Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

מבוסס על מערך השוואתי גנומית הכלאה פלטפורמה יעילה לזיהוי של עותק מספר וריאציות במוטציות מהר ניוטרון-induced אספסת truncatula

Published: November 8, 2017 doi: 10.3791/56470
Automatic Translation
1, 2, 3, 2, 2, 1
1Laboratory of Plant Genetics and Development, Noble Research Institute, 2Genetics Laboratory, University of Oklahoma Health Science Center, 3Medicine and Health School, Li Shui University

Summary

פרוטוקול זה מספק צעדים ניסיוני ומידע אודות ריאגנטים, ציוד וכלים לניתוח לחוקרים המעוניינים בביצוע ניתוח הגנום כולו מבוסס על מערך השוואתי גנומית הכלאה (CGH) של עותק מספר וריאציות צמחים.

Abstract

מוטציות הן כרב משאבים גנטי ללימודי תפקוד הגן. כדי ליצור אוספים מוטציה, שלושה סוגי מוטגנים יכול להיות מנוצל, כולל ביולוגית כגון T-DNA או transposon, כימיקלים כגון אתיל methanesulfonate (EMS), או גופני כגון קרינה יינון. הסוג של מוטציה נצפתה משתנה בהתאם מוטגן בשימוש. למוטנטים הקרינה הנוצרות על ידי יינון, מוטציות כוללות מחיקה, שכפול או סידורם מחדש. בזמן T-DNA או מבוססי transposon מוטגנזה מכוונת מוגבלת מינים רגישים טרנספורמציה, ניתן ליישם מוטגנזה מכוונת כימיים או פיזיים מגוון רחב של מינים. עם זאת, אפיון מוטציות נגזר כימיים או פיזיים מוטגנזה מכוונת באופן מסורתי מסתמך על מבוסס מפה שיבוט בגישה, אשר עבודה אינטנסיבית וצורכת זמן. . הנה, אנחנו מראים כי פלטפורמה מבוססת על מערך השוואתי גנומית הכלאה (aCGH) הגנום בצפיפות גבוהה ניתן ליישם ביעילות לזהות ולאפיין עותק מספר וריאציות (CNVs) של מוטציות נגזר מוטגנזה מכוונת הפגזה (FNB) נייטרון מהיר ב אספסת truncatula, זן קטניות. ניתוח רצף הגנום כולו מראה כי ישנם יותר מ- 50,000 גנים או דגמים ג'ין truncatula מ'. בבית הנוכחי, הנוצרות על-ידי FNB מוטציות במ truncatula נגזרים מתוך יותר מ-150,000 שורות M1, המייצג משאבים גנטי לא בפז עבור מחקרים פונקציונלי של גנים בגנום. פלטפורמת aCGH המתוארים כאן הוא כלי יעיל עבור אפיון FNB-induced מוטציות ב- truncatula מ'.

Introduction

קטניות (קטניות) הם משפחת השלישית בגודלה של צמחים בעלי פרחים, עם מינים רבים כלכלית כגון סויה (מקס גליצין), אספסת (סאטיבה אספסת). קטניות צמחים יכולים לקיים אינטראקציה עם חנקן-תיקון בחיידקים בקרקעות, בדרך כלל בשם Rhizobia לפתח פקעיות בו dinitrogen עם אווירה תקטן אמוניה לשימוש על ידי המפעל המארח. ככזה, טיפוח של גידולי קטניות דורש קלט הקטן של דשנים חנקן, ובכך תורמת חקלאות בת-קיימא. גידולי קטניות לייצר עלים וזרעים עם תוכן חלבון גבוהה, הגשה מצויינת מספוא וגרעינים. עם זאת, מינים קטניות מעובדים בדרך כלל יש מבנים מורכבים הגנום, ביצוע מחקרים פונקציונלי של גנים לשחק בתפקידי מפתח בתהליכים ספציפיים קטניות, מסורבלת. אספסת truncatula אומצה באופן נרחב כמין דגם ללימודי קטניות בעיקר בגלל זה (1) יש גנום דיפלואידי עם גודל הגנום הפלואידי קטן יחסית (~ 550 Mbp); (2) צמחים יכול להיהפך stably ללימודי פונקציונלי ג'ין; (3) זה קשורה קשר הדוק אספסת (סאטיבה מ'), המלכה מספוא, רבים כלכלית הגידולים החקלאיים ללימודי translational. לאחרונה, רצף הגנום של truncatula מ' cv Jemalong A17 כבר שוחרר1,2. ביאור של הגנום מראה כי ישנם יותר מ- 50,000 גנים החזוי או מודלים גנים בגנום. כדי לקבוע את הפונקציה של רוב בגנים truncatula מ' הגנום הוא משימה מאתגרת. כדי להקל על מחקרים פונקציונלי של גנים, אוסף מקיף של מוטציות בטווח של קווים1 מ' מעל 150,000 נוצרה באמצעות מוטגנזה מכוונת נייטרון מהיר הפגזה (FNB) ב- truncatula מ' cv Jemalong A173 ,4. נייטרון מהיר, מוטגן יינון אנרגיה גבוהה, שימש ליצירת מוטציות במינים רבים של צמחים, כולל תודרנית5,6, אורז (אורז sativa)7, עגבניות (סולנום lycopersicum), סויה (גליצין soja; ג'י מקס)8,9, (שעורה מצויה) שעורה ג'אפוניכאס לוטוס10. חלק גדול של מוטציות נגזר FNB מוטגנזה מכוונת הן בשל מחיקות הדנ א הזה מגוון גדול של כמה זוגות בסיס מגה בסיסי זוגות9,11. גנים הקשורים פנוטיפ רבים כבר בהצלחה מזוהה, מאופיין4,12,13,14,15,16, 17 , 18 , 19. בעבר, שיבוט מולקולרי של גנים הבסיסית של מוטציות FNB הסתמכה על גישה המבוססת על המפה, זמן רב ואינה מגבילה את מספר מוטציות כדי להיות מאופיין ברמה המולקולרית. לאחרונה, מספר גישות ללא תשלום כולל שיטות מבוססות על התעתיק, הגנום ריצוף מבוסס על מערך השוואתי גנומית הכלאה (CGH) עבור זיהוי וריאציה מספר עותק ה-DNA ואת רצף הגנום כולו, יש כבר מועסקים כדי להקל אפיון של מחיקה מוטציות אורגניזמים מגוונים כולל בעלי חיים וצמחים20,21,22,23,24,25, 26,27,28,29,30,31.

כדי להקל על אפיון FNB מוטציות ב- מ truncatula, הגנום כולו מבוסס על מערך השוואתי גנומית הכלאה (CGH) פלטפורמה פותחה, לאמת. כפי שדווח במערכות בעלי חיים, פלטפורמת CGH מבוסס על מערך מאפשרת גילוי של עותק מספר וריאציות (CNVs) ברמת הגנום כולו ב- FNB מ truncatula מוטציות. יתר על כן, נגעים יכול להיות מאושרות על ידי ה-PCR, מחיקת גבולות יכול להיות מזוהה על ידי רצף. בסך הכל, פלטפורמת array CGH הוא כלי יעיל ואפקטיבי בזיהוי נגעים ב truncatula מ FNB מוטציות. כאן, מומחשים array CGH הליך ואפיון PCR של מחיקת גבולות במוטציה FNB truncatula מ' .

להלן כללי התנהגות מספק צעדים ניסיוני ומידע אודות ריאגנטים, ציוד וכלים לניתוח לחוקרים המעוניינים בביצוע הגנום כולו מבוסס על מערך השוואתי גנומית הכלאה (CGH) ניתוח של מספר עותק וריאציות בצמחים. לדוגמה, אספסת truncatula FN6191 מוטציה שימש כדי לזהות אזורים המחיקה ואת המועמד גנים הקשורים פנוטיפים מוטציה. מוטציה FN6191 מ truncatula , במקור מבודד של אוסף מוטציה מחיקה הנוצרות על-ידי הפגזה נייטרון מהיר32 (ראה טבלה של חומרים), הציג הפנוטיפ היפר-nodulation לאחר חיסון עם האדמה חיידק, Sm1021 Sihorhizobium meliloti , בניגוד פראי סוג צמחים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: איור 1 מציג את השלבים חמש עבור המערך CGH פרוטוקול. הם: 1) הכנה של חומרים הצמח; 2) בידוד של דגימות די אן איי באיכות גבוהה; Labeling 3) ולטיהור דגימות די אן איי; 4) הכלאה, שטיפה, וסריקה של מערכים הגנום כולו; ו- 5) ניתוח נתונים CGH. מערכים ריצוף הגנום כולו מ truncatula מכילים סך של הגששים oligo ייחודי 971,041 פילוח יותר מ 50,000 גנים או מודלים הגן הגנום (ראו טבלה של חומרים). הגששים ייחודי ירווחו כ כל 150 בסיסי זוגות (bp) אזורים exonic, 261 bp באזורים intronic של הגנום truncatula מ.

1. הכנה של חומרים צמח

  1. Scarify פראי סוג (WT; מ truncatula קורות חיים Jemalong A17) וזרעים FN6191 מוטציה בחומצה גופרתית מרוכזת עבור 8 דקות (ראה טבלה של חומרים). להסיר ולמחוק חומצה גופרתית במיכל פסולת נוזלית.
  2. לשטוף את הזרעים במים יונים בלוק שלוש פעמים.
  3. משטח לעקר את הזרעים עם אקונומיקה 20% פתרון עבור 10 דקות
  4. לשטוף את הזרעים במים יונים בלוק שלוש פעמים.
  5. חנות זרעים ב 4 מעלות צלזיוס למשך 3 ימים. לאחר vernalization, העברה, להנביט זרעים באדמת עבור שבוע אחד בתוך תא צמיחה עם 16 h/8 h/כהה מחזור ו- µE 150/m 2 /s אור בעוצמה.
  6. השתלת השתילים 1 גלון סירים ואגדל אותם בחממה עם 16 h/8 h/כהה מחזור, 150 µE/m 2 /s עוצמת האור במשך שלושה או ארבעה שבועות. לאסוף דגימות עלים צעירים מן הצמחים עבור בידוד של דנ א.

2. בידוד של דגימות די אן איי ' איכות גבוהה '

  1. לקחת 1g של רקמת העלה הצעיר מצמח יחיד, תקפיא את זה בחנקן נוזלי מיד.
  2. לטחון רקמת העלה קפוא בחנקן נוזלי עם ומכתש משובח אבקת.
  3. לבודד דנ א גנומי עם בידוד דנ א קיט (ראה טבלה של חומרים).
  4. Resuspend מטוהרים דגימות די אן איי ב- 50 µL של בלוק זוגי יונים H 2 O (ddH 2 O) או 1 x טה מאגר (10 מ מ טריס-HCl, 1 מ"מ EDTA, pH 7.0).
  5. DNA למדוד ריכוזים עם ספקטרופוטומטרים (ראה טבלה של חומרים).
  6. להעריך 260 ננומטר/280 nm ו ננומטר/230 260 ננומטר יחסי של דגימות די אן איי.
    הערה: דגימות די אן איי איכותי צריך להיות יחס 260 ננומטר/280 nm ≥ 1.8 ויחס nm 260 ננומטר/230 ≥ 2.0.
  7. עוד יותר להעריך את דגימות די אן איי ע י בדיקת משטחים אותם 1% agarose.
    הערה: דגימות די אן איי באיכות גבוהה צריך משקל מולקולרי גבוה, לא צריך להיות שזוהמו על ידי RNA. באופן אידיאלי, הריכוז הסופי של דגימות די אן איי צריך להיות ~ 150 ng/µL.

3. DNA תיוג וטיהור

  1. µg 1 לדלל של דנ א גנומי דגימות עם ddH 2 O לאמצעי הסופי של µL 20 בשפופרת צנטרפוגה 500 µL.
  2. 5 להוסיף µL של פריימר אקראי (ראה טבלה של חומרים) לשפופרת הזו.
  3. מערבולת הצינור בקצרה ולשים אותו thermocycler דגירה, denature DNA ב 98 ° C עבור 10 דקות
  4. להשתמש ברכבת התחתית thermocycler ולשים אותו מיד על קרח מים מקררים למשך 5 דק.
  5. הכן שני תיוג מתערבב כפי שמוצג בטבלה 1-
  6. להוסיף 25 µL של תיוג mixes 1 ו- 2 ל- DNA הפניה ואת דגימת DNA צינורות, בהתאמה.
  7. לערבב את תערובת תיוג ו DNA על ידי pipetting שלוש פעמים, לסובב את הצינורות בקצרה.
  8. להכניס הצינורות thermocycler כדי דגירה 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים ולאחר מכן 65 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות להשבית את האנזים exo-Klenow (ראה טבלה של חומרים).
  9. µL 430 להוסיף 1 x טה המאגר כדי כל שפופרת.
  10. לערבב את התוכן, לסובב את הצינורות בקצרה.
  11. העברת הפתרון בצינור לתוך עמודה טיהור עם אוסף 2 מ"ל צינור (ראה טבלה של חומרים).
  12. צנטריפוגה העמודה טיהור ב g x 14,000 במשך 10 דקות
  13. למחוק את המעבר דרך פתרון.
  14. µL 480 להוסיף 1 x טה המאגר כדי שכל עמודה.
  15. צנטריפוגה העמודה שוב-14,000 g x עבור 10 דקות
  16. לבטל את הפתרון מעבר.
  17. העברת לדנ שכותרתו הנשאר על החלק התחתון של העמודה כדי שפופרת צנטרפוגה חדש.
  18. למדוד את עוצמת הקול של דגימת דנ א שכותרתו באמצעות פיפטה ולהביא את עוצמת הקול הסופי µL 80 עם 1 x מאגר טה.
  19. מודדים את הריכוז לדנ שכותרתו באמצעות ספקטרופוטומטרים (ראה טבלה של חומרים).
  20. מערבבים כמות שווה של שכותרתו דגימת DNA ו הפניה DNA ולהביא את עוצמת הקול הסופי 160 µL עם 1 x טה מאגר.
  21. 256 להוסיף µL של 2 x מאגר הכלאה, µL 50 של דנ א אנושי מתקפלת-1 ו- 50 µL של סוכן חסימה aCGH 10 × (ראה טבלה של חומרים) ומערבבים היטב על ידי pipetting עבור שלוש פעמים.
  22. לסובב את הצינורות בקצרה ומכניסים אותם לתוך thermocycler כדי דגירה ב 98 ° C במשך 10 דקות
  23. דגירה הצינורות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 20 דק.

4. הכלאה, הכביסה, ולאחר סריקה של המערכים הגנום

  1. לחמם תנור הכלאה ל 67 מעלות לפחות 4 שעות לפני הכלאה מתחילה.
  2. מקום שקופית אטם על גבי הבסיס של תא הכלאה.
  3. µL 490 עומס של הכלאה פתרון של שלב 3.23 אותן לשקופית אטם.
  4. מכסים את השקופית אטם עם שבב microarray הגנום אספסת truncatula כדי ליצור תא הכלאה.
  5. לשים את השמיכה קאמרית הכלאה והדק התא בנחישות עם תופסנים.
  6. לשים תא הכלאה התאספו לתוך התנור הכלאה, דגירה ב 67 מעלות צלזיוס במשך ה 40-48
  7. להכין שלוש שקופיות לרחוץ כלים: שתיים עם 250 מ ל שטיפה מאגר כל הזמן בטמפרטורת החדר, ושמר אחד עם שטיפה מאגר II ב- 37 מעלות צלזיוס.
  8. להכין שתי שקופיות שטיפה צנצנות: אחת עם 70 מ ל acetonitrile ואחת עם פתרון ייבוש וייצוב 70 מ ל; שמור בשכונה fume בטמפרטורת החדר (ראה טבלה של חומרים).
  9. להסיר תא הכלאה מהתנור ולהסיר את התפסים קאמרית ואת הכיסוי.
  10. להעביר השבב microarray ואת אטם להחליק אל צלחת כביסה שקופיות עם שטיפת מאגר אני להפריד את השבב השקופית כיסוי.
  11. המהלך microarray צ'יפ ל שטיפה השקופית השניה צלחת עם מאגר לשטוף, בעדינות הפיצו את הפתרון עם בר מערבבים בצלחת מערבבים מגנטי בטמפרטורת החדר במשך 5 דק
  12. העברת microarray צ'יפ לשקופית השלישי לשטוף צלחת עם כביסה מראש ומחוממת מאגר II ולשטוף אותו בעדינות עם בר מערבבים על צלחת מגנטית stir ב 37 ° C עבור מינימלית 1
  13. להעביר את השבב microarray שקופית שטיפה צנצנת עם acetonitrile בשכונה fume ולשטוף אותו ב-30 ס
  14. להעביר את השבב microarray שקופית שטיפה צנצנת עם ייצוב וייבוש פתרון ולשטוף אותו ב-30 ס
  15. להוציא את השבב לאט וזה יבש עבור מינימלית 1
  16. לסרוק את השבב microarray משתמש בסורק (ראה טבלה של חומרים) מתחת לגיל 2 מיקרומטר רזולוציה. להגדיר פרמטרים כדי לשמור תמונות מרובות, כל שקופית סריקות. להגדיר את ערוצים 1 ו-2 רווחי ל- 100%. ולבטל את רווח אוטומטי.

5. ניתוח נתונים CGH

  1. לחלץ Cy3 ואת Cy5 קרינה פלואורסצנטית עוצמות עבור כל בדיקה במערך באמצעות תוכנת הסריקה (ראה טבלה של חומרים).
  2. שימוש ניתוח פילוח של התוכנה כדי לזהות עותק מספר וריאציות (CNVs) בין דגימת DNA DNA הפניה. להשתמש את הסף של קטע יומן אכזרי 2 מדגם/הפניה יחס ± 2.5 סטיות תקן לקביעת CNVs.
  3. לבחון את ההתפלגות של יומן 2 מדגם/הפניה יחסי ברחבי הגנום כולו באמצעות תוכנת מיפוי אות (ראה טבלה של חומרים).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

איור 2 מציג את ההתפלגות של יומן מנורמל2 יחסי של מוטציה לעומת WT אותות ברחבי הגנום כולו. ניתוח של נתונים CGH גילה משוער 22 kb מחיקה על כרומוזום 4 שמקיף את הגן כולו טרופ 33 ועוד כמה מבואר גנים מוטציה FN6191 (איור 2, איור 3). האזור שנמחקו המועמד היה מכוסה 73 הגששים עוקבים במערך עם יומן מנורמל אכזרי2 יחס פחות מ- 2.5 (משלימה טבלה 1). ביקורת על מחיקת גבולות הציע כי המחיקה בשם במוטציה זו משני צדדיה הגששים ממוקם בין קואורדינטות 22,313,168 ו- 22,334,934 על כרומוזום 4 (איור 3). כדי לאשר את מחיקת גבולות, PCR תחל נועדו להיות כ 1,500 bp מלבד הגבולות החזוי מחיקה (FN6191-DB-f: GCTAGCAAGGGTCTGCGCAAGTT; FN6191-DB-R: GTATCGAGAAGGTCTTATAGCAGC) ובוצע PCR הגברה ועם אלה תחל את הפרמטרים הבאים: 94 ° C, 5 דקות; 94 ° C, 45 s, 55 ° C, 30 s, 72 ° C, כ- 1.5 דקות; מחזורים 35; 72 ° C, 10 דקות ולאחר מכן 10 ° C ללא הגבלת זמן. כצפוי, היה מוצר אחד ה-PCR של 1.5 kb בהצלחה מוגבר מוטציה FN6191, אולם לא WT (איור 4A). בהתבסס על v3.5 לשחרר הגנום מ truncatula , בגודל של המחיקה של FN 6191 היה מוערך 26.67 kb (איור 4B). התוצאות CGH הראו כי אין חריגה מקטעים אחרים נמצאים בהגנום מוטציה FN6191 (איור 2).

Figure 1
איור 1: זרימת העבודה של מערך ניתוח השוואתי הכלאה גנומית (aCGH) של מוטציה truncatula מ . (א) הכנת חומרים צמח: מ' truncatula בר (Jemalong A17) וסוג המוטציה FN6191 היו בוגרים במשך שלושה או ארבעה שבועות בחממה. (B) בידוד של דנ א גנומי באיכות גבוהה: גרם אחד של עלים צעירים מצמחים יחיד שימש כדי לבודד דנ א גנומי. איכות הדנ א נקבע באמצעות אלקטרופורזה ספקטרופוטומטרים, ג'ל. (ג) ה-DNA תיוג וטיהור. DNAs גנומית של הפניה ודוגמאות ניסיוני עם תווית עם 3 Cyanine (Cy3), Cy5 באמצעות ה-DNA תיוג קיט וטיהרו משתמש בעמודה טיהור (D) הכלאה, שטיפה, וסריקה של array CGH truncatula מ 1 x 1 מ'. (E) CGH ניתוח: כניסה2 יחסי של אותות ניסויית/הפניה שהן פחות או שווה ל- 2.5 או גדול או שווה ל- 2.5 נחשבים כמו מחיקות בשם וכפילויות, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: מערך המבוסס על ניתוח השוואתי הכלאה גנומית של עותק מספר וריאציות של מוטציה היפר nodulation מ truncatula FN6191. מוצגות יומן2 יחסי חשבונאי/פראי סוג של הגששים על כל כרומוזומים 8. אזור 73-בדיקה רצופים על כרומוזום 4 זוהה כאזור שנמחקה ב החשבונאי (חץ). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3. זיהוי של האזור שנמחקו מוטציה FN6191 truncatula מ . להציג מקרוב של האזור בכרומוזום 4, שבה הגששים microarray 73 הציג באופן משמעותי מופחתת יומן2 מוטציות/פראי סוג יחסי, שש למיפוי גנים כולל טרופ (Medtr4g070970). חיצים מציינים את המיקום ואת הכיוון של צבעי יסוד PCR הגברה של מחיקת גבולות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: אישור מחיקה ליד הגבול עם מוטציה מ truncatula FN6191. (א) PCR הגברה של מחיקת גבולות: מוצר 1.5 kb היה מוגבר של המוטציה FN6191 באמצעות תחל איגוף הגבולות מחיקה (ליין 1; מו). אותה קבוצה של צבעי יסוד לא להגביר את כל מוצרי WT (מ truncatula Jemalong A17) בשל מגבלה לגודל של ה-PCR (ליין 2; Wt). ליין M הסולם 1 kb. (B) רצפים של הצומת מחיקה של המוטציה FN6191. חץ מציין לצומת מחיקה. (ג) קביעת רצף תוצאות הראו כי מחיקת גבולות (חיצים) ממוקמים הקואורדינטות 22309163 ו- 22335836 על כרומוזום 4. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

תיוג מיקס 1 לפי התגובה x לטעום # (μL) תיוג מיקס 2 לפי התגובה x הסימוכין (μL)
ddH2O 6.0 x ddH2O 6.0 x
5 x מאגר 10.0 x 5 x מאגר 10.0 x
10 x dNTPs 5.0 x 10 x dNTPs 5.0 x
Cyanine 5 3.0 x Cyanine 3 3.0 x
Exo-Klenow 1.0 x Exo-Klenow 1.0 x
סה 25 x סה 25 x

טבלה 1: תיוג מתערבב.

משלימה טבלה 1: בדיקה רצפים למחוק ב truncatula מ FN6191 מוטציה.
אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פיתחנו פלטפורמה CGH מבוסס על מערך זיהוי, אפיון נייטרון מהיר הפגזה (FNB)-induced מוטציות ב truncatula מ cv. Jemalong A17. כדי להדגים את השימוש במערך CGH שיטת באיתור מוטציות, ביצענו ניתוח aCGH של המוטציה FN6191, אשר הציג הפנוטיפ היפר-nodulation בניגוד פראי סוג צמחים, כאשר מחוסן עם meliloti ס Sm1021. לניתוח פילוח, קטע הייתה השפעה משמעותית אם היחס2 יומן של הגששים בתוך המקטע היה מעל הסף העליון או מתחת לסף התחתון להשוואה את מערך נתון. הסף העליון עבור כל השוואה היה נחוש בדעתו להיות הערך יחס2 יומן של אחוזון ה־95 של כל נקודות נתונים. הסף התחתון עבור כל השוואה היה נחוש בדעתו להיות הערך יחס2 יומן של אחוזון חמישי נתוני כל נקודות24.

הניתוח שלנו הראה כי עותק משמעותית מספר שינויים יכול להיקבע על ידי מאחזר מקטעים עם יחס2 יומן מנורמל ממוצע גדול יותר מהממוצע על-ידי 2.5 SD (כפילות) או פחות מהממוצע by 2.5 SD (מחיקה). בהתבסס על ניתוח CGH, אנחנו זיהה אזור מחיקה עם גודל משוער של 22 kb על כרומוזום 4, המקיף את ג'ין טרופ 33. רצף תוצאות אישר כי הגודל מחיקה היה kb 26.67 בהתבסס על truncatula מ הגנום שחרור v3.5. הוכח, כי אור מקודד של קינאז קולטן חוזר לאוצין-עשיר כמו CLV1 זה קובע את מספר גולה ב truncatula מ33. התוצאות CGH שלנו מראים כי FN6191 הוא אלל אור חדש. בהתבסס על תוצאות אלו, אנו הסיק כי השיטה CGH בשילוב עם פנוטיפי, ניתוח גנטי יכול לשמש בהצלחה כדי לזהות במהירות את המועמד גנים ב- FNB מחיקה מוטציות. במהלך השנים האחרונות, השתמשנו פלטפורמה זו ב זיהוי ואפיון מוטנטים רבים FNB ללימודי פונקציונלי ג'ין מ truncatula34,35. יש לנו שנוצר מסד נתונים של עותק מספר וריאציות (CNVs) המשויך FNB הקווים המוטנטים36. במסד נתונים זה, אישר רצפים נמחקו מניתוחי CGH של יותר מ-100 מוטציות nodulation השיתופיות מופו על הגנום truncatula מ' . שרת הפיצוץ הוגדרה כדי להקל על החיפוש אחר רצפים נמחקו באוסף מוטציה. פיתוח, הרחבה נוספת של מסד הנתונים מחיקה יהיה חשוב מאוד למחקר גנומיקה תפקודית שימוש במשאבים מוטציה FNB מ truncatula .

פרוטוקול aCGH יש חמישה שלבים עיקריים. למרות כל השלבים חשובים, צריך להתבצע בזהירות, כפי שתוארו לעיל, להלן קריטי במיוחד: דגימות די אן איי (1) לא צריכה להיות מושפל, צריך לא להיות שזוהמו על ידי RNA במהלך השלב הכנה; דגימות דנ א (2) בדיקה ועיון צריך להיות לא פחות טוב מוכן כך הדגימות שכותרתו הם באיכות גבוהה זהה; (3) שכותרתו דגימות די אן איי אסור לחשוף עוצמת אור גבוהה, רמה גבוהה של האוזון; (4) הוא חשוב להשאיר כביסה מאגר II ב 37 מעלות צלזיוס במהלך השלב כביסה.

הכיסוי של המערך הגנום מ truncatula הנוכחי הוא בעיקר על האזורים exonic, ופחות על האזורים intronic, ואני בכלל לא באזורים intergenic. ניתן לשפר את הכיסוי באזורי האחרון אם הפצעים באזורים אלה חשובים עבור פנוטיפים מוטציה. מצד שני, העיצוב הנוכחי של המכשיר יש פחות חשמל לזיהוי מוטציות קטנות, נוקלאוטיד יחיד פולימורפיזמים (SNPs). מגבלה זו ניתן להתגבר באמצעות CGH + הסנ פ microarray עיצוב37. הכולל, הפלטפורמה מבוססת על מערך השוואתי גנומית הכלאה (aCGH) הגנום הוא כלי רב עוצמה עבור הניתוח של עותק מספר ווריאציות מבנית ב- FNB מ truncatula מוטציות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

המימון של עבודה זו מסופק בחלקו על ידי מענק של מחקר הגנום של הצמח NSF (IOS-1127155).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Medicago truncatula genome array, 1 x 1 M Agilent G4123A
Medicago truncatula FN6191 (mutant) In house FN6191
Medicago truncatula Jemalong A17 (reference) In house A17
Sulfuric acid Sigma-Aldrich 320501
DNeasy Plant Mini Kit Qiagen 69104
Nanodrop Spectrophotometer Thermo Scientific 1000D
SureTag DNA Labeling Kit Agilent 5190-3400
Random primer Agilent 5190-3399
Acetonitrile Sigma-Aldrich 271004-1L
Thermocycler MJ research PTC-200
Centrifuge Labnet international Inc Spectrafuge 24D
Stabilization and Drying Solution Agilent 5185-5979
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Hybridization Kit Agilent 5188-5380
Hybridization Chamber gasket slides Agilent G2505
Human Cot-1 DNA Agilent 5190-3393
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 1 and 2 Agilent 5188-5221
Hybridization Chamber, stainless Agilent G2534A
Hybridization oven Agilent G2545A
Purification Columns Agilent 5190-3391
Laser scanner Roche MS200
NimbleScan 2.6 Roche Nimblegen 5225035001
Signal Map 1.9 Roche Nimblegen Signalmap1.9

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tang, H., et al. An improved genome release (version Mt4.0) for the model legume Medicago truncatula. BMC Genomics. 15, 312 (2014).
  2. Young, N. D., et al. The Medicago genome provides insight into the evolution of rhizobial symbioses. Nature. 480 (7378), 520-524 (2011).
  3. Wang, H., Li, G., Chen, R. Fast neutron bombardment (FNB) induced deletion mutagenesis for forward and reverse genetic studies in plants. Floriculture, Ornamental and Plant Biotechnology: Advances and Topical Issues. da Silva, J. T. , 1st ed, Global Science Books. Isleworth, UK. 629-639 (2006).
  4. Rogers, C., Wen, J., Chen, R., Oldroyd, G. Deletion-based reverse genetics in Medicago truncatula. Plant Physiol. 151 (3), 1077-1086 (2009).
  5. Alonso, J. M., et al. Five components of the ethylene-response pathway identified in a screen for weak ethylene-insensitive mutants in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (5), 2992-2997 (2003).
  6. Silverstone, A. L., Ciampaglio, C. N., Sun, T. The Arabidopsis RGA gene encodes a transcriptional regulator repressing the gibberellin signal transduction pathway. Plant Cell. 10 (2), 155-169 (1998).
  7. Li, X., Lassner, M., Zhang, Y. Deleteagene: a fast neutron deletion mutagenesis-based gene knockout system for plants. Comp Funct Genomics. 3 (2), 158-160 (2002).
  8. Bolon, Y. T., et al. Phenotypic and genomic analyses of a fast neutron mutant population resource in soybean. Plant Physiol. 156 (1), 240-253 (2011).
  9. Men, A. E., et al. Fast Neutron Mutagenesis of Soybean (Glycine soja L.) Produces a Supernodulating Mutant Containing a Large Deletion in Linkage Group H. Genome Letters. 1 (3), 147-155 (2002).
  10. Hoffmann, D., Jiang, Q., Men, A., Kinkema, M., Gresshoff, P. M. Nodulation deficiency caused by fast neutron mutagenesis of the model legume Lotus japonicus. J Plant Physiol. 164 (4), 460-469 (2007).
  11. Li, X., et al. A fast neutron deletion mutagenesis-based reverse genetics system for plants. Plant J. 27 (3), 235-242 (2001).
  12. Bourcy, M., et al. Medicago truncatula DNF2 is a PI-PLC-XD-containing protein required for bacteroid persistence and prevention of nodule early senescence and defense-like reactions. New phytol. 197 (4), 1250-1261 (2013).
  13. Chen, J., et al. Control of dissected leaf morphology by a Cys(2)His(2) zinc finger transcription factor in the model legume Medicago truncatula. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (23), 10754-10759 (2010).
  14. Ge, L., et al. Increasing seed size and quality by manipulating BIG SEEDS1 in legume species. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (44), 12414-12419 (2016).
  15. Kalo, P., et al. Nodulation signaling in legumes requires NSP2, a member of the GRAS family of transcriptional regulators. Science. 308 (5729), 1786-1789 (2005).
  16. Oldroyd, G. E., Long, S. R. Identification and characterization of nodulation-signaling pathway 2, a gene of Medicago truncatula involved in Nod actor signaling. Plant Physiol. 131 (3), 1027-1032 (2003).
  17. Peng, J., et al. Regulation of compound leaf development in Medicago truncatula by fused compound leaf1, a class M KNOX gene. Plant Cell. 23 (11), 3929-3943 (2011).
  18. Tsujimoto, Y., et al. Arabidopsis TOBAMOVIRUS MULTIPLICATION (TOM) 2 locus encodes a transmembrane protein that interacts with TOM1. EMBO J. 22 (2), 335-343 (2003).
  19. Wang, D., et al. A nodule-specific protein secretory pathway required for nitrogen-fixing symbiosis. Science. 327 (5969), 1126-1129 (2010).
  20. Bejjani, B. A., Shaffer, L. G. Application of array-based comparative genomic hybridization to clinical diagnostics. J Mol Diagn. 8 (5), 528-533 (2006).
  21. Emerson, J. J., Cardoso-Moreira, M., Borevitz, J. O., Long, M. Natural selection shapes genome-wide patterns of copy-number polymorphism in Drosophila melanogaster. Science. 320 (5883), 1629-1631 (2008).
  22. Gong, J. M., et al. Microarray-based rapid cloning of an ion accumulation deletion mutant in Arabidopsis thaliana. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (43), 15404-15409 (2004).
  23. Guryev, V., et al. Distribution and functional impact of DNA copy number variation in the rat. Nat Genet. 40 (5), 538-545 (2008).
  24. Haun, W. J., et al. The composition and origins of genomic variation among individuals of the soybean reference cultivar Williams 82. Plant Physiol. 155 (2), 645-655 (2011).
  25. Infante, J. J., Dombek, K. M., Rebordinos, L., Cantoral, J. M., Young, E. T. Genome-wide amplifications caused by chromosomal rearrangements play a major role in the adaptive evolution of natural yeast. Genetics. 165 (4), 1745-1759 (2003).
  26. Jones, M. R., Maydan, J. S., Flibotte, S., Moerman, D. G., Baillie, D. L. Oligonucleotide Array Comparative Genomic Hybridization (oaCGH) based characterization of genetic deficiencies as an aid to gene mapping in Caenorhabditis elegans. BMC Genomics. 8, 402 (2007).
  27. Lakshmi, B., et al. Mouse genomic representational oligonucleotide microarray analysis: detection of copy number variations in normal and tumor specimens. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (30), 11234-11239 (2006).
  28. Mitra, R. M., et al. A Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase required for symbiotic nodule development: Gene identification by transcript-based cloning. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (13), 4701-4705 (2004).
  29. Rios, G., et al. Characterization of hemizygous deletions in citrus using array-comparative genomic hybridization and microsynteny comparisons with the poplar genome. BMC Genomics. 9, 381 (2008).
  30. Skvortsov, D., Abdueva, D., Stitzer, M. E., Finkel, S. E., Tavare, S. Using expression arrays for copy number detection: an example from E. coli. BMC Bioinformatics. 8, 203 (2007).
  31. Werner, J. D., et al. Quantitative trait locus mapping and DNA array hybridization identify an FLM deletion as a cause for natural flowering-time variation. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (7), 2460-2465 (2005).
  32. Xi, J., Chen, Y., Nakashima, J., Wang, S. M., Chen, R. Medicago truncatula esn1 defines a genetic locus involved in nodule senescence and symbiotic nitrogen fixation. Mol Plant Microbe Interact. 26 (8), 893-902 (2013).
  33. Schnabel, E., Journet, E. P., de Carvalho-Niebel, F., Duc, G., Frugoli, J. The Medicago truncatula SUNN gene encodes a CLV1-like leucine-rich repeat receptor kinase that regulates nodule number and root length. Plant Mol Biol. 58 (6), 809-822 (2005).
  34. Horvath, B., et al. Loss of the nodule-specific cysteine rich peptide, NCR169, abolishes symbiotic nitrogen fixation in the Medicago truncatula dnf7 mutant. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (49), 15232-15237 (2015).
  35. Kim, M., et al. An antimicrobial peptide essential for bacterial survival in the nitrogen-fixing symbiosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (49), 15238-15243 (2015).
  36. Noble Research Institute. Medicago truncatula Mutant Database. , Available from: https://medicago-mutant.noble.org/mutant/FNB.php (2017).
  37. Burton, R. SNP genotyping with the next generation of CGH microarray. MLO Med Lab Obs. 45 (7), (2013).

Tags

גנטיקה גיליון 129 truncatula אספסת נייטרון מהיר הפגזה מוטציות מבוסס על מערך השוואתי גנומית הכלאה להעתיק מספר וריאציות זיהוי המוטציה מוטציה
מבוסס על מערך השוואתי גנומית הכלאה פלטפורמה יעילה לזיהוי של עותק מספר וריאציות במוטציות מהר ניוטרון-induced <em>אספסת truncatula</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, Y., Wang, X., Lu, S., Wang,… More

Chen, Y., Wang, X., Lu, S., Wang, H., Li, S., Chen, R. An Array-based Comparative Genomic Hybridization Platform for Efficient Detection of Copy Number Variations in Fast Neutron-induced Medicago truncatula Mutants. J. Vis. Exp. (129), e56470, doi:10.3791/56470 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter