Summary
Bu iletişim kuralı kopya numarası değişimler tüm genom dizi tabanlı Karşılaştırmalı genomik hibridizasyon (CGH) analizi yürütmektedir ilgilenen araştırmacılar için deneysel adımlar ve reaktifler, ekipman ve çözümleme araçları hakkında bilgi sağlar bitkiler.
Abstract
Mutant gen işlevi çalışmalar için çok değerli genetik kaynaklardır. Mutant koleksiyonları oluşturmak için üç tür mutajen, dahil olmak üzere biyolojik T-DNA veya transposon gibi etil methanesulfonate (EMS) gibi kimyasal ya da fiziksel iyonlaşma radyasyonu gibi yararlı olabilir. Gözlenen mutasyon türü kullanılan alkil bağlı olarak değişir. İyonlaşma radyasyonu indüklenen mutantlar için silme, kopyalama veya yeniden mutasyonlar içerir. T-DNA veya mutagenesis transposon tabanlı dönüştürme için duyarlı türler için sınırlı olmakla birlikte, kimyasal veya fiziksel mutagenesis çok çeşitli türler için uygulanabilir. Ancak, geleneksel olarak kimyasal ve fiziksel mutagenesis türetilmiş mutasyonlar karakterizasyonu emek yoğun ve zaman alıcı olan bir harita tabanlı klonlama yaklaşım, dayanır. İşte, bir yüksek yoğunluklu genom Karşılaştırmalı genomik hibridizasyon (aCGH) dizi tabanlı platform etkili bir şekilde algılamak ve kopya numarası değişimler (CNVs) hızlı nötron bombardımanı (FNB) mutagenesis türetilen mutantlar karakterize uygulanabilir olduğunu göstermektedir Medicago truncatula, baklagil türler. Tüm genom dizi analizi orada 50.000'den fazla gen veya gen modellerin M. truncatulagöstermektedir. M. truncatula mevcut, FNB kaynaklı mutantlar, genom genlerin fonksiyonel çalışmalar için çok değerli genetik kaynakları temsil eden 150.000'den fazla M1 satırları türetilir. Burada açıklanan aCGH platformu FNB kaynaklı mutantlar M. truncatulaolarak karakterize için etkili bir araçtır.
Introduction
Baklagiller (baklagiller) soya (Glycine max) ve yonca (Medicago sativa) gibi pek çok ekonomik açıdan önemli türler ile çiçekli bitkilerin üçüncü büyük aile vardır. Baklagil bitkileri genellikle hangi atmosferik diazot amonyak kullanmak için ana bitki tarafından azalır kök nodüller geliştirmeye Rhizobia adlandırılan toprak bakteriler, azot sabitleme ile etkileşim kurabilir. Bu nedenle, baklagil bitkileri ekimi azot gübreler küçük giriş gerektirir ve böylece sürdürülebilir tarım için katkıda bulunur. Baklagil bitkileri yaprak ve tohum mükemmel yem ve tahıl ürünleri hizmet veren yüksek protein içerikli üretmek. Ancak, ekili baklagil türler genellikle karmaşık genom yapıları, baklagil özgü süreçlerinde hantal kilit rolü oynamak genlerin fonksiyonel çalışmalar yapma var. Öncelikle (1) bu nispeten küçük haploit genom büyüklüğündeki (~ 550 Mbp); ile diploit genom olduğundan Medicago truncatula yaygın bir modeli tür baklagil çalışmaları olarak kabul edilmiştir (2) bitkiler stabil gen fonksiyonel çalışmalar için dönüştürülebilir; ve (3) BT yonca (M. sativa), yemleri kraliçesi ve çevirim çalışmaları için pek çok ekonomik açıdan önemli bitkileri yakından ilgilidir. Son zamanlarda, genom dizisi M. truncatula cv Jemalong A17 yayımlanan1,2oldu. Orada 50.000'den fazla tahmin edilen gen veya gen modellerin genom genom kopyası ek açıklama göstermektedir. M. truncatula genlerinde çoğunun işlevi belirlemek için genom zorlu bir iştir. Genlerin fonksiyonel çalışmaları kolaylaştırmak için hızlı nötron bombardımanı (FNB) mutagenesis M. truncatula cv kullanarak kapsamlı bir koleksiyon 150.000 M1 satır aralığındaki mutantların oluşturuldu Jemalong A173 ,4. Hızlı nötron, yüksek enerji iyonlaşma alkil mutantlar Arabidopsis5,6, pirinç (Oryza sativa)7, domates (Solanum dahil olmak üzere birçok bitki türü oluşturmak için kullanılan lycopersicum), soya (Glycine soya; G. max)8,9, arpa (Hordeum vulgare) ve Lotus japonicus10. FNB mutagenesis türetilmiş mutasyonlar büyük bir bölümünü bu aralığı mega baz çifti9,11birkaç baz çiftinden boyutunda DNA silme nedeniyle vardır. Birçok fenotip ilişkili genlerin başarıyla olmuştur tespit ve4,12,13,14,15,16, ile karakterize 17 , 18 , 19. daha önce FNB mutantlar üzerinden temel genlerin Moleküler klonlama zaman alıcıdır ve moleküler düzeyde karakterize edilebilir mutantlar sayısını sınırlar harita dayalı yaklaşım dayanıyordu. Son zamanlarda, transkript tabanlı yöntemleri de dahil olmak üzere birkaç ücretsiz yaklaşım dizi tabanlı Karşılaştırmalı genomik hibridizasyon (CGH) DNA kopyalama numara varyasyon algılama ve tüm genom sıralama, fayans genom istihdam kolaylaştırmak için silme mutant hayvanlar ve bitkiler20,21,22,23,24,25de dahil olmak üzere çeşitli organizmalarda karakterizasyonu, 26,27,28,29,30,31.
M. truncatula, bir bütün-genom dizi tabanlı Karşılaştırmalı genomik hibridizasyon (CGH) FNB mutantlar karakterizasyonu kolaylaştırmak için platform geliştirilen doğrulanmış ve. Hayvan sistemlerinde bildirildiği gibi dizi tabanlı CGH platformu kopya numarası varyasyonları (CNVs) M. truncatula FNB mutantlar tüm genom düzeyindeki algılama sağlar. Ayrıca, lezyonlar PCR tarafından onaylanabilir ve silme sınırları sıralama tarafından belirlenebilir. Genel olarak, dizi CGH platformu M. truncatula FNB mutantlar lezyonlarının belirlenmesinde bir verimli ve etkili bir araçtır. Burada, dizi CGH yordam ve M. truncatula FNB mutant silme sınırların karakterizasyonu PCR gösterilmiştir.
Aşağıdaki iletişim kuralı tüm genom dizi tabanlı Karşılaştırmalı genomik hibridizasyon (CGH) analizi kopya sayının yerine getirirken ilgilenen araştırmacılar için deneysel adımlar ve reaktifler, ekipman ve çözümleme araçları hakkında bilgi sağlar bitkiler değişimler. Örnek olarak, Medicago truncatula FN6191 mutant silme bölgeler ve aday genleri mutasyona uğramış fenotipleri ile ilişkili tanımlamak için kullanıldı. M. truncatula FN6191 mutant, başlangıçta bir hızlı nötron bombardımanı kaynaklı silme mutant koleksiyonu32 izole (bakınız Tablo malzemeler), sergilenen bir hiper-nodulation fenotip toprak ile aşı sonra bakteri, vahşi türü bitkilerin aksine Sihorhizobium meliloti Sm1021.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Not: şekil 1 gösterir dizi CGH protokolü için beş adım. Bunlar: 1) hazırlık bitki malzeme; 2) yüksek kalitede DNA örnekleri izole; 3) etiketleme ve DNA örnekleri arıtma; 4) hibridizasyon, yıkama ve tüm genom dizileri tarama; ve 5) CGH veri analizi. M. truncatula tüm genom döşeme dizileri 971,041 benzersiz oligo probları 50.000'den fazla gen veya gen modellerin genom (bkz: tablo malzemelerin) hedefleme toplam içerir. Benzersiz probları aralıklandırılmış yaklaşık olarak her 150 baz çifti (bp) eksonik bölgelerde ve 261 M. truncatula genom intronic bölgelerinde bp.
1. bitki hazırlık malzemeleri
- Scarify vahşi türü (WT; M. truncatula cv Jemalong A17) ve FN6191 mutasyona uğramış tohum 8 min için konsantre sülfürik asit ile (bkz. Tablo malzeme). Kaldırmak ve sülfürik asit bir sıvı atık kabına atın.
- Üç kez tohum autoclaved deiyonize suyla durulayın.
- Yüzey sterilize tohumlar 10 dakika süreyle % 20 çamaşır suyu Çözümle
- Üç kez tohum autoclaved deiyonize suyla durulayın.
- 3 gün boyunca 4 ° C'de mağaza tohum. Vernalization sonra aktarmak ve bir hafta içinde bir büyüme odası ile 16 h/8 h ışık ışık/karanlık döngüsü ve 150 µE/m 2 /s yoğunluğu için toprakta tohum çimlenme.
- 1 galon tencere fidan nakli ve onları bir sera ile 16 h/8 h açık/koyu devir, 150 µE/m 2 /s ışık şiddeti üç ila dört hafta için büyümek. DNA izolasyonu için bitkilerden genç yaprak örnekleri toplamak.
2. Yüksek kaliteli DNA örnekleri izolasyon
- 1 g genç yaprak doku tek bir bitki üzerinden alıp hemen sıvı azot dondur.
- Donmuş yaprak doku harcı ve havaneli toz ince ayar yapmak için sıvı azot eziyet.
- İzole genomik DNA ile DNA izolasyon Kiti (Tablo malzemeleri görmek).
- Resuspend saf DNA örneklerinde autoclaved Çift Kişilik deiyonize H 2 O 50 µL (GKD 2 O) veya 1 x TE arabellek (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,0).
- Ölçü DNA konsantrasyonları bir Spektrofotometre ile (bkz. Tablo reçetesi).
- Değerlendirmek 260 nm/280 nm ve 260 nm/230 nm oranları DNA örneklerinin.
Not: Yüksek kaliteli DNA örnekleri 260 nm/280 nm oranına sahip olması ≥ 1.8 ve 260 nm/230 nm oranı ≥ 2.0. - Daha fazla % 1'özel jelleri çalıştırarak DNA örnekleri değerlendirmek.
Not: Yüksek kaliteli DNA örnekleri yüksek molekül ağırlıklı olmalıdır ve RNA tarafından kontamine değil. DNA örnekleri son konsantrasyonu ~ 150 ng/µL ideali.
3. DNA etiketleme ve arıtma
- seyreltik 1 µg genomik DNA örnekleri GKD 2 O 20 µL 500 µL santrifüj tüpü son hacmiyle birlikte.
- Ekleyin 5 µL rasgele bir astar (Tablo malzemeleri görmek) tüp.
- Girdap kısaca tüp ve kuluçkaya ve 10 dakika süreyle 98 ° C'de DNA tabiatını bir thermocycler içine koydu
- Tüp thermocycler dışarı almak ve hemen buzlu su için 5 dk. sakinleşmesini söyle
- Hazırlama iki etiketleme karışımları Tablo 1 ' de gösterildiği gibi.
- Sırasıyla Ekle 25 µL maddelerinin etiketlenmesi karışımları 1 ve 2 için başvuru DNA ile örnek tüpü.
- Etiketleme mix ve DNA üç kez pipetting tarafından mix ve tüpler kısaca spin.
- Tüpler 37 ° C 2 h için ve daha sonra 65 ° C exo-Klenow enzim devre dışı bırakabilirsiniz için 20 dakika için kuluçkaya için bir thermocycler içine koymak (Tablo malzemeleri görmek).
- 430 eklemek µL her tüp TE arabelleğe x 1.
- İçeriği mix ve tüpler kısaca spin.
- 2 mL koleksiyonu ile bir arıtma sütununa tüp çözümde tüp (Tablo malzemeleri görmek) transfer.
- Santrifüj arıtma sütun 14.000 x g 10 dakika süreyle
- Çözüm geçisi atın.
- Ekle 480 µL 1 x TE arabellek her sütun için.
- Santrifüj tekrar 10 dakika süreyle 14.000 x g adresindeki sütun
- Doğrudan çözüm atın.
- Yeni bir santrifüj tüpü için sütunun alt kısmında kalır etiketli DNA örneği transfer.
- Bir pipet kullanarak etiketli DNA örneği hacmi ölçmek ve 1 x TE arabellek ile 80 µL son hacim getirmek.
- Bir Spektrofotometre kullanarak etiketli DNA örneği konsantrasyonu ölçmek (Tablo malzemeleri görmek).
- Etiketli örnek DNA eşit miktarda karıştırın ve DNA başvuru ve 1 x TE arabellek ile 160 µL son hacim getirmek.
- 2 x hibridizasyon tampon, insan karyolası-1 DNA'ın 50 µL ve 50 µL 10 × aCGH engelleme Aracısı eklemek 256 µL (Tablo malzemeleri görmek) ve onları iyi için üç kez pipetting tarafından mix.
- Kısaca tüpler spin ve 10 dakika süreyle 98 ° C'de kuluçkaya için bir thermocycler içine koydu
- Tüpler 20 dk. 37 ° C'de kuluçkaya
4. Hibridizasyon, yıkama ve tarama genom dizileri
- 67 ° C en az 4 h hibridizasyon başlamadan önce hibridizasyon fırın önceden ısıtmak.
- Bir conta slayt hibridizasyon odasının tabanının üzerine yerleştirin.
- Yük 490 µL conta slayt üzerine adım 3.23 üzerinden hibridizasyon çözüm.
- Kapak conta slayt hibridizasyon odası kurmaya Medicago truncatula genom Mikroarray çip ile.
- Hibridizasyon odası kapakları üzerinde koymak ve odası sıkıca kelepçeler ile sıkın.
- Birleştirilmiş hibridizasyon Hibridizasyon fırın odasına koy ve 40-48 h. için 67 ° C'de kuluçkaya
- Bulaşık hazırla üç slayt: 250 mL arabellek yıkama ile iki oda sıcaklığında muhafaza ve arabellek II yıkama ile bir tutulan 37, ° C.
- Hazırlama iki slayt kavanoz yıkama: biri 70 mL Asetonitril ile ve diğeri 70 mL istikrar ve kurutma çözüm; tutun oda sıcaklığında bir duman Hood (Tablo malzemeleri görmek).
- Hibridizasyon odası fırından çıkarın ve odası kelepçeler ve kapak kaldırma.
- Mikroarray chip ve conta ben slayt için slayt çamaşır bulaşık yıkama arabelleği ile ve çip kapak slayttan ayrı hareket.
- Mikroarray chip ikinci slayt çamaşır taşıma bulaşık yıkama arabellek ile ben ve yavaşça dolaşımda bir heyecan bar, oda sıcaklığında 5 dakika süreyle manyetik heyecan tabakta Çözümle
- Mikrodizi Önceden ısıtılmış çamaşır arabelleği II ile bulaşık yıkama üçüncü slayt için chip ve 1 dk. 37 ° C'de bir manyetik heyecan plaka üzerinde bir heyecan çizgiyle nazikçe yıkayın transfer
- İçin 30 yıkayın ve kavanoz Asetonitril duman Hood ile yıkama bir slayt Mikroarray çip transfer s.
- Mikroarray çip kavanoz sabitleme ile yıkama ve kurutma çözüm bir slayt için transfer ve 30 için yıkayın s.
- Çip biraz ağırdan ve 1 dk. kuru
- İnceden inceye gözden geçirmek bir tarayıcı kullanarak Mikroarray çip (Tablo malzemeleri altında 2 bakınız) µm çözünürlük. Birden çok görüntüyü kaydetmek ve inceden inceye gözden geçirmek tüm slayt için parametreleri ayarlayın. Kanal 1 ve 2 kazançları % 100'e ayarlayın ve otomatik kazanç iptal.
5. CGH veri analizi
- özü Cy3 ve Cy5 floresan yoğunluklarda her sonda üzerinde tarama yazılımı kullanarak dizi için (bkz. Tablo reçetesi).
- Kullanım segment analizi kopya numarası varyasyonları (CNVs) örnek DNA ile başvuru arasında algılamak için belgili tanımlık bilgisayar yazılımı. CNVs belirlemek için bir eşik segment ortalama günlük 2 örnek/referans oranı ± 2,5 standart sapmalarının kullanın.
- Bir sinyal haritalama yazılımı kullanarak tüm genomu arasında günlük 2 örnek/başvuru oranları dağıtımını denetlemek (Tablo malzemeleri görmek).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 2 tüm genom normalleştirilmiş günlük2 oranları mutant WT sinyalleri karşı dağılımını gösterir. CGH veri analizi ortaya bir yaklaşık 22 kb silme tüm SUNN gen33 ve diğer kapsayan kromozom 4 üzerinde açıklamalı genlerinde FN6191 mutant (Şekil 2, şekil 3). Aday silinen bölge 73 ardışık probları dizi üzerinde ortalama normalleştirilmiş günlük2 oranları az-2.5 (ek tablo 1) ile kaplı idi. Teftiş silme sınırlarının koordinatları 22,313,168 ve kromozom 4 (şekil 3) üzerinde 22,334,934 arasında yer alan probları bu mutant sözde silme çevrili önerdi. Silme sınırları onaylamak için PCR astar yaklaşık 1.500 olmak tasarlanmıştır bp dışında öngörülen silme sınırları (FN6191-DB-F: GCTAGCAAGGGTCTGCGCAAGTT; FN6191-DB-R: GTATCGAGAAGGTCTTATAGCAGC) ve PCR güçlendirme gerçekleştirilen bu astar ve aşağıdaki parametreleri: 94 ° C, 5 min; 94 ° C, 45 s, 55 ° C, 30 s, 72 ° C, 1,5 dk; 35 döngüleri için; 72 ° C, 10 min ve o zaman 10 ° C süresiz olarak. Beklendiği gibi yaklaşık 1,5 kb, tek PCR ürünü başarıyla FN6191 mutant ama WT (şekil 4A) güçlendirilmiş. M. truncatula genom yayın v3.5 üzerinde bağlı olarak, FN 6191 şekilde silinmesine boyutunu 26.67 kb (şekil 4B) olarak tahmin edildi. CGH sonuçları hiçbir anormal diğer kesimlerine FN6191 mutant genom (Şekil 2) olduğunu gösterdi.
Resim 1: İş akışını M. truncatula mutant dizi Karşılaştırmalı genomik hibridizasyon (aCGH) analizi ve. (A)hazırlık bitki malzeme: M. truncatula vahşi türü (Jemalong A17) ve FN6191 mutant yetişkin üç ila dört hafta için serada. (B) yalıtım kaliteli genomik DNA'ın: bir genç tek bitki yapraklarından gram genomik DNA izole etmek için kullanıldı. DNA kalite Spektrofotometre ve Jel Elektroforez kullanarak tespit edilmiştir. (C) DNA etiketleme ve arıtma. Başvuru ve deneysel örnekler genomik DNA'lar siyanür 3 (Cy3) ve Cy5 kullanarak ile kit ve arıtma sütun kullanarak saf DNA etiketleme etiketli. (D) hibridizasyon, yıkama ve 1 x 1 M M. truncatula CGH dizi tarama. (E) CGH analizi: oturum-2.5 eşit veya daha az olan deneysel/referans sinyalleri2 oranları veya sıfırdan büyük veya eşit 2,5 sözde silme ve mükerrer, anılan sıraya göre değerlendirilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2: Dizi M. truncatula hiper nodulation mutant FN6191 kopya numarası değişimleri Karşılaştırmalı genomik hibridizasyon analizi dayalı. Günlük2 mutant/vahşi türü oranları probları tüm sekiz kromozom toplam üzerinde gösterilmiştir. Kromozom 4 bir ardışık 73-sonda bölge mutant (ok) silinen bölge olarak tespit edilmiştir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3. M. truncatula FN6191 mutant silinen bölgede tanımlaması. Günlük2 mutant/vahşi türü oranları içinde önemli ölçüde 73 Mikroarray probları sergilenen yakından görmek bölge kromozom 4, üzerinde azaltılmış ve altı SUNN (Medtr4g070970) de dahil olmak üzere genler eşleştirilmiş. Oklar astar için PCR güçlendirme silme sınırlarının yönünü ve konumunu gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: Silme onayı sınırları içinde M. truncatula FN6191 mutant. (A) PCR güçlendirme silme sınırlarının: 1,5 kb ürün silme sınırları (lane 1; kanat primerler kullanılarak FN6191 mutant güçlendirilmiş Mu). Astar aynı kümesini WT (M. truncatula Jemalong A17) herhangi bir Urun PCR (lane 2; bir boyut sınırlaması nedeniyle yükseltmek değil WT). Lane M, 1 kb merdiven. (B) dizisi silme Kavşağı'nda FN6191 mutant. Bir ok silme birleşim gösterir. (C) sonuçları sıralama gösterdi silme sınırları (oklar) kromozom 4 üzerinde 22309163 ve 22335836 koordinatları bulunur. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Mix 1 etiketleme | Reaksiyon başına x örnek # (μL) | Mix 2 etiketleme | Reaksiyon başına x # (μL) başvuru |
| GKD2O | 6.0 x | GKD2O | 6.0 x |
| 5 x arabellek | 10,0 x | 5 x arabellek | 10,0 x |
| 10 x dNTPs | 5.0 x | 10 x dNTPs | 5.0 x |
| Siyanür 5 | 3.0 x | Siyanür 3 | 3.0 x |
| EXO-Klenow | 1.0 x | EXO-Klenow | 1.0 x |
| Toplam | 25 x | Toplam | 25 x |
Tablo 1: Karışımları etiketleme.
Ek tablo 1: M. truncatula FN6191 mutant silinmiş dizileri sonda.
Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bir dizi tabanlı CGH platformu algılama ve hızlı nötron bombardımanı (FNB) karakterizasyonu için geliştirdiğimiz- M. truncatula cv. Jemalong A17 mutantlar indüklenen. Dizi içinde gen mutasyonlarının hafiye CGH yöntemi kullanımını göstermek için mutant S. meliloti Sm1021ile aşılanmış zaman vahşi türü bitkiler, aksine bir hiper-nodulation fenotip sergilenen FN6191 aCGH analizi yapılır. Segmentasyon analiz için bir kesimi, günlük2 oranı demek segmentte probları olsaydı o verilen dizi karşılaştırma için daha düşük eşik altında veya üstünde üst eşik önemli kabul edildi. Üst eşik her karşılaştırma için tüm veri noktalarının 95 persentil günlük2 oranı değeri olması konusunda kararlıydı. Daha düşük eşik her karşılaştırma için tüm veri noktaları245 yüzdelik günlük2 oranı değeri olması konusunda kararlıydı.
Bizim analiz önemli kopyalama sayı değişiklikleri olan bir ortalama normalleştirilmiş günlük2 oranı ortalama daha büyük kesimi tarafından 2.5 alarak belirlenebilir gösterdi SD (çoğaltma) veya daha az ortalama 2.5 tarafından SD (silme). CGH analizi dayalı, SUNN gen33kapsayan kromozom 4, üzerinde 22 kb bir tahmini boyutu ile bir silme bölge algıladı. Sonuçları sıralama silme boyutu 26.67 M. truncatula genom yayın v3.5 üzerinde dayalı kb olduğunu doğruladı. SUNN M. truncatula33içinde nodül sayısını kontrol altında tutar CLV1 benzeri lösin yönünden zengin tekrar reseptör kinaz kodlar gösterilmiştir. CGH sonuçlarımız FN6191 yeni bir SUNN alleli olduğunu göstermektedir. Bu sonuçlara dayanarak, biz gerekçeli CGH yöntemi ile birleştiğinde fenotipik ve genetik analiz başarıyla hızla aday genler FNB silme mutantlar olarak tanımlamak için kullanılabilir. Son birkaç yıl içinde ve çok sayıda FNB mutant gen işlevsel araştırmalar M. truncatula34,35karakterize bu platform kullandık. FNB mutant satırları36ile ilişkili kopya numarası varyasyonları (CNVs) bir veritabanı oluşturmuş. Bu veritabanı, simbiyotik nodulation mutantlar M. truncatula genom eşleştirilmiş olan 100'den fazla CGH analiz üzerinden silinmiş dizileri doğruladı. Mutant koleksiyonundaki silinmiş dizileri için arama kolaylaştırmak için bir patlama sunucusu kurulmuş olan. Geliştirme ve daha fazla genişleme silme veritabanının M. truncatula FNB mutant kaynakları kullanarak fonksiyonel genomik araştırma için son derece değerli olacaktır.
ACGH Protokolü beş önemli adımlar vardır. Her ne kadar tüm adımlar önemli ve dikkatli bir şekilde daha önce anlatıldığı gibi yapılmalıdır, aşağıdaki özellikle önemlidir: (1) DNA örnekleri değil bozulmuş ve RNA tarafından Hazırlık adımı sırasında; kontamine değil Etiketli örnekleri aynı yüksek kalitede olması (2) test ve referans DNA örnekleri-meli var olmak aynı derecede iyi hazırlanmış; (3) etiketli DNA örnekleri yüksek yoğunlukta ışık ve ozon yüksek düzeyde maruz değil; ve (4) o 37 ° C'de yıkama adımı sırasında arabellek II yıkama tutmanız önemlidir.
Geçerli M. truncatula genom dizisi kapsamında öncelikle eksonik bölgeler üzerinde olduğunu ve daha az intronic bölgelerinde ve hiç de intergenic bölgelerde. Bu bölgelerdeki lezyonları için mutant fenotipleri önemli ise ikinci bölgeler kapsamında geliştirilebilir. Öte yandan, sonda tasarım küçük mutasyonlar ve tek nükleotid polimorfizmleri (SNPs) belirlenmesinde daha az güç vardır. Bu sınırlama CGH + SNP Mikroarray tasarım37kullanarak üstesinden gelebilir. Genel olarak, genom Karşılaştırmalı genomik hibridizasyon (aCGH) dizi tabanlı platform kopya numarası ve M. truncatula FNB mutantlar yapısal değişimler analizi için güçlü bir araçtır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının bildirin.
Acknowledgments
Bu eser finansman bir grant tarafından kısmen NSF bitki genom araştırmaları (IOS-1127155) sağlanır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medicago truncatula genome array, 1 x 1 M | Agilent | G4123A | |
| Medicago truncatula FN6191 (mutant) | In house | FN6191 | |
| Medicago truncatula Jemalong A17 (reference) | In house | A17 | |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 320501 | |
| DNeasy Plant Mini Kit | Qiagen | 69104 | |
| Nanodrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | 1000D | |
| SureTag DNA Labeling Kit | Agilent | 5190-3400 | |
| Random primer | Agilent | 5190-3399 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004-1L | |
| Thermocycler | MJ research | PTC-200 | |
| Centrifuge | Labnet international Inc | Spectrafuge 24D | |
| Stabilization and Drying Solution | Agilent | 5185-5979 | |
| Oligo aCGH/ChIP-on-chip Hybridization Kit | Agilent | 5188-5380 | |
| Hybridization Chamber gasket slides | Agilent | G2505 | |
| Human Cot-1 DNA | Agilent | 5190-3393 | |
| Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 1 and 2 | Agilent | 5188-5221 | |
| Hybridization Chamber, stainless | Agilent | G2534A | |
| Hybridization oven | Agilent | G2545A | |
| Purification Columns | Agilent | 5190-3391 | |
| Laser scanner | Roche | MS200 | |
| NimbleScan 2.6 | Roche Nimblegen | 5225035001 | |
| Signal Map 1.9 | Roche Nimblegen | Signalmap1.9 |
References
- Tang, H., et al. An improved genome release (version Mt4.0) for the model legume Medicago truncatula. BMC Genomics. 15, 312 (2014).
- Young, N. D., et al. The Medicago genome provides insight into the evolution of rhizobial symbioses. Nature. 480 (7378), 520-524 (2011).
- Wang, H., Li, G., Chen, R. Fast neutron bombardment (FNB) induced deletion mutagenesis for forward and reverse genetic studies in plants. Floriculture, Ornamental and Plant Biotechnology: Advances and Topical Issues. da Silva, J. T. , 1st ed, Global Science Books. Isleworth, UK. 629-639 (2006).
- Rogers, C., Wen, J., Chen, R., Oldroyd, G. Deletion-based reverse genetics in Medicago truncatula. Plant Physiol. 151 (3), 1077-1086 (2009).
- Alonso, J. M., et al. Five components of the ethylene-response pathway identified in a screen for weak ethylene-insensitive mutants in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (5), 2992-2997 (2003).
- Silverstone, A. L., Ciampaglio, C. N., Sun, T. The Arabidopsis RGA gene encodes a transcriptional regulator repressing the gibberellin signal transduction pathway. Plant Cell. 10 (2), 155-169 (1998).
- Li, X., Lassner, M., Zhang, Y. Deleteagene: a fast neutron deletion mutagenesis-based gene knockout system for plants. Comp Funct Genomics. 3 (2), 158-160 (2002).
- Bolon, Y. T., et al. Phenotypic and genomic analyses of a fast neutron mutant population resource in soybean. Plant Physiol. 156 (1), 240-253 (2011).
- Men, A. E., et al. Fast Neutron Mutagenesis of Soybean (Glycine soja L.) Produces a Supernodulating Mutant Containing a Large Deletion in Linkage Group H. Genome Letters. 1 (3), 147-155 (2002).
- Hoffmann, D., Jiang, Q., Men, A., Kinkema, M., Gresshoff, P. M. Nodulation deficiency caused by fast neutron mutagenesis of the model legume Lotus japonicus. J Plant Physiol. 164 (4), 460-469 (2007).
- Li, X., et al. A fast neutron deletion mutagenesis-based reverse genetics system for plants. Plant J. 27 (3), 235-242 (2001).
- Bourcy, M., et al. Medicago truncatula DNF2 is a PI-PLC-XD-containing protein required for bacteroid persistence and prevention of nodule early senescence and defense-like reactions. New phytol. 197 (4), 1250-1261 (2013).
- Chen, J., et al. Control of dissected leaf morphology by a Cys(2)His(2) zinc finger transcription factor in the model legume Medicago truncatula. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (23), 10754-10759 (2010).
- Ge, L., et al. Increasing seed size and quality by manipulating BIG SEEDS1 in legume species. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (44), 12414-12419 (2016).
- Kalo, P., et al. Nodulation signaling in legumes requires NSP2, a member of the GRAS family of transcriptional regulators. Science. 308 (5729), 1786-1789 (2005).
- Oldroyd, G. E., Long, S. R. Identification and characterization of nodulation-signaling pathway 2, a gene of Medicago truncatula involved in Nod actor signaling. Plant Physiol. 131 (3), 1027-1032 (2003).
- Peng, J., et al. Regulation of compound leaf development in Medicago truncatula by fused compound leaf1, a class M KNOX gene. Plant Cell. 23 (11), 3929-3943 (2011).
- Tsujimoto, Y., et al. Arabidopsis TOBAMOVIRUS MULTIPLICATION (TOM) 2 locus encodes a transmembrane protein that interacts with TOM1. EMBO J. 22 (2), 335-343 (2003).
- Wang, D., et al. A nodule-specific protein secretory pathway required for nitrogen-fixing symbiosis. Science. 327 (5969), 1126-1129 (2010).
- Bejjani, B. A., Shaffer, L. G. Application of array-based comparative genomic hybridization to clinical diagnostics. J Mol Diagn. 8 (5), 528-533 (2006).
- Emerson, J. J., Cardoso-Moreira, M., Borevitz, J. O., Long, M. Natural selection shapes genome-wide patterns of copy-number polymorphism in Drosophila melanogaster. Science. 320 (5883), 1629-1631 (2008).
- Gong, J. M., et al. Microarray-based rapid cloning of an ion accumulation deletion mutant in Arabidopsis thaliana. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (43), 15404-15409 (2004).
- Guryev, V., et al. Distribution and functional impact of DNA copy number variation in the rat. Nat Genet. 40 (5), 538-545 (2008).
- Haun, W. J., et al. The composition and origins of genomic variation among individuals of the soybean reference cultivar Williams 82. Plant Physiol. 155 (2), 645-655 (2011).
- Infante, J. J., Dombek, K. M., Rebordinos, L., Cantoral, J. M., Young, E. T. Genome-wide amplifications caused by chromosomal rearrangements play a major role in the adaptive evolution of natural yeast. Genetics. 165 (4), 1745-1759 (2003).
- Jones, M. R., Maydan, J. S., Flibotte, S., Moerman, D. G., Baillie, D. L. Oligonucleotide Array Comparative Genomic Hybridization (oaCGH) based characterization of genetic deficiencies as an aid to gene mapping in Caenorhabditis elegans. BMC Genomics. 8, 402 (2007).
- Lakshmi, B., et al. Mouse genomic representational oligonucleotide microarray analysis: detection of copy number variations in normal and tumor specimens. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (30), 11234-11239 (2006).
- Mitra, R. M., et al. A Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase required for symbiotic nodule development: Gene identification by transcript-based cloning. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (13), 4701-4705 (2004).
- Rios, G., et al. Characterization of hemizygous deletions in citrus using array-comparative genomic hybridization and microsynteny comparisons with the poplar genome. BMC Genomics. 9, 381 (2008).
- Skvortsov, D., Abdueva, D., Stitzer, M. E., Finkel, S. E., Tavare, S. Using expression arrays for copy number detection: an example from E. coli. BMC Bioinformatics. 8, 203 (2007).
- Werner, J. D., et al. Quantitative trait locus mapping and DNA array hybridization identify an FLM deletion as a cause for natural flowering-time variation. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (7), 2460-2465 (2005).
- Xi, J., Chen, Y., Nakashima, J., Wang, S. M., Chen, R. Medicago truncatula esn1 defines a genetic locus involved in nodule senescence and symbiotic nitrogen fixation. Mol Plant Microbe Interact. 26 (8), 893-902 (2013).
- Schnabel, E., Journet, E. P., de Carvalho-Niebel, F., Duc, G., Frugoli, J. The Medicago truncatula SUNN gene encodes a CLV1-like leucine-rich repeat receptor kinase that regulates nodule number and root length. Plant Mol Biol. 58 (6), 809-822 (2005).
- Horvath, B., et al. Loss of the nodule-specific cysteine rich peptide, NCR169, abolishes symbiotic nitrogen fixation in the Medicago truncatula dnf7 mutant. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (49), 15232-15237 (2015).
- Kim, M., et al. An antimicrobial peptide essential for bacterial survival in the nitrogen-fixing symbiosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (49), 15238-15243 (2015).
- Noble Research Institute. Medicago truncatula Mutant Database. , Available from: https://medicago-mutant.noble.org/mutant/FNB.php (2017).
- Burton, R. SNP genotyping with the next generation of CGH microarray. MLO Med Lab Obs. 45 (7), (2013).
