Summary
Ett nytt protokoll för beredning av kromatin från vuxen mus skelettmuskulatur anpassas till studiet av genreglering i muskelfibrer av kromatin immunoprecipitation presenteras.
Abstract
Vi beskriver ett effektiv och reproducerbara protokoll för beredning av kromatin från vuxen mus skelettmuskulatur, en fysiskt resistenta vävnad med ett högt innehåll av strukturella proteiner. Dissekerade lem muskler från vuxna möss störs fysiskt av mekaniska homogenisering eller en kombination av malning och douncing, i en hypoton buffert innan formaldehyd fixering av cellen lysate. Den fasta kärnan renas genom ytterligare cykler av mekaniska homogenisering eller douncing och sekventiell filtreringar ta bort cellfragment. Renat atomkärnor kan vara sonicated omedelbart eller i ett senare skede efter frysning. Kromatinet kan vara sonicated effektivt och är lämplig för kromatin immunoprecipitation experiment, som illustreras av profilerna erhålls för transkriptionsfaktorer, RNA-polymeras II och kovalenta Histon ändringar. De bindande händelser detekteras med hjälp av kromatin som utarbetats av detta protokoll är huvudsakligen de som äger rum i muskelfiber kärnor trots närvaron av kromatin från andra fiber-associerade satellit- och endotelceller. Detta protokoll är därför anpassade för att studera genreglering i vuxen mus skelettmuskulaturen.
Introduction
Kromatin immunoprecipitation (ChIP) kopplat till kvantitativa polymeras-kedjereaktion (qPCR) och hög genomströmning sekvensering (ChIP-seq) har blivit metoderna för val att studera transkription och epigenetisk reglering av genuttryck i olika vävnader och celltyper1. Denna teknik tillåter genome-wide profilering av kovalent kromatin modifieringar, Histon variant beläggning och transkription faktorn bindande2,3.
Utför ChIP från odlade celler är väl etablerad, fortfarande ChIP från däggdjur vävnader är mer utmanande. Förbereda kromatin ChIP omfattar flera kritiska steg som behöver optimeras för varje vävnads- och typ. Kromatin kan framställas från den cellulära lysates odlade celler eller följande rening av deras kärnor. När det gäller däggdjur vävnader är effektiv lysis, formaldehyd fixering och rening av atomkärnor avgörande för att säkerställa optimal återhämtning av kromatinet. Dessutom har valet att fixa atomkärnor före eller efter deras rening skall bestämmas experimentellt. Trots dessa hinder, har ChIP framgångsrikt utförts från vävnader såsom levern, testiklar, eller hjärnan4,5,6. När det gäller skelettmuskler är störningar av sådan en fysiskt resistenta vävnad, som uppvisar en hög halt av strukturella proteiner och isolering av dess kärnor särskilt utmanande. Med tanke på denna specificitet, ger protokoll optimerad för andra vävnader inte tillfredsställande resultat för skelettmuskulaturen.
Här beskriver vi ett protokoll för att isolera ChIP-grade kromatin från mus skelettmuskulaturen vävnad som innebär fysiskt störa vävnaden, formaldehyd fixering och sedan isolering av kärnor och ultraljudsbehandling. Effektiviteten av denna metod för att förbereda kromatin passar ChIP från denna vävnad demonstrerades genom att utföra ChIP-qPCR och ChIP-seq för olika transkriptionsfaktorer, RNA-polymeras II och kovalenta Histon ändringar7.
Denna nya teknik är mycket snabbare än en tidigare rapporterade protokoll8 bestående av långa kollagenas matsmältningen steg under vilken tid, förändringar i genomisk lokalisering av transkriptionsfaktorer och förändringar i genuttryck kan äga rum. Snabbhet med vilken atomkärnor är isolerad och fast gör den metod som beskrivs här särskilt attraktivt att förbereda kromatin som mer troget fångar tillståndet infödda genomisk beläggning. Dessutom, även om andra metoder för kromatin isolering eller protein utvinning från muskelvävnad har har beskrivs8,9,10 och använts för ChIP-qPCR experiment på valda gener, utan ChIP-seq data har rapporterats med dem. Den metod som redovisas här är lämplig för transkription faktorn och Histon ändring ChIP-seq, och därför bör också vara lämplig för 3 / 4C eller HiC kromatin konformation capture program.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
möss förvarades i enlighet med anvisningar om skötsel och användning av laboratoriedjur och i enlighet med nationella djur vård riktlinjer (Europeiska kommissionens direktiv 86/609/EEG; Franska dekret no.87-848). Alla förfaranden godkändes av franska nationella etikkommittén.
1. isolering av muskelvävnad
- offer en vuxen 6 till 8 veckor gamla mus av cervikal dislokation. Sterlise lemmen genom att skölja det med 70% etanol och dissekera bakbenen musklerna (Gastrocnemius, Tibialis Anterior, Quadriceps) med fin punkt sax och pincett.
Obs: En mus bör ge runt 500 mg vävnad. - Färs musklerna i en 2 mL provrör innehållande 1 mL iskallt hypoton buffert till en homogen blandning av små (< 2-3 mm 3) bitar med fina sax och lämna röret skakar på en bänk topp omrörare vid 4 ° C i 5-10 min.
2. Vävnad Lysis
Obs: Vänligen se tabell 1 för alla buffert kompositioner.
- Överföra Homogenatet till ett 14 mL runda-botten rör och återsuspendera i 5 mL kall hypoton buffert (EDTA-fria proteashämmare cocktail och PMSF).
- Homogenise malet muskelvävnad med en lös dounce (20-30 slag inom 3 min) eller en mekanisk vävnad Homogenisatorer för 15-30 s i runda-botten 14 mL tuber.
Obs: Lysis effektivitet kan bedömas i detta skede av ljusmikroskop, och om det behövs ytterligare störningar kan utföras.
- Homogenise malet muskelvävnad med en lös dounce (20-30 slag inom 3 min) eller en mekanisk vävnad Homogenisatorer för 15-30 s i runda-botten 14 mL tuber.
- Överför Homogenatet 15 mL rör och fylla volym 10 ml med kall hypoton buffert. Fixa Homogenatet som beskrivs nedan innan du fortsätter med nästa musen.
3. Fixering
- lägga till formaldehyd i 1% koncentration och skaka i 10 min i rumstemperatur.
- Lägga till glycin till en slutlig koncentration på 0,125 M i varje rör att stoppa fixering och skaka i 5-10 min i rumstemperatur.
4. Atomkärnor förberedelse
Obs: Vänligen se tabell 1 för alla buffert kompositioner.
- Homogenise den fasta lysate med en lös dounce (5-10 slag).
- Överföring till en 15 mL rör och centrifugera vid 1 000 x g i 5 minuter vid 4 ° C att få kärnor och cellulära skräp.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten i färska 5 mL hypoton buffert. Filtrera den lysate genom en sil med 70 µm i cellen till en 50 mL tub. Nytt filter filtratet genom en 40 µm cell SIL.
- Överföra filtratet i en 15 mL rör och centrifugera vid 1 000 x g i 5 minuter vid 4 ° C att skaffa kärnvapen pelleten.
Obs: I detta skede atomkärnor kan vara omedelbart sonicated eller fästa fryst som en torr pellet i flytande kväve och lagras vid -80 ° C.
5. Ultraljudsbehandling
- bedöma volymen av den nukleära pelleten (cirka 50 µL för både mekanisk och dounce homogenisering) och resuspendera det i ultraljudsbehandling buffert upp till 3 till 4 gånger av packade nukleära volym och Sonikera för 10-15 min vid 4 ° C med en någon sonikator .
Obs: Kromatinet kan analyseras omedelbart som beskrivs nedan (6) eller fryst och lagras vid -80 ° C.
6. Bedömningen av kromatin Fragment storlek efter ultraljudsbehandling
Obs: Vänligen se tabell 1 för alla buffert kompositioner.
- De-crosslink, ta 30 µL av kromatin i ett 1,5 mL provrör och tillsätt 20 µL 5 M NaCl. Slutföra volymen till 500 µL och inkubera vid 65 ° C över natten.
- Nästa dag, genomför en behandling med 1 µL proteinas K (20 mg/mL lager), 10 µL 2 M Tris pH 6,8 och 10 µL 0,5 M EDTA för 1 h på 42 ° C. utför en fenol-kloroform/kloroform utvinning och fällningen DNA med 1 volymdel natrium bensyl e (3 M) och 2 volymer av 100% etanol för en h vid-80 ° C eller över natten vid -20 ° C.
- Pellet DNA genom centrifugering vid 13.500 x g i 15 min. Dekantera supernatanten och tvätta pelleten noggrant med kallt 70% etanol och centrifugera igen för 5 min. Dekantera supernatanten och lufttorka pelleten.
- Återsuspendera pelleten i den ursprungliga volymen (30 µL) av TE buffert. Mätning av DNA koncentrationen i en spektrofotometer av absorbansen vid 260 nm/280 nm. Pipettera 500-1 000 ng DNA tillsammans med en DNA storlek stege på separata körfält på en 1,5% agarosgel och utför elektrofores för att bedöma storleken fragment av kromatin.
Obs: Fragment storlek bör vara mellan 200-500 baspar, och det bör ingen påvisbar hög molekylvikt fragment motsvarande till icke - eller dåligt-fragmenterad DNA. Om så krävs, kromatin lösningen (steg 5) kan åter sonicated för en längre tid och sedan åter analyseras som beskrivs ovan tills den optimala storleken erhålls.
7. Kromatin Immunoprecipitation (ChIP)
Obs: Vänligen se tabell 1 för alla buffert kompositioner.
- Block Protein G sepharose pärlor av alikvotering 1 mL 50% suspensionen i etanol. Pellet pärlorna genom centrifugering vid 400 x g för 1 min i en bänkmonterade Centrifugera och tvätta med 1 mL av TE buffert Centrifugera vid 400 x g och upprepa wash.
- Efter den andra centrifugeringen, återsuspendering i 1 mL förtunningsbuffert ChIP med 25 µL av BSA (lager 20 mg/mL) och 20 µL jäst tRNA (lager 10 mg/mL). Blockera pärlorna för minst 2 h före användning av rotation (40-60 rpm) vid 4 ° C.
- Späd 50 µg av kromatin (steg 5) 8 till 10 gånger med ChIP förtunningsbuffert. Tillsätt 50 µL av blockerade pärla flytgödsel och inkubera i 2 h roterande (40-60 rpm) vid 4 ° C. Centrifugera vid 400 x g vid 4 ° C att få pre clearade kromatin och överföra den till en frisk slang.
- För immunoprecipitation, Tillsätt lämplig mängd primär antikropp (t.ex., 1-2 µg per 10 µg av kromatin) och inkubera över natten med rotation vid 4 ° C.
Obs: Den optimala mängden antikroppar kan rekommenderas av leverantören eller empiriskt kan bestämmas genom att utföra ChIP-qPCR med olika mängder antikroppar tills optimal anrikning observeras. Även Protein G sepharose kan ersättas av Protein A sepharose beroende på vilken subtyp av antikropp används. - Lägg till blockerade pärlorna nästa dag och inkubera i 1 h med rotation (40-60 rpm) vid 4 ° C. Centrifugera vid 400 x g i 20-30 s till pellet pärlorna, avlägsna supernatanten och starta ChIP tvättar.
- ChIP tvättar: utföra de följande tvättarna med buffertar: en gång med låg Salt buffert, och sedan två gånger med hög Salt buffert, två gånger med LiCl buffert, och slutligen två gånger med TE buffert.
- Utföra varje tvätt i 10 min med rotation (40-60 rpm) vid 4 ° C och pellet pärlor mellan varje tvätt genom centrifugering vid 400 x g i 20-30 s i en Bänkcentrifug.
- För eluering, ta bort den sista tvättningen och resuspendera pärlorna i 250 µL eluering buffert (nyberedd) under 15 minuter vid rumstemperatur under omskakning.
- Centrifugera vid 400 x g och samla eluatet i en färsk tub. Utföra detta steg två gånger och sedan de-crosslink eluatet över natten med 20 µL NaCl 5 M och 1 µL RNase A (10 mg/mL), behandla med proteinas K och fenol-kloroform/kloroform extragera som i steg 6.
- Omsuspendera i 50 µL TE buffert och använda alikvoter för ChIP-qPCR enligt standardprotokoll 15 för att kontrollera kvaliteten på chipet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att isolera atomkärnor, utfört vi mekanisk homogenisering av dissekeras och malet muskelvävnad för antingen 15 eller 45 s, vid 18.000 och 22.000 rpm (se Tabell för material). Under alla förhållanden, atomkärnor kunde skiljas från vävnad skräp, men avkastningen var optimal med lägre hastighet (figur 1A-B). Atomkärnor kan också förberedas av douncing för 3-5 min (figur 1Aoch data som inte visas), men mekanisk homogenisering är metoden för val, optimal avkastning av atomkärnor kan uppnås i så lite som 15 s, så att en viktig vinst tid speciellt om flera prover måste bearbetas (figur 1B). Använder det här protokollet, upp till 2,7 x 10 kan7 kärnor från 500 mg av vävnad (motsvarande 1 mus är vävnaden) isoleras att generera 100 µg av kromatin.
För att optimera kromatin fragmentering från fasta kärnor, sonicated vi för 5 till 20 min. Under Inställningar (se Tabell för material), en 10 min ultraljudsbehandling var optimalt att generera kromatin med en genomsnittlig fragment storleken 250 bp (figur 2). Detta steg bör optimeras experimentellt med hänsyn till typ av någon sonikator används.
För att bedöma kvaliteten på muskel kromatinet utarbetats av det protokoll som beskrivs ovan, utfördes ChIP-qPCR och ChIP-seq experimenten mot transkriptionsfaktorer, en Histon ändring eller RNA-polymeras II (Pol II). ChIP-qPCR mot glukokortikoidreceptorn (GR) i närvaro eller frånvaro av dexametason (Dex) behandling visade stark Dex-beroende GR berikning på föreskrivande delar av de Redd1 och Murf1 gener som är kända för att vara Dex och GR reglerade i muskelfibrer11, medan ingen signal sågs vid testis specifika Prm1 arrangören används som en negativ kontroll (figur 3A).
ChIP-qPCR mot acetylerade lysin 27 i Histon H3 (H3K27ac), en kovalent modifiering på aktiva förstärkare och initiativtagare, visade stark berikning på promotorn Desmin (Des) som är aktiv i muskelfibrer, jämfört med en negativ intergenic kontrollregion (figur 3B). H3K27ac ChIP-seq visade en hög nivå av detta märke i hela det Des locus, typisk för en 'super-enhancer' reglerade vävnad identitet gen12 (figur 4A). Likaså visade Pol II ChIP-seq höga halter av transkribera Pol II på denna locus.
ChIP-qPCR för transkriptionsfaktor Tead4, som spelar en viktig roll i myogenic differentiering13,7, avslöjade dess anrikning på tidigare beskrivna bindningsställen på Ccnd1 och Ifrd1 gener ( Figur 3 c). Ännu viktigare, berikning reducerades med kromatin beredd från möss där Tead4 var selektivt inaktiverat i muskelfibrer (Tead4skm-/-)7 (figur 3 c). Analyser av ChIP-seq data för både Tead1 och Tead4 visade deras bindning till en webbplats i främjare av den Kdm5a genen med kromatin från vildtyp muskel, medan Tead4 signalen, men inte som Tead1, H3K27ac eller Pol II, förlorades med kromatinet från musklerna i den Tead4skm-/- möss (figur 4B). Likaså Tead1 och Tead4 bindning till en föreskrivande del nedströms av genen Adssl1 som ses med kromatin från vildtyp muskel, medan Tead4 bindande förlorades selektivt använda kromatin från den Tead4skm-/- muskel () Figur 4 c). Dessa observationer visar att Tead4 signalen sett i ChIP-seq data kom från bindning i muskelfibern.
För att fastställa bidraget av andra celltyper som är associerad med muskelfibern till ChIP-seq resultaten, bedömde vi H3K27ac och Pol II signalerna på genen Vcam1 som är aktiv i satellit muskelceller och Pecam1, en markör för endotelceller i blodkärl som vattna musklerna. Jämfört med de höga nivåer ses vid Des eller Adssl1 gener, H3K27ac och Pol II ses vid både Vcam1 och Pecam1 gener var mycket lägre (figur 4A och figur 4 c). De stora skillnaderna i signal för muskelfiber uttryckt gener jämfört med de uttryckt i omkringliggande vävnader anges att signalen sett i ChIP från kromatinet beredd med hjälp av protokollet som beskrivs ovan kommer huvudsakligen från bindande händelser i de muskelfiber.
Figur 1: rening av kärnor från vuxen mus muskel. (A) vävnad lysates erhålls genom mekanisk homogenisering (18.000 rpm, 45 s) och dounce homogenisering (30 slag/3 min) var målat med trypan blå och observerade under en digital Mikroskop bilder fångades på 20 X förstoring. Skalstapeln = 100 µm. (B) antalet kärnor erhålls från 500 mg av vävnad (motsvarande 1 mus) efter beredning under indikerad villkorar, 18.000 och 22.000 rpm för 15 och 45 s eller 3 min av douncing. Felstaplar representera medelvärde ± S.E.M. för n = 3 möss för mekaniska homogenisering och n = 3 möss för douncing. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: kontroll av kromatin fragment storlek. Isolerade kärnor var sonicated för 5, 10, 15 eller 20 min som anges. Efter de-crosslinking och rening bedömdes DNA fragment storlek av agaros gel-elektrofores i närvaro av etidiumbromid. M är DNA storlek-markör. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: användning av kromatin för ChIP-qPCR. (A) möss utsattes för intra peritoneal injektioner av fordonet eller dexametason (10 mg/kg) och efter 1,5 h, kromatin var beredd från bakbenen muskler. Den anrikning i ChIP på GR målgener Redd1 och Murf1, jämfört med promotorn negativ kontroll Protamin (Prm1), anges i % av input som fälls ut. (B) ChIP var utfört för H3K27ac och IgG kontroll antikroppar och analyseras på promotorn Desmin och jämfört med en intergenic negativ kontrollregion. (C) Tead4 ChIP utfördes på muskel kromatin erhållits från vildtyp och muskel-specifika Tead4 knockoutmöss (Tead4skm-/-) och analyseras på Tead4 bindningsställen i Ccnd1 och Ifrd1 initiativtagarna, jämfört med den kontroll intergenic regionen. I alla experiment, kromatin från 3 möss var poolade och felstaplar representera medelvärde ± S.E.M i en students T-test för tre tekniska replikat. P-värde < 0.001* *, < 0,0001 ***; NS, icke-signifikant. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: genetiska profiler av muskelfiber kromatin. (A) skärmdumpar från Terray California i Santa Cruz genomet webbläsare de angivna lokus som illustrerar mycket högre H3K27ac och Pol II nivåer på genen Desmin, starkt uttryckt i muskelfibern, jämfört med Vcam1 och Pecam1 generna uttrycks i satellit celler och endothelial celler, respektive. (B) UCSC skärmdumpar av de angivna lokus som illustrerar bindningen av Tead1 och Tead4, samt H3K27ac och Pol II, i kromatin från vildtyp (WT) muskel jämfört med från Tead4skm-/- (MT) muskel, där selektiv förlust av Tead4 bindande är observerats. ChIP-seq data illustrerad finns som GSE82193 i GEO-databasen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Buffert namn | Sammansättning | ||
| Hypoton buffert | 10 mM HEPES-KOH (pH 7,3) | ||
| 10 mM KCl | |||
| 5 mM MgCl2 | |||
| 0,1% NP-40 | |||
| 0,1 mM PMSF (nyligen tillagd) | |||
| Proteas hämmare cocktail (PIC) 1 x (nyligen tillagd) | |||
| Ultraljudsbehandling buffert | 1% SDS | ||
| 10 mM EDTA | |||
| 20 mM Tris-HCl pH 8 | |||
| 150 mM NaCl | |||
| 0,1% natriumdeoxikolat | |||
| 1% Triton x-100 | |||
| Nyligen lagt till 0,1 mM PMSF | |||
| BILD 1 x | |||
| ChIP förtunningsbuffert | 0,01% SDS | ||
| 1,1% Triton x-100 | |||
| 1.2 mM EDTA | |||
| 16,7 mM Tris HCl pH8 | |||
| 167 mM NaCl | |||
| Nyligen lagt till 0,1 mM PMSF | |||
| BILD 1 x | |||
| Låg Salt buffert | 0,1% SDS | ||
| 1% Triton x-100 | |||
| 500 mM EDTA | |||
| 20 mM Tris HCl pH8 | |||
| 150 mM NaCl | |||
| Hög Salt buffert | 0,1% SDS | ||
| 1% Triton x-100 | |||
| 500 mM EDTA | |||
| 20 mM Tris HCl pH8 | |||
| 500 mM NaCl | |||
| LiCl buffert | 250 mM LiCl | ||
| 1% NP-40 | |||
| 1 mM EDTA | |||
| 10 mM Tris HCl pH 8 | |||
| Eluering buffert | 1% SDS | ||
| 100 mM NaHCO3 | |||
| Tris-EDTA (TE) buffert | 50 mM Tris HCl pH 8 | ||
| 1 mM EDTA | |||
Tabell 1: Buffert kompositioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här beskriver vi ett roman protokoll för att förbereda kromatin från vuxen mus skelettmuskulaturen och visa att denna kromatin är lämplig för ChIP experiment som upptäcka transkription faktorn bindande och kovalenta Histon ändringar i muskelfiber kärnor. Detta protokoll omfattar flera viktiga steg. Först är vävnad störningar som kan utföras antingen genom dounce eller genom mekanisk klippning. Mekanisk klippning är snabbare och mer reproducerbar, och är därför metoden för val. Ändå, om ingen lämplig utrustning finns tillgänglig, störningar kan även utföras av douncing, där bedömning av effektiviteten i Lys under mikroskopet rekommenderas innan du fortsätter till fixering steg. Fixering av hela-vävnad lysates, i stället för fixering av isolerade kärnor, får fler reproducerbara ultraljudsbehandling i mindre volymer och för korta löptider. Vi valde också att fixa lysates efter avbrott i stället för att fixa vävnaden innan störningar, som beskrivs av Thomas et al. 10 före fastställande vävnaden resulterade i minskad effektivitet av homogenisering. Detta protokoll baserat på mekanisk klippning är också snabbare än andra föreslagna lösningar, såsom kollagenas matsmältning, som innebär långvarig inkubation av dissekerade vävnad vid 37 ° C8. Under denna period, kan förändringar i genen uttryck och transkription faktorn bindning uppstå. Fastställande atomkärnor så fort som möjligt är därför viktigt att mer troget fånga det normala fysiologiska tillståndet.
En andra kritiska steget är rening av kärnor från den fasta lysate. För detta sekventiella filtrering av fasta lysate lösningen, först genom en 70 µm cell SIL att eliminera större skräp och sedan genom en sil 40 µm cell ta bort fina skräp, undviker igensättning silar och maximerar avkastningarna av atomkärnor erhålls. När renas genom filtrering, kärnor är sonicated och DNA fragment storlek fastställs efter de-crosslinking. En typisk beredning från två bakbenen av en mus ger 100 µg av kromatin. Sammanslagning av lysates från upp till 3 möss kan förbättra avkastningen genom att minska förlusterna under beredning. Detta förfarande är effektiv eftersom det tillåter återvinning av upp till 75% av genomisk DNA som kromatin (inga data anges).
ChIP experiment för att undersöka transkription faktorn bindande och epigenetiska förändringar visat lämpligheten av detta protokoll för att studera genreglering i muskelfiber kärnor. Starka och robusta ChIP-seq signaler för Pol II och H3K27ac genererades från kromatinet, möjliggör identifiering av muskelfiber identitet gener av deras särskiljande H3K27ac och Pol II profiler7. De mycket högre nivåerna av H3K27ac och Pol II på gener starkt uttryckt i fiber kärnor, jämfört med gener uttrycks i satellit eller endotelceller, visade att signalen kom huvudsakligen från fiber atomkärnor. Detta bekräftades även av förlusten av Tead4 ChIP signal med kromatin från möss där det var specifikt inaktiverat i muskelfibrer. Dock svagare, men klart över bakgrunden signaler, för satellit cell markörer såsom Vcam1, Pax7 (inga data anges) kan detekteras visar att kromatin från dessa celler är också närvarande. Vi räknar med att våra protokoll bör vara lämplig för andra tekniker som använder formaldehyd-fasta kromatin såsom 3 C/4 C och HiC kromatin konformation fånga tekniker. Användning av våra protokoll för att kombinera ChIP-seq för transkriptionsfaktorer och kromatin ändringar med kromatin konformation capture bör i framtiden möjliggöra en detaljerad förståelse av genen regleringsmekanismer i muskelfiber och hur dessa kan regleras upprörda av fysiologiska stimuli, såsom motion, fasta, en hög fett diet, denervering, eller i sjukdomen, med hjälp av kromatin som framställts av genetiskt modifierade möss reproducera sjukdomar som X-länkade centronuclear myopati14.
I sammanfattning kan här låg-kostnads- och tidseffektiv protokollet isolering av muskelfiber kärnor som kan vara sonicated omedelbart eller fryst vid-80 ° C för bakomliggande användning. Användning av kromatin som utarbetats av detta protokoll har gett den första genome wide ChIP-seq datafrån från muskelfiber7 och kommer att underlätta framtida studier på genreglering i denna vävnad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen.
Acknowledgments
Vi tackar all personal IGBMC hög genomströmning sekvensering anläggningen, medlem av ”Frankrike Génomique” konsortiet (ANR10-INBS-09-08) och alla IGBMC allmänna tjänster särskilt Personalen på IGBMC djuranläggningen. Detta arbete stöds av bidrag från CNRS, INSERM, AFM, det Ligue Nationale contre le Cancer, fransmännen statliga fonden genom ANR under programmet Investissements pris märkt ANR-10-IDEX-0002-02, den Labex INRT ANR-10-IDEX-0001-02 och den ANR-AR2GR-16-CE11-009-01. Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut om att offentliggöra eller beredning av manuskriptet. S.J. stöddes av det Ligue Nationale contre le Cancer och ANR-AR2GR-16-CE11-009-01 och V.U av Ministère de l'Enseignement et de la Recherche. ID är en 'équipe labellisée' för Ligue Nationale contre le Cancer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| T 25 digital ULTRA-TURRAX | T 18 ULTRA-TURRAX | 0009022800 | |
| PMSF | SIGMA-ALDRICH CHIMIE SARL | P7626-25G | |
| Protease Inhibitor Cocktail-EDTA Free | Roche Diagnostics | 11873580001 | |
| Protein G Sepharose beads | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | P-3296 | |
| Proteinase K | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | P-2308 | |
| Cell Strainers 70um | Corning BV | 431751 | |
| Cell Strainers 40um | Corning BV | 352340 | |
| Formaldehyde EM grade | Euromedex | 15710-S | |
| Rnase A | Fischer Scientific | 12091039 | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1 | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | P3803 | |
| BSA | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | B4287-25G | |
| yeast tRNA | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | R5636 | |
| Glycogen Blue | AMIBION | AM9516 | |
| Pol II ChIP Antibody | Santa Cruz | SC-9001 | |
| H3K27ac ChIP Antibody | Active Motif | 39133 | |
| Tead4 ChIP Antibody | Aviva Systems Biology | (ARP38276_P050) | |
| IGEPAL | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | I-3021 | |
| E220 Focused Ultrasonicator | Covaris E220 | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Additional items | |||
| Scissors | |||
| Loose Dounce | |||
| 15 ml and 50 ml falcon tubes | |||
| 14 ml round bottom tubes | |||
| 1.5 ml and 2 ml Eppendorf tubes | |||
| 70 μm and 40 μm cell strainers (Corning) |
References
- Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions. Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).
- Furey, T. S. ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions. Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).
- Wade, J. T. Mapping Transcription Regulatory Networks with ChIP-seq and RNA-seq. Adv Exp Med Biol. 883, 119-134 (2015).
- Alpern, D., et al. TAF4, a subunit of transcription factor II D, directs promoter occupancy of nuclear receptor HNF4A during post-natal hepatocyte differentiation. Elife. 3, e03613 (2014).
- Martianov, I., et al. Cell-specific occupancy of an extended repertoire of CREM and CREB binding loci in male germ cells. BMC Genomics. 11, 530 (2010).
- Achour, M., et al. Neuronal identity genes regulated by super-enhancers are preferentially down-regulated in the striatum of Huntington's disease mice. Hum Mol Genet. 24 (12), 3481-3496 (2015).
- Joshi, S., et al. TEAD transcription factors are required for normal primary myoblast differentiation in vitro and muscle regeneration in vivo. PLoS Genet. 13 (2), e1006600 (2017).
- Ohkawa, Y., Mallappa, C., Dacwag-Vallaster, C. S., Imbalzano, A. N. Myogenesis: Methods and protocols. DiMario, J. 798, Springer Science+Business Media LLC. 517-531 (2012).
- Dimauro, I., Pearson, T., Caporossi, D., Jackson, M. J. A simple protocol for the subcellular fractionation of skeletal muscle cells and tissue. BMC Res Notes. 5, 513 (2012).
- Thomas, J. L., et al. PAK1 and CtBP1 Regulate the Coupling of Neuronal Activity to Muscle Chromatin and Gene Expression. Mol Cell Biol. 35 (24), 4110-4120 (2015).
- Kuo, T., et al. Genome-wide analysis of glucocorticoid receptor-binding sites in myotubes identifies gene networks modulating insulin signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (28), 11160-11165 (2012).
- Whyte, W. A., et al. Master transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes. Cell. 153 (2), 307-319 (2013).
- Benhaddou, A., Keime, C., Ye, T., Morlon, A., Michel, I., Jost, B., Mengus, G., Davidson, I. Transcription factor TEAD4 regulates expression of myogenin and the unfolded protein response genes during C2C12 cell differentiation. Cell Death and Differentiation. 19 (2), 220-231 (2011).
- Cowling, B. S., et al. Reducing dynamin 2 expression rescues X-linked centronuclear myopathy. J Clin Invest. 124 (3), 1350-1363 (2014).
- Thermo Fisher Scientific. ChIP Analysis. , Available from: https://www.thermofisher.com/fr/fr/home/life-science/epigenetics-noncoding-rna-research/chromatin-remodeling/chromatin-immunoprecipitation-chip/chip-analysis.html (2017).
