN. (A) solo plano imágenes confocales (bajo 40 aumentos) a través de los nervios ciáticos en 55 dpi. Tejido de los ratones EAN muestran dramáticamente elevada expresión de aplicación localizada junto con III β tubulina (un marcador de las neuronas) carteles indicadores de estrés axonal. (B) alta potencia Z-proyecciones (100 aumentos) de paranodes teñidas con un anticuerpo contra la RSPCA en secciones del nervio ciático. En los nodos de los ratones de la EAN, hay una distancia creciente entre paranodes adyacentes indicando la ampliación del nodo. Además, patología ganglionar como interrupción de la estructura de paranode puede observarse en los ratones EAN pero está ausente de controles sanos pareados por edad. Barras de la escala = 10 μm (A) y (B) de 5 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Puntuación Criterios Notas y comentarios de criterios de evaluación
0 Ratón normal
1 Menos animada o lathery Esto se evalúa en respuesta a la manipulación normal, ratones normalmente primero muestran signos de reducción de la actividad en el del 5 día post vacunación
2 Paresia de la cola o Paresia de la cola es evaluada por la prueba de movimiento de la cola (sacudiendo la cola).
Paresia de la extremidad suave Paresia de la extremidad suave se refiere a ratones arrastrar su vientre en el suelo al caminar sobre una superficie plana
3 Paresia + paresia leve extremidad de la cola o Ataxia suave se evalúa como cualquier dificultad en caminar normal
Paresia + ataxia suave de la cola o
Paresia de la extremidad suave + ataxia suave
4 Ataxia severa Ataxia severa es identificada por anormal hacia atrás caminando, combinado con paresia de extremidades, paresia leve del miembro o cola paresia

Tabla 1: EAN clínico puntuación de paradigma.

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Discussion

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Este informe describe un método sencillo para inducir EAN con el péptido de180-199 P0 en ratones C57BL/6, lo que permite la cuantificación de los déficits neuropathological y funcionales claves en ratones inducidos con EAN. Distinto en el protocolo de inducción de EAN se describe aquí es el uso de anestesia mientras se realizan las inyecciones de inmunización. El uso de la anestesia isoflurano mejora en gran medida la capacidad para garantizar que el volumen total de inóculo se inyecta por vía subcutánea en el lugar deseado con el mínimo error y estrés a los animales.

Ratones se empezarán a mostrar signos clínicos de enfermedad de 6 PPP4 usando este método de inducción de EAN. Sin embargo, Inicio de la enfermedad medida por el puntaje clínico se ha divulgado previamente para ocurrir de ~ 10 dpi9,10. Mientras que esta diferencia en el inicio de la enfermedad según lo determinado por el puntaje clínico podría ser parcialmente debido a los diferentes criterios de puntuación clínicos, es más probable explicada por el uso de diferentes adyuvantes en el inóculo para la inducción de la EAN. Este protocolo utiliza adyuvante completo de Freund que contienen M. butyricum, que se complementa con M. tuberculosis. Otros estudios usan adyuvante de Freund de suplido solamente con M. tuberculosis en el inóculo inyectado que contiene el P0180-199 péptido9,10 para la inmunización.

En este protocolo, entrega de toxina del pertussis mediante inyección i.p. se recomienda preferentemente por vía intravenosa (i.v.) inyección en la vena de la cola. Se ha demostrado que el modo de entrega de la tos ferina no alterar significativamente el inicio o la progresión de la enfermedad4, pero la elección para entregar vía i.p., a diferencia de la vena de la cola de i.v., está motivada por la mitigación de riesgos y un intento de reducir la probabilidad de error de funcionamiento. Con frecuencia, las inyecciones de cola vena i.v. son técnicamente más difícil en comparación con las inyecciones de un volumen igual. Se ha demostrado previamente que el uso de la toxina del pertussis como coadyuvante es necesario inducir EAN al usar el P0 de péptido180-199 9. Curiosamente, trabajo previo ha demostrado que reducir a la mitad la dosis de tos ferina en este método, es suficiente para ilícito EAN medido por el puntaje clínico, neuropatología y marcha ampliación durante la caminadora funcionando4. Sin embargo, disminuir la dosis de toxina del pertussis usada en durante EAN inducción influye significativamente sobre la capacidad corriente y ratones realizan significativamente mejor en la caminadora funcionando tarea cuando EAN es inducida con la mitad de la dosis de tos ferina se describe en este método 4.

El déficit motor observado en este modelo EAN P0180-199 péptido inducido es acompañado y apoyado por evidencia de neuropathological. Previamente, se ha demostrado que cuantificar la magnitud del daño de la mielina es lo suficientemente sensible para detectar alteraciones en la gravedad de la enfermedad como resultado de reducir a la mitad la dosis de toxina del pertussis durante la inducción de la EAN. Aquí, se identifican otras características distintivas de EAN como estrés axonal y la interrupción de las estructuras del nodo/paranodal, resultando en un conjunto de marcadores cuantitativos neuropathological P0180-199 inducida EAN. Esto permite para las examinaciones más prudentes de la neuropatología al evaluar los procesos de la enfermedad, o la eficacia de nuevos agentes terapéuticos. Emocionante, estas evaluaciones neuropathological pueden ser correlacionadas con lecturas funcionales en un intento por proporcionar penetraciones más profundas y un mejor entendimiento de la relación entre el déficit de función que es una característica de este modelo de EAN y neuropatología. Además del análisis neuropathological y prueba de la función de marcha empleados en este estudio, se sugieren otras evaluaciones funcionales como medición de velocidad de conducción del nervio para captar totalmente los resultados de la función de las intervenciones terapéuticas con Este modelo.

EAN es un modelo experimental potente y comúnmente usado para examinar periférica desmielinización y remielinización, con los nervios ciáticos y la cauda equina, siendo la más frecuentemente investigados los nervios periféricos. La gran ventaja de EAN es que resulta en un déficit motor cuantificable y reproducible, permitiendo análisis de neuroprotección y mielina reparación desde una perspectiva clínica. Además, el daño de la mielina es aguda y reproducible lo que permite análisis detallados de la mielina y daño axonal desde un punto de vista histopatológico.

Mientras que EAN modelo representa un medio experimental apasionante investigar neuropatía periférica desmielinizante, hay limitaciones potenciales, así como problemas técnicos. Es importante apreciar la naturaleza de la heterogeneidad de demyelinating de neuropatía periférica en los seres humanos, que implica una interacción compleja entre el sistema inmune y PNS. El reto actual es que no hay un modelo animal de EAN puede mímico fielmente todos sus aspectos. Además, existen variaciones inter-especies y cepa entre substancial con respecto a la severidad de la enfermedad y la progresión del modelo EAN. Por ejemplo, encontramos que en general el EAN inducido en ratones de la C67/B6 es menos severa que la EAN inducida en ratas Lewis (datos no publicados). Dentro de la misma cepa, también hay diferencia de género. Nuestros datos no publicados muestran que el modelo EAN inducido en ratones C57/B6 machos es más reproducible que la inducida en los ratones hembra, sin embargo, la razón exacta que se basa esta diferencia de género es confuso.

En conclusión, nos informó un protocolo que permite una inducción rápida y robusta del modelo EAN en ratones C57/B6 machos. Combinar la puntuación clínica y la evaluación de la función motora con estudios neuropathological proporciona una herramienta estratégica para el estudio de demyelinating de neuropatía periférica de perspectivas clínicas y patológicas. Lo importante, promueve futuros estudios sobre los mecanismos de las terapias que reparación de mielina del nervio periférico utilizando enfoques de ratón transgénico.

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Disclosures

Los autores no tienen ningún conflicto de intereses con respecto a este trabajo.

Acknowledgments

DGG es NHMRC Peter Doherty y compañero de carrera temprana esclerosis múltiple investigación Australia (MSRA). JLF es apoyado por una Beca Postdoctoral de MSRA. Este trabajo fue financiado por el Australian National Health y Consejo de investigación médica (NHMRC) proyecto beca #APP1058647 a JX.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6, male, 6-8 weeks old Australian Bioresources Cenre, WA, Australia
Pertussis toxin List Biological Laboratories, Inc., CA, USA #181
0.1 M mouse-isotonic phosphated buffered salined (MT-PBS) Laboratories will have their own protocol.
Isoflurane Pharmachem, QLD, Australia Laboratories will have their own protocol for administration.
P0180–199 peptide Wuxi Nordisk Biotech Co. Lt. SHG, CHN P0180–199, sequence S–S–K–R–G–R– Q–T–P–V–L–Y–A–M–L–D–H–S–R–S
Heat killed Mycobacterium tuberculosis (strain H37RA) Difco, MI, USA #231141
Freund's complete adjuvant (FCA) Difco, MI, USA #263910
16% Paraformaldehyde (PFA) Electron Microscopy Services #15710 Dilute to 4% PFA day of tissue collection.
25% glutaraldheyde ProSciTech Pty Ltd, QLD, Australia #11-30-8 Dilute to 2.5% glutaraldehyde day of fixation.
Sodium azide Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australia SL189 Create 10% (w/v) stock in 0.1M MT-PBS. Use at 0.03% (v/v).
Sucrose Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australia SA030 Use at 30% (w/v).
Optimum cutting temperature (OCT) medium Sakura Finetek, CA, USA #4583
Normal donkey serum Merck Millipore, MA, USA #S30-100 Use as antibody diluent at 10% (v/v) or other concentration determined by own laboratory.
Triton-X 100 Sigma Aldrich, MI, USA #90o2-31-1 Use in antibody diluent at 0.3% (v/v) or other concentration determined by own laboratory.
rabbit anti-amyloid precursor protein (APP) Invitrogen (Life Technologies), CA, USA S12700 Used at 1:400 or titrate in own lab.
rabbit anti-contactin-associated protein-1 (Caspr) Gift from Prof Elior Peles, Wiezmann Institute of Science, Israel Used at 1:500 or titrate in own lab.
Appropriate Alexa Fluor conjugated secondary antibodies Molecular Probes (Life Technologies), OR, USA Various Use at 1:200 or titrate in own lab. Choice of species the antibody was raised in and Alexa Fluor chosen is at the discretion of each laboratory.
Aqueous mounting solution Dako (Agilent), CA, USA #S3023 Each laboratory will have their own preference.
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
0.5 mL syringe with 301/2 g needles BD #326105
23 g needles BD #305143
Red ink pad Any red ink pad or red food dye could be used to mark the animals' feet.
DigiGate apparatus (includes treadmill) eMouse Specifics Inc. Framingham, MA
DigiGate Imaging System eMouse Specifics Inc. Framingham, MA
Stopwatch Any timer may be used.
DigiGait 8 Software eMouse Specifics Inc. Framingham, MA
Dissecting microscope Zeiss Any appropriate dissecting microscope may be used.
Charged slides Superfrost Plus, Lomb Scientific Pty Ltd SF41296SP
Cyrostat Leica Any suitable cyrostat may be used.
Perfusion equipment and dissecting instruments Labs will have their own perfusion protoctols.
Opaque humified chamber Labs may produce their own using an opaque plastic container.
PAP pene GeneTex (USA) Wax pencil, or surface tension may also be used to create a well around the tissue section.
Confocal microscope Zeis LSM780 Any confocal microscope with appropriate laser lines may be used.
FIJI/Image J National Institues of Health Available from www.fiji.sc

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References

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Un enfoque Simple para inducir Neuritis Autoinmune Experimental en ratones C57BL/6 para las evaluaciones funcionales y Neuropathological
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Gonsalvez, D. G., Fletcher, J. L., Yoo, S. W., Wood, R. J., Murray, S. S., Xiao, J. A Simple Approach to Induce Experimental Autoimmune Neuritis in C57BL/6 Mice for Functional and Neuropathological Assessments. J. Vis. Exp. (129), e56455, doi:10.3791/56455 (2017).More

Gonsalvez, D. G., Fletcher, J. L., Yoo, S. W., Wood, R. J., Murray, S. S., Xiao, J. A Simple Approach to Induce Experimental Autoimmune Neuritis in C57BL/6 Mice for Functional and Neuropathological Assessments. J. Vis. Exp. (129), e56455, doi:10.3791/56455 (2017).

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