Summary
ここで紹介は一次電池文化のよりよくの分離に続いてひと胎盤絨毛組織のサンプリングのためのプロトコルです。Tnf α と絨毛トロホブ ラストの治療肥満の子宮内環境で炎症を繰り返すし、母性的な肥満と胎盤の炎症によって調整される分子標的の探索が容易になります。
Abstract
母性的な肥満では、オートファジーの調節不全に起因する妥協の胎盤機能によって仲介される可能性の高い周産期副作用のリスクの増加に関連付けられます。肥満妊娠から胎盤におけるオートファジー因子の発現の異常な変化は、肥満や妊娠に関連付けられている炎症性プロセスによって規制される可能性があります。ここで説明した絨毛組織のサンプリングの一次電池文化期のひと胎盤から絨毛よりよくの隔離のためのプロトコルです。腫瘍壊死因子アルファ (tnf α)、肥満と高架は炎症性サイトカインと無駄のない妊娠からプライマリ トロホブを扱うことによって肥満の子宮内環境で炎症性の環境をシミュレートするためのメソッドが続きます妊娠。ここで説明されているプロトコルの実装、外因性への曝露が分られる tnf α は、ルビコン、メスの胎児で無駄のない妊娠からトロホブにおけるオートファジーの負の調節因子の発現を調節します。肥満の子宮内環境の生物学的要因の様々 な維持トロホブで重要な経路を調節する可能性、この前のヴィヴォシステムは表現パターンを生体内で観察された場合を決定するために特に便利ひと胎盤母性的な肥満では、tnf α シグナルの直接の結果です。最終的には、このアプローチはオートファジーと他細胞クリティカルパスに影響を与える可能性のあるトロホブの母性的な肥満に関連付けられている炎症の規制および分子の影響を解析する機会を与える胎盤がある機能。
Introduction
肥満は、余分な脂肪と栄養アベイラビリティから生じる慢性的な軽度の炎症によって特徴付けられる炎症性状態です。肥満の循環で全身だけでなく、新陳代謝のティッシュの炎症性サイトカインが昇格されます。証拠の堅牢なボディは、tnf α は大幅上昇肥満の設定で意味を持つインスリン抵抗性と代謝不全1を示しています。Tnf α の活性化は、癌や自己免疫疾患、それに魅力的な治療上のターゲット2で病気の発症にもつながります。
妊娠、また炎症状態3,4によって肥満で炎症は悪化します。それは以前胎盤の tnf α のコンテンツがメスの胎児との妊娠の母体肥満と増加する示されています。さらに、tnf α の治療は、tnf α が性的に二形の方法5で胎盤の代謝の調節に関与していることを示唆している女性が、男性ではない栄養膜細胞のミトコンドリアの呼吸を阻害します。母性的な肥満は妊娠中、最も影響を受けやすい3,6,7,8 をされている男性の胎児の死産を含む様々 な合併症の発生率の増加に関連付けられています。.母体胎児のインターフェイスで、その重要な役割のため炎症性シグナル伝達への応答で肥満の子宮内環境で胎盤の機能の変化が肥満妊娠の結果を調停する際に重要な役割を再生可能性があります。
よくおよび胎盤の絨毛組織の syncytiotrophoblasts 内分泌シグナリングと母と発展途上の胎児9間栄養と酸素交換のため重要です。(以下、トロホブ) 絨毛よりよくの機能容量で中断が胎児の健康と開発を危険にさらします。このプロトコルでは、一次電池文化の絨毛トロホブ ラストの分離の最適化プロシージャと共に絨毛基底板を離れて解剖によるひと満期胎盤絨毛組織のサンプリング方法について説明します。このプロトコルはトロホブ10、を分離する差動密度遠心分離によって続いて細胞外マトリックスから細胞を解放する絨毛組織の酵素消化を含む確立された方法論から派生した11,12。このプロトコルの詳細は無駄のない妊娠から胎盤からプライマリ トロホブを扱われる炎症性の環境の 1 つのコンポーネントをシミュレートする tnf α を添加した培地でのアプローチは、母性的な肥満に関連付けられています。最後に、遺伝子発現の変化を検出するウエスタンブロット続いて tnf α 処理トロホブからの合計のセル lysates を収穫するための簡単な手順を説明します。
このモデルはそっくりそのまま子宮内環境 obesogenic を要約するだろうではない、tnf α を介した炎症トロホブの応答の個々 の貢献を解析することができます制御システムを提供します母性的な肥満。このモデルを発見したり、tnf α シグナル トロホブによる直接規制されている分子標的を確認、両方の機会を与えるだけでなく体内の母体と胎盤の遺伝子発現パターンの変化をテストすることができます。肥満では tnf α を介した炎症の可能性があります。
ここで説明している方法は、ひと培養トロホブ ラストにおけるオートファジーの調節における tnf α を介した炎症の影響をテストする実装されました。オスの胎児の展示と肥満妊娠からトロホブ中断オートファジーの回転、またはオートファゴソーム成熟13。ルビコン (実行ドメイン蛋白質相互作用の Beclin1 およびシステイン豊富なを含む)、後期エンドソーム、リソソームにローカライズされて、最近に記載されている「ブレーキ」として autophagic 回転プロセスに否定的なので、それと呼ばれるタンパク質オートファゴソーム成熟14,15のレギュレータ。実際には、ルビコン、貴重な治療上のターゲットとなるオートファジーを抑制するタンパク質のまれな例です。微生物16,17と心筋保護18に生得の免疫反応における役割を除いて、ルビコンの病態生理学的意義については、非常に小さな情報があり。ここで説明されているプロトコルを使用して、それはルビコンである tnf α の最大 250 pg/mL の濃度の増加と治療への反応で女性のプライマリ トロホブで亢進が見つかった。ルビコンの規制が役割を果たす女子胎児運賃に妊娠で男性より母性的な肥満と。肥満におけるクリティカルパスの導入規制子宮内環境の影響を検討するためのプラットフォームを提供します外因性 tnf α にひと培養トロホブ ラストを公開することによって前のヴィヴォ母性的な肥満に関連付けられている炎症をさたトロホブと胎盤の機能拡張。
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Protocol
からインフォームド コンセントとオレゴン健康制度検討委員会とオレゴン州ポートランドの大学によって承認プロトコルの下で労働と大学病院でのデリバリー ユニットから胎盤を採取、患者
。1。 コレクションの胎盤組織
- 準備
注: 組織が検出したすべての機器を滅菌する必要があります。- 121 で 60 分間オートクレーブによる解離性装置を殺菌 ° C
- 個人保護用具 (PPE) を使用: ラボ コート/ガウン/ボディス クラブ、手袋、顔面シールドまたはゴーグルとマスクします 。
- 水バス、37 に設定オン ° C
- 2 50 mL の円錐管、完全なメディア含む各 25 mL を暖める (Iscove ' s 修正ダルベッコ ' s 10 %fbs と 1% 培ペニシリン/ストレプトマイシン、表 3) 37 ° C の水浴中 。
- 情報に基づく患者の同意、帝王切開で配信の直後胎盤を取得します 。
- の胎盤も精通します。臍帯が胎児側 (絨毛プレート) 挿入され、臍帯挿入部位から放射状に広がる血管を見ることができます。反対側は、母体側、または基底板です。脱落膜と子葉と呼ばれる容器の木を含む構造体が含まれています 。
- 絨毛組織サンプリング
注: できるだけ早く以下の配信、できれば 30 分以内胎盤絨毛組織をサンプリングします。- 絨毛のプレートと 2-3 全層セクション (約 2.5 cm × 2.5 cm サイズ) を消費税上向き、ランダムを使用して鉗子ではさみ ( 図 1 a) 胎盤の外周から 2-3 cm
。 注: 胎盤の異常 (黒地に白の石灰化) が表示されるパーツを避ける 。
- 絨毛と基底板と、大きな血管をトリムします 。
- 温かみのある完全なメディアで結果絨毛組織 ( 図 1 b、合計約 80 ~ 120 g) を置き、サンプリングの 30 分以内の栄養膜分離を開始します
。 注: いくつかのダウン ストリーム試金およびアプリケーションを配信、サンプリング、および胎盤絨毛細胞分離間の潜伏期間の長さによって受けます。可能と分離間で一貫して短いとしてこれらの期間を維持することをお勧めします 。
- (センターを含む) 胎盤絨毛組織全体からの 5 つのランダムな 1 cm × 1 cm のセクションのサンプル手順 - 1.2.1、1.2.2 で説明した手法を使用しています 。
- に 4-5 分割 (約 30 mg 各)、各 1 cm x 1 cm の絨毛組織サンプル 2 mL 遠心チューブに配置し、フラッシュ カットは、リキッド N 2 でフリーズします。後の分析で使用するため-80 ° c ストア 。
- 絨毛のプレートと 2-3 全層セクション (約 2.5 cm × 2.5 cm サイズ) を消費税上向き、ランダムを使用して鉗子ではさみ ( 図 1 a) 胎盤の外周から 2-3 cm
2。絨毛組織から絨毛トロホブ ラスト分離
- 準備
注: 滅菌装置を使用し、層流フードのセルを伴う手順を実行します。- 雪解け 4 冷凍密度勾配 (表 1 必需品、試薬、装置、補足資料の表を参照してください) 4 ° C、胎盤が到着する前に、の夜で
。 注: または、密度勾配分離の日に行うことできます 。
遠心分離機で 20 セット - ターン ° C
注: すべての遠心分離手順については、最大加速度と減速度指定しない限りします 。
- X HEPES 緩衝塩類溶液 (HBSS) Ca +2 と Mg +2 (表 3) 補足の準備 1.
- 暖かいトリプシン 37 ° C
- 約 2720 kilounits/ml に滅菌希釈 DNase 補完 HBSS 。
- 新生子牛の血清 (NCS) 37 ° c の暖かい 50 mL
- 37 に完全なメディアを暖かい ° C
- 暖かい凍結メディア (90 %fbs、10 %dmso、表 3) 37 ° C
注意:DMSO は有毒である、手袋をはめて処理する必要があります 。
- 準備消化バッファー (表 2 および 3) の 308 の mL を混合することによって補われる HBSS、50 mL のトリプシン (3751.7 BAEE 単位/mL) と DNase の 0.5 mL (379.4 kilounits/mL) 滅菌ボトルにします
。 注: 絨毛組織から細胞を分離するおおよその所要時間は 7 h.
- 雪解け 4 冷凍密度勾配 (表 1 必需品、試薬、装置、補足資料の表を参照してください) 4 ° C、胎盤が到着する前に、の夜で
- 絨毛組織を処理
- リンス 50 mL の円錐管に絨毛組織の各部分に満ちて室温リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)。繰り返し、余分な血液が削除されるまで、必要に応じて PBS を交換 (PBS リンスされる明るい赤またはピンク、組織は徹底的に洗浄).
- 滅菌シャーレ内絨毛組織を置き、軽く削ってできるだけ多く血管オフ顕微鏡スライドを使用した血管から軟絨毛組織を削除します 。
- はさみを使用して結果の絨毛組織を細かくミンチします 。
- 絨毛組織の消化とトロホブ粗分離
- 分解酵素トリプシンの特定のアクティビティに基づいて計算されたボリュームによると液と滅菌ボトルにみじん切りにした絨毛組織を転送DNase (165 mL、表 2). 70 回転/分 (rpm) で揺れを 37 ° C の水浴のインキュベーションの
- 後 35 分はその側に消化ボトルを傾けるし、ボトルの底で解決する組織の未消化の部分を許可します。慎重にまとまった組織を避け血清ピペットで上澄みを描画します 。
- は 50 mL の円錐管に均等 100 μ m 携帯こし器を通って上澄みを調剤します
。 注: 時間を節約するそれは 2 つ目を開始することをお勧め残り消化液 (110 mL、表 2) を追加することによって消化解決組織と 2.3.2 の手順で説明するように孵化を再開します 。
- は、血清ピペット管の下部からゆっくりと調剤して緊張した上清の下に NCS の 3-5 mL を優しく層します。緊張した上清 (トロホブ含む) と NCS のメニスカスが表示されます ( 図 2 a) をする必要があります 。
- 遠心培養上清 NCS 上 20 ° C で 15 分間 1,250 × g結果として得られるペレット栄養膜細胞 ( 図 2 b) を含む白い層に続いて、最下位層で赤血球が含まれます 。
- 2.3.2 - 2.3.5 それぞれ (110 mL と 83.5 m それぞれ追加、組織、テーブル 2 のボトルに消化液の) 2 番目と 3 番目の消化力のための手順を繰り返します 。
- すべての培養上清が遠心分離されて、温かみのある完全なメディアの 5 mL にペレットを再懸濁します、懸濁液を一緒に分かち合う 。
- 2 つの 50 mL の円錐管と 1,250 × g で遠心する 20 で 15 分の間で均等に細胞懸濁液を分割 ° C
- はそっと上澄みを除去し、暖かい compl の 6 mL で各細胞ペレットを再懸濁しますえてメディア 。
- 密度遠心分離
- ゆっくりと慎重に重ねる、ピペットと密度勾配の上に細胞懸濁液によって 4 つの密度勾配 (3 mL) 間で均等に細胞懸濁液を分割します 。
- では、最小の加速と減速を 20 ° C で 20 分間 1,250 x g で密度勾配遠心分離機します。これは沈殿細胞 (表 4) の区別可能なバンドを生成する必要があります 。
- (DGM 35-50%) の間に絨毛細胞を含む不透明なバンド (表 4) に到達するまでゆっくりと慎重にトップ層の密度勾配メディア (DGM) を削除します 。
- 2 つの 50 mL の円錐管に絨毛バンドを転送し、温かみのある完全なメディアでいっぱい 。
- ゆっくりをミックスし、20 時 15 分 1,250 × g で遠心管 3 - 6 回反転 ° C
- は、上澄みを除去し、温かみのある完全なメディアの 5 mL で各細胞ペレットを再懸濁します。細胞懸濁液を組み合わせるし、検定とトリパン ブルー色素を使用して実行可能なセルを数える (または最寄りの細胞計数法).
- カウント細胞診断
- 優しく数回チューブを反転、上下血清ピペットでピペッティングにより細胞懸濁液をミックスします 。
- 別のチューブに細胞懸濁液とトリパン ブルー (各 20 μ すなわち) の等量を組み合わせて、軽く混ぜる 。
- 室温で 1-2 分間加温します 。
- 優しくセル トリパンの 15-20 μ L を分注、coverslip と、検定の間に混合物を青し、細胞は、毛管作用によってグリッド上で拡散する 。
- は、タリー カウンターと 4 つの 4 x 4 象限のそれぞれで (死んだ細胞、ディープ ブルーが染色される) 実行可能なセルをカウントします。セルが複数回カウントされないようにカウントのシステムを採用 (すなわち下または左の境界に接するセルはカウントされません).
注: 各 4 × 4 象限は、50-150 セル間含める必要があります。数が少なすぎる、またはあまりにも多くのセルがオーバーまたは細胞数の過小評価につながることができます 。
- 各 4 × 4 象限の総細胞数の平均を掛ける 10 4、その mL あたりのセル数を計算する希釈倍率 (トリパン ブルーに細胞懸濁液) に掛けると 。
- ML あたりのセル数合計セルの利回りを計算するセルを懸濁液の総量を掛けます
。 注: 約 1 億電池は絨毛組織の 80 ~ 120 g から始まる分離から期待されています 。
- めっきセル
- 6 ウェル プレート (ウェルあたり懸濁液 2 mL) で 300 万細胞/ウェル (3.3 cm 2 ごとの 5 セル数 10 倍) をプレートし優しく前後し、セルを均等に配布する側に側します
。 注: トロホブに正しく従う処理組織培養プレートが必要です。細胞の膜は syncytialization を促進するために必要です 。
- セルに均等に配布、解決、インキュベーターに配置する前に、井戸の底に付着し始めるように約 30 分のための層流フードのめっきされたセルのままにします 。
- 5% CO 2 と 95% 湿度 37 ° C の定温器で (毎日メディア変更) で最大 72 時間培養細胞
。 注: は、10-20 倍の文化のすべての 24 h で顕微鏡下でトロホブを調べます。トロホブ増殖しないと継代することはできません。文化の 72 時間にわたって、ラウンド個々 トロホブ ヒューズ ( 図 3 a と B) 合胞体を形成する 。
- 6 ウェル プレート (ウェルあたり懸濁液 2 mL) で 300 万細胞/ウェル (3.3 cm 2 ごとの 5 セル数 10 倍) をプレートし優しく前後し、セルを均等に配布する側に側します
- 凍結細胞
- 20 で 10 分間 1,250 × g で遠心分離によって未使用のセルをペレット ° C
- ペレットからできるだけ多くのメディアを吸い出しなさい 。
- メディア (表 3) を凍結でペレットを再懸濁します 。
- は、-80 ° c 100% イソプロパノールでいっぱい冷凍コンテナーで因数を固定します。長期保管のため次の日リキッド N 2 冷凍の因数を転送します
。 注: セルは凍結後培養することができます 。
- 融解細胞
- 凍結細胞の因数を外し、旋回しながら 37 ° C の水浴で解凍。それは完全に液体に解凍した直前に水浴から因数を削除します 。
- はすぐに 15 ml の円錐管に解凍のセルを転送します。断続的な混合の完全なメディアの 10 mL を追加し最初に、減速を開始します 。
- ミックスにチューブを数回反転します 。
- 20 ° c. で 10 分の 200 × g で遠心します。
- 、上清を吸引し、温かみのある完全なメディアの 2-5 mL にペレットを再懸濁します 。
- 細胞と前述したようにプレートをカウントします 。
3。Tnf α、セル Lysates コレクション西部にしみが付くこととプライマリ絨毛トロホブ ラスト治療
- 準備
- 37 に完全なメディアを暖かい ° C
- の使用のための準備ができるまで完全なメディア、-20 ° C で店で tnf α の 10 μ g/mL 在庫を作る 。
- は、細胞を治療する準備ができたら、完全なメディアの 1 μ G/ml の tnf α の在庫を作る。シリアル希釈 10 4 pg/mL、10 3 pg/mL、500 pg/mL、250 pg/mL、および完全なメディアで 125 pg/mL に tnf α 在庫
。 注: 10 4 pg/mL の tnf α 濃度は緩やかな細胞傷害性です。テスト tnf α 濃度の調整は、目的のダウン ストリーム アプリケーションの仕様に依存します 。
- Tnf α とセルを扱う
- 文化の 24 h 後細胞から培地を吸引であり、tnf α の 2 mL で置換補足 6 ウェル プレート治療と車両ごと (少なくとも 2 つの井戸の井戸あたりのメディアコントロール).
- 後 24 h tnf α 露出 (文化の 48 h) の tnf α の補完メディア完全なメディアに置き換えます 。
- 細胞の収穫および総蛋白
- 文化 (24 h 過去の tnf α の除去) の 72 時間後メディアを吸引、室温、PBS のセルを優しく洗い、氷冷 Radioimmunoprecipitation 試金の 80 μ L を追加新鮮なを含むバッファー (RIPA) は、各ウェルに直接プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤 (表 3) を追加します 。
- は、細胞スクレーパーとプレートからセルを削除します。治療グループ内の井戸をプーリング 1.5 mL 遠心チューブにセルを転送します 。
- 15 の少なくとも 3 つの間隔の高いチューブ ボルテックスによって細胞を溶解 s.
- インキュベート 15 分ロッキング 4 ° c セル
注: また後ステップ 3.3.3、チューブ、ボルテックス、またはをピペッティングしはフリックすることで断続的な撹拌で 15 分間氷の上セルを培養することができます。wn 。
- 手順を繰り返します 3.3.3 。
- 細胞の残骸をペレットへの 4 ° C で 5 分間 10,000 x g でチューブを遠心します 。
- 新しい 1.5 mL 容マイクロ チューブや-80 で店へ転送清 (含む細胞タンパク質) ° C
注: プロトコルがここで停止し、後で再開しました。それは複数の凍結融解サイクルを避けるために細胞蛋白質のサンプルのいくつかの因数を作ることをお勧めします 。
- ビシンコニン酸アッセイ等の優先の方法で総蛋白濃度を決定する (BCA は、必需品、試薬、装置、補足資料の表を参照してください).
- SDS のページおよびウエスタンブロット ルビコンまたは興味の蛋白質の
注: に従って西部のしみが付くプロトコルをメーカーによると ' 最寄りのラボ システムを使用しての指示。- ロード サンプル バッファー (表 3) 12% アクリルアミド ウェルあたりの総蛋白質の 20-40 μ g の間ゲル。バッファー (表 3) を実行している別の SDS-PAGE によるタンパク質 。
- ウェット転送メーカーによるとポリフッ化ビニリデン (PVDF) 二フッ化膜にゲルからタンパク質 ' の転送バッファー (表 3) の指示 。
- Tris-Buffered 生理食塩水で 0.1% と 5% 粉ミルクで膜をインキュベート トゥイーン 20 (TBST、表 3) ロッキング室温で少なくとも 1 時間 。
- ルビコン一次抗体で膜をインキュベート (必需品、試薬、装置、補足資料の表を参照) ロッキング 4 ° C で一晩 TBST で 1% ミルク パウダーで 1: 500 にします 。
- ロッキング室温で TBS で膜 TBST で 1 × 5 分の 3 × 5 分は水洗いします 。
- インキュベート集 - 1: 5000 の二次抗体の膜 (HRP リンクまたは最寄りの表示共役必需品、試薬、装置、補足資料の表を参照) に室温で少なくとも 1 h の TBST で 5% ミルク パウダーでロッキングします 。
- 3.4.5 手順に示した洗浄手順を繰り返し、イメージング システムの適切な可視化 (すなわち化学ルミネセンス) 基板を用いたしみを視覚化します 。
- 3.4.5 手順に示した洗浄手順を繰り返し、β-アクチンまたはメーカーによると最寄りのロード コントロールの膜をプローブ ' s 指示します 。
- 最寄りの画像解析ソフトで分析式吸光度 (バンド強度) の手動の定量化によるルビコンのバック グラウンドの吸光度と対応する荷重を正規化の減算はバンド強度を制御します。タンパク質レベルの統計的に有意な変化をテストする適切な統計解析を実行します 。
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Representative Results
言葉のリーンから人間の胎盤 (妊娠前ボディマス指数 (BMI) < 25) 女性の子孫を運ぶ合併症妊娠と母親が収集し、帝王 (労働の禁止) でサンプル配信から 15 分以内。石灰化の典型的な開発の不在のため、胎盤を調べた: 丸型の形状、径 15-25 cm と臍帯の中間に挿入削除薄膜とへその緒で 300-600 g の重さがあって、胎盤。絨毛組織は主栄養膜分離の出発材料として絨毛組織の約 100 グラムが得られる (図 1)、胎盤全体から 2-3 サンプルの基底部および絨毛プレートから解剖されました。前述のプライマリ トロホブを特定する手順が開始されたサンプリング絨毛組織の 20 分以内 0.8 - の間ここで、降伏 1 x 10 の8の実行可能なセル。3 × 106 (3.3 cm2ごとの5セル数 10 倍) の密度で 6 ウェル培養皿の細胞を播種されました。文化の 24 h 後添付の顕微鏡下で細胞を調べたし、適切な絨毛形態を (円形細胞個々) 確認しました。培地は、125 104 pg/mL の tnf α の濃度のシリーズを含む、少なくとも 2 つの井戸は濃度と車両制御 (完全なメディアのみ) あたりに含まれていた完全なメディアに置き換えられました。
24 時間次の tnf α トリートメント (文化の 48 h)、すべての tnf α のメディアは完全なメディアに置き換えられました。103 pg/mL 以下の濃度で tnf α と治療のためかなりの細胞死は認めなかった.104 pg/mL tnf α で治療された緩やかな細胞毒性とメディアが乳酸脱水素酵素 (LDH) の試金 (データは示されていない) によって証明されるように変更した後、この tnf α 濃度の細胞毒性作用は持続しなかった。文化の 72 h で、細胞は顕微鏡の下で syncytialization を調べた.Syncytialization と線維芽細胞汚染の免疫細胞化学では、比較的純粋な分離絨毛トロホブ ラスト (図 3) を明らかにしました。細胞溶解液は、降伏準備 BCA アッセイ (データは示されていない) によって決定されるあたりの総蛋白質の 3-8 μ g/μ L の間ここで説明プロトコルに従って収穫されました。西部のしみの大きい 250 pg/mL までの tnf α の濃度や tnf α 濃度にルビコン式の後続のダウンレギュレーションに応えてルビコン式のアップレギュレーションを示した tnf α と扱われる女性トロホブからのセル lysates の分析250 pg/mL 以上 (図 4 a と B、104 pg/mL 細胞毒性に基づく分析から除外)。同様に、ルビコンは、著しく肥満妊娠西部のしみの分析によって証明されるように、リーン コントロールと比較してメスの胎児と胎盤の絨毛組織のフラッシュ凍結生検で亢進 (図 4 、D、n = 6BMI あたり胎盤クラスには、分散分析、P < 0.05)。
| 濃度 (%) | 90 %dgm (ml) | 1 x HBSS (ml) | 層の厚さ (ml) |
| 4 x グラデーション | 4 x グラデーション | 合計 34.5 ml | |
| 70 | 14 | 4 | 4.5 |
| 60 | 8 | 4 | 3 |
| 55 | 7.33 | 4.67 | 3 |
| 50 | 3.34 | 2.67 | 3 |
| 45 | 6 | 6 | 3 (13.5 ml マーク) |
| 40 | 5.33 | 6.67 | 3 |
| 35 | 4.67 | 7.33 | 3 (19.5 ml マーク) |
| 30 | 8 | 16 | 6 |
| 20 | 2.67 | 9.33 | 3 |
| 10 | 1.33 | 10.67 | 3 |
表 1。プライマリ絨毛トロホブ ラスト密度遠心分離のための密度勾配を作るための仕様。
左から右に、1 列目には、密度勾配メディアを指定します (DGM、必需品、試薬、装置、補足資料の表を参照) 濃度 HBSS の DGM のパーセンテージで表されます。2 列 3 列 HBSS DGM ソリューションの適切な割合を作るに必要な量を指定します DGM のボリュームを指定します。4 列目には、最も高密度の層にはじまって、グラデーションを構築する 50 mL の円錐管に追加するボリュームを指定します。
| トリプシン | HBSS | DNase | ||
| 消化 | (合計活動;BAEE 単位) | 量 (ml) | (合計活動;Kunits) | 総容積 /digestion |
| 1 | 619037 (23.01 ml) | 141.76 ml | 62594 (0.230 ml) | 165 ml |
| 2 | 412691 (15.34 ml) | 94.51 ml | 41729 (0.154 ml) | 110 ml |
| 3 | 313270 (11.65 ml) | 71.74 ml | 31676 (0.116 ml) | 83.5 ml |
| 合計 | 1345000 (50 ml) | 308 ml | 136000 (0.5 ml) | 358.5 ml |
表 2。DNase およびトリプシンの特定のアクティビティに基づく主な絨毛分離分解酵素液の準備のための仕様。
左から右へ、最初の列は、消化力の数を指定、2 番目の列が消化ごとに必要なトリプシン活性を指定します、3 番目のカラムは、適切な消化のため追加する補足 HBSS の総量、4 番目の列消化ごとに必要な DNase 活性と最後の列する消化液の量を指定します。適切な消化のため胎盤組織に追加されます。
| HBSS (Ca+2と Mg+2補完) | サンプル バッファー |
| 10 %10 x HBSS | 90 %4 X Laemmli 色素 |
| 1.26 mM CaCl2 (anhyd) | 10 %2-メルカプトエタノール |
| 0.80 mM MgSO4 (anhyd) | |
| 20.77 mM HEPES | |
| 7.4 10 n NaOH で pH 最大 1 L 滅菌 ddH2O のボリュームを作る 滅菌瓶に無菌フィルター |
|
| 完全なメディア | 連続したバッファー |
| 11 %v/v IMDM を削除します。 | 25 mM のトリス基地 |
| 10 %v/v の FBS を追加します。 | 190 mM グリシン |
| 1% 追加 10,000 U/mL ペニシリン/ストレプトマイシン (100 U/mL ファイナル) | 0.1% SDS |
| pH 8.3 | |
| メディアを凍結 | |
| 90 %v/v FBS | 転送バッファー |
| v 10% DMSO | 25 mM トリス |
| 190 mM グリシン | |
| 消化バッファー | 20% メタノール |
| 50 mL のトリプシン (26,900 BAEE 単位/mL) | pH 8.3 |
| 0.5 mL DNAse (272,000 K ユニット/mL) | |
| 358.5 ml 補われた HBSS にもたらす | TBS |
| 20 mM トリス | |
| RIPA バッファー | 150 mM の NaCl |
| 25 mM トリス-HCl | 7.6 に pH |
| 5 mM EDTA | |
| 150 mM の NaCl | TBST |
| 0.1% SDS | 0.1% Tween 20 と TBS |
| 0.5 デオキシ コール酸ナトリウム % | |
| 1% トリトン X-100 | |
| 10 ml あたりプロテアーゼ/ホスファターゼ阻害剤 1 錠 RIPA バッファーします。 |
表 3。分離に必要なソリューションと西部にしみが付くことによって続いて主トロホブ文化。
| % DGM | ml のマーク | セルの種類 |
| 10 | 31.5 34.5 | 破片 |
| 20 | 28.5 31.5 | |
| 30 | 22.5 28.5 | |
| 35 | 19.5 22.5 | トロホブ |
| 40 | 16.5 19.5 | |
| 45 | 13.5 16.5 | |
| 50 | 10.5 13.5 | リンパ球 |
| 55 | 7.5 10.5 | |
| 60 | 4.5 7.5 | 赤い血液細胞 |
| 70 | 4.5 以下 |
表 4。密度遠心分離による絨毛トロホブ ラストの沈降。
左から右へ、最初の列は、DGM (表 1) の割合を指定します、2 番目の列は、DGM の対応する割合は 50 mL の円錐管にある 3 番目のカラムは、どのような携帯型の堆積物で mL マークを指定します、50 mL の円錐管に DGM と mL のマークの対応する割合です。50 35 %dgm、不透明は明瞭なバンドを形成間トロホブ堆積物。この範囲の上下に DGM を収集、細胞残屑および他の細胞型リンパ球などの汚染が発生します。
図 1。絨毛組織から分離された期ひと胎盤絨毛と基底板を削除しました。
A)上向き絨毛プレート (胎児側)、完全な厚さのサンプルは胎盤から摘出しました。B)絨毛組織のサンプルは絨毛と基底板を削除することによって得られます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2。新生子牛の血清上分解酵素液で細胞の遠心分離は多層細胞ペレットの結果します。
A)新生子牛の血清 (NCS) ダイジェスト ソリューション 50 mL のコニカル チューブに細胞懸濁液の下に階層。B) (A) の遠心分離は多層の細胞ペレットの結果します。最下位層は深い赤の色と赤い血液細胞で構成されています。上の層はトロホブが含まれています、白または色のベージュ色。栄養上層はチューブの上部に消化ソリューション (清) に続く NCS です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3。Syncytialization およびプライマリのひと胎盤絨毛細胞の培養線維芽細胞含有分析を合せて。
A)文化の 24 時間後よりよくサイトケラチン 7 (赤) の代表的なイメージ。B) syncytiotrophoblasts 72 時間文化の融合が細胞の多核巨細胞の塊を示しています後にサイトケラチン 7 (赤) の代表的なイメージ。C)文化の 72 時間後 syncytiotrophoblasts ビメンチン (赤) の代表的なイメージ。画像は、DAPI (青) 核対比染色と蛍光顕微鏡に買収されました。10 倍の倍率で可視化。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4。メスの胎児の肥満妊娠とリーンから tnf α-治療女性トロホブで、絨毛組織における内因性ルビコン発現に応答におけるルビコン発現の調節。
健康な妊娠女性の胎児を運ぶと無駄のない母親から言葉胎盤からプライマリ トロホブが分離・ 125、250、500、扱われる 10 の3、および 104 pg/mL tnf α (または車両制御)。A)女性の胎盤絨毛細胞ライセートのルビコンの代表西部のしみ方が tnf α と扱われます。Β-アクチンは、ローディング コントロールとして使用されました。B)女性トロホブ tnf α 治療に対する応答のルビコン式だった西部のしみから定量化し、β-アクチンに正規化します。値は、tnf α 濃度 ± s. e. n あたり平均ルビコン式 3 胎盤を =。C)フラッシュ対肥満妊娠メスの胎児で傾くから絨毛組織の生検を凍結から全体組織溶解液のルビコン川の西部のしみ (F1-F12)。乳酸脱水素酵素 A (発現) は、ローディング コントロールとして使用されました。D)式西部のしみ (C) からルビコンは定量化し、発現に正規化します。値が n で BMI 分類 ± 東南あたり平均ルビコン式 = BMI クラスあたり 6 胎盤 (ANOVA、* P < 0.05)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
胎盤は、胎児の成長を調整する責任は、肥満環境6で侵害された関数を展示します。絨毛トロホブ ラスト高の代謝要求にもかかわらず母性的な肥満と胎盤の機能不全のミトコンドリア呼吸6,19 を展示します。胎盤の代謝の変化合併症と肥満妊娠3,6,7で観察された胎児副作用の発生率の増加に貢献するかもしれない。オートファジーは、母性的な肥満と胎盤でも妥協しました。肥満妊娠男性胎児から胎盤は、オートファゴソーム13の蓄積によって証明されるよう機能不全 autophagic フラックスを表示します。生体のホメオスタシスの重要な最適 autophagic フラックスを維持は、母性的な肥満と胎盤における欠陥オートファジーは肥満妊娠に関連付けられている副作用を調停する際に重要な役割を再生可能性があります。
母性的な肥満の危険にさらされた胎盤機能の正確な原因はよく理解されていません、炎症性シグナル伝達に彼らの起源を持っている可能性があります。肥満と妊娠は、tnf α1,4,20,21を循環の高レベルによって特徴付けられる炎症性の状態です。Tnf α は、オートファジー22,23の活性化、肥満妊娠から胎盤におけるオートファジーのフラックスの変化を仲介することがあります。Tnf α は炎症の癌2のコンテキストで特に細胞に及ぼす影響を研究する使用されます。ここで提示されたプロトコルは文化で外因性 tnf α とプライマリ トロホブを扱うことにより肥満に関連する炎症が胎盤の機能能力に及ぼす影響を研究するためのこの方法を適応します。
このプロトコルは 4 つの主要なコンポーネントで構成されています: 胎盤絨毛組織からプライマリ絨毛トロホブ ラストの分離から絨毛組織のサンプリング文化主な絨毛トロホブ ラスト続いて tnf α 治療と続いて総細胞ライセートのコレクション西部のしみ興味の蛋白発現を測定する分析。純粋なトロホブを分離するには、絨毛と基底板が (図 1 b) 胎盤のサンプリング中に徹底的に絨毛組織から解剖してが重要です。また、絨毛組織が (すなわち内配信の 30 分) タイムリーに処理することが不可欠です。このプロトコルは、絨毛組織の細胞外マトリックスからトロホブを解放する 3 つの消化手順、各永続的な 35 分の使用を詳しく説明します。長く消化力は、セル表面蛋白質の trypsinization によって有害な細胞を危険します。ダイジェストの数を増やすと、かなり現実的な絨毛トロホブ ラスト最終収量を増加しません。ただし、収量の減少は細胞に発生します時間と消化力の数を減らす (サイモン ・ バッチャー、Maloyan、未発表のデータ)。このプロトコルは、絨毛組織の 80-120 グラムから約 1 億細胞を確実に生成します。
密度勾配分離の間に観察される区別絨毛バンド数に変動があります。他のセルタイプからの汚染を避けるためには、厳密に密度勾配 (表 4) トロホブを含むバンドを収集することが重要です。ここで詳細なプロトコルの最適化 5% 未満と比較的純粋なトロホブを降伏以前に確立された方法から他のセルからの汚染型10、11,12。正または負の選択24によって更に精製を実現できます。ただし、このアプローチは実行可能な絨毛トロホブ ラスト収量を減らすことのリスクを実行します。培養時間の 72 h 対 24 多核巨細胞の細胞塊の存在によって証明されるように、セルが syncytialization を施行したことを確認した後、ここに示す手順を使用して孤立したプライマリ トロホブ サイトケラチン 7 の免疫細胞化学的解析72 h で、栄養膜 (図 3 a と B) の寿命は、ホールマーク イベント。さらに、72 時間培養したプライマリ トロホブ ビメンチンの免疫組織化学的解析には、非常に少ない汚染線維芽細胞 (図 3) が明らかにしました。日常の目的のため、単純な形態学的評価による文化では、絨毛トロホブ ラストの純度が監視できます。培養時間の 24 h で、個々 のよりよくラウンド文化を支配します。よく融合細胞の塊で、その結果、文化の 72 時間後 syncytialization を受けます。この文化は、最も一般的な汚染細胞タイプは線維芽細胞や内皮細胞、それぞれ細長いと形、多角形であります。これらの機能は明るく顕微鏡を用いた約監視できます。
Tnf α とプライマリ トロホブの治療により、tnf α の効果を測定する 1 つトロホブにおけるクリティカルパスの導入規制信号制御システムを提供します。当然のことながら、肥満の母体環境の体内栄養機能を調整するために責任があるかもしれない tnf α 以外の要因があります。これらは含みますが、ホルモン、高脂血症、および他の炎症性要因25のホストに限定されません。さまざまな治療法の組み合わせがさらにもっと生理学的に正確な方法で肥満の子宮内環境ex vivoを要約するでしょう。外因性 tnf α までこのプロトコルでトロホブを治療に使用の濃度を超える通常体内の循環します。血清中濃度は、20 ng/mL に達するに報告された、または特定の炎症性条件の26の上位にされています。(すなわち西部のしみ) 現在の検査方法で測定可能な応答を取得するには、遺伝子発現と関心の経路の変化を明らかにする tnf α 濃度の増幅が必要です。これらの応答生体内でより少ない程度に存在するかもしれません。しかし、彼らがそれにもかかわらず大幅機能に影響絨毛トロホブ ラスト。公開の tnf α 高濃度トロホブ遺伝子発現と細胞毒性に根ざしたことがあります経路分析の成果物を生産のリスクを実行します。トロホブ LDH 細胞毒性の試金 (データは示されていない) によって証明されるように 24 時間 104 pg/mL tnf α 添加メディアへの露出で適度な細胞毒性を認めた。ただし、103 pg/mL tnf α 以下の濃度では、任意のかなりの細胞死が生成されませんでした。
テスト tnf α 濃度より小さい間隔および/またはここで説明したよりも低いことが続く場合があります最高定量的遺伝子発現の分析手法のポリメラーゼの連鎖反応 (qPCR) 遺伝子発現の小さな変化の検出に適しています。QPCR は具体的には、転写レベルでの遺伝子発現レベルのテスト中は、西部にしみが付くことはおそらく、携帯電話のタスクを実行する利用可能なタンパク質製品の最終的なレベルを検出します。発現レベルの変化が、転写の結果なのか判断は同様の遺伝子発現量の規制に対する tnf α 処理の影響を決定するための強力な方法は、組み合わせて両方の分析の手法転写後、または翻訳後調節。炎症性のストレスは、絨毛の動作、形態、および syncytialization に影響があります。分子分析方法に加え形態学的評価 (すなわち免疫細胞化学) を含む、栄養健康に tnf α の露出の効果のより包括的な分析を提供します。実験的要求によると tnf α 濃度テストと下流アッセイの調整をお勧めします。
ここで説明されているプロトコルを実装すると、tnf α を介した炎症はリポタンパクリパーゼひと培養トロホブ ラストのルビコン式メスの胎児で無駄のない妊娠から発見されています。ルビコンの絨毛のウェスタンブロッティング lysates は近くと予想される分子量 140 kDa (図 4 a) の上記 2 つの明瞭なバンドを明らかにしました。下のバンドは非特異的であることを示唆する証拠がある (PD047 反ルビコン pAb、MBL データ シート、http://ruo.mbl.co.jp/bio/g/dtl/A/?pcd=PD027#u-pub)。女性トロホブは、リポタンパクリパーゼ 250 pg/mL まで濃度の tnf α の治療への反応にルビコンの式に能力を発揮しました。この、ルビコン式よりも高い濃度で減少のレベル基準 (無処理) へ向かってし、下も (図 4 b, n = 3)。この結果はルビコンが大幅にフラッシュ凍結絨毛組織生検で亢進所見に相補的な tnf α と無駄のない妊娠からトロホブの治療肥満の子宮内環境で炎症をシミュレートする、ことを考えるリーン コントロールに比べてメスの胎児の肥満妊娠から胎盤 (図 4 および D、分散分析, n = 1 BMI クラス、P 6 < 0.05)。
リーン コントロールに比べてメスの胎児肥満妊娠からトロホブで違いをオートファジー磁束が発生しないオスの胎児の肥満妊娠からトロホブ展示形成の活性化とオートファゴソームの蓄積13. ルビコンは、オートファジーの負の調節因子オートファゴソームとリソソームの融合27を止める役割を果たします。女性トロホブがオートファジー22リーン様 autophagic フラックスの設定を維持するためにそれらを許可することができます有効にする tnf α を介した炎症に対する代償または保護機構としてルビコンの発現亢進母性的な肥満。胎盤のこの反応は肥満の子宮内環境の男性よりもより良い方法女性の胎児の運賃に役割を担うかもしれない。肥満の子宮内環境規制におけるクリティカルパスの導入に及ぼす影響を研究するためのプラットフォームを提供します母性的な肥満前のヴィヴォtnf α とプライマリひと培養トロホブ ラストの治療を通じてに関連付けられている炎症性環境のモデリングトロホブ。さた肥満の母体環境を目指した新しい、組合せのこの議定書の改正は母性的な肥満の胎盤がある機能に及ぼす影響を研究するエキサイティングな大通りを提供します。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
著者は、この研究のため、胎盤を寄付女性をありがとうございます。我々 も胎盤のコレクションを調整するため労働と配信部門大須母体と胎児の研究チームに感謝します。王博士は、エリックとケリー郭、MD にサポートに感謝して、実験方法と最適化を支援します。
NIH HD076259A (AM) によって資金が供給されたこの作品、AHA GRNT29960007 (AM)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X HBSS | Gibco | 14185-052 | |
| CaCl2 (anhyd.) | Sigma-Aldrich | C1016-100G | |
| MgSO4 (anhyd.) | Sigma-Aldrich | M7506-500G | |
| Hepes | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| DNAse | Worthington Biochemical Corp. | LS002139 | |
| Protease/Phosphatase inhibitors | Thermofisher Scientific | 88668 | |
| Tris HCl | Invitrogen | 15506-017 | |
| EDTA | Invitrogen | 15576-028 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653-1KG | |
| SDS | Fisher Scientific | BP166-600 | |
| Sodium deoxycholate. | Fisher Scientific | AAJ6228822 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | |
| Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) | Gibco | 12440-046 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| Neonatal Calf Serum (NCS) | Gibco | 26010-074 | |
| Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Gibco | 15140-122 | |
| 10% Formalin | Fisher Scientific | 23-427-098 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | |
| TNFα | Sigma-Aldrich | SRP3177-50UG | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 70013-032 | |
| K2EDTA vacutainer blood collection tubes | BD | 366450 | |
| Percoll (Density Gradient Media, DGM) | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| 6 well plates | Corning | 353046 | |
| Cell strainers | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes 2.0 mL, natural | Fisher Scientific | 22363352 | |
| Trypan Blue | Corning | 25-900-Cl | |
| Bio-Rad Mini-PROTEAN Tetra System | Bio-Rad | 1658001FC | |
| Bio-Rad Mini Trans-Blot Cell | Bio-Rad | 1658033 | |
| TGX FastCast Acrylamide Kit, 12% | Bio-Rad | 1610175 | |
| Mini-Protean 3 Multi-Casting Chamber | Bio-Rad | 1654112 | |
| 4X Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610747 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148-100ML | |
| Glycine | Bio-Rad | 1610718 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P7949-500ML | |
| Instant Nonfat Dry Milk | Carnation | ||
| Rubicon (D9F7) Rabbit mAb | Cell Signalling Technology | 8465S | |
| Monoclonal Anti-β-Actin antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | A2228-100UL | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signalling Technology | 7074S | |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signalling Technology | 7076S | |
| SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34578 |
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