Summary

Un modello di trofoblasto umano primario per studiare l'effetto di infiammazione associata con l'obesità materna sulla regolazione dell'autofagia nella Placenta

Published: September 27, 2017
doi:

Summary

Presentato qui è un protocollo per il campionamento del tessuto villous placenta umano seguito da isolamento di cytotrophoblasts per colture cellulari primarie. Trattamento del trofoblasto con TNFα ricapitola l’infiammazione nell’ambiente intrauterino obeso e facilita la scoperta di bersagli molecolari regolati da infiammazione in placente con l’obesità materna.

Abstract

L’obesità materna è associata con un rischio aumentato di esiti perinatali negativi che sono probabilmente mediati da compromissione della funzione placentare che può essere attribuito, in parte, la disregolazione dell’autofagia. Aberrante cambiamenti nell’espressione di regolatori dell’autofagia in placente da gravidanze obese possono essere regolati tramite i processi infiammatori connessi con l’obesità e la gravidanza. Un protocollo per il campionamento del tessuto villous e isolamento di cytotrophoblasts dei villi della placenta umana a termine per colture cellulari primarie è descritto qui. Questa è seguita da un metodo per simulare il milieu infiammatorio nell’ambiente intrauterino obeso trattando trofoblasti primari da magre gravidanze con fattore di necrosi tumorale alfa (TNF), una citochina proinflammatory che è elevata nell’obesità e nella gravidanza. Attraverso l’implementazione del protocollo descritto qui, è trovato che l’esposizione a esogeno TNFα regola l’espressione di Rubicon, un regolatore negativo dell’autofagia, nel trofoblasto da magre gravidanze con feti di sesso femminile. Mentre una varietà di fattori biologici nell’ambiente intrauterino obeso mantenere il potenziale di modulare le vie critiche nel trofoblasto, questo sistema ex vivo è particolarmente utile per determinare se espressione modelli osservata in vivo in placente umane con l’obesità materna sono un risultato diretto di TNFα segnalazione. In definitiva, questo approccio offre l’opportunità di analizzare le implicazioni normative e molecolare di infiammazione associata con l’obesità materna su autophagy e su altre vie cellulari critici nel trofoblasto che hanno il potenziale di impatto funzione placentare.

Introduction

L’obesità è uno stato infiammatorio caratterizzato da infiammazione cronica, derivante dal tessuto adiposo in eccesso e disponibilità di nutrienti. Nell’obesità, citochine proinfiammatorie sono elevate nei tessuti metabolici così come sistematicamente in circolazione. Un robusto corpo di prova ha dimostrato che TNFα è significativamente elevato nella regolazione dell’obesità con implicazioni in insulino-resistenza e disfunzione metabolica1. Attivazione di TNFα contribuisce alla patogenesi della malattia in condizioni come il cancro e l’autoimmunità, che lo rende un obiettivo terapeutico attraente2.

L’infiammazione nell’obesità è aggravata dalla gravidanza, inoltre, un stato proinflammatory3,4. Precedentemente è stato indicato che placentare TNFα contenuto aumenta con adiposità materna nelle gravidanze con feti di sesso femminile. Inoltre, il trattamento di TNFα inibisce la respirazione mitocondriale nelle cellule del trofoblasto femminile ma non male, suggerendo che il TNFα è coinvolto nella regolazione del metabolismo placenta in un modo sessualmente dimorphic5. L’obesità materna è associata con l’incidenza aumentata di una varietà di complicazioni durante la gravidanza, tra cui il feto nato morto, con feti maschi, essendo il più suscettibile3,6,7,8 . Dovuto il relativo ruolo chiave a livello di interfaccia materno-fetale, cambiamenti nella capacità funzionale della placenta nell’ambiente intrauterino obeso in risposta alla segnalazione infiammatoria possono svolgere un ruolo importante nel mediare gli esiti delle gravidanze obesi.

Cytotrophoblasts e syncytiotrophoblasts nel tessuto dei villi della placenta sono fondamentali per la segnalazione endocrina e scambio di nutrienti e ossigeno tra la madre e sviluppo feto9. Interruzioni nella capacità funzionale di villous cytotrophoblasts (in appresso denominato trofoblasto) possono compromettere lo sviluppo e la salute del feto. Questo protocollo descrive un metodo per il campionamento del tessuto dei villi della placenta umana a termine distanza dissezionando le piastre corioniche e basale insieme a una procedura ottimizzata per l’isolamento di trofoblasti per colture cellulari primarie. Questo protocollo è derivato da metodologie consolidate che coinvolgono digestione enzimatica del tessuto villous di rilasciare cellule dalla matrice extracellulare seguita da centrifugazione differenziale densità per isolare trofoblasti10, 11,12. Questo dettagli del protocollo un approccio in cui primari trofoblasti da placente da gravidanze magre sono trattati con mezzi di coltura completati con TNFα per simulare un componente del milieu infiammatorio associato con l’obesità materna. Infine, è descritta una procedura semplice per la raccolta lisati cellulari totali dal trofoblasto TNFα-trattati, seguita da Western blotting per rilevare i cambiamenti nell’espressione genica.

Mentre questo modello non ricapitolare obesogenico nell’utero ambiente nella sua interezza, esso fornisce un sistema controllato che permette di analizzare il contributo individuale di TNFα-mediata di infiammazione in risposta dei trofoblasti a obesità materna. Questo modello offre sia l’opportunità di scoprire o confermare bersagli molecolari direttamente disciplinate dal TNFα segnalazione nel trofoblasto, nonché permette di verificare se i cambiamenti nel pattern di espressione genica osservati in vivo in placente con materna l’obesità può essere un risultato di infiammazione TNFα-mediata.

L’approccio qui descritto è stato implementato per testare l’effetto di infiammazione TNFα-mediata sulla regolazione dell’autofagia nel trofoblasto umano. Trofoblasto da obese gravidanze con feti di sesso maschile Mostra perturbato autofagica fatturato o autofagosoma maturazione13. Una proteina chiamata Rubicon (RUN dominio proteina d’interazione Beclin1 e ricche di cisteina contenente), che è localizzato per i lisosomi e late endosomes, recentemente è stata descritta come un “freno” nel processo di autofagia fatturato perché funziona come un negativo regolatore di autofagosoma maturazione14,15. Infatti, il Rubicon è un raro esempio di una proteina che trattiene l’autofagia, che lo rende un prezioso obiettivo terapeutico. Poche informazioni sono disponibili circa il significato patofisiologico di Rubicon, fatta eccezione per i suoi ruoli nella risposta immunitaria innata a microbials16,17 e del cardiomyocyte protezione18. Mediante il protocollo descritto qui, si è constatato che il Rubicon è upregulated nel trofoblasto femminile primario in risposta al trattamento con aumento delle concentrazioni di TNFα fino a 250 pg/mL. Il regolamento di Rubicon può svolgere un ruolo in come femmina feti tariffa migliore rispetto ai maschi nelle gravidanze con l’obesità materna. Ricapitolando l’infiammazione associata con l’obesità materna ex vivo esponendo trofoblasto umano di TNFα esogena fornisce una piattaforma per studiare l’impatto dell’ambiente intrauterino obeso sulla regolamentazione dei percorsi critici in trofoblasto e, per estensione, la funzione placentare.

Protocol

placente sono stati raccolti dall’unità di consegna all’ospedale universitario e del lavoro nell’ambito di un protocollo approvato dall’istituzionale Review Board of Oregon Health and Science University a Portland, Oregon, con il consenso informato il pazienti. 1. raccolta di tessuto placentare preparazione Nota: tutte le attrezzature che incontra il tessuto devono essere sterile. L’apparecchiatura per dissezione di sterilizzare in autoclave per 60 …

Representative Results

Termine le placente umane dal magro (pre-gravidanza massa corporea (BMI) < 25) le madri con gravidanze semplici che trasportano prole femminile sono stati raccolti e campionate entro 15 minuti di consegna dalla sezione cesarean (non lavoro). Le placente sono state esaminate per l’assenza di calcificazioni e sviluppo tipico: peso compreso tra 300-600 g con il cordone ombelicale e membrane rimosse, rotondo in forma, tra 15-25 cm di diametro e inserito nel mezzo del cordone ombelicale la…

Discussion

La placenta, responsabile della regolazione della crescita del feto, esibisce funzione compromessa in obesi ambiente6. Nonostante le elevate esigenze metaboliche di trofoblasto, placente con l’obesità materna esibiscono disfunzionali respirazione mitocondriale6,19. Cambiamenti nel metabolismo placenta possono contribuire all’aumento di incidenza di complicanze e i risultati fetali avversi osservati in gravidanze obesi3</…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori ringraziano le donne che hanno donato loro placente per questo studio. Ringraziamo anche il dipartimento di consegna al OHSU e materno e fetale Team di ricerca e lavoro per coordinare la raccolta di placente. Siamo grati a Eric Wang, pH.d. e Kelly Kuo, MD per supporto e aiuto con metodi sperimentali e ottimizzazione.

Questo lavoro è stato finanziato da NIH HD076259A (AM) e AHA GRNT29960007 (AM).

Materials

10X HBSS Gibco 14185-052
CaCl2 (anhyd.) Sigma-Aldrich C1016-100G
MgSO4 (anhyd.) Sigma-Aldrich M7506-500G
Hepes Fisher Scientific BP310-500
Trypsin Gibco 15090-046
DNAse Worthington Biochemical Corp. LS002139
Protease/Phosphatase inhibitors Thermofisher Scientific 88668
Tris HCl Invitrogen 15506-017
EDTA Invitrogen 15576-028
NaCl Sigma-Aldrich S7653-1KG
SDS Fisher Scientific BP166-600
Sodium deoxycholate. Fisher Scientific AAJ6228822
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100-500ML
Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) Gibco 12440-046
Fetal Bovine Serum (FBS) Corning 35-010-CV
Neonatal Calf Serum (NCS) Gibco 26010-074
Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) Gibco 15140-122
10% Formalin Fisher Scientific 23-427-098
DMSO Sigma-Aldrich D2650-100ML
TNFα Sigma-Aldrich SRP3177-50UG
Phosphate Buffered Saline (PBS) Gibco 70013-032
K2EDTA vacutainer blood collection tubes BD 366450
Percoll (Density Gradient Media, DGM) GE Healthcare 17-0891-01
6 well plates Corning 353046
Cell strainers Fisher Scientific 22363549
Eppendorf Safe-Lock Tubes 2.0 mL, natural Fisher Scientific 22363352
Trypan Blue Corning 25-900-Cl
Bio-Rad Mini-PROTEAN Tetra System Bio-Rad 1658001FC
Bio-Rad Mini Trans-Blot Cell Bio-Rad 1658033
TGX FastCast Acrylamide Kit, 12% Bio-Rad 1610175
Mini-Protean 3 Multi-Casting Chamber Bio-Rad 1654112
4X Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 1610747
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148-100ML
Glycine Bio-Rad 1610718
Tween-20 Sigma-Aldrich P7949-500ML
Instant Nonfat Dry Milk Carnation
Rubicon (D9F7) Rabbit mAb Cell Signalling Technology 8465S
Monoclonal Anti-β-Actin antibody produced in mouse Sigma-Aldrich A2228-100UL
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody Cell Signalling Technology 7074S
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody Cell Signalling Technology 7076S
SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate Thermo Scientific 34578

References

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Cite This Article
Simon, B., Bucher, M., Maloyan, A. A Primary Human Trophoblast Model to Study the Effect of Inflammation Associated with Maternal Obesity on Regulation of Autophagy in the Placenta. J. Vis. Exp. (127), e56484, doi:10.3791/56484 (2017).

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