Summary
Een nieuw protocol voor de voorbereiding van de chromatine van volwassen muis skeletspieren aangepast aan de studie van genregulatie in spiervezels door chromatine immunoprecipitation wordt gepresenteerd.
Abstract
Beschrijven we een efficiënte en reproduceerbare protocol voor de voorbereiding van de chromatine van volwassen muis skeletspieren, een fysiek resistente weefsel met een hoog gehalte aan structurele proteïnen. Ontleed ledemaat spieren van volwassen muizen zijn fysiek verstoord door mechanische homogenisering, of een combinatie van hakken en douncing, in een hypotone buffer voordat formaldehyde fixatie van de cel lysate. De vaste kernen zijn gezuiverd door verdere cycli van mechanische homogenisering of douncing en opeenvolgende filteringen cel puin te verwijderen. De gezuiverde kernen kunnen onmiddellijk of in een later stadium worden sonicated na invriezen. De chromatine efficiënt kan worden sonicated en is geschikt voor chromatine immunoprecipitation experimenten, zoals wordt geïllustreerd door de profielen verkregen voor transcriptiefactoren, RNA polymerase II en covalente histone modificaties. De gebeurtenissen van de bindende gedetecteerd met behulp van chromatine bereid door dit protocol zijn overwegend die plaatsvindt in de kernen van de spiervezel ondanks de aanwezigheid van de chromatine van andere vezel-geassocieerde satelliet en endotheliale cellen. Dit protocol is daarom aangepast aan het bestuderen van genregulatie in de skeletspieren volwassen muis.
Introduction
Immunoprecipitation (ChIP) van de chromatine gekoppeld aan kwantitatieve polymerase-kettingreactie (qPCR) en hoge doorvoer sequencing (ChIP-seq) zijn geworden de keuze om te studeren transcriptie en Epigenetische regulatie van de genexpressie in verschillende weefsels en celtypes1. Deze techniek maakt het mogelijk genoom-brede profilering van covalente chromatine wijzigingen, histone variant bezetting en transcriptie factor bindende2,3.
Terwijl het uitvoeren van ChIP uit gekweekte cellen goed ingeburgerd is, blijft ChIP van zoogdieren weefsels uitdagend. Chromatine voorbereiden ChIP bestaat uit verschillende kritische stappen die moeten worden geoptimaliseerd voor elk type weefsel en cel. Chromatine kan bereid worden uit de cellulaire lysates van gekweekte cellen of volgende zuivering van hun kernen. In het geval van zoogdieren weefsels staan efficiënte lysis, formaldehyde fixatie en reiniging van kernen kritisch tegenover met het oog op een optimale terugwinning van de chromatine. Bovendien moet de keuze of u kunt het oplossen van de kernen, vóór of na hun zuivering experimenteel worden bepaald. Ondanks deze hindernissen, is ChIP met succes uitgevoerd van weefsels zoals de lever, testis of hersenen4,5,6. In het geval van skeletspieren vormt verstoring van dergelijke een fysiek resistente weefsel, dat een hoog gehalte aan structurele proteïnen, en isolatie van de kernen vertoont een bijzondere uitdaging. Gezien deze specificiteit, geven protocollen geoptimaliseerd voor andere weefsels geen bevredigende resultaten voor skeletspieren.
Hier beschrijven we een protocol om te isoleren van de ChIP-grade chromatine van muis skeletspieren weefsel, waarbij het weefsel, formaldehyde fixatie, waarna het isolement van de kernen en ultrasoonapparaat fysiek te verstoren. De efficiëntie van deze methode voor het bereiden van chromatine geschikt voor ChIP uit dit weefsel werd aangetoond door het uitvoeren van ChIP-qPCR en ChIP-seq voor verschillende transcriptiefactoren, RNA polymerase II en covalente histone modificaties7.
Deze nieuwe techniek is veel sneller dan een eerder gemelde protocol8 bestaande uit lange collagenase spijsvertering stappen in die periode, wijzigingen in genomic lokalisatie van transcriptiefactoren en wijzigingen in genexpressie kunnen plaatsvinden. De snelheid waarmee de kernen zijn geïsoleerd en vaste maakt de hier beschreven methode bijzonder aantrekkelijk voor het bereiden van chromatine waarmee de inheemse genomic bezetting staat meer getrouw worden vastgelegd. Bovendien, hoewel andere methoden voor het chromatine isolatie of eiwit extractie van spierweefsel zijn beschreven8,9,10 en gebruikt voor ChIP-qPCR experimenten op geselecteerde genen, geen ChIP-seq gegevens is gemeld met hen. De methode hier gemeld is geschikt voor transcriptie factor en Histon wijziging ChIP-seq, en moet daarom ook geschikt voor 3 / 4C of HiC chromatine conformatie opname toepassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Muizen werden gehouden overeenkomstig de institutionele richtsnoeren met betrekking tot de zorg en het gebruik van proefdieren en in overeenstemming met nationale Animal Care Guidelines (EuropeseCommissie richtlijn 86/609/EEG; Franse decreet no.87-848). Alle procedures door de Franse nationale ethische commissie waren goedgekeurd.
1. isolatie van spierweefsel
- offer één volwassen 6 tot 8 weken oude muis door cervicale dislocatie. Sterlise de ledemaat door het spoelen met 70% ethanol en ontleden de hind-limb spieren (Gastrocnemius, Tibialis anterieure, Quadriceps) met fijne punt schaar en pincet.
Opmerking: Één muis moet opleveren ongeveer 500 mg weefsel. - Mince de spieren in een reageerbuis van 2 mL met 1 mL ijskoud hypotone buffer tot een homogene bereiding van kleine (< 2-3 mm 3) stukken met behulp van fijn schaar en verlaat de buis schudden op een bankje top roerwerk bij 4 ° C gedurende 5-10 minuten
2. Lysis van de weefsel
Opmerking: Gelieve te verwijzen naar de tabel 1 voor alle buffer composities.
- De homogenaat overbrengen in een ronde-onderkant-buis van 14 mL en resuspendeer in 5 mL koude hypotone buffer (EDTA-vrije proteaseinhibitor cocktail en PMSF).
- Homogenise het gehakt spierweefsel met behulp van een losse dounce (20-30 lijnen binnen 3 min) of een weefsel van de mechanische homogenizer voor 15-30 s in buizen van de ronde onderkant 14 mL.
Opmerking: De efficiency van lysis van de in dit stadium kan worden geëvalueerd door de lichte microscopie, en indien nodig extra verstoring kan worden uitgevoerd.
- Homogenise het gehakt spierweefsel met behulp van een losse dounce (20-30 lijnen binnen 3 min) of een weefsel van de mechanische homogenizer voor 15-30 s in buizen van de ronde onderkant 14 mL.
- De homogenaat overbrengen in buizen van 15 mL en vul volume tot 10 mL met koude hypotone buffer. Monteren van het homogenaat zoals hieronder beschreven voordat u verdergaat met de volgende muis.
3. Fixatie
- formaldehyde toevoegen aan de eindconcentratie van 1% en schud gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Glycine toevoegen om een eindconcentratie van 0,125 M in elke buis te stoppen fixatie en schud gedurende 5-10 minuten bij kamertemperatuur.
4. Kernen voorbereiding
Opmerking: Gelieve te verwijzen naar de tabel 1 voor alle buffer composities.
- Homogenise de vaste lysate met behulp van een losse dounce (5-10 strokes).
- Overdracht aan een tube 15 mL en centrifugeer bij 1.000 x g gedurende 5 min bij 4 ° C voor kernen en cellulaire puin.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in vers 5 mL hypotone buffer. Filtreer de lysate door een 70 µm cel zeef in een tube van 50 mL. Opnieuw filteren het filtraat door een zeef van de cel 40 µm.
- Overbrengen in het filtraat een tube van 15 mL en centrifuge op 1.000 x g gedurende 5 minuten bij 4 ° C tot het verkrijgen van de nucleaire pellet.
Opmerking: In dit stadium de kernen kunnen onmiddellijk worden sonicated of uitlijnen als een droge pellet in vloeibare stikstof bevroren en opgeslagen bij -80 ° C.
5. Ultrasoonapparaat
- beoordelen van het volume van de nucleaire pellet (ongeveer 50 µL voor zowel mechanische als dounce homogenisering) en resuspendeer het in ultrasoonapparaat buffer tot 3 tot 4 keer van verpakte nucleaire volume en bewerk ultrasone trillingen ten voor 10-15 min bij 4 ° C met behulp van een ultrasoonapparaat .
Opmerking: De chromatine kan worden geanalyseerd onmiddellijk zoals beschreven onder (6) of bevroren en opgeslagen bij -80 ° C.
6. Beoordeling van de chromatine Fragment grootte na ultrasoonapparaat
Opmerking: Gelieve te verwijzen naar de tabel 1 voor alle buffer composities.
- De-dwarslijn, nemen 30 µL van de chromatine in een reageerbuis 1,5 mL en Voeg 20 µL 5 M NaCl. Vul het volume 500 µL en na een nacht bebroeden bij 65 ° C.
- De volgende dag, het uitvoeren van een behandeling met 1 µL proteïnase K (20 mg/mL stockoplossing), 10 µL 2 M Tris pH 6.8, en 10 µL van het EDTA 0.5 M gedurende 1 uur bij 42 ° C. uitvoeren een fenol-chloroform/chloroform extractie en neerslag van het DNA met 1 hoeveelheid natrium acetat e (3 M) en 2 volumes van 100% ethanol gedurende één uur bij-80 ° C, of 's nachts bij -20 ° C.
- Pellet het DNA door centrifugeren bij 13.500 x g gedurende 15 min. Decant het supernatant en de pellet grondig met koud 70% ethanol en Centrifugeer nogmaals gedurende 5 min. Decant het supernatant wassen en drogen de pellet.
- Resuspendeer de pellet in het oorspronkelijke volume (30 µL) van TE buffer. De concentratie van het DNA in een spectrofotometer meten door absorptie bij 260 nm/280 nm. Pipetteer van 500-1000 ng van DNA samen met een DNA grootte ladder op gescheiden doorgangen van een 1,5% agarose gel en het uitvoeren van elektroforese om te beoordelen van de grootte van het fragment van de chromatine.
Opmerking: Fragment grootte moeten tussen 200-500 basenparen, en moet er geen fragmenten van de detecteerbare ultrahoog moleculair gewicht overeenkomt om niet of slecht-gefragmenteerde DNA. Indien nodig, de chromatine-oplossing (stap 5) kan worden opnieuw voor een langere tijd sonicated en vervolgens opnieuw geanalyseerd zoals hierboven beschreven, totdat de optimale omvang wordt verkregen.
7. Chromatine Immunoprecipitation (ChIP)
Opmerking: Gelieve te verwijzen naar de tabel 1 voor alle buffer composities.
- Blok de G eiwit sepharose kralen van aliquoting 1 mL van de 50% drijfmest in ethanol. Pellet de kralen door centrifugeren bij 400 x g gedurende 1 minuut in een benchtop centrifugeren en wassen met 1 mL TE buffer centrifuge op 400 x g en herhaal de wash.
- Na de tweede centrifugeren, resuspendeer in 1 mL van ChIP verdunning buffer met 25 µL van BSA (voorraad 20 mg/mL) en 20 µL tRNA (voorraad 10 mg/mL gist). Blokkeren van de kralen voor ten minste 2 h vóór gebruik door rotatie (40-60 rpm) bij 4 ° C.
- Verdund 50 µg chromatine (stap 5) 8 tot 10 keer gebruik van ChIP verdunning buffer. Voeg 50 µL van geblokkeerde kraal drijfmest en incubeer gedurende 2 uur roteren (40-60 rpm) bij 4 ° C. Centrifuge bij 400 x g bij 4 ° C tot vooraf gewiste chromatine verkrijgen en over te brengen naar een verse buis.
- Voor immunoprecipitation, voeg de juiste hoeveelheid primair antilichaam (bijvoorbeeld, 1-2 µg per 10 µg chromatine) en na een nacht bebroeden met rotatie bij 4 ° C.
Opmerking: De optimale hoeveelheid antilichaam kan worden aanbevolen door de leverancier of empirisch kan worden bepaald door het uitvoeren van ChIP-qPCR met verschillende hoeveelheden van antilichaam tot optimale verrijking wordt waargenomen. Ook eiwit G sepharose mag worden vervangen door EiwitA sepharose afhankelijk van het subtype van antilichaam gebruikt. - De geblokkeerde kralen toevoegen de volgende dag en incubeer gedurende 1 h met rotatie (40-60 rpm) bij 4 ° C. Centrifuge bij 400 x g gedurende 20-30-s tot de kralen pellet, verwijder het supernatant en start de ChIP wast.
- ChIP wast: uitvoeren van de volgende wast met de buffers: met een laag zout Buffer, en vervolgens tweemaal met hoog zout Buffer, tweemaal met LiCl Buffer, en ten slotte tweemaal met de Buffer TE.
- Uitvoeren van elk wassen gedurende 10 minuten met rotatie (40-60 rpm) bij 4 ° C- and -pellet de parels tussen elke wassen door centrifugeren bij 400 x g gedurende 20-30 s in een bench-top centrifuge.
- Voor elutie, verwijderen de laatste wassen en resuspendeer de kralen in 250 µL elutie buffer (vers bereid) gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur tijdens het schudden.
- Centrifuge bij 400 x g en verzamel het eluaat in een verse buis. Uitvoeren van deze stap tweemaal en vervolgens de-dwarslijn het eluaat overnachting met 20 µL NaCl 5 M en 1 µL RNase A (10 mg/mL), behandelen met proteïnase K en fenol-chloroform/chloroform extrhandelen zoals in stap 6.
- Resuspendeer in 50 µL van TE buffer en gebruik aliquots voor ChIP-qPCR volgens standaard protocollen 15 om te controleren de kwaliteit van de ChIP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om te isoleren kernen, we uitgevoerd mechanische homogenisering van de ontleed en gehakt spierweefsel voor 15 of 45 s, van 18.000 en 22.000 toeren per minuut (Zie Tabel van materialen). In alle omstandigheden, kernen van het weefsel puin kunnen worden gescheiden, maar de opbrengst was optimaal gebruik van de lagere snelheid (figuur 1A-B). Kernen kunnen ook worden voorbereid door douncing 3-5 min (figuur 1Aen gegevens niet worden weergegeven), maar mechanische homogenisering is de methode van keuze, zoals optimale opbrengst van kernen kunnen worden bereikt in minder dan 15 s, waardoor een belangrijke tijdswinst vooral als meerdere monsters moeten worden verwerkt (figuur 1B). Met behulp van dit protocol, liefst 2,7 x 10 kunnen7 kernen van 500 mg van weefsel (equivalent aan van 1 muis weefsel) worden geïsoleerd voor het genereren van 100 µg van de chromatine.
Voor het optimaliseren van chromatine fragmentatie van de vaste kernen, sonicated we gedurende 5 tot 20 minuten. Onder de instellingen (Zie Tabel of Materials), een 10 min ultrasoonapparaat was optimaal voor het genereren van chromatine met een gemiddelde fragment grootte van 250 bp (Figuur 2). Deze stap moet worden geoptimaliseerd experimenteel rekening houdend met het soort ultrasoonapparaat gebruikt.
Om te beoordelen van de kwaliteit van de spier chromatine voorbereid door het protocol zoals hierboven beschreven, werden ChIP-qPCR en ChIP-seq experimenten uitgevoerd tegen transcriptiefactoren, een Histon wijziging of RNA polymerase II (Pol II). ChIP-qPCR tegen de glucocorticoide receptor (GR) in de aanwezigheid of afwezigheid van dexamethason (Dex) behandeling bleek sterke Dex-afhankelijke GR verrijking regelgevende elementen van de Redd1 en Murf1 genen waarvan bekend is dat Dex en GR geregeld in spiervezels11, terwijl geen signaal werd gezien op de testis promotor voor specifieke Prm1 , die is gebruikt als een negatieve controle (figuur 3A).
ChIP-qPCR tegen geacetyleerd lysine 27 van Histon H3 (H3K27ac), een covalente modificatie gevonden op de versterkers van de actieve en initiatiefnemers, toonde sterke verrijking op de promotor van de Desmin (Des) die actief is in de spiervezels, in vergelijking met een negatief intergenic controle regio (figuur 3B). H3K27ac ChIP-seq bleek een hoog niveau van dit merk in de Des -locus, typerend voor een 'super-enhancer' gereglementeerde weefsel identiteit gene12 (figuur 4A). Evenzo toonde Pol II ChIP-seq hoge niveaus van deze locus overzetten Pol II.
ChIP-qPCR voor transcriptiefactor Tead4, die een belangrijke rol in myogenic differentiatie13,7 speelt, bleek haar verrijking op eerder beschreven bandplaatsen op de Ccnd1 en de Ifrd1 genen ( Figuur 3 c). Bovenal verrijking werd verminderd met behulp van chromatine bereid uit muizen waar Tead4 was selectief geïnactiveerd in spiervezels (Tead4skm-/-)7 (Figuur 3 c). Analyses van ChIP-seq gegevens voor zowel Tead1 als Tead4 toonde hun binding aan een site in de promotor van het Kdm5a -gen met behulp van de chromatine van wild-type spier, overwegende dat het Tead4 signaal, maar niet dat van Tead1, H3K27ac of Pol II, was verloren met behulp van de chromatine van spieren van de Tead4skm-/- muizen (figuur 4B). Ook Tead1 en Tead4 binding aan een regelgevend element stroomafwaarts van het Adssl1 -gen is beschouwd met chromatine van wild-type spier, terwijl Tead4 bindende verdween selectief gebruik van chromatine van de Tead4skm-/- spier () Figuur 4C). Deze waarnemingen tonen aan dat het signaal van de Tead4 gezien in de ChIP-seq-gegevens bindend in de spiervezel vandaan.
Om te bepalen van de bijdrage van andere celtypes gekoppeld van de spiervezel tot de resultaten van de ChIP-seq, beoordeling van de H3K27ac en Pol II signalen op het Vcam1 -gen die actief is in de spiercellen van de satelliet- en Pecam1, een marker van endotheliale cellen van het bloedvat dat bevloeiing van de spieren. In vergelijking met het hoge niveau in de genen Des of Adssl1 , de niveaus van H3K27ac en Pol II zien op zowel de Vcam1 als de Pecam1 genen waren veel lagere (figuur 4A en figuur 4C). De grote verschillen in signaal voor spiervezel uitgedrukt genen in vergelijking met die uitgedrukt in omliggende weefsels aangegeven dat het signaal vanuit de chromatine opgesteld in overeenstemming met het protocol zoals hierboven beschreven in ChIP voornamelijk komt uit bindende gebeurtenissen in de spiervezel.
Figuur 1: zuivering van kernen van volwassen muis spier. (A) weefsel lysates verkregen door mechanische homogenisering (18.000 rpm, 45 s) en homogenisering van de dounce (30 lijnen/3 min) waren met trypan blauw gekleurd en onder een digitale Microscoop waargenomen beelden werden gemaakt op 20 X vergroting. Schaal bar = 100 µm. (B) aantal kernen verkregen 500 mg van weefsel (equivalent van 1 muis) na bereiding onder de aangegeven voorwaarden, 18.000 en 22.000 rpm voor 15 en 45 s of 3 min van douncing. Foutbalken vertegenwoordigen gemiddelde ± S.E.M. voor n = 3 muizen voor mechanische homogenisering en n = 3 muizen voor douncing. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: controle van de chromatine fragment grootte. Geïsoleerde kernen werden sonicated voor 5, 10, 15 of 20 min zoals aangegeven. Na de-crosslinking en reiniging evalueerden de DNA fragment grootte door agarose de Elektroforese van het gel in aanwezigheid van ethidiumbromide. M = DNA grootte markering. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: gebruik van chromatine voor ChIP-qPCR. (A) muizen werden onderworpen aan intraperitoneale injecties dexamethason (10 mg/kg) of voertuig en na 1,5 h, chromatine opgesteld van hind-limb spieren. De verrijking in ChIP op GR doelgenen Redd1 en Murf1, in vergelijking met de negatieve controle tijdje promotor (Prm1), is aangegeven als een % van de input neergeslagen. (B) ChIP was uitgevoerd voor H3K27ac en IgG antilichamen van de controle en bij de promotor Desmin geanalyseerd en vergeleken met een intergenic negatieve controle-regio. (C) Tead4-ChIP werd uitgevoerd op spier chromatine verkregen wild type en spier-specifieke Tead4 knock-out muizen (Tead4skm-/-) en geanalyseerd op Tead4 bandplaatsen in de Ccnd1 en Ifrd1 initiatiefnemers, in vergelijking met de controle intergenic regio. In alle experimenten, chromatine van 3 muizen werd gebundeld en foutbalken vertegenwoordigen gemiddelde ± S.E.M in een Student T-test voor drie technische replicatieonderzoeken. P-waarde < 0.001* *, < 0,0001 ***; NS, niet-significant. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: Genomic profielen van de spiervezel chromatine. (A) Screenshots van de terechty van California at Santa Cruz genome browser van de aangegeven loci ter illustratie van de veel hogere H3K27ac en Pol II niveaus op het Desmin-gen, sterk uitgedrukt in de spiervezel, in vergelijking met de genen van het Vcam1 en Pecam1 uitgedrukt in cellen van de satelliet en endotheliale cellen, respectievelijk. (B) UCSC screenshots van de aangegeven loci ter illustratie van de binding van Tead1 en Tead4, evenals H3K27ac en Pol II, in de chromatine van wild-type (WT) spier in vergelijking met die van Tead4skm-/- (MT) spier, waar selectieve verlies van Tead4 bindend is waargenomen. De gegevens van de ChIP-seq geïllustreerd is beschikbaar als GSE82193 in de GEO-database. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| De naam van de buffer | Samenstelling | ||
| Hypotone buffer | 10 mM HEPES-KOH (pH 7.3) | ||
| 10 mM KCl | |||
| 5 mM MgCl2 | |||
| 0,1% NP-40 | |||
| 0.1 mM PMSF (vers toegevoegd) | |||
| Protease Inhibitor cocktail (PIC) 1 x (vers toegevoegd) | |||
| Ultrasoonapparaat buffer | 1% SDS | ||
| 10 mM EDTA | |||
| 20 mM Tris-HCl pH 8 | |||
| 150 mM NaCl | |||
| 0,1% natrium Deoxycholate | |||
| 1% Triton X-100 | |||
| Vers toegevoegd 0.1 mM PMSF | |||
| PIC 1 x | |||
| ChIP verdunning buffer | 0,01% SDS | ||
| 1,1% Triton X-100 | |||
| 1.2 mM EDTA | |||
| 16.7 mM Tris HCl pH8 | |||
| 167 mM NaCl | |||
| Vers toegevoegd 0.1 mM PMSF | |||
| PIC 1 x | |||
| Laag zout buffer | 0,1% SDS | ||
| 1% Triton X-100 | |||
| 500 mM EDTA | |||
| 20 mM Tris HCl pH8 | |||
| 150 mM NaCl | |||
| Hoge zout buffer | 0,1% SDS | ||
| 1% Triton X-100 | |||
| 500 mM EDTA | |||
| 20 mM Tris HCl pH8 | |||
| 500 mM NaCl | |||
| LiCl Buffer | 250 mM LiCl | ||
| 1% NP-40 | |||
| 1 mM EDTA | |||
| 10 mM Tris HCl pH 8 | |||
| Elutie buffer | 1% SDS | ||
| 100 mM NaHCO3 | |||
| Tris-EDTA (TE) buffer | 50 mM Tris HCl pH 8 | ||
| 1 mM EDTA | |||
Tabel 1: Buffer composities.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier beschrijven we een nieuw protocol voor het voorbereiden van de chromatine van volwassen muis skeletspieren en Toon dat deze chromatine is geschikt voor ChIP experimenten die transcription factor binding en covalente histone modificaties in de spiervezel kernen detecteren. Dit protocol omvat verschillende kritische stappen. De eerste is de verstoring van de weefsels die kan worden uitgevoerd hetzij door dounce hetzij door mechanische schuintrekken. Mechanische schuintrekken sneller en meer reproduceerbaar is, en daarom is de methode van keuze. Niettemin, als er geen geschikt apparaat beschikbaar is, verstoring kan ook worden uitgevoerd door douncing, waar de beoordeling van de efficiency van lysis onder de Microscoop is aanbevolen voordat u verdergaat met de fixatie stap. Fixatie van geheel-weefsel lysates, in plaats van fixatie van geïsoleerde kernen, toegestaan meer reproduceerbare ultrasoonapparaat in kleinere volumes en voor korte perioden. Wij hebben ook besloten te fix de lysates na verstoring in plaats van het oplossen van het weefsel voor ontwrichting, zoals beschreven door Thomas et al. 10 vooraf tot vaststelling van het weefsel resulteerde in verminderde efficiëntie van homogenisering. Dit protocol op basis van mechanische schuintrekken is ook sneller dan andere voorgestelde oplossingen, zoals collagenase spijsvertering, waarbij langdurige incubatie van de ontleed weefsel bij 37 ° C8. Tijdens deze periode, kunnen wijzigingen in gen expressie en transcription factor binding optreden. Tot vaststelling van de kernen zo snel mogelijk is daarom essentieel dat getrouwer vangen de normale fysiologische toestand.
Een tweede cruciale stap is de zuivering van de kernen van de vaste lysate. Voor dit, sequentiële filteren van de vaste lysate oplossing, eerst door een zeef van de cel 70 µm te elimineren van het groter puin, en daarna door een zeef 40 µm cel te verwijderen het fijn puin, voorkomt verstopping van de zeven en maximaliseert de opbrengst van de kernen verkregen. Zodra gezuiverd door filtratie, kernen zijn sonicated en de grootte van het DNA-fragment bepaald na de-crosslinking. Een typische bereiding op basis van de twee achterste ledematen van één muis levert 100 µg van de chromatine. Bundeling van de lysates van maximaal 3 muizen kan het rendement verbeteren door vermindering van de verliezen tijdens de voorbereiding. Deze procedure is efficiënt, aangezien hierdoor het herstel van maximaal 75% van de genomic DNA als chromatine (gegevens niet worden weergegeven).
ChIP experimenten ter beoordeling van transcription factor binding en epigenetische aanpassingen aangetoond de geschiktheid van dit protocol voor het bestuderen van genregulatie in de spiervezel kernen. Sterke en robuuste ChIP-seq signalen voor Pol II en H3K27ac werden gegenereerd op basis van de chromatine, waardoor identificatie van spiervezel identiteit genen door hun kenmerkende H3K27ac en Pol II profielen7. De veel hogere niveaus van H3K27ac en Pol II op genen sterk uitgedrukt in vezel kernen, in vergelijking met genen uitgedrukt in satelliet of endotheliale cellen, toonde aan dat het signaal kwam voornamelijk uit de kernen van de vezel. Dit werd ook bevestigd door het verlies van signaal van de Tead4 ChIP met behulp van chromatine van muizen waar het was specifiek geïnactiveerd in de spiervezels. Echter, zwakker, maar duidelijk boven de achtergrond signalen voor satelliet cel markeringen zoals Vcam1, Pax7 (gegevens niet worden weergegeven) kunnen worden opgespoord tonen dat chromatine van deze cellen is ook aanwezig. Wij verwachten dat onze protocol moet geschikt zijn voor andere technieken die gebruikmaken van formaldehyde-vaste chromatine zoals 3 C/4 C en HiC chromatine conformatie vangst technieken. Gebruik van onze protocol voor het combineren van die chip-seq voor transcriptiefactoren en chromatine wijzigingen met chromatine conformatie capture mag in de toekomst een gedetailleerd begrip van gen regulerende mechanismen in de spiervezel en hoe deze kunnen worden geregeld van streek door fysiologische stimuli, zoals oefening, vasten, een hoog vet dieet, denervation, of in ziekte, met behulp van chromatine bereid uit genetisch gemodificeerde muizen ziektes zoals X-gebonden centronuclear myopathie14te reproduceren.
Kortom kunnen deze lage kosten en tijd-efficiënte protocol het isolement van de spiervezel kernen die kunnen worden onmiddellijk sonicated of bevroren bij-80 ° C voor ulterior gebruik. Gebruik van de chromatine bereid door dit protocol heeft de eerste genoom breed ChIP-seq gegevens van spiervezel7 en toekomstige studies over genregulatie in dit weefsel zal vergemakkelijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
Wij danken alle medewerkers van de IGBMC hoge doorvoer sequencing faciliteit, een lid van "Frankrijk Génomique" consortium (ANR10-INBS-09-08) en alle IGBMC algemene diensten met name het personeel van de IGBMC dier faciliteit. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de CNRS, de INSERM, de AFM, de Ligue Nationale contre le Cancer, de Franse vermelden Fonds door middel van de ANR onder het programma Investissements d'Avenir geëtiketteerd ANR-10-IDEX-0002-02, de Labex INRT ANR-10-IDEX-0001-02 en de ANR-AR2GR-16-CE11-009-01. De financiers had geen rol in de studie ontwerp, gegevensverzameling en analyse, besloten tot bekendmaking of voorbereiding van het manuscript. SJ werd gesteund door de Ligue Nationale contre le Cancer ANR-AR2GR-16-CE11-009-01 en de V.U door de Ministère de l'Enseignement et de la Recherche. ID is een 'équipe labellisée' van de Ligue Nationale contre le Cancer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| T 25 digital ULTRA-TURRAX | T 18 ULTRA-TURRAX | 0009022800 | |
| PMSF | SIGMA-ALDRICH CHIMIE SARL | P7626-25G | |
| Protease Inhibitor Cocktail-EDTA Free | Roche Diagnostics | 11873580001 | |
| Protein G Sepharose beads | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | P-3296 | |
| Proteinase K | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | P-2308 | |
| Cell Strainers 70um | Corning BV | 431751 | |
| Cell Strainers 40um | Corning BV | 352340 | |
| Formaldehyde EM grade | Euromedex | 15710-S | |
| Rnase A | Fischer Scientific | 12091039 | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1 | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | P3803 | |
| BSA | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | B4287-25G | |
| yeast tRNA | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | R5636 | |
| Glycogen Blue | AMIBION | AM9516 | |
| Pol II ChIP Antibody | Santa Cruz | SC-9001 | |
| H3K27ac ChIP Antibody | Active Motif | 39133 | |
| Tead4 ChIP Antibody | Aviva Systems Biology | (ARP38276_P050) | |
| IGEPAL | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | I-3021 | |
| E220 Focused Ultrasonicator | Covaris E220 | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Additional items | |||
| Scissors | |||
| Loose Dounce | |||
| 15 ml and 50 ml falcon tubes | |||
| 14 ml round bottom tubes | |||
| 1.5 ml and 2 ml Eppendorf tubes | |||
| 70 μm and 40 μm cell strainers (Corning) |
References
- Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions. Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).
- Furey, T. S. ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions. Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).
- Wade, J. T. Mapping Transcription Regulatory Networks with ChIP-seq and RNA-seq. Adv Exp Med Biol. 883, 119-134 (2015).
- Alpern, D., et al. TAF4, a subunit of transcription factor II D, directs promoter occupancy of nuclear receptor HNF4A during post-natal hepatocyte differentiation. Elife. 3, e03613 (2014).
- Martianov, I., et al. Cell-specific occupancy of an extended repertoire of CREM and CREB binding loci in male germ cells. BMC Genomics. 11, 530 (2010).
- Achour, M., et al. Neuronal identity genes regulated by super-enhancers are preferentially down-regulated in the striatum of Huntington's disease mice. Hum Mol Genet. 24 (12), 3481-3496 (2015).
- Joshi, S., et al. TEAD transcription factors are required for normal primary myoblast differentiation in vitro and muscle regeneration in vivo. PLoS Genet. 13 (2), e1006600 (2017).
- Ohkawa, Y., Mallappa, C., Dacwag-Vallaster, C. S., Imbalzano, A. N. Myogenesis: Methods and protocols. DiMario, J. 798, Springer Science+Business Media LLC. 517-531 (2012).
- Dimauro, I., Pearson, T., Caporossi, D., Jackson, M. J. A simple protocol for the subcellular fractionation of skeletal muscle cells and tissue. BMC Res Notes. 5, 513 (2012).
- Thomas, J. L., et al. PAK1 and CtBP1 Regulate the Coupling of Neuronal Activity to Muscle Chromatin and Gene Expression. Mol Cell Biol. 35 (24), 4110-4120 (2015).
- Kuo, T., et al. Genome-wide analysis of glucocorticoid receptor-binding sites in myotubes identifies gene networks modulating insulin signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (28), 11160-11165 (2012).
- Whyte, W. A., et al. Master transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes. Cell. 153 (2), 307-319 (2013).
- Benhaddou, A., Keime, C., Ye, T., Morlon, A., Michel, I., Jost, B., Mengus, G., Davidson, I. Transcription factor TEAD4 regulates expression of myogenin and the unfolded protein response genes during C2C12 cell differentiation. Cell Death and Differentiation. 19 (2), 220-231 (2011).
- Cowling, B. S., et al. Reducing dynamin 2 expression rescues X-linked centronuclear myopathy. J Clin Invest. 124 (3), 1350-1363 (2014).
- Thermo Fisher Scientific. ChIP Analysis. , Available from: https://www.thermofisher.com/fr/fr/home/life-science/epigenetics-noncoding-rna-research/chromatin-remodeling/chromatin-immunoprecipitation-chip/chip-analysis.html (2017).
