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Genetics

Uma matriz comparativa Genomic Hybridization plataforma baseada eficiente deteção de cópia número variações induzidas pelo neutrão rápido Medicago truncatula mutantes

Published: November 8, 2017 doi: 10.3791/56470
Automatic Translation
1, 2, 3, 2, 2, 1
1Laboratory of Plant Genetics and Development, Noble Research Institute, 2Genetics Laboratory, University of Oklahoma Health Science Center, 3Medicine and Health School, Li Shui University

Summary

Este protocolo fornece etapas experimentais e informações sobre os reagentes, equipamentos e ferramentas de análise para pesquisadores interessados na realização de análise de hibridação genômica comparativa baseada em array (CGH) do genoma inteiro das variações números de cópia em plantas.

Abstract

Os mutantes são inestimáveis recursos genéticos para estudos de função do gene. Para gerar conjuntos de mutante, três tipos de agentes mutagénicos podem ser utilizados, incluindo biológicos tais como o T-DNA ou transposon, produto químico como Metanossulfonato de etila (EMS), ou físico, como a radiação de ionização. O tipo de mutação observada varia de acordo com o mutagênico utilizado. Para ionização radiação induzida por mutantes, mutações incluem a exclusão, a duplicação ou rearranjo. Enquanto T-DNA ou mutagénese transposon-baseado é limitado a espécies que são suscetíveis a transformação, mutagênese química ou física pode ser aplicado a uma ampla gama de espécies. No entanto, a caracterização das mutações derivadas de mutagênese química ou física tradicionalmente baseia-se numa abordagem de clonagem baseados no mapa, que é a mão de obra intensiva e demorado. Aqui, nós mostramos que uma plataforma de hibridação genômica comparativa baseada em array (protocolo) do genoma de alta densidade pode ser aplicada para eficientemente detectar e caracterizar cópia números variações (CNVs) em mutantes derivados de mutagênese de bombardeio (FNB) de neutrões rápidos em Medicago truncatula, uma espécie de vegetal. Análise de sequências do genoma inteiro mostra que existem mais de 50.000 genes ou modelos de gene em M. truncatula. No presentes, induzida pelo FNB mutantes em M. truncatula são derivadas de mais de 150.000 linhas M1, representando inestimáveis recursos genéticos para estudos funcionais de genes no genoma. A plataforma de protocolo descrita aqui é uma ferramenta eficiente para caracterizar os mutantes FNB-induzida em M. truncatula.

Introduction

Leguminosas (Fabaceae) são a terceira maior família de plantas, com muitas espécies economicamente importantes, tais como a soja (Glycine max) e alfafa (Medicago sativa). Os legumes podem interagir com bactérias fixadoras de nitrogênio solo, geralmente chamado de Rhizobia desenvolver nódulos de raiz no qual o dinitrogênio atmosférico é reduzido a amônia para uso pela planta hospedeira. Como tal, o cultivo de culturas de vegetal requer pouca entrada de fertilizantes nitrogenados e, portanto, contribui para uma agricultura sustentável. Culturas de vegetal produzem folhas e sementes com conteúdo de alta proteína, servindo como forragem excelente e colheitas de grão. No entanto, a espécie vegetal cultivada geralmente têm estruturas complexas do genoma, fazendo estudos funcionais de genes que desempenham papéis-chave em processos específicos de vegetal pesados. Medicago truncatula foi adotado extensamente como uma espécie de modelo para estudos de vegetal principalmente porque (1) ele possui um genoma diploide com um tamanho relativamente pequeno genoma haploide (~ 550 Mbp); (2) plantas estàvel transformam-se para estudos funcionais do gene; e (3) que está intimamente relacionado com alfafa (M. sativa), a rainha das forragens e muitas outras culturas economicamente importantes para estudos de translação. Recentemente, a sequência do genoma de M. truncatula cv Jemalong A17 tem sido lançado1,2. Anotação do genoma mostra que existem mais de 50.000 genes previstos ou modelos de gene no genoma. Para determinar a função da maioria dos genes do M. truncatula genoma é uma tarefa desafiadora. Para facilitar estudos funcionais de genes, uma coleção abrangente de mutantes no intervalo de mais de 150.000 M1 linhas foi gerada usando o mutagenesis de bombardeio (FNB) nêutrons rápidos em M. truncatula cv Jemalong A173 ,4. Nêutron rápido, um agente mutagénico ionização de alta energia, tem sido usado na geração de mutantes em muitas espécies de plantas, incluindo Arabidopsis5,6, arroz (Oryza sativa)7, tomate (Solanum lycopersicum), soja (Glycine soja; G. máx)8,9, cevada (Hordeum vulgare) e Lotus japonicus10. Uma grande parte das mutações derivadas de mutagénese FNB são devido a exclusões de DNA que variam em tamanho de alguns pares de bases a mega pares de base9,11. Muitos genes associados fenótipo foram com êxito identificado e caracterizado4,12,13,14,15,16, 17 , 18 , 19. anteriormente, clonagem molecular dos genes subjacentes de mutantes FNB baseou-se em uma abordagem baseada em mapa, que é demorado e limita o número de mutantes para ser caracterizada a nível molecular. Recentemente, várias abordagens complementares, incluindo métodos baseados em transcrição, genoma telhar hibridação genômica comparativa baseada em array (CGH) para detecção de variação número do DNA cópia e sequenciamento do genoma inteiro, têm sido empregada para facilitar o caracterização de mutantes de exclusão em diversos organismos, incluindo animais e plantas20,21,22,23,24,25, 26,,27,28,29,30,31.

Para facilitar a caracterização de mutantes FNB em M. truncatula, uma todo-genoma baseada em array genômica hibridação comparativa (CGH) plataforma foi desenvolvida e validada. Conforme relatado em sistemas de animais, a plataforma CGH baseada em array permite a detecção de variações de número de cópia (CNVs) ao nível do genoma inteiro em mutantes M. truncatula FNB. Além disso, as lesões podem ser confirmadas por PCR e fronteiras de exclusão podem ser identificadas por sequenciamento. Em geral, a plataforma CGH matriz é uma ferramenta eficiente e eficaz na identificação de lesões em mutantes de M. truncatula FNB. Aqui, o procedimento CGH matriz e caracterização de PCR das fronteiras de exclusão em um mutante FNB M. truncatula são ilustrados.

O seguinte protocolo fornece etapas experimentais e informações sobre os reagentes, equipamentos e ferramentas de análise para os investigadores que estão interessados na realização de análise de hibridação genômica comparativa baseada em array (CGH) do genoma inteiro do número de cópia variações nas plantas. Como exemplo, Medicago truncatula FN6191 mutante foi usado para identificar regiões de exclusão e associados com fenótipos mutantes de genes candidatos. M. truncatula FN6191 mutante, originalmente isolada de um neutrão rápido exclusão induzida por bombardeio mutante coleção32 (ver Tabela de materiais), exibiu um fenótipo de hipernodulação após a inoculação com o solo bactéria, tem Sihorhizobium Sm1021, em contraste com as plantas do tipo selvagem.

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Protocol

Nota: a Figura 1 mostra as cinco etapas para a matriz de protocolo CGH. Eles são: 1) preparação dos materiais de planta; 2) o isolamento de amostras de DNA de alta qualidade; 3) rotulagem e purificação de amostras de ADN; 4) hibridização, lavagem e varredura de matrizes de genoma inteiro; e 5) a análise dos dados CGH. Matrizes de azulejos de genoma inteiro M. truncatula contêm um total de 971.041 prova de oligo exclusivo visando a mais de 50.000 genes ou modelos de gene no genoma (ver tabela de materiais). As sondas originais são espaçadas aproximadamente cada 150 pares de bases (bp) em regiões exônicos e 261 bp em regiões intrônicas do genoma de M. truncatula.

1. preparação de materiais vegetais

  1. Scarify selvagem tipo (WT; M. truncatula cv Jemalong A17) e FN6191 sementes mutantes com ácido sulfúrico concentrado durante 8 min (ver Tabela de materiais). Remova e descarte o ácido sulfúrico para um contentor de resíduos líquido.
  2. Enxaguar as sementes com água destilada esterilizada três vezes.
  3. Superfície de esterilizar as sementes com solução 20% durante 10 min.
  4. Enxaguar as sementes com água destilada esterilizada três vezes.
  5. Sementes de loja a 4 ° C, durante 3 dias. Após a vernalização, transferência e germinar as sementes no solo para uma semana em uma câmara de crescimento com 16 h/8 h ciclo claro/escuro e 150 µE/m 2 /s da intensidade de luz.
  6. Transplante de mudas para potes de 1 galão e cultivá-las em uma estufa com ciclo claro/escuro de 16 h/8 h, 150 µE/m 2 /s intensidade luminosa por três a quatro semanas. Recolher amostras de folha jovem de plantas para isolamento do DNA.

2. Isolamento de amostras de DNA de qualidade alta

  1. tomar 1G de tecido de folha jovem de uma planta e congelá-lo imediatamente em azoto líquido.
  2. Tecido de folha congelada em nitrogênio líquido com um almofariz e um pilão de pó fino de moer.
  3. Isolar o DNA genômico com um isolamento de DNA kit (veja a Tabela de materiais).
  4. Ressuspender purificado amostras de DNA em 50 µ l de autoclave duplo desionizada H 2 O (ddH 2 O) ou tampão TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.0) 1x.
  5. Concentrações de DNA de medida com um espectrofotômetro (ver Tabela de materiais).
  6. Avaliar 260 nm/280 nm e 260 nm/230 rácios de nm de amostras de DNA.
    Nota: As amostras de DNA de alta qualidade devem ter uma relação de nm nm 260/280 ≥ 1.8 e um rácio de nm nm/260 230 ≥ 2.0.
  7. Mais avaliar amostras de DNA, executando-as em 1% gel de agarose.
    Nota: Amostras de DNA de alta qualidade devem ter alto peso molecular e não devem ser contaminadas por RNA. Idealmente, a concentração final de amostras de DNA deve ser ~ 150 ng / µ l.

3. Rotulagem de DNA e purificação

  1. diluir 1 µ g de DNA genômico de amostras com DDQ 2 O até um volume final de 20 µ l em um tubo de centrífuga de 500 µ l.
  2. Adicionar 5 µ l de um primer aleatório (ver Tabela de materiais) para o tubo.
  3. Vortex o tubo momentaneamente e colocá-lo em um thermocycler para incubar e desnaturar o DNA a 98 ° C por 10 min.
  4. Pegue o tubo fora do thermocycler e colocá-lo imediatamente em água gelada para esfriar por 5 min.
  5. Misturas de preparar dois rotulagem conforme mostrado na tabela 1.
  6. Tubos de adicionar 25 µ l de rotulagem misturas 1 e 2 a referência DNA e DNA da amostra, respectivamente.
  7. Misture a mistura de rotulagem e DNA pipetando três vezes e girar os tubos brevemente.
  8. Colocar os tubos em um thermocycler para incubar a 37 ° C por 2 h e em seguida a 65 ° C por 20 min inativar a enzima Klenow-exo (ver Tabela de materiais).
  9. Adicionar 430 µ l de tampão TE a cada tubo 1x.
  10. Misturar o conteúdo e girar os tubos brevemente.
  11. Transferência da solução no tubo em uma coluna de purificação com uma coleção de 2 mL do tubo (ver Tabela de materiais).
  12. Centrífuga da coluna de purificação a 14.000 x g durante 10 min.
  13. Descartar o passar solução.
  14. Adicionar 480 µ l 1 x buffer de TE para cada coluna.
  15. Centrifugar a coluna novamente a 14.000 x g, durante 10 min.
  16. Eliminar a solução passagem.
  17. Transferir a amostra de DNA etiquetada que permanece na parte inferior da coluna para um novo tubo de centrifuga.
  18. Medir o volume da amostra do DNA rotulado com uma pipeta e trazer o volume final de 80 µ l com tampão TE 1x.
  19. Medir a concentração da amostra do DNA etiquetada usando um espectrofotômetro (ver Tabela de materiais).
  20. Misturar uma quantidade igual de rotuladas amostra de DNA e DNA de referência e trazer o volume final a 160 µ l de tampão TE 1x com o.
  21. Adicionar 256 µ l de 2x do tampão de hibridização, 50 µ l de DNA humano berço-1 e 50 µ l de 10 × agente bloqueio de protocolo (ver Tabela de materiais) e misturá-los bem pipetando por três vezes.
  22. Gire os tubos brevemente e colocá-los em um thermocycler para incubar a 98 ° C por 10 min.
  23. Incubar os tubos a 37 ° C por 20 min.

4. Hibridização, lavagem e digitalização das matrizes do genoma

  1. pré-aquecer o forno de hibridização a 67 ° C pelo menos 4 h antes do início da hibridação.
  2. Colocar um slide de vedação na base de uma câmara de hibridação.
  3. Carga 490 µ l da solução de hibridação partir 3.23 passo a lâmina junta.
  4. Cobrir o slide junta com um chip de microarray do genoma de Medicago truncatula para formar uma câmara de hibridação.
  5. Colocar as tampas de câmara de hibridação e aperte a câmara firmemente com grampos.
  6. Coloque a câmara de hibridação montado para o forno de hibridização e incubar a 67 ° C por 40-48 h.
  7. Slide preparar três pratos de lavagem: dois com 250 mL de tampão de lavagem mantidos em temperatura, e uma com tampão II de lavagem mantida a 37 ° C.
  8. Slide Prepare dois frascos de lavagem: um com 70 mL acetonitrilo e outro com solução de secagem e estabilização de 70 mL; manter os dois em uma coifa em temperatura ambiente (ver Tabela de materiais).
  9. Retire a câmara de hibridação do forno e remova os grampos da câmara e tampa.
  10. Mover a microplaqueta de microarray e Gaxeta deslize para um prato de lavagem de slide com tampão de lavagem eu e separam o chip no slide de tampa de.
  11. Mover o microarray chip para a lavagem de slide segunda prato com tampão de lavagem eu e circular suavemente a solução com uma barra de agitação em uma placa de agitação magnética em temperatura ambiente por 5 min.
  12. Transferência do microarray do chip para o terceiro slide lavar prato com tampão de lavagem previamente aquecido II e lavá-lo suavemente com uma barra de agitação em uma placa de agitação magnética a 37 ° C por 1 min.
  13. Transferir o chip de microarray para um slide lavar a jarra com acetonitrilo em uma coifa e lavá-lo por 30 s.
  14. Transferir o chip de microarray para um slide jar com estabilização de lavagem e secagem de solução e lave-o por 30 s.
  15. Tire o chip lentamente e secá-lo por 1 min.
  16. Scan o chip de microarray usando um scanner (ver Tabela de materiais) de 2 µm de resolução. Definir parâmetros para salvar várias imagens e todo deslize varreduras. Definir canais 1 e 2 de ganhos de 100% e cancelar o auto ganho.

5. Análise de dados de CGH

  1. extrato da fluorescência Cy3 e Cy5 intensidades para cada sonda na matriz usando o software de digitalização (ver Tabela de materiais).
  2. Análise de segmentação de utilização do software para detectar variações de número de cópia (CNVs) entre a amostra DNA e o DNA de referência. Use um limite dos segmento média de log 2 amostra/referência relação ± 2,5 desvios-padrão para determinar CNVs.
  3. Inspecionar a distribuição das taxas de amostra/referência 2 log através do genoma inteiro usando um software de mapeamento de sinal (ver Tabela de materiais).

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Representative Results

A Figura 2 mostra a distribuição da proporção de2 registo normalizado do mutante contra WT sinais em todo o genoma inteiro. A análise dos dados CGH revelou uma aproximada 22 kb exclusão no cromossomo 4 que abrange o inteiro SUNN gene33 e diversas outras anotado genes em mutante FN6191 (Figura 2, Figura 3). A região de candidatos excluídos foi coberta por 73 sondas consecutivas na matriz, com as média normalizada de log2 relações menos de-2.5 (Supplemental tabela 1). Uma inspeção das fronteiras de exclusão sugeriu que a exclusão putativa nesse mutante é ladeada por sondas, localizadas entre as coordenadas 22,313,168 e 22,334,934 no cromossomo 4 (Figura 3). Para confirmar as fronteiras de exclusão, iniciadores de PCR foram projetados para serem aproximadamente 1.500 bp para além das fronteiras de exclusão previsto (FN6191-DB-f: GCTAGCAAGGGTCTGCGCAAGTT; GTATCGAGAAGGTCTTATAGCAGC de FN6191-DB-R:) e amplificação por PCR foi executada com estas primeiras demão e os seguintes parâmetros: 94 ° C, 5 min; 94 ° C, 45 s, 55 ° C, 30 s, 72 ° C, 1,5 min; para 35 ciclos; 72 ° C, 10 min e 10 ° C indefinidamente. Como esperado, um único produto PCR de aproximadamente 1,5 kb com êxito foi amplificado do mutante FN6191, mas não WT (Figura 4A). Baseia o genoma de M. truncatula lançamento v 3.5, o tamanho da exclusão em FN 6191 foi estimado em 26,67 kb (Figura 4B). Os resultados CGH mostraram que outros segmentos não anormais estão presentes no genoma de mutantes FN6191 (Figura 2).

Figure 1
Figura 1: Fluxo de trabalho de análise de hibridização genômica comparativa (protocolo) matriz de M. truncatula mutante. (A) preparação dos materiais de planta: tipo de M. truncatula selvagem (Jemalong A17) e FN6191 mutante foram cultivadas por três a quatro semanas em estufa. (B) isolamento do DNA genômico de alta qualidade: uma grama de folhas jovens de plantas individuais foi usada para isolar o DNA genômico. Qualidade do DNA foi determinada utilizando um espectrofotômetro e gel de electroforese. (C) DNA rotulagem e purificação. DNAs genomic de referência e amostras experimentais foram rotulados com cianina 3 (Cy3) e Cy5 usando uma rotulagem de DNA kit e purified usando uma coluna de purificação. (D) hibridização, lavagem e varredura de 1 x 1 M M. truncatula matriz CGH. (E) CGH análise: Log2 rácios de sinais experimentais/referência que são menor ou igual a-2.5 ou maior ou igual a 2,5 é considerados como putativos deleções e duplicações, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Matriz com base em análise de hibridização genômica comparativa das variações números de cópia em M. truncatula nodulação hiper mutante FN6191. Mostrados são log rácios de tipo mutante/wild2 de sondas em todos os oito cromossomas. Uma região de 73-sonda consecutiva no cromossoma 4 foi identificada como a região excluída o mutante (seta). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3. Identificação da região excluída em M. truncatula FN6191 mutante. Uma vista close-up da região no cromossomo 4, no qual 73 microarray sondas exibiram significativamente reduzido log2 tipo de mutante/wild rácios, e seis mapeados genes incluindo SUNN (Medtr4g070970). As setas indicam a localização e a direção de primers para amplificação por PCR das fronteiras de exclusão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Confirmação de exclusão de fronteira em FN6191 M. truncatula mutante. (A), PCR amplificação das fronteiras de exclusão: um produto de 1,5 kb foi amplificado do mutante FN6191 usando as primeiras demão flanqueando as fronteiras de exclusão (faixa 1; MU). O mesmo conjunto de primers não amplificar qualquer produtos de WT (M. truncatula Jemalong A17) devido a uma limitação de tamanho de PCR (faixa 2; WT). Lane M, escada de 1 kb. (B) sequências da junção de exclusão no FN6191 mutante. Uma seta indica a junção de exclusão. (C) sequenciamento resultados mostrou que as fronteiras de exclusão (setas) estão localizadas nas coordenadas 22309163 e 22335836 no cromossoma 4. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Rotulagem de mistura 1 Por reação # (μL) da amostra x Rotulagem de mistura 2 Por reação x referência # (μL)
ddH2O 6,0 x ddH2O 6,0 x
5 x tampão 10,0 x 5 x tampão 10,0 x
10 x dNTPs 5.0 x 10 x dNTPs 5.0 x
Cianina 5 3.0 x Cianina 3 3.0 x
EXO-Klenow 1,0 x EXO-Klenow 1,0 x
Total 25 x Total 25 x

Tabela 1: Rotulagem de misturas.

Suplementar tabela 1: Sonda sequências excluído no M. truncatula FN6191 mutante.
Por favor clique aqui para baixar este arquivo.

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Discussion

Nós desenvolvemos uma plataforma CGH baseada em array para a detecção e caracterização de bombardeamento de neutrões rápidos (FNB)-induzido mutantes em M. truncatula CV Jemalong A17. Para demonstrar o uso da matriz método CGH na detecção de mutações genéticas, realizamos análise de protocolo do mutante FN6191, que exibiu um fenótipo de hipernodulação em contraste com plantas de tipo selvagem, quando inoculados com S. tem Sm1021. Para a análise de segmentação, um segmento foi considerado significativo se o rácio de2 log dizer das sondas dentro do segmento estava acima do limite superior ou abaixo do limite inferior para essa comparação de matriz determinada. O limite superior para cada comparação estava determinado a ser o valor do rácio de2 log ao percentil 95 de todos os pontos de dados. O limite inferior para cada comparação estava determinado a ser o valor do rácio de2 log do 5% de todos os pontos de dados24.

Nossa análise mostrou que mudanças de número significativo de cópia podem ser determinadas pela recuperação de segmentos com um rácio de2 registo normalizado média maior que a média de 2,5 SD (duplicação) ou menor que a média por 2.5 SD (exclusão). Com base na análise CGH, detectamos uma região de exclusão com um tamanho estimado de 22 kb no cromossomo 4, englobando o SUNN gene33. Sequenciamento resultados confirmou que o tamanho de exclusão era 26,67 kb baseado no M. truncatula genoma lançamento v 3.5. Tem sido demonstrado que SUNN codifica uma quinase do receptor de repetição rico em leucina de CLV1, como que controla o número de nódulo em M. truncatula33. Nossos resultados CGH sugerem que o FN6191 é um novo alelo SUNN . Com base nesses resultados, nós raciocinou que o método CGH juntamente com fenotípica e análise genética pode ser usada com sucesso para rapidamente identificar genes candidatos em mutantes de exclusão FNB. Ao longo dos últimos anos, temos utilizado esta plataforma em identificar e caracterizar vários mutantes FNB para estudos funcionais do gene em M. truncatula34,35. Podemos ter gerado um banco de dados de variações de número de cópia (CNVs) associado a FNB mutante linhas36. Neste banco de dados, sequências excluídas das análises CGH de mais de 100 confirmaram a nodulação simbiótica mutantes foram mapeados para o genoma de M. truncatula . Um servidor de explosão criou para facilitar a busca de sequências excluídas na coleção mutante. O desenvolvimento e a expansão adicional do banco de dados de exclusão seria altamente valiosas para pesquisa de genômica funcional usando M. truncatula FNB mutantes recursos.

O protocolo protocolo tem cinco etapas principais. Apesar de todos os passos são importantes e devem ser realizados cuidadosamente conforme descrito anteriormente, os followings são especialmente críticos: (1) amostras de DNA não deve ser prejudicado e não deve ser contaminada por RNA durante a etapa de preparação; Amostras de DNA de teste e de referência (2) devem ser igualmente bem preparadas para que as amostras rotuladas da mesma alta qualidade; (3) rotulada de amostras de DNA não devem ser expostas a uma alta intensidade de luz e um elevado nível de ozônio; e (4) é importante manter a lavagem Buffer II a 37 ° C durante a etapa de lavagem.

A cobertura da matriz de genoma de M. truncatula atual é principalmente sobre as regiões exônicos e menos sobre as regiões intrônicas e não em regiões intergênicas. A cobertura nas regiões este último pode ser melhorada se lesões nestas regiões são importantes para os fenótipos mutantes. Por outro lado, o atual projeto sonda tem menos poder na identificação de pequenas mutações e polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs). Esta limitação pode ser superada por meio de projeto de microarray CGH + SNP37. Em geral, a plataforma de hibridação genômica comparativa baseada em array (protocolo) do genoma é uma poderosa ferramenta para a análise do número de cópia e variações estruturais em mutantes M. truncatula FNB.

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Disclosures

Os autores declaram não concorrentes interesses financeiros.

Acknowledgments

Financiamento deste trabalho é fornecido em parte por uma concessão do NSF planta Genome Research (IOS-1127155).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Medicago truncatula genome array, 1 x 1 M Agilent G4123A
Medicago truncatula FN6191 (mutant) In house FN6191
Medicago truncatula Jemalong A17 (reference) In house A17
Sulfuric acid Sigma-Aldrich 320501
DNeasy Plant Mini Kit Qiagen 69104
Nanodrop Spectrophotometer Thermo Scientific 1000D
SureTag DNA Labeling Kit Agilent 5190-3400
Random primer Agilent 5190-3399
Acetonitrile Sigma-Aldrich 271004-1L
Thermocycler MJ research PTC-200
Centrifuge Labnet international Inc Spectrafuge 24D
Stabilization and Drying Solution Agilent 5185-5979
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Hybridization Kit Agilent 5188-5380
Hybridization Chamber gasket slides Agilent G2505
Human Cot-1 DNA Agilent 5190-3393
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 1 and 2 Agilent 5188-5221
Hybridization Chamber, stainless Agilent G2534A
Hybridization oven Agilent G2545A
Purification Columns Agilent 5190-3391
Laser scanner Roche MS200
NimbleScan 2.6 Roche Nimblegen 5225035001
Signal Map 1.9 Roche Nimblegen Signalmap1.9

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tang, H., et al. An improved genome release (version Mt4.0) for the model legume Medicago truncatula. BMC Genomics. 15, 312 (2014).
  2. Young, N. D., et al. The Medicago genome provides insight into the evolution of rhizobial symbioses. Nature. 480 (7378), 520-524 (2011).
  3. Wang, H., Li, G., Chen, R. Fast neutron bombardment (FNB) induced deletion mutagenesis for forward and reverse genetic studies in plants. Floriculture, Ornamental and Plant Biotechnology: Advances and Topical Issues. da Silva, J. T. , 1st ed, Global Science Books. Isleworth, UK. 629-639 (2006).
  4. Rogers, C., Wen, J., Chen, R., Oldroyd, G. Deletion-based reverse genetics in Medicago truncatula. Plant Physiol. 151 (3), 1077-1086 (2009).
  5. Alonso, J. M., et al. Five components of the ethylene-response pathway identified in a screen for weak ethylene-insensitive mutants in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (5), 2992-2997 (2003).
  6. Silverstone, A. L., Ciampaglio, C. N., Sun, T. The Arabidopsis RGA gene encodes a transcriptional regulator repressing the gibberellin signal transduction pathway. Plant Cell. 10 (2), 155-169 (1998).
  7. Li, X., Lassner, M., Zhang, Y. Deleteagene: a fast neutron deletion mutagenesis-based gene knockout system for plants. Comp Funct Genomics. 3 (2), 158-160 (2002).
  8. Bolon, Y. T., et al. Phenotypic and genomic analyses of a fast neutron mutant population resource in soybean. Plant Physiol. 156 (1), 240-253 (2011).
  9. Men, A. E., et al. Fast Neutron Mutagenesis of Soybean (Glycine soja L.) Produces a Supernodulating Mutant Containing a Large Deletion in Linkage Group H. Genome Letters. 1 (3), 147-155 (2002).
  10. Hoffmann, D., Jiang, Q., Men, A., Kinkema, M., Gresshoff, P. M. Nodulation deficiency caused by fast neutron mutagenesis of the model legume Lotus japonicus. J Plant Physiol. 164 (4), 460-469 (2007).
  11. Li, X., et al. A fast neutron deletion mutagenesis-based reverse genetics system for plants. Plant J. 27 (3), 235-242 (2001).
  12. Bourcy, M., et al. Medicago truncatula DNF2 is a PI-PLC-XD-containing protein required for bacteroid persistence and prevention of nodule early senescence and defense-like reactions. New phytol. 197 (4), 1250-1261 (2013).
  13. Chen, J., et al. Control of dissected leaf morphology by a Cys(2)His(2) zinc finger transcription factor in the model legume Medicago truncatula. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (23), 10754-10759 (2010).
  14. Ge, L., et al. Increasing seed size and quality by manipulating BIG SEEDS1 in legume species. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (44), 12414-12419 (2016).
  15. Kalo, P., et al. Nodulation signaling in legumes requires NSP2, a member of the GRAS family of transcriptional regulators. Science. 308 (5729), 1786-1789 (2005).
  16. Oldroyd, G. E., Long, S. R. Identification and characterization of nodulation-signaling pathway 2, a gene of Medicago truncatula involved in Nod actor signaling. Plant Physiol. 131 (3), 1027-1032 (2003).
  17. Peng, J., et al. Regulation of compound leaf development in Medicago truncatula by fused compound leaf1, a class M KNOX gene. Plant Cell. 23 (11), 3929-3943 (2011).
  18. Tsujimoto, Y., et al. Arabidopsis TOBAMOVIRUS MULTIPLICATION (TOM) 2 locus encodes a transmembrane protein that interacts with TOM1. EMBO J. 22 (2), 335-343 (2003).
  19. Wang, D., et al. A nodule-specific protein secretory pathway required for nitrogen-fixing symbiosis. Science. 327 (5969), 1126-1129 (2010).
  20. Bejjani, B. A., Shaffer, L. G. Application of array-based comparative genomic hybridization to clinical diagnostics. J Mol Diagn. 8 (5), 528-533 (2006).
  21. Emerson, J. J., Cardoso-Moreira, M., Borevitz, J. O., Long, M. Natural selection shapes genome-wide patterns of copy-number polymorphism in Drosophila melanogaster. Science. 320 (5883), 1629-1631 (2008).
  22. Gong, J. M., et al. Microarray-based rapid cloning of an ion accumulation deletion mutant in Arabidopsis thaliana. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (43), 15404-15409 (2004).
  23. Guryev, V., et al. Distribution and functional impact of DNA copy number variation in the rat. Nat Genet. 40 (5), 538-545 (2008).
  24. Haun, W. J., et al. The composition and origins of genomic variation among individuals of the soybean reference cultivar Williams 82. Plant Physiol. 155 (2), 645-655 (2011).
  25. Infante, J. J., Dombek, K. M., Rebordinos, L., Cantoral, J. M., Young, E. T. Genome-wide amplifications caused by chromosomal rearrangements play a major role in the adaptive evolution of natural yeast. Genetics. 165 (4), 1745-1759 (2003).
  26. Jones, M. R., Maydan, J. S., Flibotte, S., Moerman, D. G., Baillie, D. L. Oligonucleotide Array Comparative Genomic Hybridization (oaCGH) based characterization of genetic deficiencies as an aid to gene mapping in Caenorhabditis elegans. BMC Genomics. 8, 402 (2007).
  27. Lakshmi, B., et al. Mouse genomic representational oligonucleotide microarray analysis: detection of copy number variations in normal and tumor specimens. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (30), 11234-11239 (2006).
  28. Mitra, R. M., et al. A Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase required for symbiotic nodule development: Gene identification by transcript-based cloning. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (13), 4701-4705 (2004).
  29. Rios, G., et al. Characterization of hemizygous deletions in citrus using array-comparative genomic hybridization and microsynteny comparisons with the poplar genome. BMC Genomics. 9, 381 (2008).
  30. Skvortsov, D., Abdueva, D., Stitzer, M. E., Finkel, S. E., Tavare, S. Using expression arrays for copy number detection: an example from E. coli. BMC Bioinformatics. 8, 203 (2007).
  31. Werner, J. D., et al. Quantitative trait locus mapping and DNA array hybridization identify an FLM deletion as a cause for natural flowering-time variation. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (7), 2460-2465 (2005).
  32. Xi, J., Chen, Y., Nakashima, J., Wang, S. M., Chen, R. Medicago truncatula esn1 defines a genetic locus involved in nodule senescence and symbiotic nitrogen fixation. Mol Plant Microbe Interact. 26 (8), 893-902 (2013).
  33. Schnabel, E., Journet, E. P., de Carvalho-Niebel, F., Duc, G., Frugoli, J. The Medicago truncatula SUNN gene encodes a CLV1-like leucine-rich repeat receptor kinase that regulates nodule number and root length. Plant Mol Biol. 58 (6), 809-822 (2005).
  34. Horvath, B., et al. Loss of the nodule-specific cysteine rich peptide, NCR169, abolishes symbiotic nitrogen fixation in the Medicago truncatula dnf7 mutant. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (49), 15232-15237 (2015).
  35. Kim, M., et al. An antimicrobial peptide essential for bacterial survival in the nitrogen-fixing symbiosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (49), 15238-15243 (2015).
  36. Noble Research Institute. Medicago truncatula Mutant Database. , Available from: https://medicago-mutant.noble.org/mutant/FNB.php (2017).
  37. Burton, R. SNP genotyping with the next generation of CGH microarray. MLO Med Lab Obs. 45 (7), (2013).

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Chen, Y., Wang, X., Lu, S., Wang, H., Li, S., Chen, R. An Array-based Comparative Genomic Hybridization Platform for Efficient Detection of Copy Number Variations in Fast Neutron-induced Medicago truncatula Mutants. J. Vis. Exp. (129), e56470, doi:10.3791/56470 (2017).

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