Summary
Этот протокол обеспечивает экспериментальные шаги и информацию о реагентов, оборудования и инструменты анализа для исследователей, которые заинтересованы в проведении анализа на основе массива Сравнительная геномная гибридизация (CGH) всего генома копировать количество вариаций в растения.
Abstract
Мутантов являются бесценным генетических ресурсов для исследования функции гена. Для создания коллекции мутантов, могут использоваться три типа мутагенов, включая биологических например T-ДНК или transposon, химическая как этиловый метансульфонат (EMS) или физической например ИИИ. Тип мутации наблюдается варьируется в зависимости от мутаген используется. Для ионизации индуцированного излучения мутантов мутации включают, удаления, дублирования или перегруппировки. В то время как T-ДНК или на основе transposon мутагенеза ограничен видов, которые восприимчивы к трансформации, химические или физические мутагенеза может применяться к широкому спектру видов. Однако характеристика мутаций, производный от химических или физических мутагенеза традиционно опирается на карта на основе клонирования подход, который является труд интенсивной и много времени. Здесь мы покажем, что платформа на основе массива Сравнительная геномная гибридизация (aCGH) с высокой плотностью генома может применяться к эффективно обнаруживать и определять характеристики копии номер вариаций (CNVs) в мутантов, производный от быстрых нейтронах бомбардировки (ФНБ) мутагенеза в Truncatula Люцерна, бобовых видов. Весь геном последовательности анализ показывает, что существует более чем 50 000 генов или гена модели в . м. truncatula. В настоящее время, ФНБ индуцированной мутантов в . м. truncatula являются производными от более чем 150.000 линий M1, представляют собой бесценный генетические ресурсы для функциональных исследований генов в геноме. Платформа aCGH, описанные здесь является эффективным инструментом для характеризующие FNB-индуцированной мутантов в . м. truncatula.
Introduction
Бобовые (Fabaceae) — третий по величине семейство цветковых растений, с много экономически важных видов, таких как сои (Glycine max) и Люцерна (Medicago sativa). Бобовых растений может взаимодействовать с азотфиксирующих бактерий почвы, как правило, называют Rhizobia для разработки корневого узелки, в которых атмосферного азота уменьшено до аммиака для использования растения-хозяина. Таким образом выращивания бобовых культур требует мало ввода азотных удобрений и таким образом способствует устойчивому развитию сельского хозяйства. Бобовых производства, листья и семена с высоким содержанием белка, служит отличным кормом и зерновых культур. Однако культивируемых бобовых видов, как правило, имеют сложные генома структур, делая функциональные исследования генов, которые играют ключевую роль в бобовых конкретных процессов громоздким. Люцерна truncatula была широко принята в качестве модели видов бобовых исследований главным образом потому, что (1) он имеет диплоидный генома с размером относительно небольшой гаплоидным геномом (~ 550 Mbp); (2) растения могут быть стабильно преобразованы для функциональных исследований ген; и (3) она тесно связана с люцерны (м. sativa), королева кормов и многих других экономически важных культур для трансляционного исследования. Недавно, последовательность генома truncatula м. резюме Jemalong A17 был выпущен1,2. Аннотация генома показывает, что существует более чем 50000 предсказал генов или модели генов в геноме. Чтобы определить функцию большинства генов в . м. truncatula геном является сложной задачей. Чтобы облегчить функциональные исследования генов, всеобъемлющей коллекции мутантов в диапазоне свыше 150000 M1 линии был сгенерирован с помощью быстрых нейтронах бомбардировки (ФНБ) мутагенеза в . м. truncatula cv Jemalong A173 ,4. Быстрых нейтронов, высокой энергии ионизации мутаген, был использован в генерации мутантов в многих видов растений, включая Arabidopsis5,6,7риса (Oryza sativa), помидоры (Solanum lycopersicum), сои (Glycine сои; G. Макс)8,9, ячменя (Hordeum vulgare) и Lotus japonicus10. Большая часть мутаций, производный от мутагенеза FNB обусловлены ДНК удаления этого диапазона размером от нескольких пар до мега низкопробных пар9,11. Многие связанные с фенотипом гены были успешно выявлены и охарактеризованы4,12,13,14,,1516, 17 , 18 , 19. ранее, молекулярное клонирование базового генов от мутантов FNB полагались на карта на основе подхода, который отнимает много времени и ограничивает количество мутантов, чтобы охарактеризовать на молекулярном уровне. Недавно, несколько бесплатные подходов, включая методы, основанные на стенограмму, геном, черепица на основе массива Сравнительная геномная гибридизация (CGH) ДНК копии номер варианта обнаружения и всего генома, были использованы для облегчения характеристика удаления мутантов в различных организмах, включая животных и растений20,21,,2223,24,25, 26,27,28,,2930,31.
Для облегчения характеризации FNB мутантов в . м. truncatula, всего геном на основе массива сравнительной геномной гибридизации (CGH) платформа разработана и проверены. Как сообщалось в животных систем, на основе массива CGH платформа позволяет обнаружение копировать количество вариаций (CNVs) на уровне всего генома в . м. truncatula FNB мутантов. Кроме того поражения может быть подтверждена ПЦР и удаление границ могут быть идентифицированы по виртуализации. В целом платформа CGH массив является эффективным и действенным инструментом выявления поражений в . м. truncatula FNB мутантов. Здесь проиллюстрированы массив CGH процедуры и ПЦР характеристика удаления границ в мутанта FNB м. truncatula .
Следующий протокол обеспечивает экспериментальные шаги и информацию о реагентов, оборудования и инструменты анализа для исследователей, которые заинтересованы в проведении анализа на основе массива Сравнительная геномная гибридизация (CGH) всего генома копия числа вариации в растениях. В качестве примера Люцерна truncatula FN6191 мутант была использована для выявления удаления регионов и кандидат генов, связанных с мутант фенотипов. М. truncatula FN6191 мутант, первоначально изолирован от быстрых нейтронах бомбардировки индуцированной удаления мутант коллекции32 (см. Таблицу материалы), выставлены гипер узелки фенотип после прививки с почвой бактерия, Sihorhizobium meliloti Sm1021, в отличие от дикого типа растений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: на рисунке 1 показано пять шагов для массива CGH протокол. Они являются: 1) подготовка растительных материалов; 2) изоляции высокого качества образцов ДНК; 3) обозначать и очистки образцов ДНК; 4) гибридизации, мойки и сканирование всего генома массивов; и 5) анализа данных CGH. М. truncatula весь геном черепица массивы содержат в общей сложности 971,041 уникальный oligo зонды, нацеленных на более чем 50 000 генов или модели гена в геном (см. таблицу материалов). Уникальный зонды находились на расстоянии приблизительно каждые 150 пар оснований (ВР) в exonic регионах и 261 bp в intronic регионах генома м. truncatula.
1. Подготовка растений материалы
- Scarify дикого типа (WT; М. truncatula cv Jemalong A17) и FN6191 мутант семена с концентрированной серной кислотой 8 мин (см. Таблицу материалы). Снимите и выбросьте серной кислоты для жидких отходов контейнер.
- Сполосните семена газобетона деионизированной водой три раза.
- Поверхность стерилизации семян раствором отбеливателя 20% за 10 мин.
- Сполосните семена газобетона деионизированной водой три раза.
- Хранилище семян на 4 ° C на 3 дня. После яровизация, передачи и прорастанию семян в почве за одну неделю в камере роста с 16 h/8 h интенсивность света свет/темно цикла и 150 µE/m/s 2.
- Пересадка саженцев на 1 галлон горшки и вырастить их в парник с циклом 16/8 ч свет/темно, 150 µE/m 2/s интенсивности света для трех-четырех недель. Собирают молодые листья образцы из растений для изоляции ДНК.
2. Изоляции высокого качества образцов ДНК
- 1 г ткани молодых листьев с одного завода и немедленно заморозить ее в жидком азоте.
- Измельчения замороженных листовой ткани в жидком азоте с ступку и пестик для тонкого порошка.
- Изолировать геномной ДНК с ДНК изоляции комплект (см. Таблицу материалы).
- Ресуспензируйте очищенная ДНК образцов в 50 мкл газобетона двойной дейонизированной H 2 O (ddH 2 O) или 1 x TE буфера (10 мм трис-HCl, 1 мм ЭДТА, рН 7,0).
- ДНК измерения концентрации с спектрофотометр (см. Таблицу материалы).
- Оценить 260 Нм/280 Нм и 260 Нм/230 Нм соотношения образцов ДНК.
Примечание: Высокое качество образцов ДНК должны иметь 260 Нм/280 Нм коэффициент ≥ 1.8 и 260 Нм/230 Нм коэффициент ≥ 2.0. - Дальнейшей оценки образцов ДНК, запустив их в 1% гелей агарозы.
Примечание: Высокое качество образцов ДНК должны иметь высокий молекулярный вес и не должны быть загрязнены РНК. В идеале, конечная концентрация ДНК образцов должна быть ~ 150 нг/мкл.
3. ДНК маркировки и очистки
- развести 1 мкг геномной ДНК образцов с ddH 2 O конечный объем 20 мкл в 500 мкл пластиковых пробирок.
- Добавить 5 мкл случайного праймера (см. Таблицу материалы) на трубе.
- Вихревой трубе кратко и положил его в Термоциклер инкубировать и денатурировать ДНК на 98 ° C на 10 мин
- Возьмите трубку из Термоциклер и положил его сразу в ледяной воде, чтобы холод в течение 5 минут
- Подготовка двух маркировки смеси, как показано в таблице 1.
- Добавить 25 мкл маркировки смесей 1 и 2 ссылка ДНК и ДНК образцов труб, соответственно.
- Смешать маркировки смеси и ДНК, закупорить три раза и спин трубы кратко.
- Положить трубы в Термоциклер для инкубации при 37 ° C 2 h, а затем при 65 ° C за 20 мин до инактивирует фермент exo фрагменты (см. Таблицу материалы).
- Добавить 430 мкл 1 x TE буфера к каждой пробке.
- Смешать содержимое и спин трубы кратко.
- Передачи, решение в трубку в столбец очистки с коллекцией 2 мл трубки (см. Таблицу материалы).
- Центрифуга столбце очистки в 14.000 x g за 10 мин.
- Проходят через решение отменить.
- Добавить 480 мкл 1 x TE буфер для каждого столбца,.
- Центрифуга столбце снова в 14.000 x g за 10 мин.
- Отменить решение сквозного.
- Передачи надписью образец ДНК, которая остается в нижней части столбца для новых пластиковых пробирок.
- Измерить объем помечены образца ДНК с помощью пипетки и предавать конечный объем 80 мкл с 1 x TE буфера.
- Измерения концентрации обозначенных образца ДНК, используя спектрофотометр (см. Таблицу материалы).
- Смешать равное количество помечены образец ДНК и ссылаться на ДНК и довести до 160 мкл с 1 x буфер TE окончательный объем.
- Добавить 256 мкл 2 x гибридизации буфера, 50 мкл ДНК человека Cot-1 и 50 мкл 10 × aCGH блокировки агента (см. Таблицу материалы) и смешайте их хорошо закупорить три раза.
- Спин трубы кратко и положил их в Термоциклер для инкубации на 98 ° С за 10 мин.
- Инкубировать труб при 37 ° C в течение 20 мин.
4. Гибридизация, мытье и сканирование массивов генома
- предварительно теплой печь гибридизации до 67 ° C по меньшей мере 4 ч до начала гибридизации.
- Место слайд прокладку на основание камеры гибридизации.
- Нагрузки 490 мкл раствора гибридизации с шагом 3.23 слайд прокладку.
- Покрытия прокладка слайд с чипом microarray генома Medicago truncatula образовать камеру гибридизации.
- Поставить на крышки камеры гибридизации и затяните камеры с прижимами.
- Положите зале собраны гибридизации в печь гибридизации и Инкубируйте на 67 ° C для 40-48 ч.
- Подготовка трех слайдов, мытье посуды: два с 250 мл отмывающего буфера я храниться при комнатной температуре, и один с отмывающего буфера II в 37 ° C.
- Подготовить два слайд мытья банок: один с 70 мл ацетонитриле и один с 70 мл стабилизации и сушки решение; держать в вытяжной шкаф при комнатной температуре (см. Таблицу материалы).
- Удалите гибридизации камеры из печи и камеры зажимы и обложка.
- Перемещения microarray чипа и прокладка слайд слайд Стиральная блюдо с буфером мыть я и отдельный чип от крышка слайд.
- Переместить microarray чип для второй слайд Стиральная блюдо с мыть буфера я и аккуратно распространить решение с баром переполох на Плиты магнитные перемешать при комнатной температуре на 5 мин
- Передача microarray чип на третий слайд, мытье блюдо с подогретым Отмывающий буфер II и промойте его осторожно перемешать бар на Плиты магнитные перемешать при 37 ° C за 1 мин
- Передача обломоку microarray слайд мытья банку с Ацетонитрил в зонта и мыть его за 30 s.
- Передача обломоку microarray слайд банку с стабилизации стирки и сушки раствора и промыть его на 30 s.
- Вынуть чип медленно и высушить его за 1 мин
- Сканирования обломоку microarray дна с использованием сканера (см. Таблицу материалы) до 2 мкм резолюции. Установите параметры для сохранения нескольких изображений и весь слайд сканирования. Установить каналы 1 и 2 до 100% и отменить auto gain.
5. Анализ данных CGH
- экстракт Cy3 и Cy5 флуоресцирования интенсивности для каждого зонда на массив с помощью программного обеспечения сканирования (см. Таблицу материалы).
- Анализ сегментации использования программного обеспечения для обнаружения копии номер вариаций (CNVs) между образец ДНК и ДНК ссылкой. Используйте порог сегмента среднего журнал 2 образца/эталона соотношение ± 2,5 стандартных отклонений для определения CNVs.
- Проверить распределение журнала 2 образца/эталона соотношения через весь геном с помощью программного обеспечения отображения сигнала (см. Таблицу материалы).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Рисунок 2 показывает распределение коэффициентов2 нормализованных журнала мутант против WT сигналы через весь геном. Анализ данных CGH показал примерное удаление 22 КБ на хромосоме 4, которая охватывает весь ген SUNN 33 и несколько других Аннотированная генов в FN6191 мутанта (рис. 2, рис. 3). Кандидат удаленные региона была покрыта 73 последовательных преобразователей на массив с соотношением2 среднее нормализованных журнала меньше -2,5 (Справочная таблица 1). Проверку удаления границ предложил, что предполагаемый удаление в этот мутант окружении зонды, расположенный между координатами 22,313,168 и 22,334,934 на хромосоме 4 (рис. 3). Чтобы подтвердить удаление границ, праймеры PCR были предназначены для примерно 1500 bp Помимо прогнозируемого удаление границ (FN6191-DB-F: GCTAGCAAGGGTCTGCGCAAGTT; FN6191-DB-R: GTATCGAGAAGGTCTTATAGCAGC) и амплификации PCR была выполнена с этими грунты и следующие параметры: 94 ° C, 5 мин; 94 ° C, 45 s, 55 ° C, 30 s, 72 ° C, 1.5 мин; для 35 циклов; 72 ° C, 10 мин и затем 10 ° C на неопределенный срок. Как и ожидалось, один продукт PCR приблизительно 1,5 КБ был успешно усиливается от FN6191 мутант, но не WT (рис. 4A). Основываясь на v3.5 релиз генома м. truncatula , был оценкам размер удаления в FN 6191 26.67 КБ (рис. 4В). CGH результаты показали, что без других аномальных сегменты присутствуют в геноме мутантные FN6191 (рис. 2).
Рисунок 1: Процесс анализа массива Сравнительная геномная гибридизация (aCGH) м. truncatula мутант. (A) подготовка растительных материалов: м. truncatula дикого типа (Jemalong A17) и FN6191 мутант были выращены для трех-четырех недель в парнике. (B) изоляции высокого качества геномной ДНК: один грамм молодых листьев от одного растения был использован для изолировать геномной ДНК. ДНК качества определялся с помощью спектрофотометра и гель электрофореза. (C) ДНК маркировки и очистки. Геномная ДНК ведения и экспериментальных образцов были помечены цианиновые 3 (Cy3) и Cy5 с помощью ДНК маркировки Кит и очищается с помощью столбца очистки. (D) гибридизации, мойки и сканирование 1 x 1 М . м. truncatula CGH массива. (E) CGH анализ: журнал2 коэффициенты экспериментальной/ссылка сигналов, которые меньше или равны -2,5 или больше чем или равен 2,5 считаются предполагаемого изъятия и дублирования, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Массива на основе анализа сравнительной геномной гибридизации копировать количество вариаций в мутанта гипер узелки truncatula м. FN6191. Изображены журнала2 мутант/дикого типа соотношения зондов на всех восьми хромосом. Подряд регион 73-зонд на хромосоме 4 была определена как удаленные региона в мутанта (стрелка). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
На рисунке 3. Идентификации удаленных региона в мутанта FN6191 м. truncatula . В увеличенном региона на хромосоме 4, в котором 73 microarray зонды выставлены значительно сократить журнал2 мутант/дикого типа соотношения, и шесть сопоставлены генов, включая SUNN (Medtr4g070970). Стрелки указывают местоположение и направление праймеров для амплификации PCR удаления границ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: Подтверждение удаления границы в мутанта truncatula м. FN6191. (A) PCR амплификация удаление границ: 1,5 КБ продукт был усиленный от FN6191 мутант, используя праймеры фланговые удаление границ (переулок 1; Му). Тот же набор праймеры не усиливают любых продуктов от WT (м. truncatula Jemalong A17) связано с ограничением размера ПЦР (лэйн 2; WT). Лейн M, лестница 1 КБ. (B) последовательности удаления перекрестка в FN6191 мутант. Стрелка обозначает удаление соединения. (C) секвенирования результаты показали, что удаление границ (стрелки) расположен в точке с координатами 22309163 и 22335836 на 4-й хромосоме. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Маркировка mix 1 | В реакции x образец # (мкл) | Маркировка микс 2 | В реакции x Референтный # (мкл) |
| ddH2O | 6.0 x | ddH2O | 6.0 x |
| 5 x буфера | 10.0 x | 5 x буфера | 10.0 x |
| 10 x dNTPs | 5,0 x | 10 x dNTPs | 5,0 x |
| Цианиновые 5 | 3.0 x | Цианиновые 3 | 3.0 x |
| EXO фрагменты | 1.0 x | EXO фрагменты | 1.0 x |
| Итого | 25 x | Итого | 25 x |
Таблица 1: Маркировка смеси.
Справочная таблица 1: Зонд последовательностях удален в. м. truncatula FN6191 мутант.
Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы разработали платформу на основе массива CGH для обнаружения и определения характеристик быстрых нейтронах бомбардировки (ФНБ)-индуцированной мутантов в . м. truncatula cv. Jemalong A17. Чтобы продемонстрировать использование массива CGH метод выявления мутаций гена, мы провели анализ aCGH мутант FN6191, который exhibited фенотип гипер узелки в отличие от дикого типа растений, когда прививки с S. meliloti Sm1021. Для анализа сегментации сегмент было сочтено значительным, если коэффициент2 журнала означает из зондов в сегменте был выше верхнего порога или ниже нижнего порога для сравнения данного массива. Верхний порог для каждого сравнения было установлено значение коэффициента2 журнала 95-й процентиль всех точек данных. Нижний порог для каждого сравнения было установлено значение коэффициента2 журнала 5-го процентиля всех точек данных24.
Наш анализ показал, что значительные копии номер изменения могут быть определены путем извлечения сегментов с соотношением2 среднее нормализованных журнала больше, чем в среднем 2,5 SD (дублирования) или меньше, чем в среднем 2,5 SD (удаление). Основываясь на анализе CGH, мы обнаружили удаления региона с предполагаемый размер 22 КБ на хромосоме 4, охватывающих ген SUNN 33. Секвенирование результаты подтвердили, что удаление размер 26.67 КБ, основанный на м. truncatula генома релиз v3.5. Было показано, что SUNN кодирует CLV1-как лейцин богатые повторить рецептор киназы, который контролирует число конкреций в . м. truncatula33. Наши CGH результаты позволяют предположить, что FN6191 нового аллеля SUNN . На основе этих результатов, мы рассудил, что CGH метод в сочетании с фенотипических и генетический анализ может успешно использоваться для быстро идентифицировать кандидата генов в ФНБ удаления мутантов. За последние несколько лет мы использовали эту платформу в идентификации и установлению характеристик многочисленные FNB мутантов для функциональных исследований ген в . м. truncatula34,35. Мы сформировали базу данных копия числа вариаций (CNVs) связанные с FNB мутантных линий36. В этой базе данных удаленных последовательности от CGH анализ свыше 100 подтвердил, что симбиотические узелки мутанты были сопоставлены с геном м. truncatula . Сервер взрыв был создан для облегчения поиска для удаленных последовательностей в коллекции мутантов. Развитие и дальнейшее расширение базы данных, удаление было бы весьма ценным для исследования функциональной геномики, с использованием ресурсов мутант FNB м. truncatula .
ACGH протокол имеет пять основных шагов. Хотя все шаги имеют важное значение и должны осуществляться тщательно как описано выше, следующие объяснения особенно важны: (1) образцы ДНК не должно ухудшаться и не должны быть загрязнены РНК на этапе подготовки; (2) образцы ДНК тест и ссылки должны быть одинаково хорошо подготовлены, чтобы помечены образцы имеют такое же высокое качество; (3) помечены образцы ДНК не должно подвергаться воздействию высокой интенсивности света и высокий уровень озона; и (4) важно сохранить Стиральная II буфера при 37 ° C на этапе стирки.
Охват текущего массива генома м. truncatula является главным образом на exonic регионов и меньше на intronic регионов, а не на всех в intergenic регионах. Освещение в последнем регионах можно повысить, если поражения в этих регионах имеют важное значение для мутантов фенотипов. С другой стороны текущий дизайн зонд имеет меньше энергии в определении малых мутаций и единичных нуклеотидных полиморфизмов (ОНП). Это ограничение можно преодолеть с помощью CGH + SNP microarray дизайн37. В целом геном платформа на основе массива Сравнительная геномная гибридизация (aCGH) является мощным инструментом для анализа числа копирования и структурные изменения в м. truncatula FNB мутантов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют не конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Финансирование этой деятельности обеспечивается частично грант от исследования генома растений NSF (IOS-1127155).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medicago truncatula genome array, 1 x 1 M | Agilent | G4123A | |
| Medicago truncatula FN6191 (mutant) | In house | FN6191 | |
| Medicago truncatula Jemalong A17 (reference) | In house | A17 | |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 320501 | |
| DNeasy Plant Mini Kit | Qiagen | 69104 | |
| Nanodrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | 1000D | |
| SureTag DNA Labeling Kit | Agilent | 5190-3400 | |
| Random primer | Agilent | 5190-3399 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004-1L | |
| Thermocycler | MJ research | PTC-200 | |
| Centrifuge | Labnet international Inc | Spectrafuge 24D | |
| Stabilization and Drying Solution | Agilent | 5185-5979 | |
| Oligo aCGH/ChIP-on-chip Hybridization Kit | Agilent | 5188-5380 | |
| Hybridization Chamber gasket slides | Agilent | G2505 | |
| Human Cot-1 DNA | Agilent | 5190-3393 | |
| Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 1 and 2 | Agilent | 5188-5221 | |
| Hybridization Chamber, stainless | Agilent | G2534A | |
| Hybridization oven | Agilent | G2545A | |
| Purification Columns | Agilent | 5190-3391 | |
| Laser scanner | Roche | MS200 | |
| NimbleScan 2.6 | Roche Nimblegen | 5225035001 | |
| Signal Map 1.9 | Roche Nimblegen | Signalmap1.9 |
References
- Tang, H., et al. An improved genome release (version Mt4.0) for the model legume Medicago truncatula. BMC Genomics. 15, 312 (2014).
- Young, N. D., et al. The Medicago genome provides insight into the evolution of rhizobial symbioses. Nature. 480 (7378), 520-524 (2011).
- Wang, H., Li, G., Chen, R. Fast neutron bombardment (FNB) induced deletion mutagenesis for forward and reverse genetic studies in plants. Floriculture, Ornamental and Plant Biotechnology: Advances and Topical Issues. da Silva, J. T. , 1st ed, Global Science Books. Isleworth, UK. 629-639 (2006).
- Rogers, C., Wen, J., Chen, R., Oldroyd, G. Deletion-based reverse genetics in Medicago truncatula. Plant Physiol. 151 (3), 1077-1086 (2009).
- Alonso, J. M., et al. Five components of the ethylene-response pathway identified in a screen for weak ethylene-insensitive mutants in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (5), 2992-2997 (2003).
- Silverstone, A. L., Ciampaglio, C. N., Sun, T. The Arabidopsis RGA gene encodes a transcriptional regulator repressing the gibberellin signal transduction pathway. Plant Cell. 10 (2), 155-169 (1998).
- Li, X., Lassner, M., Zhang, Y. Deleteagene: a fast neutron deletion mutagenesis-based gene knockout system for plants. Comp Funct Genomics. 3 (2), 158-160 (2002).
- Bolon, Y. T., et al. Phenotypic and genomic analyses of a fast neutron mutant population resource in soybean. Plant Physiol. 156 (1), 240-253 (2011).
- Men, A. E., et al. Fast Neutron Mutagenesis of Soybean (Glycine soja L.) Produces a Supernodulating Mutant Containing a Large Deletion in Linkage Group H. Genome Letters. 1 (3), 147-155 (2002).
- Hoffmann, D., Jiang, Q., Men, A., Kinkema, M., Gresshoff, P. M. Nodulation deficiency caused by fast neutron mutagenesis of the model legume Lotus japonicus. J Plant Physiol. 164 (4), 460-469 (2007).
- Li, X., et al. A fast neutron deletion mutagenesis-based reverse genetics system for plants. Plant J. 27 (3), 235-242 (2001).
- Bourcy, M., et al. Medicago truncatula DNF2 is a PI-PLC-XD-containing protein required for bacteroid persistence and prevention of nodule early senescence and defense-like reactions. New phytol. 197 (4), 1250-1261 (2013).
- Chen, J., et al. Control of dissected leaf morphology by a Cys(2)His(2) zinc finger transcription factor in the model legume Medicago truncatula. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (23), 10754-10759 (2010).
- Ge, L., et al. Increasing seed size and quality by manipulating BIG SEEDS1 in legume species. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (44), 12414-12419 (2016).
- Kalo, P., et al. Nodulation signaling in legumes requires NSP2, a member of the GRAS family of transcriptional regulators. Science. 308 (5729), 1786-1789 (2005).
- Oldroyd, G. E., Long, S. R. Identification and characterization of nodulation-signaling pathway 2, a gene of Medicago truncatula involved in Nod actor signaling. Plant Physiol. 131 (3), 1027-1032 (2003).
- Peng, J., et al. Regulation of compound leaf development in Medicago truncatula by fused compound leaf1, a class M KNOX gene. Plant Cell. 23 (11), 3929-3943 (2011).
- Tsujimoto, Y., et al. Arabidopsis TOBAMOVIRUS MULTIPLICATION (TOM) 2 locus encodes a transmembrane protein that interacts with TOM1. EMBO J. 22 (2), 335-343 (2003).
- Wang, D., et al. A nodule-specific protein secretory pathway required for nitrogen-fixing symbiosis. Science. 327 (5969), 1126-1129 (2010).
- Bejjani, B. A., Shaffer, L. G. Application of array-based comparative genomic hybridization to clinical diagnostics. J Mol Diagn. 8 (5), 528-533 (2006).
- Emerson, J. J., Cardoso-Moreira, M., Borevitz, J. O., Long, M. Natural selection shapes genome-wide patterns of copy-number polymorphism in Drosophila melanogaster. Science. 320 (5883), 1629-1631 (2008).
- Gong, J. M., et al. Microarray-based rapid cloning of an ion accumulation deletion mutant in Arabidopsis thaliana. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (43), 15404-15409 (2004).
- Guryev, V., et al. Distribution and functional impact of DNA copy number variation in the rat. Nat Genet. 40 (5), 538-545 (2008).
- Haun, W. J., et al. The composition and origins of genomic variation among individuals of the soybean reference cultivar Williams 82. Plant Physiol. 155 (2), 645-655 (2011).
- Infante, J. J., Dombek, K. M., Rebordinos, L., Cantoral, J. M., Young, E. T. Genome-wide amplifications caused by chromosomal rearrangements play a major role in the adaptive evolution of natural yeast. Genetics. 165 (4), 1745-1759 (2003).
- Jones, M. R., Maydan, J. S., Flibotte, S., Moerman, D. G., Baillie, D. L. Oligonucleotide Array Comparative Genomic Hybridization (oaCGH) based characterization of genetic deficiencies as an aid to gene mapping in Caenorhabditis elegans. BMC Genomics. 8, 402 (2007).
- Lakshmi, B., et al. Mouse genomic representational oligonucleotide microarray analysis: detection of copy number variations in normal and tumor specimens. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (30), 11234-11239 (2006).
- Mitra, R. M., et al. A Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase required for symbiotic nodule development: Gene identification by transcript-based cloning. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (13), 4701-4705 (2004).
- Rios, G., et al. Characterization of hemizygous deletions in citrus using array-comparative genomic hybridization and microsynteny comparisons with the poplar genome. BMC Genomics. 9, 381 (2008).
- Skvortsov, D., Abdueva, D., Stitzer, M. E., Finkel, S. E., Tavare, S. Using expression arrays for copy number detection: an example from E. coli. BMC Bioinformatics. 8, 203 (2007).
- Werner, J. D., et al. Quantitative trait locus mapping and DNA array hybridization identify an FLM deletion as a cause for natural flowering-time variation. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (7), 2460-2465 (2005).
- Xi, J., Chen, Y., Nakashima, J., Wang, S. M., Chen, R. Medicago truncatula esn1 defines a genetic locus involved in nodule senescence and symbiotic nitrogen fixation. Mol Plant Microbe Interact. 26 (8), 893-902 (2013).
- Schnabel, E., Journet, E. P., de Carvalho-Niebel, F., Duc, G., Frugoli, J. The Medicago truncatula SUNN gene encodes a CLV1-like leucine-rich repeat receptor kinase that regulates nodule number and root length. Plant Mol Biol. 58 (6), 809-822 (2005).
- Horvath, B., et al. Loss of the nodule-specific cysteine rich peptide, NCR169, abolishes symbiotic nitrogen fixation in the Medicago truncatula dnf7 mutant. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (49), 15232-15237 (2015).
- Kim, M., et al. An antimicrobial peptide essential for bacterial survival in the nitrogen-fixing symbiosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (49), 15238-15243 (2015).
- Noble Research Institute. Medicago truncatula Mutant Database. , Available from: https://medicago-mutant.noble.org/mutant/FNB.php (2017).
- Burton, R. SNP genotyping with the next generation of CGH microarray. MLO Med Lab Obs. 45 (7), (2013).
