המוצג כאן הוא פרוטוקול עבור דגימה של רקמה אנושית היפרדות villous חלקית ואחריה בידוד של cytotrophoblasts לתרבות התא הראשי. טיפול trophoblasts עם TNFα recapitulates דלקת התוך-רחמית שמנים ומקל על גילוי מטרות מולקולריות מוסדר על ידי דלקת מאחד לשני עם השמנת יתר אימהית.
השמנת יתר אימהית קשורה לסיכון מוגבר של תוצאות שליליות הלידה זה סביר בתיווך פרוץ פונקציה היפרדות ניתן לייחס, בין השאר, dysregulation של autophagy. חריגה שינויים בביטוי של הרגולטורים autophagy ב מאחד לשני של הריונות מהשמנת יתר עשוי להיות מפוקח על ידי תהליכים דלקתיים המשויכים השמנת יתר והריון. המתוארים כאן הוא פרוטוקול עבור דגימה של רקמת villous חלקית ובידוד של cytotrophoblasts villous חלקית של השליה האנושית המונח לתרבות התא הראשי. זה מלווה שיטה כדי לדמות את חצרו דלקתיות ב התוך-רחמית מהשמנת יתר על ידי טיפול trophoblasts העיקרי של הריונות רזה עם הגידול נקרוזה מקדם אלפא (TNFα), ציטוקינים proinflammatory כי הוא גבוה ב השמנת יתר הריון. תוך יישום הפרוטוקול המתואר כאן, הוא נמצא כי החשיפה ל אקסוגניים TNFα מווסת את הביטוי של רוביקון, מווסת שלילי של autophagy, ב- trophoblasts של הריונות רזה עם העוברים הנשי. בעוד מגוון רחב של גורמים ביולוגיים התוך-רחמית שמנים לשמור על פוטנציאל לווסת נתיבים קריטיים ב- trophoblasts, מערכת זו שמחוץ היא שימושית במיוחד עבור קביעת אם הביטוי תבניות שנצפה ויוו אנושי מאחד לשני עם השמנת יתר אימהית הם תוצאה ישירה של TNFα איתות. בסופו של דבר, גישה זו מעניקה הזדמנות לנתח את ההשלכות רגולטוריות ומולקולרית של דלקת הקשורות בהשמנת יתר אימהית על autophagy מסלולים אחרים קריטי הסלולר ב trophoblasts שיש להם פוטנציאל לפגיעה פונקציית היפרדות.
השמנת יתר היא מדינה דלקתית המאופיינת בדרגה נמוכה דלקת כרונית, הנובעות רקמת שומן עודף וזמינות חומר מזין. ההשמנה, ציטוקינים proinflammatory גבוהות ברקמות מטבולית וכן מערכתית במחזור. גוף חזקים של הראיות הוכיחו כי TNFα הוא משמעותי גבוה בסביבה של השמנת יתר עם השלכות תנגודת לאינסולין ואת תפקוד מטבולי1. הפעלה של TNFα תורם גם מחלת פתוגנזה בתנאים כגון סרטן, מחלת חיסון עצמי, הפיכתה ליעד אטרקטיבי טיפולית של2.
דלקת ההשמנה מורכב ההריון, גם proinflammatory המדינה3,4. בעבר הוכח כי תוכן TNFα היפרדות מגביר עם השמנה אימהי של הריונות עם העוברים הנשי. יתר על כן, הטיפול TNFα מעכב נשימה מיטוכונדריאלי בתאים trophoblast נקבה אך לא זכר, רומז כי TNFα מעורב בוויסות חילוף החומרים היפרדות בצורה מינית dimorphic5. השמנת יתר אימהית קשורה עם שכיחות מוגברת של מגוון רחב של סיבוכים במהלך ההריון, כולל לידות, בעוברים זכרים להיות רגישים ביותר3,6,7,8 . בשל תפקידה מפתח-הממשק אמהי-עוברית, שינויים ביכולת תפקודית של השליה ב התוך-רחמית שמנים בתגובה איתות דלקתיות עשוי לשחק תפקיד חשוב תיווכה התוצאות של הריונות מהשמנת יתר.
Cytotrophoblasts syncytiotrophoblasts בתוך הרקמה villous חלקית של השליה הם קריטיים עבור איתות האנדוקרינית ו- exchange חומרי מזון וחמצן בין האם לעובר המתפתח9. שיבושים ביכולת תפקודית של cytotrophoblasts villous חלקית (ןלהל trophoblasts) עלול לסכן את בריאות העובר והתפתחות. פרוטוקול זה מתאר שיטת דגימה של רקמת villous חלקית של השליה האנושית המונח על ידי לנתח משם את הצלחות שליה, הבסיס יחד עם שגרת ממוטב עבור בידודו של trophoblasts לתרבות התא הראשי. פרוטוקול זה נגזר מתודולוגיות הוקמה מעורבים עיכול אנזימטי של רקמות villous חלקית כדי לשחרר תאים מטריצה חוץ-תאית ואחריו צפיפות דיפרנציאלית צנטריפוגה כדי לבודד trophoblasts10, 11,12. פרוטוקול זה פרטים גישה שבה trophoblasts העיקרי של מאחד לשני של הריונות רזה מטופלים עם תרבות המדיה בתוספת TNFα כדי לדמות מרכיב אחד של הסביבה שבה התרחשה דלקתיות הקשורות בהשמנת יתר אימהית. לבסוף, מתואר הליך פשוט לשימוש בתא סכום lysates מן trophoblasts שטופלו TNFα ואחריו המערבי סופג כדי לזהות שינויים בביטוי הגנים.
בעוד מודל זה לא מסכם את הדברים obesogenic בתוך הרחם הסביבה בשלמותו, הוא מספק מערכת מבוקרת המאפשר אחד כדי לנתח את תרומתו של הפרט של דלקת בתיווך TNFα בתגובה של trophoblasts השמנת יתר אימהית. מודל זה מעניק את ההזדמנות לגלות או לאשר את מטרות מולקולריות ישירות מוסדר על ידי TNFα איתות ב trophoblasts, כמו גם מאפשר לבדוק אם שינויים בדפוסי ביטוי גנים נצפתה ויוו ב מאחד לשני עם אימהית השמנת יתר עשוי להיות תוצאה של דלקת בתיווך TNFα.
הגישה המתוארת כאן בוצע כדי לבחון את ההשפעה של דלקת בתיווך TNFα על ויסות autophagy ב trophoblasts האנושית. Trophoblasts של הריונות שמנים עם נספח בעוברים זכרים משובשות מחזור autophagic, או autophagosome ההבשלה13. חלבון הנקרא רוביקון (בניהול תחום חלבון אינטראקציה-Beclin1 וציסטאין-עשיר המכיל), אשר הוא מקומי אל lysosomes ואל endosomes המאוחרות, לאחרונה מתוארת כ “בלימה” בתהליך מחזור autophagic כי הוא פועל כמו שלילי הרגולטור של autophagosome-התבגרות-14,–15. למעשה, רוביקון הוא דוגמה נדירה של חלבון זה מרסן autophagy, מה שהופך אותה מטרה טיפולית יקרי ערך. מעט מאוד מידע זמין למשמעות pathophysiological רוביקון, למעט תפקידים שלה בתגובה חיסונית מולדת microbials16,17 ו cardiomyocyte הגנה18. באמצעות הפרוטוקול המתואר כאן הוא נמצא כי רוביקון היא upregulated ב trophoblasts הראשי הנשי בתגובה לטיפול עם הגדלת ריכוזי TNFα עד 250 pg/mL. ברגולציה של רוביקון עשוי לשחק תפקיד איך נשים שהעוברים הנסיעה יותר גברים הריונות עם השמנת יתר אימהית. Recapitulating דלקת הקשורים עם השמנת יתר אימהית ex-vivo על ידי חשיפת האדם trophoblasts ל אקסוגניים TNFα מספק פלטפורמה לחקור את ההשפעה של התוך-רחמית מהשמנת יתר על התקנון של נתיבים קריטיים ב trophoblasts על ידי הרחבת, הפונקציה היפרדות.
השליה, אחראית להסדרת הצמיחה של העובר, תערוכות פונקציה פרוץ ב סביבה שמנים6. למרות דרישות המטבולית גבוהה של trophoblasts, מאחד לשני עם השמנת יתר אימהית התערוכה מתפקדת נשימה מיטוכונדריאלי6,19. שינויים בחילוף החומרים היפרדות עשוי לתרום שכיחות מוגברת של סי…
The authors have nothing to disclose.
המחברים תודה נשים שתרמה שלהם מאחד לשני במחקר זה. אנו מודים גם את העבודה ואת משלוח במחלקת OHSU ואת Maternal צוות המחקר העוברי לתיאום איסוף מאחד לשני. אנו אסירי תודה אריק וונג, Ph.d., ו קלי קואו, MD לתמיכה, לעזור עם שיטות נסיוניות ואופטימיזציה.
עבודה זו מומן על ידי NIH HD076259A (AM) ו AHA GRNT29960007 (AM).
10X HBSS | Gibco | 14185-052 | |
CaCl2 (anhyd.) | Sigma-Aldrich | C1016-100G | |
MgSO4 (anhyd.) | Sigma-Aldrich | M7506-500G | |
Hepes | Fisher Scientific | BP310-500 | |
Trypsin | Gibco | 15090-046 | |
DNAse | Worthington Biochemical Corp. | LS002139 | |
Protease/Phosphatase inhibitors | Thermofisher Scientific | 88668 | |
Tris HCl | Invitrogen | 15506-017 | |
EDTA | Invitrogen | 15576-028 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653-1KG | |
SDS | Fisher Scientific | BP166-600 | |
Sodium deoxycholate. | Fisher Scientific | AAJ6228822 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | |
Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) | Gibco | 12440-046 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
Neonatal Calf Serum (NCS) | Gibco | 26010-074 | |
Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Gibco | 15140-122 | |
10% Formalin | Fisher Scientific | 23-427-098 | |
DMSO | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | |
TNFα | Sigma-Aldrich | SRP3177-50UG | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 70013-032 | |
K2EDTA vacutainer blood collection tubes | BD | 366450 | |
Percoll (Density Gradient Media, DGM) | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
6 well plates | Corning | 353046 | |
Cell strainers | Fisher Scientific | 22363549 | |
Eppendorf Safe-Lock Tubes 2.0 mL, natural | Fisher Scientific | 22363352 | |
Trypan Blue | Corning | 25-900-Cl | |
Bio-Rad Mini-PROTEAN Tetra System | Bio-Rad | 1658001FC | |
Bio-Rad Mini Trans-Blot Cell | Bio-Rad | 1658033 | |
TGX FastCast Acrylamide Kit, 12% | Bio-Rad | 1610175 | |
Mini-Protean 3 Multi-Casting Chamber | Bio-Rad | 1654112 | |
4X Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610747 | |
2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148-100ML | |
Glycine | Bio-Rad | 1610718 | |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | P7949-500ML | |
Instant Nonfat Dry Milk | Carnation | ||
Rubicon (D9F7) Rabbit mAb | Cell Signalling Technology | 8465S | |
Monoclonal Anti-β-Actin antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | A2228-100UL | |
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signalling Technology | 7074S | |
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signalling Technology | 7076S | |
SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34578 |