Det här protokollet ger experimentella anvisningar och information om reagenser, utrustning och analysverktyg för forskare som är intresserade av att genomföra hela genomet arraybaserade jämförande genomisk hybridisering (CGH) analys av kopia antalet variationer i växter.
Mutanter är ovärderlig genetiska resurser för gen funktion studier. För att generera mutant samlingar, kan tre typer av mutagena ämnen utnyttjas, inklusive biologiska såsom T-DNA eller transposon, kemiska såsom etyl methanesulfonate (EMS) eller fysiska såsom jonisering strålning. Vilken typ av mutation observerade varierar beroende på den mutagen som används. För jonisering strålning inducerade mutanter inkluderar mutationer borttagning, dubbelarbete eller omflyttning. Även T-DNA eller transposon-baserat mutagenes är begränsad till arter som är mottagliga för omvandling, kan kemiska eller fysiska mutagenes tillämpas på ett brett spektrum av arter. Karakterisering av mutationer som härrör från kemisk eller fysikalisk mutagenes traditionellt är dock beroende av ett kartbaserat kloning tillvägagångssätt, som är labor intensiv och tidskrävande. Här, visar vi att en hög densitet genomet arraybaserade jämförande genomisk hybridisering (aCGH) plattform kan tillämpas för att effektivt upptäcka och karaktärisera kopia antalet variationer (CNVs) i mutanter som härrör från snabb neutron beskjutning (FNB) mutagenes i Medicago truncatula, släktet baljväxter. Hela genomet sekvens analysen visar att det finns fler än 50 000 gener eller gen modeller i M. truncatula. På nuvarande, FNB-inducerade mutanter i M. truncatula härrör från mer än 150 000 M1 linjer, som representerar ovärderliga genetiska resurser för funktionella studier av gener i genomet. ACGH plattformen beskrivs här är ett effektivt verktyg för att karaktärisera FNB-inducerade mutanter i M. truncatula.
Ärtväxter (Fabaceae) är den tredje största familjen av blommande växter, med många ekonomiskt viktiga arter såsom sojabönor (Glycine max) och alfalfa (Medicago sativa). Baljväxt växter kan interagera med kvävefixerande jordbakterier, allmänt kallad Rhizobia att utveckla roten knölar där den atmosfäriska Kvävetetroxid minskas till ammoniak för användning av värdväxt. Som sådan, odling av baljväxter kräver liten insats av kväve gödselmedel och således bidrar till hållbart jordbruk. Baljväxter ger bladen och fröna med hög proteinhalt, som serverar utmärkt foder och spannmålsskörden. Odlade baljväxter arter har dock generellt komplexa genomet strukturer, att göra funktionella studier av gener som spelar viktiga roller i baljväxter-specifika processer omständligt. Medicago truncatula har allmänt antagits som en modell art för baljväxter studier främst eftersom (1) den har en diploida genomet med en relativt liten haploida genomet storlek (~ 550 Mbp); (2) växter omvandlas stabilt för genen funktionella studier; och (3) det är närbesläktat med alfalfa (M. sativa), drottningen av Vallfoder och många andra ekonomiskt viktiga grödor för translationella studier. Nyligen, genomsekvens av M. truncatula cv Jemalong A17 har släppt1,2. Annotering av genomet visar att det finns mer än 50.000 förutspådda gener eller gen modeller i genomet. För att avgöra funktionen av de flesta av generna i den M. truncatula är genomet en utmanande uppgift. För att underlätta funktionella studier av gener, en omfattande samling av mutanter i spänna av över 150 000 M1 rader har genererats med hjälp av snabb neutron beskjutning (FNB) mutagenes i M. truncatula cv Jemalong A173 ,4. Snabb neutron, hög energi jonisering mutagen, har använts i generera mutanter i många växtarter inklusive Arabidopsis5,6, ris (Oryza sativa)7, tomat (Solanum lycopersicum), sojabönor (Glycine soja; G. max)8,9, korn (Hordeum vulgare) och Lotus japonicus10. En stor del av mutationer som härrör från FNB mutagenes beror på DNA borttagningar som varierar i storlek från några baspar till mega baspar9,11. Många fenotyp-associerade gener har varit framgångsrikt identifieras och karakteriseras4,12,13,14,15,16, 17 , 18 , 19. tidigare, molekylär kloning av underliggande generna från FNB mutanter åberopade ett kartbaserat tillvägagångssätt som är tidskrävande och begränsar antalet mutanter att präglas på molekylär nivå. Nyligen, flera gratis metoder inklusive avskrift-baserade metoder, genomet plattsättning arraybaserade jämförande genomisk hybridisering (CGH) för DNA kopia nummer variant upptäckt, och hela Genomsekvensering, har anställts för att underlätta den karakterisering av radering mutanter i olika organismer inklusive djur och växter20,21,22,23,24,25, 26,27,28,29,30,31.
För att underlätta karakterisering av FNB mutanter i M. truncatula, en helgenom-arraybaserade jämförande genomisk hybridisering (CGH) har plattformen utvecklats och validerats. Som rapporterats i djurens system, kan arraybaserade CGH plattformen kopiera antal variationer (CNVs) på hela genomet nivå i M. truncatula FNB mutanter. Dessutom lesioner kan bekräftas genom PCR och radering gränser kan identifieras genom sekvensering. Övergripande, den array-CGH plattformen är ett effektivt verktyg att identifiera lesioner i M. truncatula FNB mutanter. Här, illustreras i förfarandet för array-CGH och PCR-karakterisering av radering gränser i en M. truncatula FNB mutant.
Följande protokoll ger experimentella anvisningar och information om reagenser, utrustning och analysverktyg för forskare som är intresserade av att genomföra hela genomet arraybaserade jämförande genomisk hybridisering (CGH) analys av kopia antal variationer i växter. Som ett exempel, var Medicago truncatula FN6191 mutant används för att identifiera radering regioner och kandidatgener associerade med muterade fenotyper. M. truncatula FN6191 mutant, ursprungligen isolerats från en snabb neutron beskjutning-inducerad radering mutant samling32 (se Tabell för material), uppvisade en hyper-nodulationen fenotyp efter inokulering med marken bakterie, Sihorhizobium meliloti Sm1021, i motsats till vildtyp växter.
Vi har utvecklat en matris-baserad CGH plattform för upptäckt och karakterisering av snabb neutron beskjutning (FNB)-inducerade mutanter i M. truncatula cv. Jemalong A17. För att demonstrera användningen av matrisen CGH metod att upptäcka genmutationer, utfört vi aCGH analys av muterat FN6191, som ställde ut en hyper-nodulationen fenotyp i motsats till vildtyp växter, när inokuleras med S. meliloti Sm1021. För segmentering analys ansågs ett segment betydande om förhållandet log2 …
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete finansieras delvis genom ett bidrag från NSF växtforskning genomet (IOS-1127155).
Medicago truncatula genome array, 1 x 1 M | Agilent | G4123A | |
Medicago truncatula FN6191 (mutant) | In house | FN6191 | |
Medicago truncatula Jemalong A17 (reference) | In house | A17 | |
Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 320501 | |
DNeasy Plant Mini Kit | Qiagen | 69104 | |
Nanodrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | 1000D | |
SureTag DNA Labeling Kit | Agilent | 5190-3400 | |
Random primer | Agilent | 5190-3399 | |
Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004-1L | |
Thermocycler | MJ research | PTC-200 | |
Centrifuge | Labnet international Inc | Spectrafuge 24D | |
Stabilization and Drying Solution | Agilent | 5185-5979 | |
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Hybridization Kit | Agilent | 5188-5380 | |
Hybridization Chamber gasket slides | Agilent | G2505 | |
Human Cot-1 DNA | Agilent | 5190-3393 | |
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 1 and 2 | Agilent | 5188-5221 | |
Hybridization Chamber, stainless | Agilent | G2534A | |
Hybridization oven | Agilent | G2545A | |
Purification Columns | Agilent | 5190-3391 | |
Laser scanner | Roche | MS200 | |
NimbleScan 2.6 | Roche Nimblegen | 5225035001 | |
Signal Map 1.9 | Roche Nimblegen | Signalmap1.9 |