Summary
여기에 제시 된 인간 placental villous 조직의 기본 세포 배양에 대 한 cytotrophoblasts의 격리 다음 샘플링에 대 한 프로토콜이입니다. TNFα와 trophoblasts의 치료 비만 자궁내 환경에 염증이 분자 대상 산 모 비만과 염증 반응과에 의해 규제의 발견을 촉진 한다.
Abstract
산 모 비만 가능성이 autophagy의 dysregulation, 부분에서, 표시 될 수 있습니다 손상 된 태 반 기능에 의해 중재 불리 한 perinatal 결과의 위험 증가와 연결 됩니다. 비만 임신에서 반응과 autophagy 레 귤 레이 터의 식에서 벗어난 변화는 비만 및 임신과 관련 된 염증 과정에 의해 통제 될 수 있습니다. 여기서 설명 하는 것은 villous 조직의 샘플링 및 기본 세포 배양에 대 한 용어는 인간의 태 반 으로부터 villous cytotrophoblasts의 격리에 대 한 프로토콜이입니다. 이것은 종양 괴 사 인자 알파 (TNFα), proinflammatory cytokine은 고가의 비만 마른 임신에서 기본 trophoblasts 치료 하 여 비만 자궁내 환경에 선 동적인 환경 시뮬레이션을 위한 방법으로 뒤 임신입니다. 여기에 설명 된 프로토콜의 구현을 통해 외 인에 노출 있다 TNFα 루비콘, 여성 태아와 마른 임신에서 trophoblasts에서 autophagy의 부정적인 레 귤 레이 터의 표현을 조절. 다양 한 비만 자궁내 환경에 생물학적 요인 trophoblasts 중요 한 통로 변조 가능성이 유지,이 비보 전 시스템은 식 패턴 vivo에서 관찰 된 경우 결정 하는 데 특히 유용 모성 비만과 인간의 반응과에서 TNFα 신호의 직접적인 결과입니다. 궁극적으로,이 방법은 월급 autophagy 및 다른 중요 한 세포 경로에 영향을 미칠 가능성이 있는 trophoblasts 모성 비만과 관련 된 염증의 규제 및 분자 의미 밖으로 구문 분석 하는 기회 태 반 기능입니다.
Introduction
비만 과잉 지방이 많은 직물 및 양분 가용성에서 형태소 분석 만성 낮은 학년 염증이 특징 염증 성 상태입니다. 비만, proinflammatory cytokines는 상승 된 대사 조직 뿐만 아니라 체계적으로 순환. 증거의 강력한 시체는 TNFα 크게 상승 비만의 설정에서 의미와 함께 인슐린 저항성 및 대사 부전1에 보이고 있다. TNFα의 활성화는 또한 암 등 면역, 그것에 게 매력적인 치료 대상2를 만드는 조건에서 질병 병 인에 기여.
염증 비만에서 임신, 또한 proinflammatory 상태3,4에 의해 복합입니다. 그것은 이전 보였다 태 반 TNFα 콘텐츠 여성 태아와 임신에서 모성 adiposity와 증가. 또한, TNFα 처리 TNFα는 성적으로 동종이 형 방식으로5placental 신진 대사 조절에 관여 하는 것을 건의 하는 여성만 아니라 남성 trophoblast 셀에 미토 콘 드리 아 호흡을 억제. 산 모 비만 임신 동안에, 사 산를 포함 하 여 남성 태아는 가장 취약3,6,7,8 되와 관련 된 다양 한 합병증의 발생률이 증가 . 때문에 산 모 신생아 인터페이스에서의 주요 역할, 염증 신호에 대 한 응답 비만 자궁내 환경에 태 반의 기능 용량에 변화 중재 비만 임신의 결과에 중요 한 역할을 재생할 수 있습니다.
Cytotrophoblasts 및 syncytiotrophoblasts는 태 반의의 villous 조직에 내 분 비 신호 및 어머니와 개발 태아9영양소와 산소 교환에 대 한 중요 하다. 태아 건강 및 개발 villous cytotrophoblasts (trophoblasts 라 함)의 기능 용량에 중단 위태롭게 될 수 있습니다. 이 프로토콜 멀리 trophoblasts 기본 세포 배양에 대 한 격리에 대 한 최적화 절차를 함께 chorionic 및 기저 판 해 부하 여 villous 조직의 인간의 용어 태에서 샘플링 하는 방법을 설명 합니다. 이 프로토콜은 기질 trophoblasts10, 을 차동 밀도 원심 분리에 의해 뒤에서 셀 출시 villous 조직의 효소 소화와 관련 된 설립된 방법론에서 파생 된 11,12. 이 프로토콜 세부 사항 산 모 비만과 관련 된 방법을 반응과 마른 임신에서에서 기본 trophoblasts 문화 미디어 TNFα 선 동적인 환경에의 한 구성 요소를 시뮬레이션 하기 위해 보충으로 취급 됩니다. 마지막으로, TNFα 처리 trophoblasts 유전자 발현에서 변화를 감지 하 더럽혀 서 뒤에서 총 세포 lysates 수확에 대 한 간단한 절차 설명 되어 있습니다.
이 모델에는 전체에서 환경에 utero obesogenic 정리 하지 않습니다, 하는 동안 trophoblasts' 응답으로 TNFα 중재 염증의 개별 기여에 밖으로 구문 분석할 수 있도록 제어 시스템 제공 임산부 비만입니다. 이 모델 발견 하거나 직접 TNFα trophoblasts에서 신호에 의해 통제 하는 분자 목표를 확인 하는 모두 기회를 월급으로 유전자 식 패턴의 변화에서 관찰 vivo에서 모자와 반응과에서 테스트 한 비만은 TNFα 중재 염증의 결과 수 있습니다.
여기에 설명 된 방법은 인간의 trophoblasts autophagy의 규제에 염증 TNFα 중재의 효과 테스트 하려면 구현 되었습니다. 남성 태아 전시와 함께 비만 임신에서 trophoblasts autophagic 회전율, 또는 autophagosome 성숙13중단. 리소좀을 늦은 endosomes 지역화, 최근으로 설명 하고있다 "브레이크" autophagic 매출 과정에서 그것은으로 작동 하기 때문에 (실행 도메인 단백질 상호 작용 하는 Beclin1 및 시스테인-부자 포함), 루비콘 이라고 불리는 단백질 autophagosome 성숙14,15의 레 귤 레이 터. 사실, 루비콘 autophagy, 그것에 게 귀중 한 치료 목표를 억제 하는 단백질의 드문 예입니다. 아주 작은 정보는 microbials16,17 cardiomyocyte 보호18에 타고 난 면역 반응에 있는 그것의 역할을 제외 하면 루비콘의 병 태 생리 의미에 대 한 사용할 수 있습니다. 여기 설명 된 프로토콜을 사용 하 여, 루비콘 upregulated 여성 기본 trophoblasts 250 pg/mL까지 TNFα의 농도 증가 함께 치료에 대 한 응답에서에 발견 된다. 루비콘의 규제 수 역할 어떻게 여성 태아 요금에 임신에 남성 보다 더 나은 산 모 비만. 에 중요 한 통로의 규칙에 비만 자궁내 환경에 미치는 영향을 연구 플랫폼을 제공 업과 인간의 trophoblasts 외 인 TNFα 노출 하 여 비보 전 산 모 비만과 관련 된 염증 trophoblasts 및 확장, 태 반 기능.
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Protocol
placentae 프로토콜에서 동의와 제도적 검토 보드 오 레 곤 건강 과학 대학의 포틀랜드, 오 레 곤,에 의해 승인 아래는 노동 및 배달 단위 대학 병원에서 수집 된는 환자.
1. 태 반 조직 컬렉션
- 준비
참고: 조직에서 발생 하는 모든 장비는 살 균 되어야 합니다.- 121에서 60 분 동안 압력가 마로 소독 하 여 해 장비를 소독 ° c.
- 개인 보호 장비 (PPE) 사용: 연구실 코트/가운/스크럽, 장갑, 그리고 얼굴 방패 또는 고글 마스크.
- 물 목욕과 37로 설정에 ° c.
- 따뜻한 두 50 mL 원뿔 튜브, 완전 한 미디어의 각 포함 25 mL (Iscove ' s 수정 Dulbecco ' s 매체 보충 10 %FBS 1% 페니실린/스, 표 3) 37 ° C 물 욕조에.
- 정보 환자 동의 제왕 절 개에 의해 배달 직후 태 반 얻기.
- 될 태 반에 익숙해져야 합니다. 탯 태아 측 (chorionic 접시)에 삽입 되 고 혈관은 탯 삽입 사이트에서 밖으로 발산 하는 보실 수 있습니다. 반대 측 어머니 쪽, 또는 기저 판입니다. 그것은 decidua cotyledons 라는 배 나무를 포함 하는 구조 포함.
- Villous 조직 샘플링
참고: Villous 조직을 최대한 빨리 배달, 가급적 30 분 또는 그 이하의 다음 태에서 샘플링 해야 합니다.- Chorionic 플레이트 2-3 풀-두께 섹션 (약 2.5 c m x 2.5 c m 크기에서) 소비 세 위쪽으로 직면 하 고 무작위로, 사용 하 여 집게와가 위 ( 그림 1A)에 태 반의의 주변에서 2-3 cm.
참고: 방지 비정상적인 (즉 백색 석 회화) 나타나는 태 부. - Chorionic, 기저 접시 및 어떤 큰 혈관 떨어져 트림.
- 따뜻한 완벽 한 미디어에서 결과 villous 조직 ( 그림 1B, 총 약 80-120 g)를 배치 하 고 샘플링의 30 분 이내 trophoblast 격리 시작.
참고: 일부 다운스트림 분석 실험 및 응용 프로그램은 영향을 배달, 샘플링, trophoblast 격리 사이 대기 기간. 으로 가능 하 고 격리 사이 일관 된이 짧은 기간을 유지 하는 것이 좋습니다. - 단계-1.2.1, 1.2.2에에서 설명 된 기술을 사용 하 여 샘플 5 무작위 1 cm × 1 cm 섹션 villous 조직 전체에서 태 반 (를 포함 하 여 센터).
- 컷으로 4-5 더 작은 조각 (약 30 mg 각), 각 1 cm × 1 cm villous 조직 샘플 2 mL microcentrifuge 튜브에 놓고 플래시 액체 N 2에 고정 합니다. 스토어 나중 분석에 사용 하기 위해-80 ° C에.
- Chorionic 플레이트 2-3 풀-두께 섹션 (약 2.5 c m x 2.5 c m 크기에서) 소비 세 위쪽으로 직면 하 고 무작위로, 사용 하 여 집게와가 위 ( 그림 1A)에 태 반의의 주변에서 2-3 cm.
2. Trophoblasts Villous 조직에서의 격리
- 준비
참고: 살 균 장비를 사용 하 고 층 류 두건에 있는 셀을 포함 하는 절차를 수행. - 해 동
- 4 냉동된 밀도 기울기 (표 1, 표 필수 소모품, 시 약, 장비, 보충 자료를 참조) 4 ° C 밤 태 도착 하기 전에에서.
참고: 또는, 밀도 기울기 만들어질 수 있다 고립의 날. - 차례 원심 분리기 및 20에 ° c.
참고: 모든 원심 분리 단계가 최대 가속과 감속에서 달리 지정 하지 않는 한. - HEPES 버퍼링 소금물 (HBSS) Ca + 2와 Mg + 2 (표 3) 보완 x 준비 1.
- 따뜻한 trypsin 37 ° c.
- 약 2720 kilounits/mL에서 살 균을 희석 DNase 보충 HBSS.
- 갓 태어난 송아지 혈 청 (NCS) 37 ° c의 따뜻한 50 mL
- 37 완전 한 미디어 따뜻한 ° c.
- 따뜻한 어 미디어 (90 %FBS, 10 %DMSO, 표 3) 37 ° c.
주의: DMSO 독성과 장갑으로 처리 되어야 합니다. - 준비 소화 버퍼 (표 2와 3)의 308 mL를 혼합 하 여 보충 HBSS, Trypsin의 50 mL (3751.7 BAEE 단위/mL), 및 DNase의 0.5 mL (379.4 kilounits/mL) 무 균 병에서.
참고: villous 조직에서 세포를 분리 하는 데 필요한 대략적인 시간입니다 7 h.
- 린스 50 mL 원뿔 튜브에서 villous 직물의 각 조각을 가득 실내 온도 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS). 반복 하 고 과잉 혈액 제거 될 때까지 필요한 만큼 PBS를 교체 (PBS 린스 됩니다 빛 빨간색 또는 분홍색 조직을 철저 하 게 씻어 서 때).
- Villous 조직 멸 균 페 트리 접시에 놓고 부드럽게 된다고 하 여 가능한 많은 혈관에서 현미경 슬라이드를 사용 하 여 혈관에서 부드러운 villous 조직 제거.
- 정밀 하 게가 위를 사용 하 여 결과 villous 조직 말하다.
- trypsin의 구체적인 활동에 따라 계산 된 볼륨에 따라 소화 솔루션 불 임 병에 다진된 villous 조직 전송 그리고 DNase (165 mL, 표 2).
- 후 35 분 70 분당 회전 (rpm)에서 떨고와 37 ° C 물 욕조에 외피의 기울기의 측면에 소화 병 고 소화 되지 않은 조각의 조직 병의 하단에 정착. 신중 하 게 정착된 조직 피하 혈 청 학적인 피 펫과 상쾌한 세우.
- 분배는 상쾌한 50 mL 원뿔 관 사이 100 µ m 셀 스 트레이너를 통해.
참고: 시간을 절약 하는 것이 좋습니다 두 번째를 시작 하는 나머지 소화 솔루션 (110 mL, 표 2)를 추가 하 여 소화 정착 조직 및 2.3.2 단계에서 설명한 대로 부 화를 다시 시작. - 부드럽게 천천히 튜브의 아래쪽에는 혈 청 학적인 피 펫에서 분배 하 여 긴장된 상쾌한 아래 NCS의 3-5 mL를 계층. (Trophoblasts 포함) 긴장된 상쾌한 NCS 사이 초승달 표시 ( 그림 2A) 되어야 합니다.
- 20 ° c.에서 15 분 1250 x g에서 NCS에는 supernatants 원심 결과 펠 릿 trophoblast 셀 ( 그림 2B)를 포함 하는 흰색 레이어 뒤 가장 낮은 계층에서 붉은 혈액 세포를 포함 합니다.
- 단계 2.3.2-각 (110 mL 및 추가 83.5 m, 각각, 조직, 표 2의 병에 소화 솔루션의) 두 번째 및 세 번째 소화의 2.3.5 반복.
- 모든 supernatants centrifuged 되었습니다, 일단 따뜻한 완벽 한 미디어의 5 mL에 각 펠 릿을 resuspend 하 고 다음 정지를 함께 풀.
- 사이 두 50 mL 원뿔 튜브와 20 시 15 분 1250 x g에서 원심 분리기 세포 현 탁 액을 분할 ° c.
- 부드럽게는 상쾌한을 제거 하 고 따뜻한 성의 6 mL에 각 셀 펠 릿 resuspend죽어 야 지 미디어.
- 천천히 그리고 신중 하 게 전송 피펫으로와 밀도 그라디언트 상단 세포 현 탁 액을 레이어 링 하 여 4 개의 밀도 기울기 (각 3 mL) 사이 세포 현 탁 액을 분할.
- 최소 가속 및 감속 20 ° C에서 20 분 1250 x g에 밀도 기울기 원심. 이 구별 밴드 sedimented 셀 (표 4)을 생산 한다.
- Trophoblast 셀 (35-50 %DGM) 사이 포함 하는 불투명 밴드 (표 4)에 도달할 때까지 천천히 그리고 신중 하 게 밀도 그라데이션 미디어 (DGM)의 상위 레이어를 제거.
- Trophoblast 밴드 두 50 mL 원뿔 튜브로 전송 하 고 따뜻한 완벽 한 미디어 입력.
- 부드럽게 혼합 하 고 20 시 15 분 1250 x g에서 원심 튜브 3-6 회 반전 ° c.
- 는 상쾌한을 제거 하 고 따뜻한 완벽 한 미디어의 5 mL에 각 셀 펠 릿 resuspend. 셀 정지를 결합 하 고 가능한 셀 hemocytometer 고 Trypan 블루를 사용 하 여 (또는 선호 셀 계산 방법).
- serological 피펫으로와 아래로 pipetting 또는 부드럽게 반전 튜브 여러 번 세포 현 탁 액을 혼합.
- 별도 튜브에 세포 현 탁 액 및 Trypan 블루 (즉 20 µ L 각)의 동등한 부분을 결합 하 고 부드럽게 혼합.
- 실 온에서 1-2 분 동안 품.
- 부드럽게 15-20 µ L 셀 Trypan의 분배는 coverslip와는 hemocytometer 혼합물을 블루와 모 세관 작용에 의해 그리드에 걸쳐 확산 셀 수.
- 계산 집계 카운터와 4 개의 4 x 4 사분면의 각 가능한 셀 (죽은 세포 물 들일 것 이다 깊은 파랑). 셀이 한 번 이상 계산 되지 않습니다 보장 하기 위해 계산의 시스템 사용 (즉, 계산 하지 않음 아래쪽 또는 왼쪽된 경계 셀).
참고: 각 4 x 4 사분면은 50-150 셀 사이의 포함 되어야 합니다. 너무 적은 또는 너무 많은 세포 이상 또는 휴대폰 번호의 과소에 발생할 수 있습니다. - 10 곱하면 총 셀 4 x 4 사분면의 각각에서 계산 하는 평균 4, mL 당 셀의 수를 계산 하려면 희석 비율 (세포 현 탁 액을 Trypan 파랑)을 곱하면.
- 총 양의 세포 현 탁 액 총 셀 수율을 계산 하 여 mL 당 세포의 수를 곱하면.
참고: 약 100 백만 셀 villous 조직의 80-120 g로 시작 하는 격리에서 예상 된다.
- 3 백만 셀/잘 (3.3 c m 2 당 10 5 셀 x)는 6-잘 접시 (잘 당 서 스 펜 션의 2 개 mL) 접시 부드럽게 앞뒤로 바위 하 고 균일 하 게 배포 셀 측면에 사이드.
참고: Trophoblasts 제대로 준수를 취급 하는 조직 문화 접시 필요 합니다. 세포의 단층 syncytialization를 홍보 하는 데 필요한. - 떠나 약 30 분을 균등 하 게 배포, 정착, 인큐베이터에 배치 하기 전에 우물의 바닥에 고착 하기 시작 셀 수 있도록 층 류 두건에 도금된 셀.
- 문화 셀 (와 매일 미디어 변화) 5% CO 2와 95%의 습도와 37 ° C 배양 기에서 최대 72 h.
참고: trophoblasts 문화의 모든 24 h x 10-20에 현미경으로 검사 합니다. Trophoblasts 증식 하지 않습니다 하 고 passaged 수 없습니다. 문화의 72 h 동안 라운드 개별 trophoblasts syncytium ( 그림 3A , B)를 형성 하기 위하여 융합.
- 에서 1250 x g 20에서 10 분 동안 원심 분리 하 여 사용 하지 않는 셀을 작은 ° c.
- 펠 릿에서 가능한 많은 미디어를 발음.
- 미디어 (표 3)에 펠 릿 resuspend.
- 동결 냉동 컨테이너 100% 소 프로 파 놀으로 가득-80 ° C에서 aliquots. 전송 냉동된 aliquots 액체 N 2 장기 저장에 대 한 다음 날.
참고: 세포는 동결 후에 경작 수.
- 냉동된 세포의 약 수를 제거 하 고 소용돌이 동안 37 ° C 물 욕조에 녹여. 바로 전에 완전히 액체에 해 동에 약 수 물 목욕에서 제거.
- 해 동된 셀 15 ml 원뿔 튜브에 즉시 전송. 간헐적으로 혼합과 완전 한 미디어의 10 mL를 추가 시작, 처음에 둔화.
- 혼합 튜브 여러 번 반전.
- 20 ° c.에서 10 분 동안 200 x g에서 원심 분리기
- 는 상쾌한 발음 하 고 따뜻한 완벽 한 미디어의 2-5 mL에 펠 릿 resuspend.
- 셀 및 앞에서 설명한 접시 계산.
3. 치료와 TNFα, 세포 Lysates의 컬렉션 서 부 럽 기본 Trophoblasts
- 준비
- 37 완전 한 미디어 따뜻한 ° c.
- 사용에 대 한 준비까지 완전 한 미디어에-20 ° C에 게 TNFα의 10 µ g/mL 재고 확인.
- 완전 한 미디어 셀 치료를 준비 하는 경우에 TNFα의 작업 사진 1 µ g/mL 확인 합니다. 시리얼 TNFα 작업 사진 10 4 pg/mL, 10 3 pg/mL, 500 pg/mL, 250 pg/mL, 그리고 완전 한 미디어에 125 pg/mL로 희석.
참고: 10 4 pg/mL의 TNFα 농도 적당히 세포 독성. 테스트 TNFα 농도의 조정 원하는 다운스트림 응용 프로그램의 특성에 따라 달라 집니다.
- 치료 셀 TNFα
- 문화의 24 시간 후 배양 세포에서 발음 및 TNFα의 2 개 mL 바꿀 보충 6 잘 플레이트 (치료 및 차량 당 적어도 2 개의 우물에 잘 당 미디어 제어).
- 후 24 h 문화 (48 h), TNFα-노출의 완전 한 미디어 TNFα 보충 매체 바꿉니다.
- 수확 셀과 총 단백질
- 문화 (TNFα의 제거 과거 h 24)의 72 h 후 미디어 발음, 실내 온도, PBS로 세포를 부드럽게 씻어 하 고 얼음 감기 Radioimmunoprecipitation 분석 결과의 80 µ L을 추가 갓 들어 버퍼 (RIPA) 직접 각 잘 프로 테아 제와 인산 가수분해 효소 억제제 (표 3)을 추가.
- 셀 스 크레이 퍼와 접시에서 셀을 제거합니다. 치료 그룹 내에서 우물을 풀링 1.5 mL microcentrifuge 튜브 셀 전송.
- Lyse 세포 vortexing에 의해 높은 튜브 15의 적어도 3 개의 간격에 대 한 s.
- 셀 락을 15 분으로 4 ° C에서 품 어
참고: 또는, 후 단계 3.3.3., 셀 수 있는 알을 품을 간헐적으로 동요와 15 분 동안 얼음에 튜브, vortexing, 또는 최대 pipetting 고 할 터치 하 여wn. - 반복 단계 3.3.3.
- 작은 세포질 파편을 4 ° C에서 5 분 동안 10000 x g에서 튜브 원심.
- 이전 상쾌한 (포함 세포 단백질)는 새로운 1.5 mL microcentrifuge 튜브 스토어-80 ° c.
참고: 프로토콜 여기 중지 고 나중에 다시 시작 될 수 있습니다. 그것은 세포질 단백질 샘플을 여러 freeze-thaw 주기를 피하기 위해 몇 가지 aliquots을 확인 하는 것이 좋습니다. - Bicinchoninic 산 분석 결과 등 원하는 방법으로 총 단백질 농도 결정 (BCA, 필수 용품, 시 약, 장비, 보조 자료의 표 참조).
- SDS 페이지와 루비콘 또는 단백질의 관심에 대 한 서 부 럽
참고: 따라 서 부 제조 업체에 따라 프로토콜 blotting ' 선호 실험실 시스템을 사용 하 여 s 지시.- 부하 12% 아크릴에 잘 당 샘플 버퍼 (표 3)에서 총 단백질의 20-40 µ g 사이 젤. 버퍼 (표 3)을 실행에 단백질 SDS-PAGE로 분리.
- 젖은 전송 제조 업체에 따르면 polyvinylidene difluoride (PVDF) 막에 젤에서 단백질 ' s 명령을 전송 버퍼 (표 3).
- 0.1 %Tris-Buffered 염 분에 5% 우유 가루에 막 품 어 락으로 실내 온도에 적어도 1 시간에 대 한 트윈 20 (TBST, 표 3).
- 루비콘 1 차 항 체에 멤브레인을 품 어 (필수 소모품, 시 약, 장비, 보조 자료의 표 참조) 락 4 ° C에서 하룻밤 TBST에 1% 우유 가루에 1: 500에.
- TBS에서 락으로 실 온에서 막 3 x 5 분 TBST 및 1 x 5 분을 부드럽게 씻어.
- 1: 2000-1: 5000 이차 항 체에에서 멤브레인을 품 어 (HRP 연결 또는 기본 표시 켤레 필수 소모품, 시 약, 장비, 보조 자료의 표 참조) 5 %TBST 우유 분말은 실내 온도에 적어도 1 시간에 대 한 락.
- 3.4.5 단계에서 설명 하는 세척 절차를 반복 하 고 시각화 이미징 시스템에 적절 한 시각화 (즉 chemiluminescent) 기판으로 오 점.
- 3.4.5 단계에서 설명 하는 세척 절차를 반복 하 고 제조 업체에 따라 기본 로드 컨트롤이 나 β-걸 막 프로브 ' s 지침.
- 선호 이미지 분석 소프트웨어, 분석 식 흡 광도 (밴드 농도)의 수동 정량화 하 여 루비콘의 배경 흡 광도, 및 해당 로드를 정규화의 빼기 밴드 농도 제어. 단백질 수준에서 통계적으로 중요 한 변화에 대 한 테스트를 적절 한 통계 분석 수행.
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Representative Results
엎드려 서에서 인간의 반응과 용어 (임신 전 체 질량 지 (수 BMI) < 25) 단순한 임신 여성 자손을 들고 어머니 수집 하 고 제왕 절 개 (노동) 배달의 15 분 이내 샘플링 했다. 반응과 석 회화 및 일반적인 개발의 부재에 대 한 조사 했다: 모양, 15-25 cm 직경, 그리고 탯 줄의 중간에 삽입 사이에서 라운드 탯 300-600 g와 막 제거 무게는 태 반입니다. Villous 조직 기초 및 chorionic 판 (그림 1), 태 반 전체에서 2-3 샘플에서 저조한 villous 조직의 기본 trophoblast 격리에 대 한 자료를 시작으로 약 100 g에서 해 부 했다. 20 분 이내 villous 조직 샘플링, 설명 된 대로 기본 trophoblasts 분리 절차 시작 되었다 여기, 0.8-사이 저조한 1 x 108 가능한 셀. 세포는 3 x 106 (3.3 c m2당 105 셀 x)의 조밀도에 6-잘 배양 배지에서 시드 했다. 문화의 24 h 후 셀 첨부 파일에 대 한 현미경 조사 됐다 하 고 적절 한 trophoblast 형태학 (개별 셀 라운드) 확인 되었다. 문화 미디어는 적어도 2 개의 우물 농도 및 차량 통제 (완전 한 미디어에만) 포함 된 있도록 125-104 pg/mL 사이 TNFα의 농도의 일련을 포함 하는 완전 한 미디어로 대체 되었습니다.
20-4 시간 다음 TNFα-치료 (48 h 문화의), 모든 TNFα 매체는 완전 한 미디어로 교체 했다. 아니 감지할 세포 죽음 103 pg/mL 이하의 농도에서 TNFα와 치료 때문에 관찰 되었다. 104 pg/mL TNFα 치료 알맞게 세포 독성 그리고 젖 산 효소 (LDH) 분석 실험 (데이터 표시 되지 않음)에 의해 입증으로 미디어 변경 된 후이 TNFα 농도의 세포 독성 효과 지속 되지 않았다. 문화의 72 h에 세포는 현미경 syncytialization 위해 시험 되었다. Immunocytochemistry syncytialization 및 섬유 오염에 대 한 상대적으로 순수한 절연 trophoblasts (그림 3)의 계시. 세포 lysates 준비 BCA 분석 결과 (데이터 표시 되지 않음)에 의해 결정으로 당 총 단백질의 3-8 µ g / µ L 사이 저조한 여기에 설명 된 프로토콜에 따라 수확 했다. 서쪽 오 점 분석 여성 trophoblasts 큰 TNFα 최대 250 pg/mL의 농도와 TNFα 농도에 루비콘 식의 후속 downregulation 루비콘 식의 upregulation를 보였다 TNFα 치료에서 세포 lysates 250 pg/ml (그림 4A 와 B, 104 pg/mL 세포 독성 효과에 기반 하는 분석에서 제외). 마찬가지로, 루비콘은 크게 서쪽 오 점 분석에 의해 입증으로 마른 컨트롤에 비해 여성 태아와 비만 임신에서 반응과에서 플래시-냉동 villous 조직 생 검에서 upregulated (그림 4C 와 D, n = 6 BMI 당 반응과 클래스, ANOVA, P < 0.05).
| 농도 (%) | 90 %DGM (ml) | 1 x HBSS (ml) | 레이어 두께 (ml) |
| 4 x 그라데이션 | 4 x 그라데이션 | 총 34.5 ml | |
| 70 | 14 | 4 | 4.5 |
| 60 | 8 | 4 | 3 |
| 55 | 7.33 | 4.67 | 3 |
| 50 | 3.34 | 2.67 | 3 |
| 45 | 6 | 6 | 3 (13.5 ml 마크) |
| 40 | 5.33 | 6.67 | 3 |
| 35 | 4.67 | 7.33 | 3 (19.5 ml 마크) |
| 30 | 8 | 16 | 6 |
| 20 | 2.67 | 9.33 | 3 |
| 10 | 1.33 | 10.67 | 3 |
표 1입니다. 기본 Trophoblasts의 밀도 원심 분리에 대 한 밀도 그라디언트를 만들기 위한 규격.
왼쪽에서 오른쪽, 1 열 밀도 그라데이션 미디어를 지정 합니다 (DGM, 필수 용품, 시 약, 장비, 보조 자료의 표 참조) 농도 HBSS에 DGM의 백분율로 표현. 열 2 열 3 HBSS DGM 솔루션의 적절 한 비율을 만들기 위한 필요한 볼륨을 지정 하는 동안 DGM의 볼륨을 지정 합니다. 열 4 가장 조밀한 층으로 시작 그라데이션 만들려고 50 mL 원뿔 튜브에 추가 될 볼륨을 지정 합니다.
| 트립 신 | HBSS | DNase | ||
| 소화 | (총 활동; BAEE 단위) | 볼륨 (ml) | (총 활동; Kunits) | 총 볼륨 /digestion |
| 1 | 619037 (23.01 ml) | 141.76 ml | 62594 (0.230 ml) | 165 ml |
| 2 | 412691 (15.34 ml) | 94.51 ml | 41729 (0.154 ml) | 110 ml |
| 3 | 313270 (11.65 ml) | 71.74 ml | 31676 (0.116 ml) | 83.5 ml |
| 총 | 1345000 (50 ml) | 308 ml | 136000 (0.5 ml) | 358.5 ml |
표 2입니다. 기본 Trophoblast 격리 DNase Trypsin의 구체적인 활동에 따라 소화 솔루션의 준비에 대 한 규격.
왼쪽에서 오른쪽으로, 첫 번째 열은 소화 수를 지정 합니다, 두 번째 열 지정 소화 당 필요한 트립 신 활동, 적절 한 소화를 위한 추가 보충된 HBSS의 총 볼륨을 지정 하는 세 번째 열은 네 번째 열 소화, 필요한 DNase 활동 고 마지막 열 수 소화 솔루션의 볼륨을 지정 합니다.적절 한 소화를 위한 태 반 조직에 추가.
| HBSS (Ca+ 2 와 Mg+ 2보충) | 샘플 버퍼 |
| 10 %10 x HBSS | 90 %4 X Laemmli 염료 |
| 1.26 m m CaCl2 (anhyd) | 10 %2-Mercaptoethanol |
| 0.80 mM MgSO4 (anhyd) | |
| 20.77 mM HEPES | |
| pH 7.4 10N NaOH와를 1 L 살 균 ddH2O 최대 볼륨 무 균 병으로 살 균 필터 |
|
| 완전 한 미디어 | 실행 버퍼 |
| 11 %v / v IMDM 제거 | 25mm Tris 자료 |
| 추가 10 %v / v FBS | 190mm 글리신 |
| 1% 추가 10000 U/mL 페니실린/스 (100 U/mL 최종) | 0.1% SDS |
| pH를 8.3 | |
| 고정 미디어 | |
| 90 %v / v FBS | 전송 버퍼 |
| 10 %v / v DMSO | 25mm Tris |
| 190mm 글리신 | |
| 소화 버퍼 | 20% 메탄올 |
| 50 mL 트립 신 (26,900 BAEE 단위/mL) | pH를 8.3 |
| 0.5 mL DNAse (272,000 K 단위/mL) | |
| 보충된 HBSS 358.5 ml를 | TBS |
| 20 mM Tris | |
| RIPA 버퍼 | 150 mM NaCl |
| 25mm Tris HCl | 7.6에 pH |
| 5 mM EDTA | |
| 150 mM NaCl | TBST |
| 0.1% SDS | 0.1% Tween 20와 TBS |
| 0.5% 나트륨 deoxycholate | |
| 1% 트라이 톤 X-100 | |
| 10 ml 당 효소/인산 가수분해 효소 억제 물의 1 태블릿 RIPA 버퍼 |
표 3입니다. 격리에 필요한 솔루션 그리고 서 럽 뒤 기본 Trophoblasts 문화.
| % DGM | ml 마크 | 셀 유형 |
| 10 | 31.5-34.5 | 파편 |
| 20 | 28.5 31.5 | |
| 30 | 22.5-28.5 | |
| 35 | 19.5 22.5 | Trophoblasts |
| 40 | 16.5 19.5 | |
| 45 | 13.5-16.5 | |
| 50 | 10.5-13.5 | 림프 톨 |
| 55 | 7.5 10.5 | |
| 60 | 4.5-7.5 | 적혈구 |
| 70 | 4.5 below |
표 4입니다. Trophoblasts 밀도 원심 분리에 의해의 침전입니다.
왼쪽에서 오른쪽으로, 첫 번째 열 DGM (표 1)의 백분율을 지정 합니다, 두 번째 열 지정 어디 DGM의 해당 비율 50 mL 원뿔 튜브에 발견 하 고 세 번째 열 지정 합니다에서 어떤 세포 유형 퇴적 물 mL 마크는 DGM 및 mL 50 mL 원뿔 튜브에 마크의 해당 비율. 50-35 %DGM, 뚜렷한 불투명 밴드 형성 사이 trophoblasts 앙금. 이 범위 보다 크거나 DGM을 수집 하는 것은 세포질 파편 및 다른 세포 유형 세포 등의 오염 귀 착될 것 이다.
그림 1입니다. Villous 조직에서 격리 기간 인간 태 반 융 기저 플레이트를 제거 하 여.
A) 는 chorionic 플레이트 (태아 쪽) 위쪽으로 향하게, 전체 두께 샘플 태에서 excised입니다. B) villous 조직 샘플 chorionic, 기저 접시를 제거 하 여 얻은 것입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2입니다. 갓 태어난 송아지 혈 청을 통해 소화 솔루션에 셀의 원심 다층 셀 펠 릿에 결과.
A) 신생아 송아지 혈 청 (NCS) 다이제스트 솔루션 50 mL 원뿔 튜브에서에 세포 현 탁 액 아래 계층. B) (A)의 원심 다층된 셀 펠 릿에 결과. 맨 레이어 붉은 색에 깊이 이며, 적혈구의 구성 됩니다. 위의 레이어 trophoblasts 포함 하 고 흰색 또는 베이지색 색깔에. trophoblast 위에 레이어 NCS 소화 솔루션 (표면에 뜨는) 튜브의 상단에 다음 이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3입니다. Immunocytological Syncytialization 및 기본 인간의 Trophoblast 문화에서 섬유 콘텐츠 분석.
A) cytotrophoblasts 문화의 24 시간 후에 Cytokeratin-7 (레드)의 대표 이미지. B) syncytiotrophoblasts 후 72 h 문화의 표시는 융합 하는 셀의 multinucleated 대 중에서에서 Cytokeratin-7 (레드)의 대표 이미지. C) syncytiotrophoblasts 문화의 72 h 후에 Vimentin (빨간색)의 대표 이미지. 이미지 (파란색) DAPI 핵 counterstain와 형광 현미경에 인수 했다. 10 배 확대에 시각. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4입니다. 루비콘 식 비만 임신 여성의 태아와 대 린 여성 Trophoblasts에 TNFα-치료 및 Villous 조직에서 내 생 루비콘 식에 대 한 응답에서의 규칙.
건강 한 임신 여성 태아를 들고와 야 윈 어머니에서 용어 반응과에서 기본 trophoblasts 고립 되었고 125, 250, 500, 치료 103104 pg/mL TNFα (및 차량 통제). A) TNFα로 여성 trophoblast lysates에 루비콘에 대 한 대표 서양 오 점 치료. Β-말라 로드 제어로 사용 되었다. B) 루비콘 여성 trophoblasts에 TNFα 치료에 대 한 응답에서은 서 부도 말에서 계량 표현과 β-걸으로 표준화. 값은 TNFα 농도 ± 남동 n에서 당 평균 루비콘 식 3 반응과 =. C) 서 부 루비콘에 대 한 상체 비만 임신 여성의 태아와 대에서 villous 조직의 biopsies 냉동 플래시에서 전체 조직 lysates에 지우고 (F1-F12). 젖 산 효소 A (LDHA) 로드 제어로 사용 되었다. D) 루비콘 서양에서 식 (C)에서 몰아내고 정량 되었고 LDHA로 표준화. 값은 BMI 분류 ± 남동 n에서 당 평균 루비콘 식 = BMI 클래스 당 6 반응과 (ANOVA, * P < 0.05). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
태 반, 태아의 성장 조절에 대 한 책임6비만 환경 손상 된 기능을 전시 한다. Trophoblasts의 높은 신진 대사 요구에도 불구 하 고 산 모 비만과 반응과 미토 콘 드 리아 기능 장애 호흡6,19전시. Placental 대사에서 변화는 합병증과 비만 임신3,,67에서 관찰 된 불리 한 태아 결과의 발생률이 증가에 기여할 수 있습니다. Autophagy는 또한 산 모 비만 반응과에 손상 됩니다. 남성 태아와 비만 임신에서 반응과 기능 장애 autophagic 플럭스 autophagosomes13의 축적에 의해 입증으로 표시. 최적의 autophagic 유량을 유지 하는 것이 중요 세포 항상성 그리고 모성 비만 반응과 결함이 autophagy 비만 임신과 관련 된 불리 한 결과 중재 하는 중요 한 역할을 재생할 수 있습니다.
산 모 비만 손상 placental 함수의 정확한 원인을 잘 이해 되지 않는다 고 염증 신호에 그들의 기원에 있을 수 있습니다. 비만 임신 TNFα1,4,,2021순환의 높은 수준에 의해 특징 proinflammatory 상태는. TNFα는 autophagy22,23의 활성 제 이며 비만 임신에서 반응과 autophagic 유동적에서 변화를 중재할 수 있습니다. TNFα는 일반적으로 암2의 맥락에서 특히 세포에 염증의 효과 연구 하는 데 사용 됩니다. 여기에 제시 된 프로토콜 외 인 TNFα와 기본 trophoblasts 문화에서 치료 하 여 태 반의 기능 능력에 비만 관련 염증의 효과 연구에 대 한이 접근을 적응 시킨다.
이 프로토콜 4 개의 주요 구성 요소로 구성 됩니다: 기본 trophoblasts의 문화 TNFα 치료, 및 다음 전체 세포 lysates의 컬렉션 뒤 태 반, 기본 trophoblasts villous 조직에서의 격리에서에서 villous 조직의 샘플링 서 관심의 protein(s)의 식을 측정 하는 분석 오 점. 순수한 trophoblasts를 분리 하는 chorionic, 기저 접시는 철저 하 게 해 부 villous 조직에서 태 반 (그림 1B)의 샘플링 하는 동안 중요 하다. 그것은 또한 필수적 villous 조직 (즉 배달의 30 분) 이내에 처리 됩니다. 이 프로토콜 villous 조직의 엑스트라 세포 매트릭스에서 trophoblasts 출시 각 지속적인 35 분, 3 소화 단계의 사용을 자세히 설명 합니다. Lengthier 소화 세포 표면 단백질의 trypsinization에 의해 손상 세포를 위험. 다이제스트의 수를 증가 가능한 trophoblasts의 최종 수익률 평가할 수 있 증가 되는 것은 없습니다. 그러나, 시간 및 수 소화의 감소 귀 착될 것 이다 감소 셀 생산량 (사이먼, Bucher, 및 Maloyan, 데이터를 게시). 이 프로토콜은 안정적으로 villous 조직의 80-120 그램에서 약 100 백만 셀을 생성합니다.
구별할 수 trophoblast 밴드 격리 간 밀도 기울기에 관찰 수에 변화가입니다. 다른 세포 유형에서 오염을 방지 하려면 엄격 하 게 수집 등에 trophoblasts 밀도 그라데이션 (표 4)에 포함 된 중요 하다. 여기서 설명 하는 프로토콜 최적화는 5% 미만으로 비교적 순수한 trophoblasts 항복 이전 설립된 방법에서 다른 셀에서 오염 유형10,,1112. 더 정화는 포지티브 또는 네거티브 선택24에 의해 얻을 수 있습니다. 그러나,이 접근 가능한 trophoblasts의 수확량을 감소의 위험을 실행 합니다. 기본 trophoblasts 문화 시간 72 h 대 24 셀에 syncytialization 수술 multinucleated 세포 질량의 존재에 의해 입증 확인 후 여기에 제시 된 절차를 사용 하 여 격리에서 Cytokeratin-7의 Immunocytochemical 분석 72 h, trophoblast (그림 3A , B)의 수명에 각 인 이벤트. 또한, 기본 trophoblasts 72 h에 대 한 교양 Vimentin의 immunocytochemical 분석 거의 오염 섬유 아 세포를 (그림 3C)을 공개 했다. 루틴에, trophoblasts 순도 모니터링할 수 있습니다 문화에서 간단한 형태학 평가 의해. 문화 시간 24 h, 개별 cytotrophoblasts 라운드 지배 하는 문화. Cytotrophoblasts 융합된 세포의 덩어리 인 문화, 72 h 후 syncytialization를 받 다. 가장 일반적인 오염 셀 형식이이 문화에 있는 섬유 아 세포 나 내 피 세포는 길쭉한 모양에 있는 다각형 각각 이다. 이러한 기능을 모니터링할 수 있습니다 대략 밝은 현미경을 사용 하 여.
TNFα와 기본 trophoblasts 치료 trophoblasts 중요 한 통로의 규칙에 신호 한 TNFα의 효과 측정 하 수 제어 시스템을 제공 합니다. 물론, 비만 임산부 환경에서 비보에 trophoblast 함수 변조에 대 한 책임 수 있습니다 TNFα 이외의 요인이 있다. 이들은 포함 하지만 호르몬 신호, 고 지 혈 증, 및 다른 proinflammatory 요인25의 호스트에 국한 되지 않습니다. 다른 치료의 조합 더 순수 더 정확한 방법으로 비만 자궁내 환경 전 비보 을 정리 합니다. Trophoblasts이이 프로토콜까지 치료 하는 데 사용 하는 외 인 TNFα의 농도 일반적으로 생체 내에서순환 그 초과. 혈 청 농도 또는 특정 선 동적인 조건2620 ng/mL까지 보고 되었습니다. (즉 서 부 럽) 현재 실험실 방법으로 측정 가능한 응답을 얻으려면, 그것은 유전자 발현 및 관심의 경로 있는 변화를 나타내기 위해 TNFα 농도 증폭 해야 합니다. 이러한 응답에 vivo에서 조금 있을 수 있습니다. 그러나, 그들은 수 있었다 그럼에도 불구 하 고 크게 영향 trophoblasts의 기능. 유전자 발현 및 세포 독성 효과에 뿌리 수 있습니다 통로 분석에서 아티팩트를 생성의 위험을 실행 trophoblasts TNFα의 높은 농도에 노출. 적당 한 세포 독성 trophoblasts LDH 세포 독성 분석 실험 (데이터 표시 되지 않음)에 의해 입증 104 pg/mL TNFα 보충 미디어 24 h에 노출에서 관찰 되었다. 그러나, 농도 103 pg/mL TNFα 이하로 어떤 감지할 세포 죽음을 생성 하지 않았습니다.
작은 간격 및/또는 그는 여기서 설명 하는 보다 낮은 TNFα 농도 테스트 수 있습니다 최고의 뒤따라갈 양적연쇄 반응 (정량) 유전자 표정 분석, 기술에 대 한 적합 유전자 발현에서 작은 변화를 감지 합니다. 정량은 특별히 transcriptional 수준에서 유전자 표현 레벨 테스트, 하는 동안 아마도 그들의 휴대 전화 작업을 수행할 수 있는 단백질 제품의 최종 레벨 감지 부 럽. TNFα 치료 식 수준에 변화는 transcriptional의 결과 확인에 관해서는 뿐만 유전자 식 레벨의 규정에의 영향을 결정 하기 위한 강력한 접근은 함께에서 두 분석 기법을 사용 하 여 post-transcriptional, 또는 포스트 번역 상 규칙. 염증 성 스트레스 trophoblast 동작, 형태, 및 syncytialization 영향을 줄 수 있습니다. 분자 분석 접근 외에 형태학 평가 (예: immunocytochemistry)를 포함 하 여 trophoblast 건강에 TNFα 노출의 효과 대 한 보다 포괄적인 분석을 제공 합니다. TNFα 농도 테스트 및 다운스트림 분석 실험 수요에 따라의 조정 것이 좋습니다.
여기에 설명 된 프로토콜을 구현 하 여 TNFα 중재 염증 upregulate 인간의 trophoblasts 루비콘 식 여성 태아와 마른 임신에서 발견 된다. Trophoblast에 루비콘에 더럽혀 서 부 lysates 근처와 140 kDa (그림 4A)의 예상된 분자량 위에 두 가지 밴드 계시. 낮은 밴드 일반적인 제안 증거 (PD047 안티 루비콘 pAb, MBL 데이터 시트, http://ruo.mbl.co.jp/bio/g/dtl/A/?pcd=PD027#u-pub). 여성의 trophoblasts upregulate 250 pg/mL 까지의 농도의 TNFα 치료에 루비콘의 표현 하는 능력을 보여주었다. 이, 루비콘 식 보다 높은 농도에서 레벨 감소 기준 (치료 제어) 쪽으로 다시와 아래도 (그림 4B, n = 3). 이 결과 보완 루비콘은 크게 upregulated에서 플래시-냉동 villous 조직 생 검에서 발견 하는 TNFα와 마른 임신에서 trophoblasts 치료 염증 비만 자궁내 환경에서 시뮬레이션, 마른 컨트롤에 비해 여성 태아와 비만 임신에서 반응과 (그림 4C 와 D, ANOVA, n = BMI P 당 6 < 0.05).
Trophoblasts 남성 태아와 비만 임신에서 형성의 활성화 및 autophagosomes 의 축적을 전시 autophagic 플럭스 마른 컨트롤에 비해 여성 태아와 비만 임신에서 trophoblasts에 다 표시 되지 않습니다, 하는 동안 13. 루비콘 어디 그것은 autophagosome 리소좀 퓨전27중단 행동 한다 autophagy의 부정적인 레 귤 레이 터 이다. 여성 trophoblasts 있습니다 upregulate를 TNFα 중재 염증, autophagy22, 유지의 설정에서 엎드려 서 같은 autophagic 플럭스를 활성화할 수 있습니다에 대 한 보상 또는 보호 메커니즘으로 루비콘의 표현 임산부 비만입니다. 태 반에이 응답 비만 자궁내 환경에서 남성 보다 더 나은 어떻게 여성 태아 요금에 한 역할을 재생할 수 있습니다. 비만 자궁내 환경에 중요 한 통로의 규정에의 효과 연구 플랫폼을 제공 합니다 산 모 비만 비보 전 통해 TNFα와 주 인간의 trophoblasts 치료와 관련 된 염증 성 환경 모델링 trophoblasts입니다. 새로운 및 조합 치료 비만 모성 환경 업과 겨냥이 프로토콜 개정 태 반 기능에의 모성 비만 효과 연구 하는 흥미로운 수단을 제공할 것입니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자는 여자를 들이 연구에 대 한 그들의 반응과 기증 감사 합니다. 우리 또한 조정 반응과의 컬렉션에 대 한 노동 및 배달 부 오 스 모자와 태아 연구 팀에 감사. 우리는 에릭 왕, 박사, 그리고 켈리 쿠오, MD 지원 감사 하 고 실험 방법 및 최적화에 도움이.
이 작품은 NIH HD076259A (오전)에 의해 투자 되었다와 AHA GRNT29960007 (오전).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X HBSS | Gibco | 14185-052 | |
| CaCl2 (anhyd.) | Sigma-Aldrich | C1016-100G | |
| MgSO4 (anhyd.) | Sigma-Aldrich | M7506-500G | |
| Hepes | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| DNAse | Worthington Biochemical Corp. | LS002139 | |
| Protease/Phosphatase inhibitors | Thermofisher Scientific | 88668 | |
| Tris HCl | Invitrogen | 15506-017 | |
| EDTA | Invitrogen | 15576-028 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653-1KG | |
| SDS | Fisher Scientific | BP166-600 | |
| Sodium deoxycholate. | Fisher Scientific | AAJ6228822 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | |
| Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) | Gibco | 12440-046 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| Neonatal Calf Serum (NCS) | Gibco | 26010-074 | |
| Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Gibco | 15140-122 | |
| 10% Formalin | Fisher Scientific | 23-427-098 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | |
| TNFα | Sigma-Aldrich | SRP3177-50UG | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 70013-032 | |
| K2EDTA vacutainer blood collection tubes | BD | 366450 | |
| Percoll (Density Gradient Media, DGM) | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| 6 well plates | Corning | 353046 | |
| Cell strainers | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes 2.0 mL, natural | Fisher Scientific | 22363352 | |
| Trypan Blue | Corning | 25-900-Cl | |
| Bio-Rad Mini-PROTEAN Tetra System | Bio-Rad | 1658001FC | |
| Bio-Rad Mini Trans-Blot Cell | Bio-Rad | 1658033 | |
| TGX FastCast Acrylamide Kit, 12% | Bio-Rad | 1610175 | |
| Mini-Protean 3 Multi-Casting Chamber | Bio-Rad | 1654112 | |
| 4X Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610747 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148-100ML | |
| Glycine | Bio-Rad | 1610718 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P7949-500ML | |
| Instant Nonfat Dry Milk | Carnation | ||
| Rubicon (D9F7) Rabbit mAb | Cell Signalling Technology | 8465S | |
| Monoclonal Anti-β-Actin antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | A2228-100UL | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signalling Technology | 7074S | |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signalling Technology | 7076S | |
| SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34578 |
References
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