Summary
Представленные здесь — это протокол для отбора проб тканей человека плацентарной ворсинок, следуют изоляции cytotrophoblasts для начальных клеточной культуры. Лечение трофобласты с TNFα резюмирует воспаления в ожирением внутриутробной среды и облегчает открытие молекулярных целей регулируется воспаление плаценты с материнской ожирения.
Abstract
Материнская тучность ассоциируется с повышенным риском неблагоприятных перинатальных исходов, которые скорее всего опосредовано скомпрометированных плацентарной функция, которая может объясняться, в части, регуляции autophagy. Аномальные изменения в выражении autophagy регуляторов в плаценты с ожирением беременности может регулироваться воспалительные процессы, связанные с ожирением и беременности. Описанные здесь — это протокол для выборки ворсинчатых ткани и изоляции ворсинчатых cytotrophoblasts из плаценты человека термин культуры главной ячейки. Это сопровождается метод для моделирования воспалительных окружение в ожирением внутриутробной среды, рассматривая первичной трофобласты от худой беременностей с провоспалительных цитокинов, который возводится в ожирение и фактора некроза опухоли альфа (TNFα), беременности. Посредством осуществления протокола, описанные здесь, установлено, что воздействие экзогенных TNFα регулирует выражение Рубикон, негативный регулятор autophagy, в от худой беременностей с женский плод трофобласты. Хотя целый ряд биологических факторов в ожирением внутриутробной среды поддерживать потенциал, чтобы модулировать критических путей в трофобласты, эта система ex vivo является особенно полезным для определения, если выражение моделей наблюдаемого в естественных условиях в человеческой плаценты с материнской ожирения являются прямым результатом TNFα сигнализации. В конечном счете такой подход дает возможность разобрать регулирования и молекулярных последствия воспаления, связанные с материнской ожирения на autophagy и других важнейших клеточных путей в трофобласты, которые имеют потенциал для воздействия плацентарный функции.
Introduction
Ожирение является воспалительных состояние, характеризующееся хроническим низкосортных воспаления, вытекающие из избыток жировой ткани и наличия питательных веществ. В ожирение провоспалительных цитокинов повышенный уровень метаболизма тканей, а также системно в обращении. Надежные совокупность доказательств показал, что TNFα значительно повышается в параметре ожирения с последствиями в сопротивление инсулина и метаболический дисфункции1. Активация TNFα также способствует патогенеза заболеваний в условиях, таких как рак и аутоиммунные заболевания, что делает его привлекательным терапевтического цели2.
Воспаление в ожирении усугубляется вследствие беременности, также провоспалительных государства3,4. Ранее было показано, что содержание плацентарного TNFα увеличивается с материнской ожирения в беременности с женского плода. Кроме того TNFα лечения препятствует митохондриальное дыхание клеток трофобласта женщин, но не мужчин, предполагая, что TNFα участвует в регулировании плацентарной метаболизм в сексуально диморфных образом5. Материнская тучность ассоциируется с увеличением числа различных осложнений во время беременности, включая мертворождение, с мужской плодов, будучи наиболее восприимчивы3,6,7,8 . Из-за его ключевую роль в интерфейсе матери и плода изменения функциональных возможностей через плаценту в ожирением внутриутробной среды в ответ на воспалительные сигнализации могут играть важную роль в посредничестве итоги ожирением беременностей.
Cytotrophoblasts и syncytiotrophoblasts в ворсинчатых ткани плаценты являются критическими для эндокринных сигнализации и питательных веществ и кислорода обмен между матерью и развивающегося плода9. Сбои в функциональные возможности ворсинчатых cytotrophoblasts (в дальнейшем именуемый трофобласты) может поставить под угрозу здоровье плода и развития. Этот протокол описывает метод для выборки ворсинчатых ткани из плаценты человека срок путем рассечения прочь хорионический и базальных плит наряду с оптимизированной процедуры для изоляции трофобласты культуры главной ячейки. Этот протокол является производным от установленным методологиям, с участием ферментативного пищеварения ворсинчатых ткани выпустить клетки из внеклеточного матрикса, следуют плотность дифференциального центрифугирования изолировать трофобласты10, 11,12. Этот подход, в котором первичный трофобласты от плаценты от худой беременности относятся с культура СМИ дополнена TNFα для имитации один компонент воспалительных окружение, связанных с материнской ожирения детали протокола. Наконец описан простой процедуры для уборки всего lysates клетки от TNFα-лечение трофобласты следуют западной blotting обнаружить изменения в экспрессии генов.
Хотя эта модель не пилки obesogenic в утробе матери окружающей среды во всей ее полноте, она обеспечивает управляемая система, которая позволяет разобрать индивидуального вклада TNFα-опосредованной воспаления в ответ трофобласты Материнская тучность. Эта модель дает возможность обнаружить или подтвердить молекулярных целей, непосредственно регулируются TNFα сигнализации в трофобласты, а также позволяет проверить, если изменения в картин выражения гена наблюдается в естественных условиях в плаценты с материнской ожирение может быть результатом TNFα-опосредованной воспаления.
Чтобы проверить эффект TNFα-опосредованной воспаления на регулирование autophagy в человека трофобласты был реализован подход, описанный здесь. Трофобласты с ожирением беременностей с мужской плодов выставку нарушается autophagic оборот или autophagosome созревания13. Белок, называемый Рубикон (запуск домена Beclin1-взаимодействующих и хвоща богатые белковые), который локализован для лизосомы и поздно endosomes, был недавно описан как «тормоз» в процессе autophagic оборот потому, что он функционирует как отрицательный Регулятор autophagosome созревания14,15. В самом деле Рубикон является редким примером белок, который сдерживает autophagy, что делает его ценным терапевтических цели. Очень мало информации имеется о патофизиологические значение Рубикон, за исключением его роли в врожденный иммунный ответ на микробы16,17 и cardiomyocyte защиты18. Используя протокол, описанный здесь, он найден что Рубикон upregulated в женской первичной трофобласты в ответ на лечение с увеличением концентрации TNFα до 250 пг/мл. Регулирование Рубикон могут играть роль в как женский плод тариф лучше, чем мужчины в беременности с материнской ожирения. Изложив воспаления, связанные с материнской ожирения ex vivo , подвергая человека трофобласты экзогенных TNFα обеспечивает платформу для изучения последствий страдают ожирением внутриутробной среды на регулирование критических путей в трофобласты и, следовательно, функция плаценты.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
роль162 были собраны из группы труда и доставки в университетском госпитале под протоколом, утвержденным институционального обзора Совет Oregon Health и науки университета в Портленде, штат Орегон, с осознанного согласия от больных.
1. коллекции плацентарной ткани
- Подготовка
Примечание: все оборудование, которое обнаруживает ткани должны быть стерильными.- Стерилизовать рассечения оборудования путем автоклавирования для 60 мин при 121 ° C.
- Использовать средства индивидуальной защиты (СИЗ): лаборатории пальто/платья/скрабы, перчатки и маску с лица щит или очки.
- Поворот на водяной бане и набор до 37 ° C.
- Тепло два 50 мл конические трубы, каждый содержащий 25 мл полной СМИ (Iscove ' s Modified Дульбекко ' s с 10% FBS и 1% среднего пенициллина/стрептомицина, Таблица 3) в ванну воды 37 ° C.
- С информированного согласия пациента, получить сразу же после родов, кесарева сечения плаценты.
- Ознакомиться с плацентой. Пуповины вставляется на стороне плода (Хорионический плита) и кровеносные сосуды можно увидеть излучающая из пуповины вставки сайте. Противоположной стороны является материнской стороны, или базальной пластине. Она включает в себя decidua и структуры, которые содержат судно деревьев, под названием семядоли.
- Выборки ворсинчатых ткани
Примечание: ворсинчатых ткани должны отбираться из плаценты как можно скорее после еды, желательно в 30 минут или меньше.- С хорионический пластину вверх, акцизный 2-3 полный толщина секций (примерно 2,5 см x 2,5 см в размер) 2-3 см от периферии плаценты на случайных, используя пинцет и ножницы ( рис. 1A).
Примечание: Избегайте частей плаценты, которые появляются ненормальные (т.е. белый обызвествления). - Отделка прочь хорионический и базальной пластинки и любых крупных кровеносных сосудов.
- Результате ворсинчатых ткани ( рис. 1B, приблизительно 80-120 g всего) в теплых полный СМИ и начать трофобласта изоляции в течение 30 мин выборки.
Примечание: Некоторые течению анализов и приложений затронуты длина латентный период между поставкой, выборки и изоляции трофобласта. Это лучше всего держать эти периоды как короткие, как возможно и согласованность между изоляции. - Используя методы, описанные в шагах 1.2.1 - 1.2.2, образец 5 случайных 1 см x 1 см секций ворсинчатых ткани от через плаценту (включая центр).
- Вырезать каждый образец ворсинчатых ткани 1 см x 1 см на 4-5 более мелкие куски (примерно 30 мг каждый), в 2 мл microcentrifuge трубы и флэш-заморозить в жидкости N 2. Хранить при температуре-80 ° C для использования в более поздних анализов.
- С хорионический пластину вверх, акцизный 2-3 полный толщина секций (примерно 2,5 см x 2,5 см в размер) 2-3 см от периферии плаценты на случайных, используя пинцет и ножницы ( рис. 1A).
2. Изоляция трофобласты от ворсинок ткани
- Подготовка
Примечание: использование стерильного оборудования и выполнения процедур, связанных с клетки в Ламинарный шкаф.- Оттепель четыре замороженных плотности градиенты (Таблица 1, см. таблицу основных материалов, реагентов и оборудования, дополнительного материала) при 4 ° C в ночь перед плаценты поступает.
Примечание: в качестве альтернативы, градиенты плотности может быть сделан на день изоляции. - Поворот на центрифуге и равным 20 ° C.
Примечание: Все шаги центрифугирования находятся на максимальное ускорение и замедление, если не указано иное. - Подготовка 1 x HEPES-буфер солевой раствор (HBSS) дополнена Ca + 2 и Mg + 2 (Таблица 3).
- Теплый трипсина до 37 ° C.
- Развести DNase около 2720 kilounits/мл в стерильных дополнены HBSS.
- Теплый 50 мл сыворотки (NCS) новорожденного теленка до 37 ° C.
- Теплый полный СМИ до 37 ° C.
- Теплый замораживания средств массовой информации (90% FBS, 10% ДМСО, Таблица 3) до 37 ° C.
ОСТОРОЖНОСТЬЮ: ДМСО токсичных и должны быть обработаны перчатки с. - Пищеварение подготовка буфера (таблицы 2 и 3), смешивая 308 мл дополнены HBSS, 50 мл трипсина (3751.7 BAEE единиц/мл) и 0,5 мл DNase (379.4 kilounits/мл) в стерильный флакон.
Примечание: Приблизительное время, необходимое для изоляции клетки от ворсинок ткани — 7 ч.
- Оттепель четыре замороженных плотности градиенты (Таблица 1, см. таблицу основных материалов, реагентов и оборудования, дополнительного материала) при 4 ° C в ночь перед плаценты поступает.
- Обработка ворсинчатых ткани
- полоскание, каждый кусок ворсинчатых ткани в 50 мл Конические трубки заполнены с комнатной температуре фосфат буфер солевой раствор (PBS). Повторить и при необходимости заменить PBS, пока удаляется избыток крови (полоскание PBS будет светло-красный или розовый когда ткань тщательно промыть).
- Место ворсинчатых ткани в стерильных Петри и удалить, как много кровеносных сосудов максимально аккуратно соскабливания офф ворсинчатых мягких тканей с судов с использованием микроскопа.
- Фарш мелко результате ворсинчатых ткани, используя ножницы.
- Ворсинчатых ткани пищеварение и сырой изоляции трофобласты
- передать стерильный флакон с пищеварение решения согласно расчетные тома, основанный на специфическую активность трипсина фарш ворсинчатых ткани и DNase (165 мл, Таблица 2).
- После 35 минут инкубации в ванну воды 37 ° C с встряхивания на 70 оборотов в минуту (об/мин), наклон пищеварение бутылку на его стороне и позволяют непереваренных кусочков ткани поселиться в нижней части бутылки. Тщательно составить супернатант с Серологические Пипетки, избегая поселились ткани.
- Обойтись супернатант через стрейнер ячейки 100 мкм поровну между 50 мл конические трубы.
Примечание: Чтобы сэкономить время, желательно начать второй пищеварение путем добавления пищеварение раствор (110 мл, таблица 2) оставшиеся поселились ткани и возобновление инкубации, как описано в шаге 2.3.2. - Нежно слой 3-5 мл NCS под напряженными супернатанта, медленно дозирования от Серологические Пипетки в нижней части трубки. Мениск между напряженными супернатант (содержащие трофобласты) и NCS должно быть видно ( рис. 2A).
- Центрифуга supernatants над NCS на 1250 x g 15 мин при 20 ° C. Результате гранулы будет включать в себя красные кровяные клетки, в нижнем большинство слое следуют белый слой, содержащий клеток трофобласта ( рис. 2B).
- Повторите шаги 2.3.2 - 2.3.5 для каждого из второго и третьего пищеварения (Добавление 110 мл и 83,5 м, соответственно, пищеварение решения бутылка ткани, Таблица 2).
- После того, как все supernatants были центрифугируется, Ресуспензируйте каждой гранулы в 5 мл теплой полный СМИ и затем воедино суспензий.
- Сплит суспензию клеток поровну между двумя 50 мл конические трубы и центрифуги на 1250 x g для 15 мин при 20 ° с.
- Осторожно удалить супернатант и Ресуспензируйте каждой ячейки гранул в 6 мл теплой комплETE СМИ.
- Плотность центрифугирования
- делят суспензию клеток поровну между четырьмя градиенты плотности (по 3 мл), медленно и осторожно расслоение суспензию клеток на вершине градиенты плотности с передачей накапайте.
- Центрифуга градиенты плотности в 1250 x g 20 мин при 20 ° C с минимальным ускорение и замедление. Это должно производить различимых групп отложившейся клеток (Таблица 4).
- Медленно и осторожно удалить верхние слои плотности градиента СМИ (DGM) до частот непрозрачный мощности, содержащих клеток трофобласта (между 35-50% DGM) (Таблица 4).
- Передача трофобласта полос в два 50 мл конические трубы и заполнить с теплой полный СМИ.
- Нежно инвертировать трубы 3 - 6 раз перемешать и центрифуги на 1250 x g для 15 мин при 20 ° с.
- Удалить супернатант и Ресуспензируйте каждой ячейки Пелле в 5 мл теплой полный СМИ. Объединить ячейку суспензий и количество жизнеспособных клеток с помощью Горяева и Трипановый синий (или предпочтительным ячейки, подсчитывая метод).
- Подсчет клеток с Горяева
- перемешать суспензию клеток закупорить вверх и вниз, с Серологические Пипетки или нежно инвертирование трубке несколько раз.
- Комбинат равных частей суспензию клеток и Трипановый синий (т.е. 20 мкл каждого) в отдельные трубки и осторожно перемешать.
- Инкубировать в течение 1-2 мин при комнатной температуре.
- Нежно лунки 15-20 мкл клетки Трипановый синий смесь между coverslip и Горяева и позволяют клеткам диффузного через сетку действием капиллярных.
- Количество жизнеспособных клеток (мертвые клетки быть окрашены темно-синий) в каждом из четырех 4 x 4 квадрантах с счетчиком Талли. Использовать систему учета для обеспечения ячейки не учитываются более одного раза (т.е. не учитываются дотрагиваться до нижней и левой границ ячеек).
Примечание: Каждый квадрант 4 x 4 должны содержать между ячейками 50-150. Слишком мало или слишком много клеток может привести к более или недооценка количества клеток. - Средней ячейке отсчеты каждого из 4 x 4 квадрантах, умножить на 10 4, а затем умножить на коэффициент разбавления (суспензию клеток к Трипановый синий) вычислить количество клеток / мл.
- Умножить количество клеток / мл на объем суспензии клеток для вычисления доходности ячейке.
Примечание: Примерно 100 миллионов клеток, как ожидается от изоляции, начиная с 80-120 g ворсинчатых ткани.
- Покрытие клетки
- пластина 3 миллиона клеток/колодец (3.3 x 10 5 клеток / см 2) в 6-ну плита (2 мл суспензии в колодец) и мягко рок и обратно и стороны в сторону, чтобы равномерно распределить клетки.
Примечание: Трофобласты требуют тканевой культуры рассматриваются пластины присоединиться должным образом. Монослой клеток необходима для содействия syncytialization. - Оставить покрытием клетки в Ламинарный шкаф для примерно 30 минут, чтобы позволить клетки, чтобы равномерно распределить, урегулировать и начинают придерживаться нижней части скважины до размещения в инкубаторе.
- Культуры клеток для до 72 ч (с ежедневно средства массовой информации изменения) в 37 ° C инкубатор с CO 2 и 95% влажности 5%.
Примечание: Изучите трофобласты под микроскопом на 10-20 x каждые 24 ч культуры. Трофобласты не размножаются и не может быть пассированной. В течение 72 ч культуры, раунд отдельных трофобласты предохранитель сформировать синцития ( рис. 3A и B).
- пластина 3 миллиона клеток/колодец (3.3 x 10 5 клеток / см 2) в 6-ну плита (2 мл суспензии в колодец) и мягко рок и обратно и стороны в сторону, чтобы равномерно распределить клетки.
- Замораживания клетки
- Пелле неиспользуемые клетки центрифугированием при 1250 x g за 10 мин при 20 ° C.
- Аспирационная столько СМИ как можно дальше от гранул.
- Ресуспензируйте Пелле в замораживания средств массовой информации (Таблица 3).
- Заморозить аликвоты на-80 ° C в контейнере замораживания, заполнены с 100% изопропиловый спирт. Перевод замороженных аликвоты жидкости N 2 на следующий день для долгосрочного хранения.
Примечание: После замораживания может культивируемых клеток.
- Отогрева клетки
- Удалить Алиготе замороженных клеток и размораживать в ванну воды 37 ° C во время крутятся. Удаление Алиготе из водяной бани, только прежде, чем он полностью разморозить в жидкость.
- Немедленно перевести талой клетки в 15 мл Конические трубки. Начало, замедление во-первых, добавить 10 мл полной СМИ с прерывистой смешивания.
- Инвертировать трубки несколько раз перемешать.
- Центрифуга на 200 x g 10 мин при 20 ° C.
- Аспирационная супернатант и Ресуспензируйте гранулы в 2-5 мл теплой полный СМИ.
- Количество клеток и пластины как описано.
3. Лечение первичных трофобласты TNFα, коллекции от Lysates клетки и западный Blotting
- Подготовка
- теплый полный СМИ до 37 ° C.
- Сделать 10 мкг/мл запас TNFα в полной СМИ и хранить при температуре-20 ° C до готовности для использования в.
- Сделать 1 мкг/мл рабочий запас TNFα в полной СМИ, когда будете готовы лечить клетки. Серийный разбавить фондовой работы TNFα 10 4 пг/мл, 10-3 пг/мл, 500 пг/мл, 250 пг/мл, и 125 пг/мл в полной СМИ.
Примечание: 10 4 пг/мл концентрация TNFα умеренно цитотоксические. Регулировка концентрации TNFα испытания будет зависеть от специфики желаемого нисходящие приложения.
- Лечении клетки с TNFα
- после 24 ч культуры, аспирационная культуры СМИ от клеток и заменить с 2 мл TNFα дополнены СМИ в колодец на 6-ну пластины (по крайней мере две скважины за лечение и транспортного средства Управление).
- После 24 ч TNFα-облучения (48 h культуры), заменить СМИ TNFα дополнен полным СМИ.
- Уборки клеток и общего белка
- после 72 ч культуры (24 h мимо удаления TNFα), аспирационная СМИ, Осторожно промойте клетки с комнатной температуре PBS и 80 мкл ледяной Radioimmunoprecipitation Assay Буфер (RIPA), содержащий свежие добавлены ингибиторы протеазы и фосфатазы (Таблица 3) непосредственно в каждой скважине.
- Удалить ячейки из пластины с скребок ячейки. Передать трубку microcentrifuge 1,5 мл, объединения скважин в группах лечения клетки.
- Лизируйте клетки, vortexing трубы на высоком для по крайней мере трех интервалов 15 s.
- Инкубировать клетки на 4 ° C с качания 15 мин
Примечание: в качестве альтернативы, после шага 3.3.3., клетки могут быть насиживают на льду на 15 мин с прерывистой агитации стряхивая трубки, vortexing, или закупорить вверх и делатьWN. - Повторите шаг 3.3.3.
- Центрифуга трубы на 10000 x g 5 мин при 4 ° C для пеллет сотовой мусора.
- Передача супернатант (содержащий клеточных белков) новые пробки microcentrifuge 1,5 мл и магазина на -80 ° C.
Примечание: Протокол может быть остановился здесь и возобновлено на более позднее время. Это рекомендуется сделать несколько аликвоты клеточных белков образцов, чтобы избежать нескольких циклов замораживания оттаивания. - Определение общего белка концентрацию предпочтительным методом, например bicinchoninic кислоты пробирного (BCA, см. таблицу основных материалов, реагентов и оборудования, дополнительные материалы).
- SDS-PAGE и западный Blotting для Рубикон или протеин интереса
Примечание: следовать западной blotting протоколы по данным производителя ' s инструкции с использованием предпочтительного лабораторной системы. Гель- нагрузки между 20-40 мкг общего белка в буфер (Таблица 3) образца в колодец на 12% акриламида. Отделить протеины, SDS-PAGE в управлении буфера (Таблица 3).
- Мокрый передача белки от геля с мембраной винилидена фторид (PVDF) согласно данным производителя ' s инструкции в буфер передачи (Таблица 3).
- Проинкубируйте мембрану в сухое молоко 5% в Tris-Buffered солевой с 0.1% 20 анимации (TBST, Таблица 3) для по крайней мере 1 ч при комнатной температуре с качания.
- Проинкубируйте мембрану в основное антитело Рубикон (см. таблицу основных материалов, реагентов и оборудования, дополнительные материалы) в 1: 500 в 1% сухое молоко в TBST на ночь при 4 ° C с качания.
- Осторожно промыть мембраны 3 x 5 мин в TBST и 1 x 5 мин в TBS при комнатной температуре с качания.
- Проинкубируйте мембрану в 1: 2000 - 1: 5000 вторичные антитела (HRP-связаны или предпочтительным видимых конъюгата, см. таблицу основных материалов, реагентов и оборудования, дополнительные материалы) в сухое молоко 5% в TBST для по крайней мере 1 ч при комнатной температуре с Рокинг.
- Повторить Стиральная, описанную на шаге 3.4.5 и визуализировать блот с соответствующей визуализации (то есть хемилюминесцентный) субстрата на съемочной системы.
- Повторить Стиральная, описанную на шаге 3.4.5 и зонд мембрана для предпочтительного загрузки управления согласно данным производителя или β-актина ' s инструкции.
- На предпочтительный образ программного обеспечения для анализа, проанализировать выражение Рубикон, ручной количественной оценки поглощения (Группа интенсивности), вычитание фона поглощения и нормализации для загрузки соответствующего управления группа интенсивности. Проводить статистический анализ необходимости для проверки статистически значимых изменений в уровни белка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Срок человеческой плаценты от худой (до беременности массы тела (ИМТ) < 25) матерей с неосложненной беременности, перевозящих потомства были собраны и попробовать в течение 15 минут о доставки путем операции кесарева сечения (без труда). Плаценты были рассмотрены за отсутствие обызвествления и типичные развития: весом 300-600 g с пуповиной и мембраны удалены, круглые формы, между 15-25 см в диаметре и пуповины, вставляется в середине плаценты. Ворсинчатых ткани был расчлененный от базальной и хорионического пластины в 2-3 пробах через плаценту (рис. 1), уступая приблизительно 100 г ворсинчатых ткани как исходный материал для изоляции первичных трофобласта. В течение 20 минут выборки ворсинчатых ткани, процедура для изоляции первичных трофобласты был запущен как описано здесь, уступая между 0,8 - 1 x 108 жизнеспособных клеток. Клетки были посеяны в 6-ну культуры пластин на плотности 3 х 106 (3.3 x 105 клеток / см2). После 24 ч культуры были изучены клетки под микроскопом для вложения и надлежащего трофобласта морфология было подтверждено (индивидуальные круглые клетки). Средства массовой информации культуры был заменен полной СМИ, содержащий ряд концентрации TNFα между4 125-10 пг/мл, так что по крайней мере две скважины были включены в концентрации и управления транспортным средством (только для полной СМИ).
Двадцати четырех часов после TNFα-лечение (48 h культуры), все СМИ TNFα были заменены полным СМИ. Нет ощутимого клеточной гибели наблюдалась вследствие лечения с TNFα в концентрациях на уровне или ниже 103 пг/мл. Лечения с 104 пг/мл TNFα был умеренно цитотоксических и цитотоксических эффектов этой концентрации TNFα не сохраняются после того, как средства массовой информации было изменено, что подтверждается Лактатдегидрогеназа (LDH) анализов (данные не показаны). 72 ч культуры клетки были изучены для syncytialization под микроскопом. Immunocytochemistry для фибробластов загрязнения и syncytialization показали относительно чистой изоляции трофобласты (рис. 3). Сотовый лизатов собрано согласно протоколу, описанных здесь, уступая между 3-8 мкг/мкл общего белка на подготовку как определяется BCA пробирного (данные не показаны). Западной помарке анализа в lysates клетки от женского трофобласты, относились с TNFα, показал upregulation Рубикон выражения в ответ на концентрации TNFα до 250 пг/мл и последующего Даунрегуляция Рубикон выражения в концентрациях, TNFα, большей более 250 пг/мл (рис. 4A и B, 104 пг/мл исключены из анализа на основе цитотоксическими эффектами). Аналогичным образом, Рубикон, значительно upregulated в флэш замороженные ворсинчатых ткани биопсий из плаценты с ожирением беременностей с женского плода по сравнению с худой контроля, что подтверждается Западный анализ помаркой (Рисунок 4 c и D, n = 6 плаценты на BMI класса, ANOVA, P < 0,05).
| Концентрация (%) | 90% DGM (мл) | 1 x HBSS (мл) | Толщина слоя (мл) |
| 4 x градиент | 4 x градиент | Всего 34,5 мл | |
| 70 | 14 | 4 | 4.5 |
| 60 | 8 | 4 | 3 |
| 55 | 7.33 | 4.67 | 3 |
| 50 | 3.34 | 2.67 | 3 |
| 45 | 6 | 6 | 3 (13,5 мл знак) |
| 40 | 5.33 | 6.67 | 3 |
| 35 | 4.67 | 7.33 | 3 (пометить 19,5 мл) |
| 30 | 8 | 16 | 6 |
| 20 | 2.67 | 9.33 | 3 |
| 10 | 1.33 | 10,67 | 3 |
Таблица 1. Технические характеристики для создания плотности градиенты плотности центрифугирования первичных трофобласты.
Слева направо, столбец определяет градиент плотности СМИ (DGM, см. таблицу основных материалов, реагентов и оборудования, дополнительные материалы) концентрации, выраженный в виде процентной доли DGM в HBSS. Второй колонке указывает объем DGM, в то время как третий столбец указывает объем HBSS, необходимых для принятия соответствующий процент DGM решения. Колонка 4 определяет громкость для добавления 50 мл Конические трубки для создания градиента, начиная с наиболее плотного слоя.
| Трипсин | HBSS | DNase | ||
| Пищеварение | (полная активность; BAEE единиц) | объем (мл) | (полная активность; Куниц) | Общий объем /DIGESTION |
| 1 | 619037 (23.01 мл) | 141.76 мл | 62594 (0,230 мл) | 165 мл |
| 2 | 412691 (15.34 мл) | 94.51 мл | 41729 (0,154 мл) | 110 мл |
| 3 | 313270 (11.65 мл) | 71.74 мл | 31676 (0,116 мл) | 83.5 мл |
| Итого | 1345000 (50 мл) | 308 мл | 136000 (0,5 мл) | 358.5 мл |
Таблица 2. Технические характеристики для подготовки пищеварение решения для изоляции первичных трофобласта, основанной на специфическую активность DNase и трипсина.
Слева направо, первый столбец указывает количество пищеварения, второй столбец определяет активность трипсина, требуется на пищеварение, третья колонка указывает общий объем дополнениями HBSS добавляться соответствующие пищеварение, четвертый столбец указывает DNase деятельности требуется на пищеварение, и последний столбец указывает объем раствора пищеварение будетдобавлены в плацентарной ткани для соответствующих пищеварения.
| HBSS (дополненная Ca+ 2 и Mg+ 2) | Буфер образца |
| 10% 10 x HBSS | 90% 4 X Laemmli краска |
| 1.26 мм CaCl2 (производные). | 10% 2-меркаптоэтанол |
| 0,80 мм MgSO4 (производные). | |
| 20.77 мм HEPES | |
| рН 7,4 с 10N NaOH Сделать объем до 1 L с стерильных ddH2O Стерильные фильтр в стерильные бутылки |
|
| Полная СМИ | Идущий буфер |
| Удаление 11% v/v IMDM | Tris база 25 мм |
| Добавить 10% v/v FBS | 190 мм глицин |
| Добавить 1% 10 000 ед/мл пенициллина/стрептомицина (100 ед/мл финал) | 0,1% SDS |
| pH до 8,3 | |
| Замораживание средств массовой информации | |
| 90% v/v FBS | Передача буфера |
| 10% v/v ДМСО | 25 мм трис |
| 190 мм глицин | |
| Пищеварение буфер | 20% метанола |
| 50 мл трипсина (26 900 BAEE единиц/мл) | pH до 8,3 |
| 0,5 мл DNAse (272,000 K единиц/мл) | |
| Довести до 358.5 мл в дополнение HBSS | TBS |
| 20 мм трис | |
| Буфер RIPA | 150 мм NaCl |
| 25 мм трис HCl | pH 7.6 |
| 5 мм ЭДТА | |
| 150 мм NaCl | TBST |
| 0,1% SDS | TBS с 0.1% анимации 20 |
| 0,5 Дезоксихолат натрия % | |
| 1% X-100 Тритон | |
| Буфер RIPA 1 таблетка ингибитора протеазы/фосфатазы на 10 мл |
Таблица 3. Решения, необходимые для изоляции и культуры первичной трофобласты следуют западный Blotting.
| % DGM | Марк мл | Тип ячейки |
| 10 | 31.5-34,5 | Мусор |
| 20 | 28,5-31.5 | |
| 30 | 22,5-28,5 | |
| 35 | 19,5-22,5 | Трофобласты |
| 40 | 16,5-19,5 | |
| 45 | 13.5-16,5 | |
| 50 | 10,5-13,5 | Лимфоциты |
| 55 | 7.5-10,5 | |
| 60 | 4,5-7,5 | Красные кровяные клетки |
| 70 | Ниже 4.5 |
Таблица 4. Седиментирование трофобласты центрифугированием плотности.
Слева направо, первый столбец указывает процент DGM (Таблица 1), второй столбец указывает знак мл, где соответствующий процент DGM находится на 50 мл Конические трубки, и третий столбец определяет, какие ячейки типа отложений на соответствующий процент марки DGM и мл на 50 мл Конические трубки. Трофобласты осадков между 50-35% DGM, образуя собственный непрозрачные полосы. Сбор DGM, выше или ниже этого диапазона приведет к загрязнению сотовой мусора и другие типы клеток, таких как лимфоциты.
Рисунок 1. Ворсинчатых ткани изолирован от термин человеческой плаценты, удалив хорионического и базальной пластинки.
A) с хорионический пластину (плода сторона) вверх, полная толщина образца вырезан из плаценты. B) образец ворсинчатых ткани получается путем удаления хорионический и базальной пластинки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Центрифугирование клеток в растворе пищеварение над новорожденного теленка сыворотки приводит многослойных Пелле ячейки.
A) новорожденного теленка сыворотки (NCS) накладывается под суспензию клеток в растворе дайджест в 50 мл Конические трубки. B) центрифугирования (A) приводит в многослойных ячейки Пелле. Самый нижний слой глубоко в красный цвет и состоит из красных кровяных клеток. Слой выше включает трофобласты, белый или бежевый цвет. Выше трофобласта слой — NCS, следуют пищеварение решение (супернатант) в верхней части трубки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
На рисунке 3. Immunocytological анализ содержания фибробластов в культурах основного человеческого трофобласта и Syncytialization.
A) представитель образ Цитокератины-7 (красный) в cytotrophoblasts после 24 ч культуры. B) представитель образ Цитокератины-7 (красный) в syncytiotrophoblasts после 72 ч культуры показывает многоядерные массы клеток, которые слиты. C) представитель образ виментин (красный) в syncytiotrophoblasts после 72 ч культуры. Изображения были приобретены на флуоресцентный микроскоп с ядерной изображение DAPI (синий). Визуализируется при 10-кратном. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. Регуляция экспрессии Рубикон в ответ на TNFα-лечение в женских трофобласты и эндогенных Рубикон выражение в ворсинчатых ткани от Lean по сравнению с ожирением беременностей с женского плода.
Основная трофобласты от термин плаценты от худой матерей с здоровой беременности, перевозящих женского плода были изолированы и относились с 125, 250, 500, 103и 104 пг/мл TNFα (или управления транспортного средства). A) представитель западной помарке для Рубикон в женских трофобласта лизатов относились с TNFα. Β-актина был использован как элемент управления загрузки. B) Рубикон выражение в ответ TNFα-лечение в женских трофобласты был количественно от западной помарки и нормализуется к β-актина. Значения являются среднее Рубикон выражение за TNFα концентрации ± ФБ в n = 3 плаценты. C) западных помарок для Рубикон в цельной ткани лизатов из флэш замороженных биопсии ворсинок ткани от худой по сравнению с ожирением беременностей с женского плода (F1-F12). Лактатдегидрогеназа (LDHA) был использован как элемент управления загрузки. D) Рубикон, выражение в западных помарок от (C) был количественно и нормализуется до LDHA. Значения являются означает выражение Рубикон на BMI классификации ± ФБ в n = 6 плаценты каждого класса BMI (ANOVA, * P < 0,05). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Плацента, ответственным за регулирование роста плода, экспонаты нарушенной функцией в ожирением среды6. Несмотря на высокие метаболические требования трофобласты плаценты с материнской ожирения экспонат неблагополучных митохондриальное дыхание6,19. Изменения в плацентарной метаболизма может способствовать рост числа случаев осложнений и неблагоприятных исходов плода, наблюдается в ожирением беременности3,6,7. Autophagy нарушается также в плаценты с материнской ожирения. Плаценты с ожирением беременностей с мужской плодов Показать неблагополучных autophagic потока как подтверждается накопление autophagosomes13. Поддержание оптимального autophagic поток имеет решающее значение для клеточного гомеостаза и дефектных autophagy в плаценты с материнской ожирения может играть важную роль в посредничестве неблагоприятных исходов, связанных с ожирением беременностей.
Точное причину(ы) нарушенной функцией плаценты, выставлены в материнской ожирения не вполне понятны и могут иметь свои истоки в воспалительных сигнализации. Ожирение и беременность являются провоспалительных государства характеризуются повышенный уровень циркулирующих TNFα1,4,,2021. TNFα активатор autophagy22,23и может посредничать изменения в autophagic потока в плаценты от ожирением беременностей. TNFα обычно используется для изучения последствий воспаления на клетки, особенно в контексте рака2. Протокола, представленные здесь адаптирует этот подход для изучения воздействия связанных с ожирением воспаления на функциональные возможности плаценты при лечении первичной трофобласты с экзогенной TNFα в культуре.
Этот протокол состоит из четырех основных компонентов: выборки ворсинчатых ткани из плаценты, изоляции первичных трофобласты от ворсинок ткани, культура первичных трофобласты следуют TNFα лечение и сбор всего сотовой лизатов следуют Западной помарке анализа для оценки выражения белки интерес. Чтобы изолировать чисто трофобласты, важно, что хорионический и Базальные пластины тщательно расчлененный от ворсинок ткани во время выборки плаценты (Рисунок 1B). Важно также, что ворсинчатых ткань обрабатывается своевременно (то есть в течение 30 минут его доставки). Этот протокол подробности использования трех шагов, пищеварение, каждый длительностью 35 минут, выпустить трофобласты от дополнительных клеточных матрицы ворсинчатых ткани. Более продолжительные пищеварения риска повреждения клеток, trypsinization белков клеток поверхности. Увеличение числа дайджесты окончательный выход жизнеспособных трофобласты определённо не увеличить. Однако, уменьшается время и количество пищеварения приведет к снижению клеток урожайности (Симон, Бухер и Малоян, неопубликованные данные). Этот протокол надежно производит около 100 миллионов клеток от 80-120 грамм ворсинчатых ткани.
Есть изменчивость в количество различимых трофобласта полос на плотности градиенты между изоляции. Чтобы избежать загрязнения от других типов клетки, важно собрать строго частот мощности, содержащие трофобласты на градиент плотности (Таблица 4). Здесь подробно протокол оптимизирован от ранее созданных методов, которые дают относительно чистой трофобласты с менее чем 5% загрязнения от других клеток типы10,,1112. Дальнейшего очищения может быть достиган положительный или отрицательный отбор24. Однако этот подход работает риск снижения урожайности жизнеспособных трофобласты. Анализ иммуноцитохимическое Цитокератины-7 в первичной трофобласты изолированы с помощью процедуры, представленные здесь, после того, как 24 против 72 h время культуры подтвердил, что клетки прошли syncytialization, о чем свидетельствует присутствие масс многоядерные клетки 72 h, визитной карточкой событие в жизни трофобласта (рис. 3A и B). Кроме того иммуноцитохимическое анализ виментин в первичной трофобласты, культивированный за 72 ч показал очень немногие загрязняющие фибробластов (рис. 3 c). Для выполнения плановых процессов чистоту трофобласты может контролироваться в культуре простой морфологической оценки. В 24 ч время культуры раунд отдельных cytotrophoblasts доминируют культуры. Cytotrophoblasts пройти syncytialization после 72 ч культуры, результате кусты плавленого клеток. Наиболее распространенных загрязняющих тип ячейки в этой культуре является фиброцита или эндотелиальных клеток, которые являются удлиненные и полигональной формы, соответственно. Эти функции могут контролироваться примерно с помощью ярких микроскопа.
Лечение первичного трофобласты с TNFα обеспечивает управляемая система, которая позволяет измерить эффект TNFα сигнализации на регулирование критических путей в трофобласты. Естественно существуют факторы помимо TNFα ожирением матери среды в естественных условиях , могут быть ответственны за модулирует функции трофобласта. Они включают, но не ограничиваются гормональные сигналы, гиперлипидемия и целый ряд других провоспалительных факторов25. Комбинации различных методов лечения будет далее напомнить ожирением внутриутробной среды ex vivo в физиологически более точным способом. Концентрации экзогенных TNFα, используется для лечения трофобласты в этом протоколе намного превышают обычно циркулирующих в естественных условиях. Концентрации в сыворотке крови были сообщалось до 20 нг/мл или в некоторых воспалительных26выше. Получить измеримые ответ на текущие лабораторные методы (т.е. Западный blotting), это необходимо для усиления концентрации TNFα выявить изменения в экспрессии генов и пути интерес. Эти ответы могут существовать в естественных условиях в меньшей степени. Однако они могут тем не менее существенно повлиять на функции трофобласты. Разоблачение трофобласты высоких концентраций TNFα рискует производить артефакты в экспрессии генов и путь анализа, которые могут быть корнями в цитотоксических эффектов. Умеренные цитотоксичность наблюдалась в трофобласты, подвергаются 104 пг/мл СМИ TNFα дополнены для 24 h как подтверждается ЛДГ цитотоксичность анализов (данные не показаны). Однако концентрации на уровне или ниже 10-3 пг/мл TNFα не производят каких-либо заметных клеточной гибели.
Тестирование TNFα концентрации на меньшие промежутки времени и/или которые являются ниже, чем описано здесь может быть лучше всего последовать количественныхполимеразной цепной реакции (ПЦР) для анализа выражения гена, метод хорошо подходит для обнаружения небольшие изменения в экспрессии генов. В то время как ПЦР тесты специально для уровни выражения гена на уровне транскрипционный анализ, Западный blotting обнаруживает окончательный уровень белковых продуктов, которые предположительно доступны для выполнения их клеточных задачам. Используя оба аналитических методов в сочетании представляет собой мощный подход для определения воздействия TNFα лечения на регулирование уровни выражения гена, а также для определения, если изменения в уровнях выражения являются результатом транскрипционный анализ, POST-transcriptional, или столб-поступательные регулирование. Воспалительные стресс может повлиять на поведение трофобласта, морфология и syncytialization. Включая морфологической оценки (то есть immunocytochemistry) помимо молекулярные аналитические подходы обеспечит более всесторонний анализ последствий TNFα воздействия на здоровье трофобласта. Корректировка TNFα концентрации протестированы и ниже по течению анализов по данным экспериментальных требования является целесообразным.
Путем реализации протокола, описанные здесь, upregulate Рубикон выражение в человека трофобласты обнаружено TNFα-опосредованной воспаление от худой беременностей с женского плода. Западный blotting для Рубикон в трофобласта лизатов показали две отдельных группы вблизи и выше ожидаемых молекулярный вес 140 кДа (рис. 4A). Есть основания полагать, что нижняя полоса неспецифические (pAb PD047 анти Рубикон, MBL данных листа, http://ruo.mbl.co.jp/bio/g/dtl/A/?pcd=PD027#u-pub). Трофобласты женщин продемонстрировала способность upregulate выражение Рубикон в ответ на лечение TNFα концентрации до 250 пг/мл. В концентрациях, превышающих этот, Рубикон выражение уровня снизилась обратно к базовой (необработанных управления) и даже ниже (рис. 4б, n = 3). Учитывая, что лечение трофобласты от худой беременностей с TNFα имитирует воспаления в ожирением внутриутробной среды, этот результат является дополнением к вывод это Рубикон значительно upregulated в флэш замороженные ворсинчатых ткань биопсии от плаценты с ожирением беременностей с женского плода по сравнению с худой управления (Рисунок 4 c и D, ANOVA, n = 6 процентов BMI класса, P < 0,05).
В то время как autophagic потока, как представляется, не отличаются в трофобласты с ожирением беременностей с женского плода по сравнению с худой элементов управления, с ожирением беременностей с мужской плод трофобласты exhibit активации формирования и накопление autophagosomes 13. Рубикон это негативный регулятор autophagy, где она действует прекратить autophagosome Лизосома фьюжн27. Женские трофобласты может upregulate выражение Рубикон как механизм компенсационных или защитных против TNFα-опосредованной воспаление, которое может активировать autophagy22, позволяя им поддерживать autophagic потока lean как в обстановке Материнская тучность. Этот ответ в плаценты может играть роль в как женский плод тариф лучше, чем мужчины, страдают ожирением внутриутробной среды. Моделирование воспалительных окружения, связанные с материнской ожирения ex vivo через лечении первичного человека трофобласты с TNFα обеспечивает платформу для изучения последствий страдают ожирением внутриутробной среды на регулирование критических путей в трофобласты. Внесения поправок в этот протокол с новой и комбинаторного лечения, направленные на перечислении ожирением матери окружающей среды будет предоставлять захватывающие проспект для изучения влияния материнской ожирения на плацентарный функции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Авторы благодарят женщин, кто пожертвовал их плаценты для этого исследования. Мы также благодарим труда и отдел доставки на OHSU и матери и плода исследовательская группа для координации сбора плаценты. Мы благодарны Эрик ван, к.т.н., и Келли Куо, MD за поддержку и помощь с экспериментальными методами и оптимизации.
Эта работа финансировалась по НИЗ HD076259A (AM) и Ана GRNT29960007 (AM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X HBSS | Gibco | 14185-052 | |
| CaCl2 (anhyd.) | Sigma-Aldrich | C1016-100G | |
| MgSO4 (anhyd.) | Sigma-Aldrich | M7506-500G | |
| Hepes | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| DNAse | Worthington Biochemical Corp. | LS002139 | |
| Protease/Phosphatase inhibitors | Thermofisher Scientific | 88668 | |
| Tris HCl | Invitrogen | 15506-017 | |
| EDTA | Invitrogen | 15576-028 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653-1KG | |
| SDS | Fisher Scientific | BP166-600 | |
| Sodium deoxycholate. | Fisher Scientific | AAJ6228822 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | |
| Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) | Gibco | 12440-046 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| Neonatal Calf Serum (NCS) | Gibco | 26010-074 | |
| Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Gibco | 15140-122 | |
| 10% Formalin | Fisher Scientific | 23-427-098 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | |
| TNFα | Sigma-Aldrich | SRP3177-50UG | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 70013-032 | |
| K2EDTA vacutainer blood collection tubes | BD | 366450 | |
| Percoll (Density Gradient Media, DGM) | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| 6 well plates | Corning | 353046 | |
| Cell strainers | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes 2.0 mL, natural | Fisher Scientific | 22363352 | |
| Trypan Blue | Corning | 25-900-Cl | |
| Bio-Rad Mini-PROTEAN Tetra System | Bio-Rad | 1658001FC | |
| Bio-Rad Mini Trans-Blot Cell | Bio-Rad | 1658033 | |
| TGX FastCast Acrylamide Kit, 12% | Bio-Rad | 1610175 | |
| Mini-Protean 3 Multi-Casting Chamber | Bio-Rad | 1654112 | |
| 4X Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610747 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148-100ML | |
| Glycine | Bio-Rad | 1610718 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P7949-500ML | |
| Instant Nonfat Dry Milk | Carnation | ||
| Rubicon (D9F7) Rabbit mAb | Cell Signalling Technology | 8465S | |
| Monoclonal Anti-β-Actin antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | A2228-100UL | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signalling Technology | 7074S | |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signalling Technology | 7076S | |
| SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34578 |
References
- Gregor, M. F., Hotamisligil, G. S. Inflammatory mechanisms in obesity. Annu. Rev. Immunol. 29, 415-445 (2011).
- van Horssen, R., Ten Hagen, T. L. M., Eggermont, A. M. M. TNF-alpha in cancer treatment: molecular insights, antitumor effects, and clinical utility. Oncologist. 11 (4), 397-408 (2006).
- Yogev, Y., Catalano, P. M. Pregnancy and obesity. Obstet. Gynecol. Clin. North Am. 36 (2), 285-300 (2009).
- Basu, S., et al. Pregravid obesity associates with increased maternal endotoxemia and metabolic inflammation. Obesity (Silver Spring). 19 (3), 476-482 (2011).
- Muralimanoharan, S., Guo, C., Myatt, L., Maloyan, A. Sexual dimorphism in miR-210 expression and mitochondrial dysfunction in the placenta with maternal obesity. Int J Obes (Lond). 39 (8), 1274-1281 (2015).
- Myatt, L., Maloyan, A. Obesity and placental function. Semin. Reprod. Med. 34 (1), 42-49 (2016).
- Aune, D., Saugstad, O. D., Henriksen, T., Tonstad, S. Maternal body mass index and the risk of fetal death, stillbirth, and infant death: a systematic review and meta-analysis. JAMA. 311 (15), 1536-1546 (2014).
- Eriksson, J. G., Kajantie, E., Osmond, C., Thornburg, K., Barker, D. J. P. Boys live dangerously in the womb. Am. J. Hum. Biol. 22 (3), 330-335 (2010).
- Kliman, H. J. Trophoblast to human placenta. Enc. Reprod. Knobil, E., Neill, J. D. 4, Academic Press. San Diego. 834-846 (1999).
- Kliman, H. J., Nestler, J. E., Sermasi, E., Sanger, J. M., Strauss, J. F. Purification, characterization, and in vitro differentiation of cytotrophoblasts from human term placentae. Endocrinology. 118 (4), 1567-1582 (1986).
- Bax, C. M., et al. Ultrastructural changes and immunocytochemical analysis of human placental trophoblast during short-term culture. Placenta. 10 (2), 179-194 (1989).
- Le Bellego, F., Vaillancourt, C., Lafond, J. Isolation and culture of term human cytotrophoblast cells and in vitro methods for studying human cytotrophoblast cells' calcium uptake. Methods Mol. Biol. 550, 73-87 (2009).
- Muralimanoharan, S., Gao, X., Weintraub, S., Myatt, L., Maloyan, A. Sexual dimorphism in activation of placental autophagy in obese women with evidence for fetal programming from a placenta-specific mouse model. Autophagy. 12 (5), 752-769 (2016).
- Matsunaga, K., et al. Two Beclin 1-binding proteins, Atg14L and Rubicon, reciprocally regulate autophagy at different stages. Nat. Cell. Biol. 11 (4), 385-396 (2009).
- Zhong, Y., et al. Distinct regulation of autophagic activity by Atg14L and Rubicon associated with Beclin 1-phosphatidylinositol-3-kinase complex. Nat. Cell. Biol. 11 (4), 468-476 (2009).
- Yang, C. -S., et al. Autophagy Protein Rubicon Mediates Phagocytic NADPH Oxidase Activation in Response to Microbial Infection or TLR Stimulation. Cell Host & Microbe. 11 (3), 264-276 (2012).
- Yang, C. -S., et al. The Autophagy Regulator Rubicon Is a Feedback Inhibitor of CARD9-Mediated Host Innate Immunity. Cell Host & Microbe. 11 (3), 277-289 (2012).
- Zi, Z., et al. Rubicon deficiency enhances cardiac autophagy and protects mice from lipopolysaccharide-induced lethality and reduction in stroke volume. J. Cardiovasc. Pharmacol. 65 (3), 252-261 (2015).
- Mele, J., Muralimanoharan, S., Maloyan, A., Myatt, L. Impaired mitochondrial function in human placenta with increased maternal adiposity. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 307 (5), E419-E425 (2014).
- Mor, G., Cardenas, I., Abrahams, V., Guller, S. Inflammation and pregnancy: the role of the immune system at the implantation site. Ann N Y Acad Sci. 1221 (1), 80-87 (2011).
- Resi, V., et al. Molecular inflammation and adipose tissue matrix remodeling precede physiological adaptations to pregnancy. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 303 (7), E832-E840 (2012).
- Levine, B., Mizushima, N., Virgin, H. W. Autophagy in immunity and inflammation. Nature. 469 (7330), 323-335 (2011).
- Virgin, H. W., Levine, B. Autophagy genes in immunity. Nat. Immunol. 10 (5), 461-470 (2009).
- Sagrillo-Fagundes, L., et al. Human Primary Trophoblast Cell Culture Model to Study the Protective Effects of Melatonin Against Hypoxia/reoxygenation-induced Disruption. JoVE. (113), (2016).
- Segovia, S. A., Vickers, M. H., Gray, C., Reynolds, C. M. Maternal obesity, inflammation, and developmental programming. Biomed. Res. Int. , 418975 (2014).
- Komatsu, M., et al. Tumor necrosis factor-alpha in serum of patients with inflammatory bowel disease as measured by a highly sensitive immuno-PCR. Clin. Chem. 47 (7), 1297-1301 (2001).
- Matsunaga, K., Noda, T., Yoshimori, T. Binding Rubicon to cross the Rubicon. Autophagy. 5 (6), 876-877 (2009).
