Summary
En roman protokol for forberedelse af kromatin fra voksne mus skeletmuskulatur tilpasset til studiet af RIBOREGULATION i muskelfibre af kromatin immunoprecipitation præsenteres.
Abstract
Vi beskriver en effektiv og reproducerbare protokol for forberedelse af kromatin fra voksne mus skeletmuskulatur, en fysisk resistente væv med et højt indhold af strukturelle proteiner. Dissekeret lemmer muskler fra voksne mus er fysisk forstyrret af mekaniske homogenisering, eller en kombination af hakning og douncing, i en hypotonic buffer inden formaldehyd fiksering af cellen lysate. De faste kerner er renset af yderligere cyklusser af mekaniske homogenisering eller douncing og sekventiel filtrations fjerne celle debris. De renset kerner kan sonicated umiddelbart eller på et senere tidspunkt efter frysning. Kromatin kan være effektivt sonicated og er velegnet til kromatin immunoprecipitation eksperimenter, som illustreret ved profilerne fremstillet for transkriptionsfaktorer, RNA polymerase II og kovalente Histon ændringer. De bindende begivenheder registreret bruger kromatin udarbejdet af denne protokol er overvejende dem finder sted i muskelfiber kerner trods tilstedeværelsen af kromatin fra andre fiber-forbindelse satellit og endotelceller. Denne protokol er derfor tilpasset til at studere RIBOREGULATION i voksen mus skeletmuskulatur.
Introduction
Kromatin immunoprecipitation (ChIP) koblet til kvantitative Polymerasekædereaktionen (qPCR) og høj overførselshastighed sekventering (ChIP-FF.) er blevet metoder til valg at studere transskription og epigenetisk regulering af genekspression i forskellige væv og celletyper1. Denne teknik gør det muligt for genome-wide profilering af kovalent kromatin ændringer, Histon variant belægning og transskription faktor bindende2,3.
Mens udfører ChIP fra dyrkede celler er veletablerede, forbliver ChIP fra mammale væv mere udfordrende. Forberede ChIP kromatin indebærer flere kritiske trin, der skal optimeres for hvert vævs- og type. Kromatin kan fremstilles af de cellulære lysates af dyrkede celler eller følgende rensning af deres kerner. Mammale væv er effektiv lysis, formaldehyd fiksering og rensning af kerner kritisk for at sikre optimal nyttiggørelse af kromatin. Desuden har valget om at fastsætte kerner, før eller efter deres rensning bestemmes eksperimentelt. Trods disse forhindringer, er ChIP blevet med held udført fra væv såsom lever, testiklerne eller hjernen4,5,6. I tilfælde af skeletmuskulatur er afbrydelse af sådan en fysisk resistente væv, som udviser et højt indhold af strukturelle proteiner, og isolering af dens kerner særligt udfordrende. Givet denne specificitet, giver protokoller optimeret til andre væv ikke tilfredsstillende resultater for skeletmuskulatur.
Her beskriver vi en protokol for at isolere ChIP-grade kromatin fra mus skeletmuskulatur væv, der involverer fysisk forstyrrer vævet, formaldehyd fiksering og derefter isolation af kerner og sonikering. Effektiviteten af denne metode til at forberede kromatin egnet til ChIP fra dette væv blev demonstreret ved at udføre ChIP-qPCR og ChIP-seq for forskellige transkriptionsfaktorer, RNA polymerase II og kovalente Histon ændringer7.
Denne nye teknik er meget hurtigere end en tidligere rapporteret protokol8 bestående af lang collagenase fordøjelsen trin i hvilket tidsrum, ændringer i genomisk lokalisering af transkriptionsfaktorer og ændringer i genekspression kan finde sted. Den hurtighed, hvormed kerner er isoleret og fast gør metoden beskrevet her særligt attraktivt at forberede kromatin, der mere trofast fanger indfødte genomisk belægning stat. Desuden, selv om andre metoder for kromatin isolation eller protein udvinding fra muskelvæv har har været beskrevet8,9,10 og anvendes til ChIP-qPCR forsøg på udvalgte gener, ingen ChIP-seq data er blevet rapporteret ved hjælp af dem. Metoden rapporteret her er velegnet til transskription faktor og Histon ændring ChIP-FF., og derfor bør være også egnet til 3 / 4C eller HiC kromatin kropsbygning capture programmer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
mus blev holdt i overensstemmelse med de institutionelle retningslinjer for pleje og brug af forsøgsdyr og National Animal Care retningslinjer (Europa-Kommissionens direktiv 86/609/EØF; Fransk dekret no.87-848). Alle procedurer blev godkendt af det franske nationale etiske udvalg.
1. isolation af muskelvæv
- offer en voksen 6 til 8 uger gamle mus af cervikal dislokation. Sterlise lemmer ved at skylle det med 70% ethanol og dissekere hind lemmer muskler (Gastrocnemius, Tibialis Anterior, Quadriceps) ved hjælp af fin spids saks og pincet.
Bemærk: En mus bør give omkring 500 mg væv. - Hakkekød muskler i et 2 mL prøveglas indeholdende 1 mL iskold hypotonic buffer til en homogen blanding af små (< 2-3 mm 3) stykker med fine saks og forlader røret ryster på en bænk top omrører ved 4 ° C i 5-10 min.
2. Væv Lysis
Bemærk: henvises til tabel 1 for alle buffer kompositioner.
- Overførsel af homogenatet til en 14 mL runde-nederste rør og resuspend i 5 mL koldt hypotonic buffer (EDTA-fri protease hæmmer cocktail og PMSF).
- Homogenise ved hjælp af en løs dounce (20-30 slag i 3 min) eller en mekanisk væv homogeniseringsapparat til 15-30 s i runde-bunden 14 mL rør hakket muskelvæv.
Bemærk: Lysis effektivitet kan vurderes på dette stadium ved lysmikroskopi, og om nødvendigt yderligere forstyrrelser kan udføres.
- Homogenise ved hjælp af en løs dounce (20-30 slag i 3 min) eller en mekanisk væv homogeniseringsapparat til 15-30 s i runde-bunden 14 mL rør hakket muskelvæv.
- Overførsel af homogenatet til 15 mL rør og fylde volumen til 10 mL ved hjælp af kolde hypotonic buffer. Løse homogenatet, som beskrevet nedenfor, før du fortsætter med næste musen.
3. Fiksering
- tilføje formaldehyd til 1% slutkoncentration og rystes i 10 min ved stuetemperatur.
- Tilføje glycin til en endelig koncentration på 0,125 M i hver tube at stoppe fiksering og ryste for 5-10 min ved stuetemperatur.
4. Kerner forberedelse
Bemærk: henvises til tabel 1 for alle buffer kompositioner.
- Homogenise de faste lysate ved hjælp af en løs dounce (5-10 slag).
- Overførsel til en 15 mL rør og centrifugeres ved 1.000 x g i 5 min. ved 4 ° C til indhente kerner og celleaffald.
- Fjern supernatanten og resuspenderes i frisk 5 mL hypotonic buffer. Filtrere de lysate gennem en 70 µm celle si i en 50 mL tube. Re filtrere filtratet gennem en 40 µm celle si.
- Overføre filtratet til en 15 mL rør og centrifugeres ved 1.000 x g i 5 minutter ved 4 ° C til indhente den nukleare pellet.
Bemærk: På dette stadium, kerner kan være straks sonicated eller snap frosset som en tør pellet i flydende nitrogen og opbevares ved-80 ° C.
5. Sonikering
- vurdere omfanget af den nukleare pellet (ca. 50 µL for både mekanisk og dounce ensretning) og resuspend det i sonikering buffer op til 3 til 4 gange af pakket nukleare volumen og Rens med ultralyd i 10-15 min. ved 4 ° C ved hjælp af en sonikator .
Bemærk: Kromatin kan analyseres straks som beskrevet nedenfor (6) eller frosne og opbevares ved-80 ° C.
6. Vurdering af kromatin Fragment størrelse efter ultralydbehandling
Bemærk: henvises til tabel 1 for alle buffer kompositioner.
- Til de-bitmapgenkendelse, tage 30 µL af kromatin i et 1,5 mL reagensglas og tilsæt 20 µL 5 M NaCl. Komplet volumen til 500 µL og inkuberes ved 65 ° C natten.
- Den næste dag, udføre en behandling med 1 µL proteinase K (20 mg/mL lager), 10 µL 2 M Tris pH 6,8 og 10 µL af 0,5 M EDTA i 1 time på 42 ° C. Udfør en phenol-chloroform/chloroform udvinding og udfældes DNA med 1 mængden af natrium acetat e (3 M) og 2 bind af 100% ethanol for én h ved-80 ° C eller natten over ved -20 ° C.
- Pellet DNA ved centrifugering ved 13.500 x g i 15 min. Decant supernatanten og vaske pellet grundigt med koldt 70% ethanol og centrifugeres igen i 5 min. Decant supernatanten og lufttørre toerstoffet.
- Resuspenderes i det oprindelige bind (30 µL) TE buffer. Mål koncentrationen af DNA i et spektrofotometer ved absorbans på 260 nm/280 nm. Tilsæt 500-1.000 ng af DNA med en DNA størrelse stige på separate baner af en 1,5%-agarosegel og udføre elektroforese for at vurdere størrelsen fragment af kromatin.
Bemærk: Fragment størrelse bør være mellem 200-500 basepar, og der bør være nogen påviselig høj molekylvægt fragmenter svarende til ikke - eller dårligt-fragmenteret DNA. Hvis det er påkrævet, kromatin løsning (trin 5) kan re sonicated i længere tid og derefter analyseres igen som beskrevet ovenfor indtil den optimale størrelse opnås.
7. Kromatin Immunoprecipitation (ChIP)
Bemærk: henvises til tabel 1 for alle buffer kompositioner.
- Blok Protein G sepharose perler af aliquoting 1 mL 50% gylle i ethanol. Pellet perler ved centrifugering ved 400 x g i 1 min i en benchtop centrifugeres og vask med 1 mL af TE buffer centrifuge på 400 x g og gentage Wash
- Efter den anden centrifugering, genopslæmmes i 1 mL af ChIP fortynding buffer med 25 µL af BSA (stock 20 mg/mL) og 20 µL gær tRNA (stock 10 mg/mL). Blokere perler til mindst 2 h før brug af rotation (40-60 rpm) ved 4 ° C.
- Fortyndes 50 µg af kromatin (trin 5) 8 til 10 gange ved hjælp af ChIP fortynding buffer. Tilsæt 50 µL af blokerede perle gylle og inkuberes i 2 h roterende (40-60 rpm) ved 4 ° C. Centrifuge på 400 x g ved 4 ° C til indhente pre-ryddet kromatin og overføre det til en frisk tube.
- For immunoprecipitation, tilføje den passende mængde af primære antistof (f.eks., 1-2 µg pr. 10 µg af kromatin) og der inkuberes natten over med rotation ved 4 ° C.
Bemærk: Den optimale mængde antistof kan være anbefalet af leverandøren eller empirisk kan bestemmes ved at udføre ChIP-qPCR med forskellige mængder af antistof indtil optimal berigelse er observeret. Også Protein G sepharose kan erstattes af Protein A sepharose afhængigt af undertypen af antistof bruges. - Tilføje blokerede perlerne næste dag og Inkuber i 1 time med rotation (40-60 rpm) ved 4 ° C. der centrifugeres ved 400 x g i 20-30 s til pellet perlerne, Fjern supernatanten, og start chippen vasker.
- ChIP vasker: Udfør de følgende vasker med buffere: en gang med lav Salt Buffer, og derefter to gange med høje Salt Buffer, to gange med LiCl Buffer, og endelig to gange med TE Buffer.
- Udføre hver vask i 10 min med rotation (40-60 rpm) ved 4 ° C og pellet perler mellem hver vask ved centrifugering ved 400 x g i 20-30 s i en Bordcentrifuge.
- Til eluering, fjerne den sidste vask og resuspend perler i 250 µL eluering buffer (frisklavet) i 15 min. ved stuetemperatur under omrystning.
- Centrifuge på 400 x g og indsamle eluatet i en frisk tube. Udføre dette trin to gange og derefter de-bitmapgenkendelse eluatet natten over med 20 µL NaCl 5 M og 1 µL RNase A (10 mg/mL), behandle med proteinase K, og phenol-chloroform/chloroform udsugningfungere som i trin 6.
- Resuspend i 50 µL af TE buffer og bruge delprøver for ChIP-qPCR pr standardprotokoller 15 til at kontrollere kvaliteten af chippen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at isolere kerner, udførte vi mekanisk homogenisering af dissekerede og hakket muskelvæv for enten 15 eller 45 s, på 18.000 og 22.000 rpm (Se Tabel af materialer). Under alle forhold, kerner kunne adskilles fra væv snavs, men udbyttet var optimal brug af den lavere hastighed (figur 1A-B). Kerner kunne også være forberedt af douncing på 3-5 min (figur 1A, og data ikke vist), men mekanisk homogenisering er metoden, som optimal udbytte af kerner kan opnås i så lidt som 15 s, giver en vigtig gevinst på tid, især hvis flere prøver, der skal behandles (figur 1B). Ved hjælp af denne protokol, op til 2,7 x 10 kan7 kerner fra 500 mg væv (svarende til 1 mus væv) isoleres til at generere 100 µg af kromatin.
For at optimere kromatin opsplitning fra faste kerner, sonicated vi for 5 til 20 min. Under indstillinger (Se Tabel af materialer), en 10 min sonikering var optimal til at generere kromatin med en gennemsnitlig fragment størrelse på 250 bp (figur 2). Dette skridt bør optimeres eksperimentelt under hensyntagen til typen af sonikator anvendes.
For at vurdere kvaliteten af muskel kromatin udarbejdet af den protokol, der er beskrevet ovenfor, blev ChIP-qPCR og ChIP-seq eksperimenter udført mod transkriptionsfaktorer, en Histon ændring eller RNA polymerase II (Pol II). ChIP-qPCR mod glukokortikoid receptor (GR) i tilstedeværelse eller fravær af dexamethason (Dex) behandling afslørede stærk Dex-afhængige GR berigelse på regulerende elementer af de Redd1 og Murf1 gener, der er kendt for at være Dex og GR reguleret i muskelfibre11, mens ingen signal blev set på testiklerne særlige Prm1 selskabet bruges som en negativ kontrol (figur 3A).
ChIP-qPCR mod acetyleret lysin 27 af Histon H3 (H3K27ac), en kovalent ændring fundet på aktive smagsforstærkere og promotorer, viste stærk berigelse på Desmin (Des) promotor, der er aktive i muskelfibre, i forhold til en negativ intergenic kontrol region (figur 3B). H3K27ac ChIP-seq afslørede et højt niveau af dette mærke i hele det Des locus, typisk af en "super-forstærker" regulerede væv identitet gen12 (figur 4A). Pol II ChIP-seq viste tilsvarende høje niveauer af overførsel Pol II i denne locus.
ChIP-qPCR for transskription faktor Tead4, som spiller en vigtig rolle i myogenic differentiering13,7, afslørede dets berigelse på tidligere beskrevet bindingssteder på Ccnd1 og Ifrd1 gener ( Figur 3 c). Vigtigere, berigelse blev reduceret ved hjælp af kromatin forberedt fra mus hvor Tead4 blev selektivt inaktiverede i muskelfibre (Tead4skm-/-)7 (figur 3 c). Analyser af ChIP-seq data for både Tead1 og Tead4 viste deres binding til et websted i promotor af Kdm5a -genet ved hjælp af kromatin fra vildtype muskel, der henviser til, at Tead4 signalet, men ikke for Tead1, H3K27ac eller Pol II, blev afbrudt ved hjælp af kromatin fra musklerne i Tead4skm-/- mus (figur 4B). Ligeledes, Tead1 og Tead4 binding til en regulerende element neden for Adssl1 -gen er set med kromatin fra vildtype muskel, mens Tead4 bindende var selektivt tabt, ved hjælp af kromatin fra Tead4skm-/- muskel () Figur 4 c). Disse observationer viser, at det Tead4 signal set i ChIP-seq data kom fra bindende i muskelfiber.
For at bestemme bidrag af andre celletyper, der er tilknyttet muskelfiber ChIP-seq resultater, vurderet vi H3K27ac og Pol II signaler på Vcam1 genet, der er aktive i muskelceller satellit og Pecam1, en markør for Endothelial celler af blodkar, overrisle musklerne. Sammenlignet med den høje set på Des eller Adssl1 generne, niveauer af H3K27ac og Pol II set på både Vcam1 og Pecam1 gener var meget lavere (figur 4A og figur 4 c). De store forskelle i signal for muskel fiber udtrykte gener i forhold til dem, der kommer til udtryk i omgivende væv angivet at signalet set i ChIP fra kromatin udarbejdet ved hjælp af protokollen beskrevet ovenfor kommer overvejende fra bindende arrangementer i den muskelfiber.
Figur 1: rensning af kerner fra voksne mus muskel. (A) væv lysates fremstillet ved mekaniske homogenisering (18.000 rpm, 45 s) og dounce homogenisering (30 slag/3 min.) var farves med trypan blå og observeret under en digital mikroskop og billeder blev taget til fange ved 20 X forstørrelse. Skalalinjen = 100 µm. (B) antallet af kerner udvundet 500 mg væv (svarende til 1 mus) efter forberedelse under de angivne betingelser, 18.000 og 22.000 omdr. / min. til 15 og 45 s eller 3 min af douncing. Fejllinjer udgør gennemsnit ± S.E.M. for n = 3 mus for mekaniske homogenisering og n = 3 mus for douncing. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: verifikation af kromatin fragment størrelse. Isolerede kerner var sonicated i 5, 10, 15 eller 20 min. som angivet. Efter de-crosslinking og rensning, blev DNA fragment størrelse vurderet ved agarosegelelektroforese gelelektroforese under tilstedeværelse af ethidiumbromid. M er DNA størrelse markør. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: brug af kromatin for ChIP-qPCR. (A) mus blev udsat for intra peritoneal injektioner af køretøjet eller dexamethason (10 mg/kg) og efter 1,5 time, kromatin blev udarbejdet fra hind lemmer muskler. Berigelse i ChIP på GR target gener Redd1 og Murf1, i forhold til negative kontrol protamine promotoren (Prm1), er angivet som % af input fældet. (B) ChIP blev udført for H3K27ac og IgG kontrol antistoffer og analyseret på Desmin promotor og i forhold til en intergenic negativ kontrol region. (C) Tead4 ChIP blev udført på muskel kromatin fremstillet af vildtype og muskel-specifik Tead4 knockout mus (Tead4skm-/-) og analyseret på Tead4 bindingssteder i Ccnd1 og Ifrd1 initiativtagerne, i forhold til den kontrol intergenic region. I alle eksperimenter, kromatin fra 3 mus blev samlet og fejllinjer repræsenterer gennemsnit ± S.E.M i en Students T-test for tre tekniske replikater. P-værdi < 0.001* *, < 0,0001 ***; NS, ikke-væsentlig. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: genomiske profiler af muskel fiber kromatin. (A) Screenshots fra University af California i Santa Cruz genom browser for de angivne loci illustrerer de meget højere H3K27ac og Pol II niveauer på Desmin gen, stærkt udtrykt i muskel fiber, i forhold til Vcam1 og Pecam1 gener udtrykt i satellit celler og Endothelial celler, henholdsvis. (B) UCSC screenshots af de angivne loci illustrerer binding af Tead1 og Tead4, samt H3K27ac og Pol II, i kromatin fra wild-type (WT) muskel sammenlignes fra Tead4skm-/- (MT) muskel, hvor selektiv tab af Tead4 bindende er observeret. ChIP-seq data illustreret er tilgængelig som GSE82193 i GEO-databasen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Buffer navn | Sammensætning | ||
| Hypotonic buffer | 10 mM HEPES-KOH (pH 7.3) | ||
| 10 mM KCl | |||
| 5 mM MgCl2 | |||
| 0,1% NP-40 | |||
| 0.1 mM PMSF (frisk tilføjet) | |||
| Protease hæmmer cocktail (PIC) 1 x (frisk tilføjet) | |||
| Sonikering buffer | 1% SDS | ||
| 10 mM EDTA | |||
| 20 mM Tris-HCl pH 8 | |||
| 150 mM NaCl | |||
| 0,1% natrium Deoxycholate | |||
| 1% Triton X-100 | |||
| Frisk tilføjet 0,1 mM PMSF | |||
| PIC 1 x | |||
| ChIP fortynding buffer | 0,01% SDS | ||
| 1.1% Triton X-100 | |||
| 1,2 mM EDTA | |||
| 16,7 mM Tris HCl pH8 | |||
| 167 mM NaCl | |||
| Frisk tilføjet 0,1 mM PMSF | |||
| PIC 1 x | |||
| Lav Salt buffer | 0,1% SDS | ||
| 1% Triton X-100 | |||
| 500 mM EDTA | |||
| 20 mM Tris HCl pH8 | |||
| 150 mM NaCl | |||
| Høje Salt buffer | 0,1% SDS | ||
| 1% Triton X-100 | |||
| 500 mM EDTA | |||
| 20 mM Tris HCl pH8 | |||
| 500 mM NaCl | |||
| LiCl Buffer | 250 mM LiCl | ||
| 1% NP-40 | |||
| 1 mM EDTA | |||
| 10 mM Tris HCl pH 8 | |||
| Eluering buffer | 1% SDS | ||
| 100 mM NaHCO3 | |||
| Tris-EDTA (TE) buffer | 50 mM Tris HCl pH 8 | ||
| 1 mM EDTA | |||
Tabel 1: Buffer kompositioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskriver vi en roman protokol for at forberede kromatin fra voksne mus skeletmuskulatur og vise, at denne kromatin er egnet til ChIP eksperimenter, der registrerer transskription faktor bindende og kovalente Histon ændringer i muskelfiber kerner. Denne protokol omfatter flere kritiske trin. Først er væv forstyrrelser, der kan udføres enten ved dounce eller ved mekanisk klipning. Mekanisk klipning er hurtigere og mere reproducerbare, og derfor er den foretrukne metode. Ikke desto mindre, hvis ingen passende apparater er tilgængelige, forstyrrelser kan også udføres ved douncing, hvor vurderingen af effektiviteten af lysis under mikroskop anbefales før du fortsætter til trinnet fiksering. Fiksering af hele-væv lysates i stedet for fiksering af isolerede kerner, tilladt mere reproducerbare sonikering i mindre mængder og for korte varigheder. Vi valgte også at lave lysates efter afbrydelse i stedet for at lave væv før afbrydelse, som beskrevet af Thomas et al. 10 pre fastsættelse vævet resulterede i nedsat effektivitet af ensretning. Denne protokol baseret på mekanisk klipning er også hurtigere end andre foreslåede løsninger, såsom collagenase fordøjelse, som indebærer, at længere tids inkubation af dissekerede væv ved 37 ° C8. I denne periode, kan der forekomme ændringer i gen expression og transskription faktor bindende. Fastsættelse af kerner så hurtigt som muligt er derfor afgørende at mere trofast fange den normale fysiologiske tilstand.
Et andet kritisk trin er rensning af kerner fra de faste lysate. For dette, sekventiel filtrering af de faste lysate løsning, først gennem en 70 µm celle si at fjerne større resterne og derefter gennem en 40 µm celle si til at fjerne den fine snavs, undgår tilstopning af sier og maksimerer udbyttet af kerner opnået. Når renset ved filtrering, kerner er sonicated og DNA fragment størrelse bestemmes efter de-crosslinking. En typisk forberedelse fra de to hind lemmer af en mus udbytter 100 µg af kromatin. Samle lysates fra op til 3 mus kan forbedre udbyttet ved at reducere tab under forberedelse. Denne procedure er effektiv, da det giver mulighed for genoprettelse af op til 75% af genomisk DNA som kromatin (data ikke vist).
ChIP eksperimenter designet til at vurdere transskription faktor bindende og epigenetiske ændringer demonstreret egnetheden af denne protokol for at studere RIBOREGULATION i muskelfiber kerner. Stærk og robust ChIP-seq signaler for Pol II og H3K27ac blev genereret fra kromatin, tillader identifikation af muskel fiber identitet gener af deres karakteristiske H3K27ac og Pol II profiler7. De meget højere niveauer af H3K27ac og Pol II på gener kraftigt udtrykt i fiber kerner, i forhold til gener udtrykt i satellit eller endotelceller, viste, at signalet kom overvejende fra fiber kerner. Dette blev også bekræftet af tabet af Tead4 ChIP signal ved hjælp af kromatin fra mus hvor det var specielt inaktiveret i muskelfibre. Imidlertid svagere, men klart over baggrunden signaler, for satellit celle markører som Vcam1, Pax7 (data ikke vist) kan påvises viser at kromatin fra disse celler er også til stede. Vi forventer, at vores protokol bør være egnet til andre teknikker, der bruger formaldehyd-fast kromatin som 3 C/4 C og HiC kromatin kropsbygning capture teknikker. Brug af vores protokol til at samle ChIP-seq for transskriptionsfaktorer og kromatin ændringer med kromatin kropsbygning fange bør i fremtiden tillade en detaljeret forståelse af genet reguleringsmekanismer i muskel fiber og hvordan disse kan reguleres forstyrret af fysiologiske stimuli, såsom motion, fastende, en høj fedt diæt, denervering, eller i sygdom, ved hjælp af kromatin fremstillet af genetisk modificeret mus gengive sygdomme som X-linked centronuclear myopathy14.
I Resumé tillader denne lave omkostninger og tid-effektive protokol isolering af muskel fiber kerner, der kan sonicated straks eller frosset ved-80 ° C for bagtanker brug. Brug af kromatin udarbejdet af denne protokol har givet de første genom brede ChIP-seq data fra muskel fiber7 og vil lette fremtidige undersøgelser på RIBOREGULATION i dette væv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi takke alle ansatte i IGBMC høj overførselshastighed sekventering facilitet, medlem af "France Génomique" consortium (ANR10-INBS-09-08) og alle IGBMC generelle tjenesteydelser især personalet i IGBMC animalske facilitet. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra CNRS, INSERM, AFM, Ligue Nationale contre le Cancer, franske stat fonden gennem ANR under programmet Investissements d'Avenir mærket ANR-10-IDEX-0002-02, Labex INRT ANR-10-IDEX-0001-02 og den ANR-AR2GR-16-CE11-009-01. Finansieringskilderne spillede ingen rolle i undersøgelse design, dataindsamling og analyse, beslutningen om at offentliggøre eller forberedelse af manuskriptet. SJ blev støttet af Ligue Nationale contre le Cancer og ANR-AR2GR-16-CE11-009-01 og V.U af Ministère de l'Enseignement et de la Recherche. ID er en 'équipe labellisée' af Ligue Nationale contre le Cancer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| T 25 digital ULTRA-TURRAX | T 18 ULTRA-TURRAX | 0009022800 | |
| PMSF | SIGMA-ALDRICH CHIMIE SARL | P7626-25G | |
| Protease Inhibitor Cocktail-EDTA Free | Roche Diagnostics | 11873580001 | |
| Protein G Sepharose beads | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | P-3296 | |
| Proteinase K | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | P-2308 | |
| Cell Strainers 70um | Corning BV | 431751 | |
| Cell Strainers 40um | Corning BV | 352340 | |
| Formaldehyde EM grade | Euromedex | 15710-S | |
| Rnase A | Fischer Scientific | 12091039 | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1 | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | P3803 | |
| BSA | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | B4287-25G | |
| yeast tRNA | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | R5636 | |
| Glycogen Blue | AMIBION | AM9516 | |
| Pol II ChIP Antibody | Santa Cruz | SC-9001 | |
| H3K27ac ChIP Antibody | Active Motif | 39133 | |
| Tead4 ChIP Antibody | Aviva Systems Biology | (ARP38276_P050) | |
| IGEPAL | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | I-3021 | |
| E220 Focused Ultrasonicator | Covaris E220 | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Additional items | |||
| Scissors | |||
| Loose Dounce | |||
| 15 ml and 50 ml falcon tubes | |||
| 14 ml round bottom tubes | |||
| 1.5 ml and 2 ml Eppendorf tubes | |||
| 70 μm and 40 μm cell strainers (Corning) |
References
- Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions. Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).
- Furey, T. S. ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions. Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).
- Wade, J. T. Mapping Transcription Regulatory Networks with ChIP-seq and RNA-seq. Adv Exp Med Biol. 883, 119-134 (2015).
- Alpern, D., et al. TAF4, a subunit of transcription factor II D, directs promoter occupancy of nuclear receptor HNF4A during post-natal hepatocyte differentiation. Elife. 3, e03613 (2014).
- Martianov, I., et al. Cell-specific occupancy of an extended repertoire of CREM and CREB binding loci in male germ cells. BMC Genomics. 11, 530 (2010).
- Achour, M., et al. Neuronal identity genes regulated by super-enhancers are preferentially down-regulated in the striatum of Huntington's disease mice. Hum Mol Genet. 24 (12), 3481-3496 (2015).
- Joshi, S., et al. TEAD transcription factors are required for normal primary myoblast differentiation in vitro and muscle regeneration in vivo. PLoS Genet. 13 (2), e1006600 (2017).
- Ohkawa, Y., Mallappa, C., Dacwag-Vallaster, C. S., Imbalzano, A. N. Myogenesis: Methods and protocols. DiMario, J. 798, Springer Science+Business Media LLC. 517-531 (2012).
- Dimauro, I., Pearson, T., Caporossi, D., Jackson, M. J. A simple protocol for the subcellular fractionation of skeletal muscle cells and tissue. BMC Res Notes. 5, 513 (2012).
- Thomas, J. L., et al. PAK1 and CtBP1 Regulate the Coupling of Neuronal Activity to Muscle Chromatin and Gene Expression. Mol Cell Biol. 35 (24), 4110-4120 (2015).
- Kuo, T., et al. Genome-wide analysis of glucocorticoid receptor-binding sites in myotubes identifies gene networks modulating insulin signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (28), 11160-11165 (2012).
- Whyte, W. A., et al. Master transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes. Cell. 153 (2), 307-319 (2013).
- Benhaddou, A., Keime, C., Ye, T., Morlon, A., Michel, I., Jost, B., Mengus, G., Davidson, I. Transcription factor TEAD4 regulates expression of myogenin and the unfolded protein response genes during C2C12 cell differentiation. Cell Death and Differentiation. 19 (2), 220-231 (2011).
- Cowling, B. S., et al. Reducing dynamin 2 expression rescues X-linked centronuclear myopathy. J Clin Invest. 124 (3), 1350-1363 (2014).
- Thermo Fisher Scientific. ChIP Analysis. , Available from: https://www.thermofisher.com/fr/fr/home/life-science/epigenetics-noncoding-rna-research/chromatin-remodeling/chromatin-immunoprecipitation-chip/chip-analysis.html (2017).
