Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

المستندة إلى صفيف "مقارنة الجينوم التهجين منصة" "الكشف عن كفاءة من نسخ عدد الاختلافات" في طفرات "سريعة النيوترون" المستحثة فصة برميلية

Published: November 8, 2017 doi: 10.3791/56470
Automatic Translation
1, 2, 3, 2, 2, 1
1Laboratory of Plant Genetics and Development, Noble Research Institute, 2Genetics Laboratory, University of Oklahoma Health Science Center, 3Medicine and Health School, Li Shui University

Summary

يوفر هذا البروتوكول خطوات تجريبية ومعلومات حول الكواشف ومعدات وأدوات التحليل للباحثين الذين يرغبون في القيام بتحليل الجينوم كله التهجين الجينومي المقارن القائم على صفيف (CGH) لنسخ عدد الاختلافات في النباتات.

Abstract

هي طفرات لا تقدر بثمن من الموارد الوراثية للدراسات وظيفة الجينات. لإنشاء مجموعات متحولة، يمكن أن تستخدم ثلاثة أنواع من المطفرة، بما في ذلك البيولوجية مثل تي-دنا أو ينقول، أو الكيميائية مثل إيثيل ميثانيسولفوناتي (EMS) أو المادية مثل الإشعاعات التأين. نوع الطفرة لاحظ يتفاوت مطفر المستخدمة. للتأين الإشعاعي الناجم عن طفرات، تشمل طفرات الحذف أو الازدواجية، أو إعادة ترتيب. بينما يقتصر تي-دنا أو الطفرات ينقول المستندة إلى الأنواع التي عرضه للتحول، يمكن تطبيق الطفرات الكيميائية أو الفيزيائية لمجموعة واسعة من الأنواع. ومع ذلك، وصف الطفرات المستمدة من الطفرات الكيميائية أو الفيزيائية تقليديا يعتمد على خريطة نهجاً قائما على استنساخ، وهو العمل المكثف ومضيعة للوقت. وهنا نعرض أن منصة تهجين جينومي مقارن القائم على مجموعة (أكغ) عالي الكثافة جينوم يمكن تطبيقها على الكشف عن كفاءة وتميز الاختلافات نسخة رقم (كنفس) في طفرات المستمدة من الطفرات القصف (ليبونن) النيوترونات السريعة في فصة برميلية، أنواع البقول. تحليل تسلسل الجينوم كله يبين أن هناك جينات أكثر من 50,000 أو نماذج الجينات في م. برميلية. في طفرات الحالية، والتي يسببها ليبونن في برميلية م. مستمدة من أكثر من 150,000 خطوط M1، تمثل الموارد الوراثية لا تقدر بثمن للدراسات الفنية للجينات في الجينوم. منصة أكغ الموصوفة هنا أداة فعالة لوصف طفرات المستحثة ليبونن في م. برميلية.

Introduction

البقوليات (قرنيات) هي ثالث أكبر عائلة النباتات المزهرة، مع العديد من الأنواع الهامة اقتصاديا مثل فول الصويا (ماكس جليكاين) والبرسيم (فصة ساتيفا). نباتات البقول يمكن أن تتفاعل مع البكتيريا التربة النتروجين، تسمى عموما رهيزوبيا لتطوير العقيدات الجذرية التي ينخفض رابع الغلاف الجوي للأمونيا للاستخدام بالنبات المضيف. على هذا النحو، يتطلب إدخال القليل من الأسمدة النيتروجينية زراعة محاصيل البقول وهكذا تسهم الزراعة المستدامة. إنتاج محاصيل البقول الأوراق والبذور ذات محتوى عالي البروتين، تخدم كعلف ممتاز ومحاصيل الحبوب. ومع ذلك، أنواع البقول المزروعة عموما لديهم هياكل معقدة الجينوم، مما يجعل الدراسات الفنية من الجينات التي تلعب أدواراً رئيسية في العمليات الخاصة بالبقول مرهقة. فصة برميلية قد اعتمدت على نطاق واسع كأنواع نموذجية للدراسات البقول أساسا لتكنولوجيا المعلومات (1) يحتوي جينوم مثنوية مع حجم جينوم فرداني صغيرة نسبيا (~ 550 Mbp)؛ (2) نباتات يمكن أن تتحول ستابلي لدراسات الجينات الوظيفية؛ وهو (3) ارتباطاً وثيقا بالبرسيم (م. ساتيفا) والملكة من الأعلاف والعديد من المحاصيل الأخرى الهامة من الناحية الاقتصادية للدراسات متعدية الجنسيات. في الآونة الأخيرة، تسلسل الجينوم والسيرة الذاتية برميلية م. A17 جيمالونج قد صدر1،2. تعليق توضيحي للجينوم تبين أن هناك أكثر من 50,000 الجينات المتوقعة أو نماذج الجينات في الجينوم. لتحديد وظيفة معظم الجينات في برميلية م. المجين مهمة صعبة. لتسهيل الدراسات الفنية للجينات، مجموعة شاملة من طفرات في نطاق الأسطر1 م 150,000 أكثر من تم إنشاؤها باستخدام النيوترونات السريعة القصف (ليبونن) الطفرات في السيرة الذاتية برميلية م. A17 جيمالونج3 ،4. وقد استخدمت النيوترونات السريعة، مطفر تاين ذات طاقة عالية، في توليد طفرات في العديد من الأنواع النباتية بما في ذلك أعطيت5،6،7من الأرز (أرز)، الطماطم (Solanum بندورة)، فول الصويا (سوجا جليكاين؛ زاي ماكس)8،9والشعير (فولغاري شعير) Lotus japonicus10. جزء كبير من الطفرات المستمدة من الطفرات ليبونن هي سبب الحذف الحمض النووي التي تتراوح في حجمها من بضع قاعدة أزواج ميجا قاعدة أزواج9،11. وقد تم العديد من الجينات المرتبطة بالنمط الظاهري بنجاح تحديد ووصف4،،من1213،،من1415،16، 17 , 18 , 19-الاستنساخ الجزيئي للجينات الكامنة من طفرات ليبونن سابقا، تعتمد على نهج قائم على الخريطة، التي تستغرق وقتاً طويلاً، ويحد من العدد طفرات تتسم على المستوى الجزيئي. في الآونة الأخيرة، عدة نهج المجاملة بما في ذلك الأساليب المستندة إلى نص، الجينوم تبليط التهجين الجينومي المقارن القائم على صفيف (CGH) للحمض النووي نسخة رقم الكشف عن الاختلاف، وتسلسل الجينوم كله، قد استخدمت لتسهيل وصف طفرات الحذف في الكائنات المتنوعة بما في ذلك الحيوانات والنباتات20،،من2122،،من2324،25، 26،27،،من2829،،من3031.

تيسيرا لتوصيف طفرات ليبونن في م. برميلية، كل الجينوم المستندة إلى صفيف مقارنة الجينوم تهجين (CGH) وضعت منصة والتحقق من صحتها. كما ورد في النظم الحيوانية، منصة CGH المستندة إلى الصفيف يتيح الكشف عن تغيرات نسخة رقم (كنفس) على مستوى كامل الجينوم في طفرات ليبونن برميلية م. . وعلاوة على ذلك، آفات يمكن أن تؤكده بكر ويمكن تحديد حدود الحذف بالتسلسل. عموما، منهاج CGH صفيف أداة كفؤة وفعالة في تحديد الآفات في طفرات ليبونن م. برميلية . ويوضح هنا، الصفيف CGH الإجراءات وتوصيف PCR الحدود الحذف في المسخ ليبونن برميلية م. .

وينص البروتوكول التالية خطوات تجريبية ومعلومات حول الكواشف ومعدات وأدوات التحليل للباحثين الذين يرغبون في القيام بتحليل الجينوم كله التهجين الجينومي المقارن القائم على صفيف (CGH) من عدد النسخ الاختلافات في النباتات. على سبيل مثال، استخدمت فصة برميلية FN6191 المسخ لتحديد مناطق الحذف والجينات المرشحة المقترنة تعمل متحولة. برميلية م. FN6191 متحولة، معزولة أصلاً من جمع متحولة حذف التي يسببها القصف النيوترونات سريعة32 (انظر الجدول للمواد)، عرضت النمط الظاهري فرط نودوليشن بعد التطعيم بالتربة بكتيريا، Sm1021 الرايزوبيوم سيهورهيزوبيوم ، وعلى النقيض من النباتات البرية نوع.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: الشكل 1 يبين الخطوات الخمس لمجموعة بروتوكول CGH. وهم: 1) إعداد المواد النباتية؛ 2) عزل عينات الحمض النووي ذات جودة عالية؛ 3) التالي وتنقية لعينات من الحمض النووي؛ 4) التهجين، الغسل، والمسح الضوئي من صفائف الجينوم كله؛ و 5) تحليل البيانات CGH. م. برميلية الجينوم كله بلاط صفائف تحتوي على ما مجموعة 971,041 المسابير اليغو فريدة من نوعها تستهدف 50,000 أكثر من الجينات أو نماذج الجينات في الجينوم (انظر الجدول للمواد). تحقيقات فريدة متباعدة تقريبا كل 150 زوج قاعدي (bp) في مناطق اكسونيك و 261 bp في مناطق الجينوم برميلية م. إينترونيك.

1-"إعداد المواد النباتية"

  1. سكاريفي البرية نوع (WT؛ السيرة الذاتية برميلية م. A17 جيمالونج) وبذور FN6191 متحولة مع تركيز حامض الكبريتيك لمدة 8 دقائق (انظر الجدول للمواد). إزالة وتجاهل حمض الكبريتيك إلى حاوية نفايات سائلة-
  2. شطف البذور مع يعقم المياه ثلاث مرات-
  3. سطح تعقيم البذور بمحلول التبييض 20% للحد الأدنى 10
  4. شطف البذور مع يعقم المياه ثلاث مرات-
  5. تخزين البذور في 4 درجات مئوية لمدة 3 أيام. وبعد فيرناليزيشن، نقل وتنبت البذور في التربة لمدة أسبوع واحد في غرفة نمو مع ح 16/8 ح دورة الضوء/الظلام و µE 150/م 2/ق ضوء كثافة.
  6. زراعة الشتلات للأواني 1 غالون وتنمو لهم في دفيئة مع ح 16/8 ح دورة الضوء/الظلام، 150 µE/م 2/ق كثافة الضوء لمدة ثلاثة إلى أربعة أسابيع. جمع عينات من الشباب نبات من النباتات لعزل الحمض النووي-

2. عزل "عينات الحمض النووي ذات جودة عالية"

  1. ز 1 أنسجة نبات الشباب من مصنع واحد وتجميدها في نيتروجين سائل فورا.
  2. طحن أنسجة نبات المجمدة في النتروجين السائل بقذائف الهاون والمدقة غرامة مسحوق.
  3. عزل الحمض النووي مع عزل الحمض النووي كيت (انظر الجدول للمواد)-
  4. ريسوسبيند تنقية عينات من الحمض النووي في 50 ميليلتر من يعقم مزدوجة منزوع ح 2 س (ddH 2 س) أو 1 × المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات (10 ملم تريس-HCl، 1 مم يدتا، درجة الحموضة 7.0).
  5. تركيزات "الحمض النووي التدبير" مع جهاز المطياف الضوئي (انظر الجدول للمواد)-
  6. تقييم 260 نيوتن متر/280 نانومتر ونسب نانومتر nm/230 260 من عينات الحمض النووي-
    ملاحظة: يجب أن يكون عينات الحمض النووي ذات جودة عالية نسبة نانومتر نانومتر 260/280 ≥ 1.8 ونسبة نانومتر 260 nm/230 ≥ 2.0.
  7. كذلك تقييم عينات من الحمض النووي من تشغيلها في 1% [اغروس] المواد الهلامية.
    ملاحظة: يجب أن يكون ارتفاع الوزن الجزيئي عينات الحمض النووي ذات جودة عالية ويجب أن لا تكون ملوثة بالجيش الملكي النيبالي. ومن الناحية المثالية، ينبغي أن يكون التركيز النهائي لعينات من الحمض النووي ~ 150 نانوغرام/ميليلتر.

3. تصنيف الحمض النووي وتنقية

  1. تمييع 1 ميكروغرام من الحمض النووي عينات مع ddH 2 س إلى وحدة تخزين نهائي من 20 ميليلتر في أنبوب الطرد مركزي 500 ميليلتر.
  2. إضافة 5 ميليلتر من التمهيدي عشوائية (انظر الجدول للمواد) إلى الأنبوبة.
  3. دوامة الأنبوب بإيجاز ووضعه في ثيرموسيكلير احتضان وتؤذي الحمض النووي عند 98 درجة مئوية للحد الأدنى 10
  4. اتخاذ أنبوب الخروج من ثيرموسيكلير ووضعها مباشرة في الماء المثلج لالبرد لأدنى 5
  5. وسم تحضير اثنين يمزج كما هو مبين في الجدول 1-
  6. الأنابيب إضافة 25 ميليلتر من وسم يمزج 1 و 2 إلى مرجع الحمض النووي وعينات الحمض النووي، على التوالي.
  7. مزيج مزيج التوسيم والحمض النووي من بيبيتينج ثلاث مرات، وتدور هذه الأنابيب بإيجاز-
  8. وضع الأنابيب في ثيرموسيكلير لاحتضان في 37 درجة مئوية ح 2، ثم في 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة لإلغاء تنشيط الإنزيم exo-كلينوو (انظر الجدول للمواد)-
  9. ميليلتر إضافة 430 1 × المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات لكل أنبوبة.
  10. خلط المحتويات وتدور هذه الأنابيب بإيجاز-
  11. نقل الحل في الأنبوب في عمود تنقية مع مجموعة 2 مل أنبوب (انظر الجدول للمواد)-
  12. أجهزة الطرد المركزي العمود تنقية في 14,000 س ز للحد الأدنى 10
  13. تجاهل بالمرور من خلال الحل.
  14. ميليلتر إضافة 480 1 × المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات لكل عمود.
  15. أجهزة الطرد المركزي العمود مرة أخرى في 14,000 س ز للحد الأدنى 10
  16. تجاهل الحل التمريري.
  17. نقل عينة الحمض النووي المسمى الذي ما زال في الجزء السفلي من العمود إلى أنبوب الطرد مركزي جديدة.
  18. قياس حجم عينة الحمض النووي المسمى باستخدام ماصة وإحضار وحدة التخزين النهائي ميليلتر 80 مع 1 × المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات-
  19. قياس تركيز عينة الحمض النووي المسمى باستخدام جهاز المطياف الضوئي (انظر الجدول للمواد)-
  20. ميكس مبلغ مساو من عينة المسمى الحمض النووي ومرجع الحمض النووي وإحضار وحدة التخزين النهائي إلى 160 ميليلتر مع 1 × المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات-
  21. ميليلتر إضافة 256 2 x التهجين المخزن المؤقت, 50 ميليلتر من "الحمض النووي" البشري عند استخدام سرير-1 و 50 ميليلتر من عامل حظر أكغ 10 × (انظر الجدول للمواد) ومزجها جيدا قبل بيبيتينج ثلاث مرات-
  22. تدور هذه الأنابيب بإيجاز ووضعها في ثيرموسيكلير لاحتضان عند 98 درجة مئوية للحد الأدنى 10
  23. احتضان هذه الأنابيب عند 37 درجة مئوية عن 20 دقيقة

4. التهجين، الغسل، والمسح الضوئي من "صفائف الجينوم"

  1. الحارة قبل الفرن التهجين إلى ح 67 درجة مئوية على الأقل 4 قبل بدء التهجين.
  2. ضع شريحة طوقا على قاعدة الدائرة التهجين.
  3. 490 تحميل ميليلتر من محلول التهجين من 3.23 خطوة على الشريحة طوقا.
  4. تغطي الشريحة طوقا مع شريحة فصة برميلية ميكرواري جينوم لتشكيل دائرة تهجين.
  5. وضعت على أغلفة الدائرة التهجين وتشديد الدائرة بحزم مع المشابك.
  6. وضعت الدائرة التهجين المجتمعون في الفرن التهجين واحتضان في 67 درجة مئوية ه 40-48.
  7. الشريحة تحضير ثلاثة غسل الصحون: اثنان مع 250 مل غسل العازلة حافظت في درجة حرارة الغرفة، وواحدة مع الغسيل المخزن المؤقت الثاني أبقى على 37 درجة مئوية.
  8. الشريحة تحضير اثنين الغسيل الجرار: أحدهما مع 70 مل الاسيتو الانيتريل والآخر مع 70 مل الاستقرار وحل التجفيف؛ والاحتفاظ بغطاء دخان في درجة حرارة الغرفة (انظر الجدول للمواد)-
  9. قم بإزالة الدائرة التهجين من الفرن والمشابك الدائرة والغطاء.
  10. نقل رقاقة ميكرواري وطوقا الشرائح إلى طبق غسيل شريحة مع المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي أنا وفصل الرقائق من الشريحة غلاف.
  11. نقل ميكرواري رقاقة لغسل الشريحة الثانية طبق مع المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي وأنا وتعمم بلطف الحل مع شريط ضجة في لوحة إثارة مغناطيسية في درجة حرارة الغرفة للحد الأدنى 5
  12. نقل ميكرواري شريحة إلى الشريحة الثالثة غسل الطبق مع الغسيل قبل حرارة المخزن المؤقت الثاني وغسله برفق مع شريط ضجة في لوحة إثارة مغناطيسية في 37 درجة مئوية للحد الأدنى 1
  13. نقل رقاقة ميكرواري إلى شريحة الغسيل جرة مع الاسيتو الانيتريل في غطاء دخان وغسله لمدة 30 س.
  14. نقل رقاقة ميكرواري إلى شريحة الغسيل جرة مع الاستقرار وتجفيف الحل وغسله لمدة 30 س.
  15. تأخذ بها الرقاقة ببطء والجافة للحد الأدنى 1
  16. تفحص رقاقة ميكرواري استخدام ماسح ضوئي (انظر الجدول للمواد) تحت 2 ميكرومتر القرار. تعيين معلمات لحفظ الصور ومسح الشريحة كاملة متعددة. تعيين القنوات المكاسب 1 و 2 إلى 100%، وإلغاء كسب السيارات-

5. تحليل بيانات CGH

  1. استخراج الأسفار Cy3 و Cy5 كثافة لكل مسبار على صفيف باستخدام برنامج المسح (انظر الجدول للمواد)-
  2. استخدام التحليل تجزئة البرنامج للكشف عن الاختلافات نسخة رقم (كنفس) بين عينات الحمض النووي والحمض النووي المرجعية. استخدم حدا لسجل يعني الجزء 2 نسبة العينة والمراجع ± 2.5 الانحرافات المعيارية لتحديد كنفس-
  3. تفقد توزيع نسب العينة والمراجع 2 سجل عبر الجينوم كله باستخدام برنامج رسم خرائط إشارة (انظر الجدول للمواد)-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويبين الشكل 2 توزيع نسب2 سجل تم تسويتها للمسخ مقابل إشارات WT عبر الجينوم كله. وكشف تحليل للبيانات CGH التقريبي الحذف 22 كيلو بايت على كروموسوم 4 تشمل الجينات السونة كامل33 والعديد غيرها المشروح الجينات في الطور FN6191 (الشكل 2و الشكل 3). وغطت المنطقة المحذوفة المرشح 73 تحقيقات متتالية في الصفيف مع نسب2 سجل طبيعية يعني أقل من-2.5 (تكميلية الجدول 1). واقترح إجراء تفتيش لحذف الحدود أن الحذف المفترضة في هذا المسخ هو يحف به المسابر الواقعة بين الإحداثيات 22,313,168 و 22,334,934 على كروموسوم 4 (الشكل 3). لتأكيد الحذف الحدود، [بكر] كبسولة تفجير مصممة لتكون تقريبا 1,500 بي بي وبصرف النظر عن حدود توقع الحذف (FN6191-DB-f: "جكتاجكاججتكتجكجكاجت"؛ جتاتكجاجاجتكتاتاجكاجك FN6191-DB-R:) وقد أنجز [بكر] تضخيم مع هذه الإشعال والمعلمات التالية: 94 درجة مئوية، 5 دقيقة؛ 94 درجة مئوية، 45 ثانية، 55 درجة مئوية، 30 ق، 72 درجة مئوية، 1.5 دقيقة؛ لدورات 35؛ 72 درجة مئوية، 10 دقيقة ثم 10 درجة مئوية إلى أجل غير مسمى. كما هو متوقع، اتسع نطاق منتج PCR واحد من 1.5 كيلو تقريبا بنجاح من المسخ FN6191، ولكن ليس بالوزن (الشكل 4 أ). استناداً إلى v3.5 الإفراج عن الجينوم برميلية م. ، قدر حجم الحذف في 6191 الجبهة الوطنية أن تكون 26.67 كيلو بايت (الشكل 4 باء). وأظهرت نتائج CGH لا شرائح شاذة أخرى موجودة في الجينوم FN6191 المسخ (الشكل 2).

Figure 1
الشكل 1: سير العمل من الصفيف التهجين الجينومي المقارن (أكغ) تحليلاً للمسخ برميلية م. . (أ) إعداد المواد النباتية: برميلية م. البرية نوع (A17 جيمالونج) والمسخ FN6191 كانت تزرع لمدة ثلاثة إلى أربعة أسابيع في الدفيئة. (ب) عزل الحمض النووي ذات جودة عالية: غرام واحد من الشباب أوراق النباتات واحدة استخدمت لعزل الحمض النووي. كان يحدد نوعية الحمض النووي باستخدام التفريد جهاز المطياف الضوئي وجل. (ج) الحمض النووي وسم وتنقية. كانت وصفت الجينوم السلطات الوطنية المعينة والعينات التجريبية مع 3 سيانيني (Cy3) واستخدام Cy5 وسم الحمض النووي كيت وتنقيته باستخدام عمود تنقية. (د) التهجين، الغسل، والمسح الضوئي من الصفيف CGH برميلية م. م 1 x 1. (ﻫ) CGH التحليل: تسجيل نسب2 الإشارات التجريبية والمراجع التي تكون أقل من أو يساوي إلى-2.5 أو أكبر من أو يساوي 2.5 تعتبر كالحذف المفترضة والازدواجية، على التوالي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2: الصفيف على أساس تحليل التهجين الجينومي المقارن لنسخ عدد الاختلافات في المسخ نودوليشن فرط برميلية م. FN6191- يظهر سجل نسب نوع المسخ/وايلد2 من إجراء تحقيقات في جميع الكروموسومات ثمانية. واعتبرت منطقة 73-المسبار على التوالي على كروموسوم 4 المنطقة المحذوفة في المسخ (السهم). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3. تحديد المنطقة المحذوفة في المسخ برميلية م. FN6191- عرض عن قرب للمنطقة على كروموسوم 4، التي أظهرت 73 ميكرواري المسابر إلى حد كبير انخفاض نسب نوع المسخ/وايلد2 سجل، وتعيين ستة الجينات بما في ذلك الصنجية (Medtr4g070970). تشير الأسهم إلى موقع واتجاه كبسولة تفجير للتضخيم PCR لحذف الحدود. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: تأكيد حذف الحدود في المسخ برميلية م. FN6191- (A) بكر التضخيم لحذف الحدود: منتج 1.5 كيلو بايت تم تضخيمه من المسخ FN6191 استخدام كبسولة تفجير المرافقة حدود الحذف (لين 1؛ مو). عدم تضخيم نفس مجموعة من الإشعال أي منتجات من وزن (برميلية م. جيمالونج A17) بسبب وجود قيود على حجم بكر (لين 2؛ وزن). لين م، سلم 1 كيلو بايت. (ب) تسلسل من مفرق الحذف في المسخ FN6191. سهم يشير إلى تقاطع الحذف. (ج) ترتيب النتائج أظهرت أن حدود الحذف (الأسهم) تقع في الإحداثيات 22309163 و 22335836 على كروموسوم 4. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

وسم ميكس 1 كل رد فعل العينة x # (ميكروليتر) وسم ميكس 2 كل رد فعل x مرجع # (ميكروليتر)
ddH2س 6.0 x ddH2س 6.0 x
5 x المخزن المؤقت 10.0 x 5 x المخزن المؤقت 10.0 x
10 x dNTPs 5.0 x 10 x dNTPs 5.0 x
سيانيني 5 3.0 x سيانيني 3 3.0 x
أكسو-كلينوو 1.0 x أكسو-كلينوو 1.0 x
المجموع 25 x المجموع 25 x

الجدول 1: تصنيف يمزج.

تكميلية الجدول 1: حذف تسلسل التحقيق في برميلية م. FN6191 المسخ.
الرجاء انقر هنا لتحميل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

لقد قمنا بتطوير منصة CGH المستندة إلى الصفيف للكشف ووصف القصف النيوترونات السريعة (ليبونن)-التي يسببها طفرات في عام م. برميلية A17 جيمالونج. للتدليل على استخدام صفيف الأسلوب CGH في الكشف عن الطفرات الجينية، أجرينا تحليلاً أكغ للمسخ FN6191، التي عرضت النمط الظاهري فرط نودولاتيون خلافا للنباتات البرية نوع، عند تلقيح مع الرايزوبيوم س. Sm1021. لتحليل تجزئة، اعتبرت شريحة كبيرة إذا كان يعني أن نسبة2 سجل للتحقيقات داخل الجزء كان فوق العتبة العليا أو أدنى من عتبة أدنى لأن مقارنة المصفوفة المعطاة. العتبة العليا لكل مقارنة عازمة على أن تكون قيمة نسبة2 سجل المئين الخامس والتسعين من كافة نقاط البيانات. الحد الأدنى لكل مقارنة عازمة على قيمة نسبة2 سجل المئين الخامس من كافة نقاط البيانات24.

أظهر التحليل أن تغيير رقم نسخة كبيرة يمكن تحديده من خلال استرداد شرائح مع2 سجل تطبيع متوسط نسبة أكبر من المتوسط من 2.5 SD (الازدواجية) أو أقل من المتوسط من 2.5 SD (الحذف). استناداً إلى تحليل CGH، اكتشفنا منطقة حذف مع المقدرة بحجم 22 كيلوبايت على كروموسوم 4، تشمل الجينات السونة 33. ترتيب نتائج أكدت أن حجم الحذف 26.67 كيلو بايت استناداً إلى برميلية م. الجينوم الإصدار v3.5. لقد ثبت أن السونة ترميز كيناز مستقبلات تكرار لوسين الغنية مثل CLV1 التي تتحكم في عدد العقيدات في برميلية م.33. تشير نتائجنا CGH FN6191 اليل الصنجية جديدة. وبناء على هذه النتائج، نحن مسبب أن الأسلوب CGH مقترنة بالمظهرية والتحليل الوراثي يمكن أن تستخدم بنجاح لسرعة تحديد الجينات المرشحة في طفرات الحذف ليبونن. على مدى السنوات العديدة الماضية، وقد استخدمنا هذا البرنامج في تحديد ووصف العديد من طفرات ليبونن لدراسات الجينات الوظيفية في34، برميلية م.35. ونحن قد ولدت قاعدة بيانات لنسخ عدد الاختلافات (كنفس) المرتبطة ب خطوط متحولة ليبونن36. في قاعدة البيانات هذه، أكد متواليات المحذوفة من تحليلات CGH لما يزيد على 100 تم تعيينها طفرات نودولاتيون التكافلية للجينوم برميلية م . خادم انفجار أنشئت لتسهيل البحث عن تسلسل المحذوفة في جمع المسخ. تطوير وتوسيع قاعدة الحذف ستكون قيمة للغاية لبحوث الجينوم الوظيفي باستخدام موارد متحولة ليبونن برميلية م. .

بروتوكول أكغ بخمس خطوات رئيسية. على الرغم من أن جميع الخطوات الهامة وينبغي أن يتم بعناية كما هو موضح سابقا، يلي أهمية خاصة: (1) عينات من الحمض النووي ينبغي لا تتحلل ولا تكون ملوثة بالجيش الملكي النيبالي خلال الخطوة إعداد؛ (2) مرجع واختبار عينات من الحمض النووي ينبغي أن تكون مستعدة بشكل جيد على قدم المساواة حيث تكون العينات مسماة من نفس نوعية عالية؛ (3) عينات من الحمض النووي المسمى لا ينبغي أن تتعرض لكثافة عالية من الضوء ودرجة عالية من الأوزون؛ وهو (4) من المهم الاحتفاظ "المخزن المؤقت الثاني غسل" عند 37 درجة مئوية خلال الخطوة الغسيل.

تغطية برميلية م. الجينوم الصفيف الحالي أساسا في منطقتي اكسونيك وأقل في مناطق إينترونيك، وليس على الإطلاق في المناطق إينتيرجينيك. ويمكن تحسين التغطية في المناطق الأخيرة إذا كانت الآفات في هذه المناطق الهامة لتعمل المسخ. من ناحية أخرى، تصميم المسبار الحالي لديه طاقة أقل في تحديد الطفرات الصغيرة ومجمع الأشكال المتعددة النوكليوتيدات واحدة (المشاع). ويمكن التغلب على هذا القيد باستخدام CGH + SNP ميكرواري تصميم37. عموما، منهاج الجينوم التهجين الجينومي المقارن القائم على مجموعة (أكغ) هي أداة قوية لتحليل عدد النسخ والتغيرات الهيكلية في طفرات ليبونن برميلية م .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب يعلن لا تضارب المصالح المالية.

Acknowledgments

هذا العمل هو توفير التمويل جزئيا بمنحه من "جبهة الخلاص الوطني محطة أبحاث الجينوم" (دائرة الرقابة الداخلية--1127155).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Medicago truncatula genome array, 1 x 1 M Agilent G4123A
Medicago truncatula FN6191 (mutant) In house FN6191
Medicago truncatula Jemalong A17 (reference) In house A17
Sulfuric acid Sigma-Aldrich 320501
DNeasy Plant Mini Kit Qiagen 69104
Nanodrop Spectrophotometer Thermo Scientific 1000D
SureTag DNA Labeling Kit Agilent 5190-3400
Random primer Agilent 5190-3399
Acetonitrile Sigma-Aldrich 271004-1L
Thermocycler MJ research PTC-200
Centrifuge Labnet international Inc Spectrafuge 24D
Stabilization and Drying Solution Agilent 5185-5979
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Hybridization Kit Agilent 5188-5380
Hybridization Chamber gasket slides Agilent G2505
Human Cot-1 DNA Agilent 5190-3393
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 1 and 2 Agilent 5188-5221
Hybridization Chamber, stainless Agilent G2534A
Hybridization oven Agilent G2545A
Purification Columns Agilent 5190-3391
Laser scanner Roche MS200
NimbleScan 2.6 Roche Nimblegen 5225035001
Signal Map 1.9 Roche Nimblegen Signalmap1.9

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tang, H., et al. An improved genome release (version Mt4.0) for the model legume Medicago truncatula. BMC Genomics. 15, 312 (2014).
  2. Young, N. D., et al. The Medicago genome provides insight into the evolution of rhizobial symbioses. Nature. 480 (7378), 520-524 (2011).
  3. Wang, H., Li, G., Chen, R. Fast neutron bombardment (FNB) induced deletion mutagenesis for forward and reverse genetic studies in plants. Floriculture, Ornamental and Plant Biotechnology: Advances and Topical Issues. da Silva, J. T. , 1st ed, Global Science Books. Isleworth, UK. 629-639 (2006).
  4. Rogers, C., Wen, J., Chen, R., Oldroyd, G. Deletion-based reverse genetics in Medicago truncatula. Plant Physiol. 151 (3), 1077-1086 (2009).
  5. Alonso, J. M., et al. Five components of the ethylene-response pathway identified in a screen for weak ethylene-insensitive mutants in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (5), 2992-2997 (2003).
  6. Silverstone, A. L., Ciampaglio, C. N., Sun, T. The Arabidopsis RGA gene encodes a transcriptional regulator repressing the gibberellin signal transduction pathway. Plant Cell. 10 (2), 155-169 (1998).
  7. Li, X., Lassner, M., Zhang, Y. Deleteagene: a fast neutron deletion mutagenesis-based gene knockout system for plants. Comp Funct Genomics. 3 (2), 158-160 (2002).
  8. Bolon, Y. T., et al. Phenotypic and genomic analyses of a fast neutron mutant population resource in soybean. Plant Physiol. 156 (1), 240-253 (2011).
  9. Men, A. E., et al. Fast Neutron Mutagenesis of Soybean (Glycine soja L.) Produces a Supernodulating Mutant Containing a Large Deletion in Linkage Group H. Genome Letters. 1 (3), 147-155 (2002).
  10. Hoffmann, D., Jiang, Q., Men, A., Kinkema, M., Gresshoff, P. M. Nodulation deficiency caused by fast neutron mutagenesis of the model legume Lotus japonicus. J Plant Physiol. 164 (4), 460-469 (2007).
  11. Li, X., et al. A fast neutron deletion mutagenesis-based reverse genetics system for plants. Plant J. 27 (3), 235-242 (2001).
  12. Bourcy, M., et al. Medicago truncatula DNF2 is a PI-PLC-XD-containing protein required for bacteroid persistence and prevention of nodule early senescence and defense-like reactions. New phytol. 197 (4), 1250-1261 (2013).
  13. Chen, J., et al. Control of dissected leaf morphology by a Cys(2)His(2) zinc finger transcription factor in the model legume Medicago truncatula. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (23), 10754-10759 (2010).
  14. Ge, L., et al. Increasing seed size and quality by manipulating BIG SEEDS1 in legume species. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (44), 12414-12419 (2016).
  15. Kalo, P., et al. Nodulation signaling in legumes requires NSP2, a member of the GRAS family of transcriptional regulators. Science. 308 (5729), 1786-1789 (2005).
  16. Oldroyd, G. E., Long, S. R. Identification and characterization of nodulation-signaling pathway 2, a gene of Medicago truncatula involved in Nod actor signaling. Plant Physiol. 131 (3), 1027-1032 (2003).
  17. Peng, J., et al. Regulation of compound leaf development in Medicago truncatula by fused compound leaf1, a class M KNOX gene. Plant Cell. 23 (11), 3929-3943 (2011).
  18. Tsujimoto, Y., et al. Arabidopsis TOBAMOVIRUS MULTIPLICATION (TOM) 2 locus encodes a transmembrane protein that interacts with TOM1. EMBO J. 22 (2), 335-343 (2003).
  19. Wang, D., et al. A nodule-specific protein secretory pathway required for nitrogen-fixing symbiosis. Science. 327 (5969), 1126-1129 (2010).
  20. Bejjani, B. A., Shaffer, L. G. Application of array-based comparative genomic hybridization to clinical diagnostics. J Mol Diagn. 8 (5), 528-533 (2006).
  21. Emerson, J. J., Cardoso-Moreira, M., Borevitz, J. O., Long, M. Natural selection shapes genome-wide patterns of copy-number polymorphism in Drosophila melanogaster. Science. 320 (5883), 1629-1631 (2008).
  22. Gong, J. M., et al. Microarray-based rapid cloning of an ion accumulation deletion mutant in Arabidopsis thaliana. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (43), 15404-15409 (2004).
  23. Guryev, V., et al. Distribution and functional impact of DNA copy number variation in the rat. Nat Genet. 40 (5), 538-545 (2008).
  24. Haun, W. J., et al. The composition and origins of genomic variation among individuals of the soybean reference cultivar Williams 82. Plant Physiol. 155 (2), 645-655 (2011).
  25. Infante, J. J., Dombek, K. M., Rebordinos, L., Cantoral, J. M., Young, E. T. Genome-wide amplifications caused by chromosomal rearrangements play a major role in the adaptive evolution of natural yeast. Genetics. 165 (4), 1745-1759 (2003).
  26. Jones, M. R., Maydan, J. S., Flibotte, S., Moerman, D. G., Baillie, D. L. Oligonucleotide Array Comparative Genomic Hybridization (oaCGH) based characterization of genetic deficiencies as an aid to gene mapping in Caenorhabditis elegans. BMC Genomics. 8, 402 (2007).
  27. Lakshmi, B., et al. Mouse genomic representational oligonucleotide microarray analysis: detection of copy number variations in normal and tumor specimens. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (30), 11234-11239 (2006).
  28. Mitra, R. M., et al. A Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase required for symbiotic nodule development: Gene identification by transcript-based cloning. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (13), 4701-4705 (2004).
  29. Rios, G., et al. Characterization of hemizygous deletions in citrus using array-comparative genomic hybridization and microsynteny comparisons with the poplar genome. BMC Genomics. 9, 381 (2008).
  30. Skvortsov, D., Abdueva, D., Stitzer, M. E., Finkel, S. E., Tavare, S. Using expression arrays for copy number detection: an example from E. coli. BMC Bioinformatics. 8, 203 (2007).
  31. Werner, J. D., et al. Quantitative trait locus mapping and DNA array hybridization identify an FLM deletion as a cause for natural flowering-time variation. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (7), 2460-2465 (2005).
  32. Xi, J., Chen, Y., Nakashima, J., Wang, S. M., Chen, R. Medicago truncatula esn1 defines a genetic locus involved in nodule senescence and symbiotic nitrogen fixation. Mol Plant Microbe Interact. 26 (8), 893-902 (2013).
  33. Schnabel, E., Journet, E. P., de Carvalho-Niebel, F., Duc, G., Frugoli, J. The Medicago truncatula SUNN gene encodes a CLV1-like leucine-rich repeat receptor kinase that regulates nodule number and root length. Plant Mol Biol. 58 (6), 809-822 (2005).
  34. Horvath, B., et al. Loss of the nodule-specific cysteine rich peptide, NCR169, abolishes symbiotic nitrogen fixation in the Medicago truncatula dnf7 mutant. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (49), 15232-15237 (2015).
  35. Kim, M., et al. An antimicrobial peptide essential for bacterial survival in the nitrogen-fixing symbiosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (49), 15238-15243 (2015).
  36. Noble Research Institute. Medicago truncatula Mutant Database. , Available from: https://medicago-mutant.noble.org/mutant/FNB.php (2017).
  37. Burton, R. SNP genotyping with the next generation of CGH microarray. MLO Med Lab Obs. 45 (7), (2013).

Tags

علم الوراثة، ومسألة 129، فصة برميلية، طفرات القصف النيوترونات السريعة، التهجين الجينومي المقارن المستندة إلى الصفيف، نسخ تباين عدد، والكشف عن الطفرة، والطفرة
المستندة إلى صفيف "مقارنة الجينوم التهجين منصة" "الكشف عن كفاءة من نسخ عدد الاختلافات" في طفرات "سريعة النيوترون" المستحثة <em>فصة برميلية</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, Y., Wang, X., Lu, S., Wang,… More

Chen, Y., Wang, X., Lu, S., Wang, H., Li, S., Chen, R. An Array-based Comparative Genomic Hybridization Platform for Efficient Detection of Copy Number Variations in Fast Neutron-induced Medicago truncatula Mutants. J. Vis. Exp. (129), e56470, doi:10.3791/56470 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter