Summary
ويرد بروتوكول رواية تحضيرا للونين من الماوس الكبار الهيكل العظمى والعضلات تتكيف مع دراسة تنظيم الجينات في ألياف العضلات التي إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين.
Abstract
يصف لنا بروتوكولا كفاءة واستنساخه لإعداد الكروماتين من الماوس الكبار الهيكل العظمى والعضلات، أنسجة بدنيا مقاومة ذات محتوى العالي من البروتينات الهيكلية. العضلات تشريح أطرافهم من الفئران الكبار تتعطل جسديا هوموجينيسيشن الميكانيكية، أو مزيج من تنميق ودونسينج، في مخزن ناقص التوتر قبل التثبيت فورمالدهايد الخلية ليستي. هي تنقية الأنوية الثابتة بزيادة دورات هوموجينيسيشن الميكانيكية أو دونسينج وتصفيات متتابعة لإزالة الحطام خلية. يمكن سونيكاتيد الأنوية المنقي فورا أو في مرحلة لاحقة بعد تجميد. يمكن أن يكون سونيكاتيد الكروماتين كفاءة ويتم الحصول على مناسبة للتجارب إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين، كما يتضح من التشكيلات الجانبية لعوامل النسخ ورنا بوليميراز الثاني التعديلات التساهمية هيستون. ربط أحداث الكشف عن استخدام الكروماتين التي أعدت بموجب هذا البروتوكول أساسا تلك التي تحدث في نواة الألياف العضلية وعلى الرغم من وجود الكروماتين من السواتل الأخرى المرتبطة بالألياف والخلايا البطانية. ولذلك هذا البروتوكول تكييف لدراسة تنظيم الجينات في الهيكل العظمى والعضلات الماوس الكبار.
Introduction
إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين (رقاقة) بالإضافة إلى كمية البلمرة المتسلسل (qPCR) وإنتاجية عالية التسلسل (الرقائق-seq) أصبحت أساليب الاختيار لدراسة النسخ وجينيه تنظيم التعبير الجيني في أنسجة مختلفة وأنواع الخلايا1. يسمح هذا الأسلوب على نطاق الجينوم التنميط التعديلات التساهمية الكروماتين، وشغل البديل هيستون والنسخ عامل ملزم2،3.
في حين أداء رقاقة من الخلايا المزروعة بشكل جيد، يبقى رقاقة من أنسجة الثدييات أكثر تحديا. إعداد الكروماتين لرقاقة ينطوي على العديد من الخطوات الهامة التي تحتاج إلى أن يكون الأمثل لكل نوع من أنواع الخلايا والأنسجة. يمكن إعداد الكروماتين من ليساتيس الخلوية للخلايا المزروعة أو تنقية التالية على نويات. في حالة أنسجة الثدييات، تحلل تتسم بالكفاءة، وتثبيت فورمالدهايد، وتنقية نويات ضرورية بغية ضمان استرداد الأمثل الكروماتين. وعلاوة على ذلك، واختيار ما إذا كنت تريد إصلاح الأنوية قبل أو بعد تنقية قد يتحدد تجريبيا. على الرغم من هذه العقبات، تم بنجاح أداء رقاقة من الأنسجة مثل الكبد أو الخصية، أو الدماغ4،،من56. في حالة الهيكل العظمى والعضلات، تعطيل هذه الأنسجة مقاومة جسديا، الذي يسلك محتوى العالي من البروتينات الهيكلية، وعزله عن نويات يشكل تحديا كبيرا. ونظرا لهذه الخصوصية، البروتوكولات الأمثل للأنسجة الأخرى لا تعطي نتائج مرضية لعضلات الهيكل العظمى.
هنا يصف لنا وضع بروتوكول لعزل الكروماتين الصف شريحة من أنسجة العضلات الهيكلية الماوس ينطوي فعلياً تعطيل الأنسجة، والفورمالديهايد التثبيت، ومن ثم عزل نوى و sonication. وتجلى كفاءة هذا الأسلوب لإعداد الكروماتين مناسبة لشريحة من هذا النسيج أداء رقاقة--قبكر والرقائق-seq لمختلف عوامل النسخ ورنا بوليميراز الثاني التعديلات التساهمية هيستون7.
هذا الأسلوب الجديد أسرع بكثير من بروتوكول سبق الإبلاغ عنها8 تضم طويلة كولاجيناز الهضم الخطوات خلال هذه الفترة، التغييرات في أقلمة الجينوم من عوامل النسخ وقد تجري تعديلات في التعبير الجيني. أن السرعة التي تعزل الأنوية وثابت يجعل الأسلوب الموصوفة هنا جاذبية خاصة لإعداد الكروماتين الذي يلتقط أكثر أمانة الدولة شغله الجينومية الأصلي. وعلاوة على ذلك، على الرغم من أن أساليب أخرى لاستخراج الكروماتين العزلة أو البروتين من أنسجة العضلات وقد تم وصف8،،من910 وتستخدم لإجراء التجارب على رقاقة--قبكر على الجينات المحددة، لا رقاقة-seq تم الإبلاغ عن البيانات باستخدام لهم. الطريقة التي ذكرت هنا وهي مناسبة لتعديل هيستون وعامل النسخ seq رقاقة، ومن ثم ينبغي أن تكون أيضا مناسبة ج 3/4 أو الائتلاف الكروماتين تكيف التقاط التطبيقات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وأبقى الفئران وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية المتعلقة برعاية واستخدام الحيوانات المختبرية، ووفقا "المبادئ التوجيهية الوطنية لرعاية الحيوان" (المفوضية الأوروبية التوجيه رقم 86/609/أوروبا الوسطى والشرقية؛ الفرنسية مرسوم no.87-848). وافق جميع الإجراءات لجنة الأخلاقيات الوطنية الفرنسية-
1-"عزل أنسجة العضلات"
ماوس- تضحية واحدة 6 الكبار إلى عمرها 8 أسبوع من التفكك عنق الرحم. ستيرليسي أطرافهم بدهن أنه مع الإيثانول 70% وتشريح العضلات أطرافهم هند (الفخذ الساق، Anterior الظنبوبي،) باستخدام نقطة غرامة مقص وملقط.
ملاحظة: ينبغي أن تسفر عن ماوس واحد حوالي 500 ملغ أنسجة. - فرم العضلات في أنبوب اختبار 2 مل يحتوي على 1 مل من المخزن المؤقت ناقص التوتر المثلج إعداد صغيرة متجانسة (< 2-3 مم 3) القطع باستخدام مقص بشكل جيد وترك الأنبوب تهز على المحرض أعلى مقاعد البدلاء عند 4 درجة مئوية للحد الأدنى 5-10
2. تحلل أنسجة
ملاحظة: يرجى الرجوع إلى الجدول 1 لكل المخزن المؤقت التراكيب-
- نقل هوموجيناتي إلى أنبوب أسفل جولة 14 مل وريسوسبيند في 5 مل الباردة ناقص التوتر المخزن المؤقت (خالية من يدتا مثبط البروتياز كوكتيل وبمسف)-
- هوموجينيسي النسيج العضلي المفروم باستخدام دونسي فضفاضة (20-30 السكتات الدماغية داخل 3 دقائق) أو أنسجة ميكانيكية الخالطون ل 15-30 s في أنابيب أسفل الجولة 14 مل.
ملاحظة: يمكن تقييم كفاءة تحلل في هذه المرحلة من خلال الفحص المجهري الخفيفة، وإذا لزم الأمر، يمكن أن يؤديها تعطل إضافية.
- هوموجينيسي النسيج العضلي المفروم باستخدام دونسي فضفاضة (20-30 السكتات الدماغية داخل 3 دقائق) أو أنسجة ميكانيكية الخالطون ل 15-30 s في أنابيب أسفل الجولة 14 مل.
- نقل هوموجيناتي إلى أنابيب 15 مل وملء وحدة التخزين إلى 10 مل باستخدام المخزن المؤقت ناقص التوتر الباردة. إصلاح هوموجيناتي كما هو موضح أدناه قبل المتابعة مع الماوس المقبل.
3. تثبيت
- إضافة فورمالدهايد بتركيز 1% النهائي ويهز لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة-
- إضافة جليكاين إلى تركيز نهائي من 0.125 M في كل أنبوبة لإيقاف التثبيت ويهز لمدة 5-10 دقائق في درجة حرارة الغرفة-
4. إعداد نواة
ملاحظة: يرجى الرجوع إلى الجدول 1 لكل المخزن المؤقت التراكيب-
- هوموجينيسي استخدام ليستي ثابت دونس فضفاضة (5-10 السكتات الدماغية).
- نقل إلى أنبوب 15 مل وأجهزة الطرد المركزي في 1,000 س ز لمدة 5 دقائق عند 4 درجة مئوية للحصول على نوى والحطام الخلوية.
- إزالة المادة طافية وريسوسبيند بيليه في المخزن المؤقت ناقص التوتر الطازجة 5 مل. تصفية من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر في أنبوب 50 مل. إعادة تصفية فيلتراتي من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر. نقل
- فيلتراتي إلى أنبوب 15 مل وأجهزة الطرد المركزي في 1,000 س ز لمدة 5 دقائق عند درجة 4 مئوية للحصول على بيليه النووية.
ملاحظة: في هذه المرحلة، النواة يمكن أن سونيكاتيد فورا، أو انجذاب مجمدة بيليه جافة في النتروجين السائل وتخزينه في-80 درجة مئوية.
5. سونيكيشن
- تقييم حجم بيليه النووية (حوالي 50 ميليلتر هوموجينيسيشن الميكانيكية ودونس) وريسوسبيند أنه في المخزن المؤقت سونيكيشن تصل إلى 3 إلى 4 مرات من حجم النووية معبأة و sonicate لمدة 10-15 دقيقة في 4 درجات مئوية باستخدام سونيكاتور .
ملاحظة: الكروماتين يمكن تحليلها فورا كما هو موضح أدناه (6) أو المجمدة والمخزنة في-80 درجة مئوية.
6. تقييم "حجم جزء الكروماتين" عقب سونيكاتيون
ملاحظة: يرجى الرجوع إلى الجدول 1 لكل المخزن المؤقت التراكيب-
- دي-التشعب، تأخذ 30 ميليلتر من الكروماتين في أنبوب اختبار 1.5 مل وإضافة 20 ميليلتر م 5 كلوريد الصوديوم. إكمال وحدة التخزين إلى 500 ميليلتر واحتضان عند 65 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
- في اليوم التالي، تنفيذ علاج مع البروتيناز 1 ميليلتر ك (20 ملغ/مل الأسهم)، 10 ميليلتر م 2 تريس الأس الهيدروجيني 6.8، و 10 ميليلتر يدتا 0.5 M ح 1 في 42 ° C. إجراء فينول-كلوروفورم/كلوروفورم الاستخراج ويعجل بالحمض النووي مع حجم 1 من أسيتات الصوديوم ه (م 3) ووحدات التخزين 2 الإيثانول 100% ح واحد في-80 درجة مئوية، أو بين عشية وضحاها في-20 درجة مئوية.
- بيليه الحمض النووي باستخدام الطرد المركزي في 13,500 س ز لصب المادة طافية 15 دقيقة ويغسل بيليه جيدا بالبرد 70% إيثانول والطرد المركزي مرة أخرى لأدنى 5 صب المادة طافية وأيردري بيليه.
- ريسوسبيند بيليه في وحدة التخزين الأصلية (30 ميليلتر) من المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات. قياس تركيز الحمض في جهاز المطياف الضوئي بامتصاص في 260 نيوتن متر/280 نانومتر. "الماصة؛" 500 1,000 نانوغرام من الحمض النووي جنبا إلى جنب مع سلم حجم الحمض النووي في ممرات منفصلة من 1.5% [اغروس] هلام وإجراء التفريد لتقييم حجم جزء من الكروماتين-
ملاحظة: يجب أن يكون حجم الجزء بين 200-500 قاعدة أزواج، وينبغي أن يكون هناك لا أجزاء الوزن الجزيئي عالية يمكن كشفها المقابلة لغير-أو سيئة-تجزئة الحمض النووي. إذا لزم الأمر، الحل الكروماتين (الخطوة 5) يمكن إعادة سونيكاتيد لوقت أطول وثم إعادة تحليلها كما هو موضح أعلاه حتى يتم الحصول على الحجم الأمثل-
7. إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين (رقاقة)
ملاحظة: يرجى الرجوع إلى الجدول 1 لكل المخزن المؤقت التراكيب-
- كتلة ز البروتين الخرز سيفاروسي من اليقوتينج 1 مل الطين 50% في الإيثانول. بيليه الخرز بالطرد المركزي في ز 400 x لمدة 1 دقيقة في benchtop الطرد المركزي وتغسل مع 1 مل من الشركة المصرية للاتصالات المخزن المؤقت لأجهزة الطرد المركزي في 400 x ز وكرر واشنطن
- بعد الطرد المركزي الثاني، وإعادة تعليق في 1 مل من المخزن المؤقت لتمييع رقاقة مع 25 ميليلتر لجيش صرب البوسنة (الأسهم 20 ملغ/مل) وميليلتر 20 خميرة الحمض الريبي النووي النقال (الأسهم 10 ملغ/مل). كتلة الخرز على الأقل 2 ساعة قبل استخدامها بالتناوب (40-60 لفة في الدقيقة) في 4 ° C.
- تمييع 50 ميكروغرام من الكروماتين (الخطوة 5) 8 إلى 10 مرات استخدام رقاقة تمييع المخزن المؤقت. إضافة 50 ميليلتر من الملاط حبة المحظورة واحتضانها ح 2 (40-60 لفة في الدقيقة) بالتناوب في 4 ° جيم أجهزة الطرد المركزي في 400 غرام x عند 4 درجة مئوية الحصول على الكروماتين المجازين وتحويلها إلى أنبوب جديد.
- إيمونوبريسيبيتيشن، إضافة المقدار المناسب من جسم الأولية (مثلاً، 1-2 ميكروغرام كل 10 ميكروغرام من الكروماتين) واحتضان بين عشية وضحاها بالتناوب في 4 ° C.
ملاحظة: المبلغ الأمثل لجسم قد أوصت به المورد أو يمكن تحديده تجريبيا من خلال أداء رقاقة--قبكر مع كميات مختلفة من جسم حتى يلاحظ التخصيب الأمثل. كما سيفاروسي "ز البروتين" يمكن الاستعاضة سيفاروسي البروتين بحسب النوع الفرعي للأجسام المضادة المستخدمة. - إضافة الخرز الممنوعة في اليوم التالي واحتضانها ح 1 مع التناوب (40-60 لفة في الدقيقة) في 4 ° جيم أجهزة الطرد المركزي في 400 غ س ل 20-30 s بيليه الخرز وإزالة المادة طافية، والبدء الرقاقة يغسل.
- رقاقة يغسل: أداء يغسل التالية مع المخازن المؤقتة: مرة واحدة مع "منخفضة الملح المخزن المؤقت"، ومن ثم مرتين مع "المخزن المؤقت الملح عالية"، مرتين مع ليكل المخزن المؤقت، وأخيراً مرتين مع "المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات".
- أداء كل غسل لمدة 10 دقيقة مع التناوب (40-60 لفة في الدقيقة) عند 4 درجة مئوية وبيليه الخرز بين كل غسل بالطرد المركزي في 400 غ س ل s 20-30 في الطرد مركزي أعلى مقاعد البدلاء.
- شطف، إزالة الغسيل الأخير وريسوسبيند الخرز في 250 ميليلتر شطف العازلة (طازج) لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة بينما تهز.
- الطرد المركزي في 400 × ز وجمع النذرة في أنبوب جديد. إجراء هذه الخطوة مرتين ثم دي-التشعب النذرة بين عشية وضحاها مع 20 ميليلتر كلوريد الصوديوم 5 م وألف رناسي 1 ميليلتر (10 مغ/مل)، تعامل مع بروتيناز ك، والفينول-كلوروفورم/كلوروفورم إكسترالقانون كما هو الحال في الخطوة 6.
- ريسوسبيند في 50 ميليلتر من المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات واستخدام مختبرين لرقاقة qPCR وفقا للبروتوكولات القياسية 15 للتحقق من جودة الرقاقة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لعزل النوى، أجرينا الميكانيكية تجانس النسيج العضلي تشريح ومفروم ل s أما 15 أو 45، في دورة في الدقيقة 18,000 و 22,000 (انظر الجدول للمواد). في جميع الأحوال، يمكن فصل النوى عن الحطام الأنسجة، ولكن كان العائد الأمثل باستخدام سرعة أقل (الشكل 1 أ-ب). ويمكن أيضا إعداد الأنوية دونسينج لمدة 3-5 دقيقة (الشكل 1A، والمعطيات غير معروضة)، ولكن التجانس الميكانيكية هو الأسلوب المفضل، كما يمكن تحقيق غلال الأمثل من النوى في أقل من 15 s، السماح مكسباً هاما للوقت خاصة إذا عينات متعددة يجب أن تكون المعالجة (الشكل 1B). استخدام هذا البروتوكول، يصل إلى 2.7 × 107 نواة من 500 ملغ أنسجة (ما يعادل الأنسجة 1 الماوس) يمكن أن تكون معزولة لتوليد 100 ميكروغرام من الكروماتين.
لتحسين أمثلية تجزئة الكروماتين من نواة ثابتة، ونحن سونيكاتيد لمدة 5 إلى 20 دقيقة. تحت الإعدادات (انظر الجدول للمواد)، سونيكيشن 10 دقيقة كان الأمثل لتوليد الكروماتين مع حجم جزء متوسط من 250 شركة بريتيش بتروليوم (الشكل 2). هذه الخطوة ينبغي أن يكون الأمثل تجريبيا مع مراعاة نوع سونيكاتور المستخدم.
لتقييم نوعية الكروماتين العضلات أعدتها البروتوكول، المذكورة أعلاه، أجريت تجارب qPCR رقاقة ورقاقة seq ضد عوامل النسخ أو التعديل هيستون أو الحمض النووي الريبي بوليميراز الثاني (بول الثاني). رقاقة--قبكر ضد مستقبلات جلوكوكورتيكويد (GR) في وجود أو عدم وجود علاج الديكساميتازون (Dex) كشفت القوى التخصيب التنفيذ المباشر-تعتمد على الموارد الوراثية في العناصر التنظيمية للجينات Redd1 و Murf1 من المعروف أن التنفيذ المباشر والموارد الوراثية وتنظم في11من ألياف العضلات، بينما كان ينظر إلى أي إشارة في مروج Prm1 الخصية محددة تستخدم كعنصر سلبي (الشكل 3A).
رقاقة--قبكر ضد أسيتيلاتيد يسين 27 هستون H3 (H3K27ac)، تعديل التساهمية عثر عليها في القدرة على النشطة والمروجين، أظهرت تخصيب قوية في المروج ديسمين (Des) التي تنشط في ألياف العضلات، مقارنة بسلبية إينتيرجينيك مراقبة المنطقة (الشكل 3B). H3K27ac رقاقة-seq كشفت عن مستوى عال من هذه العلامة في جميع أنحاء المكان Des ، نموذجية من أنسجة التنظيم 'سوبر-محسن' هوية الجينات12 (الشكل 4 أ). وبالمثل، "بول الثاني" رقاقة-seq أظهرت مستويات عالية من الاختزال "بول الثاني" في هذا المكان.
رقاقة qPCR لعامل النسخ Tead4، الذي يلعب دوراً هاما في التمايز شذوذ13،7، كشفت عن تخصيبها في مواقع الربط هو موضح سابقا في Ccnd1 و Ifrd1 الجينات ( الشكل 3). الأهم من ذلك، خفضت تخصيب باستخدام لونين إعداد من الفئران حيث كان Tead4 المعطل بشكل انتقائي في ألياف العضلات (Tead4سكم--/--)7 (الشكل 3). أظهرت التحليلات seq رقاقة البيانات لكل من Tead1 و Tead4 على الربط إلى موقع في المروج للجينات Kdm5a باستخدام لونين من البرية من نوع العضلات، بينما إشارة Tead4، ولكن ليس هذا من Tead1 "أو" H3K27ac "أو" بول الثاني، قد فقدت باستخدام لونين من عضلات Tead4سكم--/-- الفئران (الشكل 4 باء). وبالمثل، يعتبر ملزما Tead1 و Tead4 إلى عنصر تنظيمي المصب من الجينات Adssl1 مع الكروماتين من البرية من نوع العضلات، حين خسر بشكل انتقائي باستخدام لونين من Tead4ملزمة Tead4سكم--/-- العضلات ( الشكل 4). وتبين هذه الملاحظات أن إشارة Tead4 ينظر في بيانات seq رقاقة جاءت من الربط في الألياف العضلية.
لتحديد المساهمة أنواع الخلايا الأخرى المرتبطة بالألياف العضلية إلى نتائج seq رقاقة، قمنا بتقييم الإشارات H3K27ac وبول الثاني في الجينات Vcam1 التي تنشط في خلايا العضلات الأقمار الصناعية و Pecam1، علامة على الخلايا البطانية للأوعية الدموية التي ري العضلات. مقارنة بمستويات عالية في الجينات Des أو Adssl1 ، وكانت مستويات H3K27ac والثاني بول رأيت في الجينات Vcam1 و Pecam1 على السواء الكثير أقل (4A الشكل و الشكل 4). الاختلافات الكبيرة في إشارة للألياف العضلية وأعرب عن الجينات مقارنة بتلك التي أعرب عنها في الأنسجة المرتبطة بها أشارت إلى أن إشارة ينظر في رقاقة من الكروماتين المعدة باستخدام البروتوكول المذكورة أعلاه يأتي أساسا من ربط الأحداث في الألياف العضلية.
رقم 1: تنقية نويات من الماوس الكبار العضلات. (A) ليساتيس الأنسجة التي حصل عليها هوموجينيسيشن الميكانيكية (18,000 لفة في الدقيقة، 45 ثانية) والملون باللون الأزرق تريبان دونس التجانس (30 دقيقة السكتات الدماغية/3) ولاحظ تحت مجهر رقمي والصور تم القبض على 20 X التكبير. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. (ب) عدد الأنوية الحصول عليها من 500 ملغ أنسجة (أي ما يعادل 1 الماوس) بعد إعداد تحت الظروف المشار إليها، و 18,000 و 22,000 في الدقيقة 15 و 45 s أو 3 دقائق من دونسينج. تمثل أشرطة الخطأ ± يعني S.E.M. ل n = 3 الفئران لتجانس الميكانيكية، و n = 3 الفئران دونسينج. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: تحقق حجم جزء الكروماتين. وقد سونيكاتيد النوى معزولة لمدة 5 أو 10 أو 15 أو 20 دقيقة كما هو مبين. بعد دي-crosslinking وتنقية، تم تقييم حجم جزء الحمض النووي قبل [اغروس] هلام التفريد حضور اثيديوم بروميد. M علامة حجم الحمض النووي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: استخدام لونين لرقاقة--قبكر- (أ) تعرض الفئران للحقن البريتوني داخل السيارة أو الديكساميتازون (10 مغ/كغ) وبعد ح 1.5، أعد الكروماتين من العضلات أطرافهم هند. تتم الإشارة إلى التخصيب في رقاقة في الموارد الوراثية الجينات المستهدفة Redd1 و Murf1، المروج البروتامين مراقبة سلبية (Prm1)، بالمقارنة مع % من مدخلات عجلت. (ب) رقاقة كان يؤديها للأجسام المضادة لمكافحة H3K27ac ومفتش وتحليلها في المروج ديسمين ومقارنة بمنطقة مراقبة سلبية إينتيرجينيك. (ج) أنجز رقاقة Tead4 على الكروماتين العضلات التي تم الحصول عليها من نوع البرية والفئران بالضربة القاضية Tead4 الخاصة بالعضلات (Tead4سكم-/-) وجرى تحليلها في مواقع الربط Tead4 في المروجين Ccnd1 و Ifrd1 ، بالمقارنة مع مراقبة المنطقة إينتيرجينيك. في جميع التجارب، تم تجميع الكروماتين من الفئران 3 وأشرطة الخطأ تمثل ± يعني S.E.M في اختبار T للطالب لثلاثة replicates التقنية. قيمة P < 0.001* *، < 0.0001 * * *؛ NS، غير هامة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: الملامح المجينية للألياف العضلات الكروماتين. (أ) لقطات من الابتعاثy كاليفورنيا في سانتا كروز الجينوم المستعرض من المكاني المشار إليها توضح مستويات أعلى بكثير H3K27ac وبول الثاني في الجينات ديسمين، وأعرب عن درجة عالية في الألياف العضلية، مقارنة بالجينات Vcam1 و Pecam1 في خلايا الأقمار الصناعية وأعرب عن و غشائي الخلايا، على التوالي. (ب) التسخن لقطات من المكاني المشار إليها توضح ملزمة Tead1 و Tead4، وكذلك H3K27ac و "بول الثاني"، في الكروماتين من البرية من نوع (WT) العضلات مقارنة بمن Tead4سكم--/-- العضلات (MT)، حيث يتم فقدان الانتقائي لربط Tead4 ولاحظ. تتوفر البيانات seq رقاقة يتضح ك GSE82193 في قاعدة بيانات توقعات البيئة العالمية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| اسم المخزن المؤقت | تكوين | ||
| المخزن المؤقت ناقص التوتر | 10 ملم حبيس-كوه (7.3 درجة الحموضة) | ||
| 10 ملم بوكل | |||
| 5 مم مجكل2 | |||
| 0.1 NP %-40 | |||
| مم 0.1 بمسف (أضيف حديثا) | |||
| كوكتيل مثبط البروتياز (الموافقة المسبقة عن علم) 1 x (أضيف حديثا) | |||
| المخزن المؤقت سونيكاتيون | الحزب الديمقراطي الصربي 1% | ||
| 10 مم يدتا | |||
| 20 مم تريس-HCl pH 8 | |||
| 150 مم كلوريد الصوديوم | |||
| 0.1 ديوكسيتشولاتي الصوديوم % | |||
| 1% Triton X-100 | |||
| أضيف حديثا 0.1 مم بمسف | |||
| الموافقة المسبقة عن علم 1 x | |||
| المخزن المؤقت لتمييع رقاقة | الحزب الديمقراطي الصربي 0.01 ٪ | ||
| 1.1% Triton X-100 | |||
| 1.2 مم يدتا | |||
| 16.7 مم HCl تريس pH8 | |||
| 167 ملم كلوريد الصوديوم | |||
| أضيف حديثا 0.1 مم بمسف | |||
| الموافقة المسبقة عن علم 1 x | |||
| المخزن المؤقت "منخفضة الملح" | 0.1 الحزب الديمقراطي الصربي % | ||
| 1% Triton X-100 | |||
| 500 مم يدتا | |||
| 20 مم HCl تريس pH8 | |||
| 150 مم كلوريد الصوديوم | |||
| المخزن المؤقت الملح عالية | 0.1 الحزب الديمقراطي الصربي % | ||
| 1% Triton X-100 | |||
| 500 مم يدتا | |||
| 20 مم HCl تريس pH8 | |||
| 500 ملم كلوريد الصوديوم | |||
| ليكل المخزن المؤقت | 250 مم ليكل | ||
| NP-40 1% | |||
| 1 مم يدتا | |||
| 10 ملم HCl تريس pH 8 | |||
| شطف المخزن المؤقت | الحزب الديمقراطي الصربي 1% | ||
| 100 مم NaHCO3 | |||
| المخزن المؤقت تريس يدتا (TE) | 50 مم HCl تريس pH 8 | ||
| 1 مم يدتا | |||
الجدول 1: المخزن المؤقت التراكيب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا يصف لنا بروتوكول رواية لإعداد الكروماتين من الماوس الكبار عضلات الهيكل العظمى، وتبين أن هذا الكروماتين مناسبة لإجراء التجارب على رقاقة التي كشف ملزم عامل النسخ والتعديلات التساهمية هستون في الأنوية الألياف العضلية. ويشمل هذا البروتوكول عدة خطوات حاسمة. الأول هو اختلال الأنسجة التي يمكن أن يؤديها دونس أو بالقص الميكانيكية. القص الميكانيكية أسرع وأكثر قابل لإعادة الإنتاج، وذلك هو الأسلوب المفضل. ومع ذلك، في حالة توفر لا جهاز مناسب، تعطل يمكن أيضا أن يؤديها دونسينج، حيث يوصي بتقييم كفاءة تحلل تحت المجهر قبل المتابعة إلى الخطوة التثبيت. التثبيت لكل الأنسجة ليساتيس، بدلاً من تثبيت نواة معزولة، يسمح أكثر sonication استنساخه بكميات أصغر وعلى فترات قصيرة. لقد اخترنا أيضا إصلاح في ليساتيس بعد انقطاع بدلاً من إصلاح الأنسجة قبل التعطيل، كما وصفها توماس et al. 10 قبل تحديد الأنسجة أدت إلى انخفاض كفاءة هوموجينيساتيون. هذا البروتوكول استناداً إلى القص الميكانيكية أيضا أسرع من غيرها الحلول المقترحة، مثل الهضم كولاجيناز، التي تنطوي على حضانة طويلة تشريح الأنسجة في8من 37 درجة مئوية. وخلال هذه الفترة، يمكن أن تحدث تغييرات في الجينات التعبير والنسخ عامل ملزم. تحديد الأنوية أسرع وقت ممكن من الضروري أكثر دقة التقاط حالة فيزيولوجية طبيعية.
خطوة حاسمة ثانية هو تنقية الأنوية من الثابتة ليساتي. لذلك، تصفية متسلسلة من الحل ليستي الثابتة، أولاً من خلال مصفاة خلية 70 ميكرون لإزالة الأنقاض أكبر، ومن ثم من خلال مصفاة خلية 40 ميكرون لإزالة الأنقاض غرامة، يتجنب انسداد في مصافي ويزيد غلة الأنوية التي تم الحصول عليها. بمجرد تنقيته عن طريق الترشيح، هي سونيكاتيد نوى وتحديد حجم جزء الحمض النووي بعد دي-كروسلينكينج. إعداد نموذجي من أطرافه هند اثنين واحد بالماوس غلة 100 ميكروغرام من الكروماتين. تجميع ليساتيس من الفئران تصل إلى 3 قد تحسين الغلة بتقليل الخسائر أثناء الإعداد. هذا الإجراء كفاءة أنها تتيح استرداد يصل إلى 75% من الحمض النووي الجينوم الكروماتين (البيانات لا تظهر).
رقاقة تجارب تهدف إلى تقييم النسخ عامل ملزم وتعديلات جينية أظهرت مدى ملاءمة هذا البروتوكول لدراسة تنظيم الجينات في نواة الألياف العضلية. تم إنشاؤها إشارات seq رقاقة قوية ومتينة لبول الثاني و H3K27ac من الكروماتين، تتيح تحديد هوية ألياف العضلية هوية الجينات بهم المميزة H3K27ac وبول الثاني لمحات7. وأظهر مستويات أعلى بكثير من H3K27ac وبول الثاني على الجينات المعرب عنها بقوة في نويات الألياف، مقارنة بالجينات في الأقمار الصناعية أو خلايا بطانية، وأعرب عن أن الإشارة جاءت أساسا من نواة الألياف. هذا ما أكده أيضا فقدان إشارة رقاقة Tead4 باستخدام لونين من الفئران حيث أنه كان على وجه التحديد غير نشط في ألياف العضلات. على الرغم من ذلك، ولكن الأضعف، وضوح أعلاه الإشارات الخلفية، ليمكن الكشف عن علامات خلية الأقمار الصناعية مثل Vcam1، Pax7 (البيانات لا تظهر) تبين أن الكروماتين من هذه الخلايا وهذا أيضا. ونحن نتوقع أن لدينا البروتوكول ينبغي أن تكون مناسبة للتقنيات الأخرى التي تستخدم الكروماتين فورمالدهايد--الثابتة مثل ج 3/4 ج والائتلاف الكروماتين تكيف تقنيات الالتقاط. استخدام بروتوكول لدينا للجمع بين seq رقاقة لعوامل النسخ والتعديلات الكروماتين مع التقاط تكيف الكروماتين في المستقبل ينبغي السماح لفهم مفصل للجينات الآليات التنظيمية في الألياف العضلية وكيف يمكن تنظيم هذه أو مستاء من المنبهات الفسيولوجية، مثل ممارسة، الصوم، حمية عالية الدهون، إزالة التعصيب، أو المرض، باستخدام لونين أعدت من وراثيا تعديل الفئران استنساخ الأمراض مثل centronuclear ترتبط X عضلي14.
وباختصار، يسمح هذا البروتوكول منخفضة التكلفة وفعالة من حيث الوقت عزل نواة الألياف العضلية التي يمكن أن سونيكاتيد فورا أو المجمدة في-80 درجة مئوية لاستخدام خفية. استخدام الكروماتين التي أعدت بموجب هذا البروتوكول، قدمت بيانات seq شريحة واسعة الجينوم الأولى من الألياف العضلية7 وسيسهل الدراسات المستقبلية في تنظيم الجينات في هذا النسيج.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.
Acknowledgments
ونحن نشكر جميع موظفي مرفق تسلسل الإنتاجية العالية إيجبمك، عضو في اتحاد "فرنسا Génomique" (ANR10-إينبس-09-08) وجميع الخدمات العامة إيجبمك وبخاصة موظفي مرفق الحيوان إيجبمك. كان يؤيد هذا العمل من المنح المقدمة من يزار، في INSERM، فؤاد، الرابطة الوطنية جنيه مكافحة السرطان، الصندوق من خلال وكالة الاستخبارات الوطنية في إطار برنامج يشرف دعفينير المسمى ANR-10-معرض أيدكس-0002-02، لابيكس ANR إينرت-10-معرض أيدكس-0001-02 الدولة الفرنسية ANR-AR2GR-16-CE11-009-01. وكان الممولين أي دور في تصميم الدراسة أو جمع البيانات والتحليل، وقرار نشر أو إعداد المخطوطة. أيده S.J جنيه الرابطة الوطنية مكافحة السرطان، و ANR-AR2GR-16-CE11-009-01، و V.U بوزارة التعليم et de la البحوث. هو معرف 'équipe labellisée' من الرابطة الوطنية جنيه مكافحة السرطان.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| T 25 digital ULTRA-TURRAX | T 18 ULTRA-TURRAX | 0009022800 | |
| PMSF | SIGMA-ALDRICH CHIMIE SARL | P7626-25G | |
| Protease Inhibitor Cocktail-EDTA Free | Roche Diagnostics | 11873580001 | |
| Protein G Sepharose beads | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | P-3296 | |
| Proteinase K | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | P-2308 | |
| Cell Strainers 70um | Corning BV | 431751 | |
| Cell Strainers 40um | Corning BV | 352340 | |
| Formaldehyde EM grade | Euromedex | 15710-S | |
| Rnase A | Fischer Scientific | 12091039 | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1 | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | P3803 | |
| BSA | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | B4287-25G | |
| yeast tRNA | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | R5636 | |
| Glycogen Blue | AMIBION | AM9516 | |
| Pol II ChIP Antibody | Santa Cruz | SC-9001 | |
| H3K27ac ChIP Antibody | Active Motif | 39133 | |
| Tead4 ChIP Antibody | Aviva Systems Biology | (ARP38276_P050) | |
| IGEPAL | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | I-3021 | |
| E220 Focused Ultrasonicator | Covaris E220 | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Additional items | |||
| Scissors | |||
| Loose Dounce | |||
| 15 ml and 50 ml falcon tubes | |||
| 14 ml round bottom tubes | |||
| 1.5 ml and 2 ml Eppendorf tubes | |||
| 70 μm and 40 μm cell strainers (Corning) |
References
- Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions. Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).
- Furey, T. S. ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions. Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).
- Wade, J. T. Mapping Transcription Regulatory Networks with ChIP-seq and RNA-seq. Adv Exp Med Biol. 883, 119-134 (2015).
- Alpern, D., et al. TAF4, a subunit of transcription factor II D, directs promoter occupancy of nuclear receptor HNF4A during post-natal hepatocyte differentiation. Elife. 3, e03613 (2014).
- Martianov, I., et al. Cell-specific occupancy of an extended repertoire of CREM and CREB binding loci in male germ cells. BMC Genomics. 11, 530 (2010).
- Achour, M., et al. Neuronal identity genes regulated by super-enhancers are preferentially down-regulated in the striatum of Huntington's disease mice. Hum Mol Genet. 24 (12), 3481-3496 (2015).
- Joshi, S., et al. TEAD transcription factors are required for normal primary myoblast differentiation in vitro and muscle regeneration in vivo. PLoS Genet. 13 (2), e1006600 (2017).
- Ohkawa, Y., Mallappa, C., Dacwag-Vallaster, C. S., Imbalzano, A. N. Myogenesis: Methods and protocols. DiMario, J. 798, Springer Science+Business Media LLC. 517-531 (2012).
- Dimauro, I., Pearson, T., Caporossi, D., Jackson, M. J. A simple protocol for the subcellular fractionation of skeletal muscle cells and tissue. BMC Res Notes. 5, 513 (2012).
- Thomas, J. L., et al. PAK1 and CtBP1 Regulate the Coupling of Neuronal Activity to Muscle Chromatin and Gene Expression. Mol Cell Biol. 35 (24), 4110-4120 (2015).
- Kuo, T., et al. Genome-wide analysis of glucocorticoid receptor-binding sites in myotubes identifies gene networks modulating insulin signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (28), 11160-11165 (2012).
- Whyte, W. A., et al. Master transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes. Cell. 153 (2), 307-319 (2013).
- Benhaddou, A., Keime, C., Ye, T., Morlon, A., Michel, I., Jost, B., Mengus, G., Davidson, I. Transcription factor TEAD4 regulates expression of myogenin and the unfolded protein response genes during C2C12 cell differentiation. Cell Death and Differentiation. 19 (2), 220-231 (2011).
- Cowling, B. S., et al. Reducing dynamin 2 expression rescues X-linked centronuclear myopathy. J Clin Invest. 124 (3), 1350-1363 (2014).
- Thermo Fisher Scientific. ChIP Analysis. , Available from: https://www.thermofisher.com/fr/fr/home/life-science/epigenetics-noncoding-rna-research/chromatin-remodeling/chromatin-immunoprecipitation-chip/chip-analysis.html (2017).
