Summary
פרוטוקול חדש עבור הכנת כרומטין של שרירי השלד העכבר למבוגרים הותאם במחקר של הכונה של סיבי השריר על ידי כרומטין immunoprecipitation מוצג.
Abstract
אנו מתארים פרוטוקול לשחזור ויעיל עבור הכנת כרומטין של שריר השלד העכבר למבוגרים, טישו פיזית עמיד עם תכולה גבוהה של חלבונים מבניים. שרירי הגפיים ביתור של עכברים בוגרים הן משובשות פיזית על ידי מכני homogenisation, או שילוב של הא ו douncing, במאגר היפוטוניק לפני פורמלדהיד קיבוע של התא lysate. גרעינים קבוע כבר טהור לפי מחזורים נוספים homogenisation מכני, סינון רציפים כדי להסיר שאריות תאים או douncing. גרעינים מטוהרים יכול להיות sonicated באופן מיידי או בשלב מאוחר יותר לאחר הקפאה. יכול להיות sonicated ביעילות כרומטין, הוא השיג מתאימה לניסויים immunoprecipitation כרומטין, כפי שהודגמה בעזרת הפרופילים עבור גורמי שעתוק RNA פולימראז II, שינוי היסטון קוולנטיות. האירועים איגוד זוהה באמצעות כרומטין שהוכנו על ידי פרוטוקול זה הם בעיקר אלה מתרחשים גרעינים סיבי השריר למרות נוכחותם של כרומטין של הלווין האחר הקשורים סיבים ותאי אנדותל. פרוטוקול זה לכן מותאם ללמוד הכונה בשריר השלד העכבר למבוגרים.
Introduction
Immunoprecipitation כרומטין (ChIP) מצמידים תגובת שרשרת של פולימראז כמותית (qPCR), רצף תפוקה גבוהה (צ'יפ-seq) הפכו את השיטות של הבחירה ללמוד שעתוק ו epigenetic בקרת גנים ברקמות שונות סוגי תאים1. טכניקה זו מאפשרת הגנום כולו פרופיל של שינויים כרומטין קוולנטיות, תפוסת variant היסטון שעתוק מקדם האיגוד2,3.
בזמן ביצוע שבב של תאים בתרבית וותיקה, השבב של רקמות יונקים נשאר יותר מאתגר. הכנת כרומטין שבב כרוך במספר שלבים קריטיים צריך להיות מותאם לכל סוג הרקמה והתא. כרומטין ניתן להכין את lysates הסלולר של תאים בתרבית או טיהור הבאים בגרעין. במקרה של רקמות יונקים, פירוק יעיל קיבוע פורמלדהיד, טיהור של גרעינים הם קריטיים כדי להבטיח התאוששות אופטימלי של כרומטין. יתר על כן, לבחור לתקן הגרעינים לפני או אחרי טיהור שלהם צריך להיקבע השפעול. למרות משוכות אלה, שבב בוצעה בהצלחה רקמות כמו הכבד, testis, או המוח4,5,6. במקרה של שריר השלד, שיבוש כזה עמיד פיזית טישו, אשר מוצגים תכולה גבוהה של חלבונים מבניים, ובידוד של הגרעינים שלה הוא מאתגר במיוחד. בהתחשב סגוליות זה, פרוטוקולים ממוטב בשביל לרקמות אחרות לא נותנים תוצאות משביעות רצון לשרירי השלד.
כאן נתאר פרוטוקול לבודד את השבב-כיתה כרומטין של רקמת שריר השלד העכבר המערבת פיזית לשבש את הרקמה, קיבוע פורמלדהיד, ולאחר מכן הבידוד של גרעינים, sonication. היעילות של שיטה זו להכין כרומטין מתאים שבב מרקמות זה הודגם על-ידי ביצוע שבב-qPCR וצ'יפ-seq עבור שונים גורמי שעתוק RNA פולימראז II, שינוי היסטון קוולנטיות7.
טכניקה חדשה זו הרבה יותר מהר מאשר פרוטוקול שדווחה בעבר8 הכוללת זמן collagenase עיכול צעדים אשר במהלכו, שינויים לוקליזציה גנומית של גורמי שעתוק, שינויים בביטוי הגנים יכול להתרחש. מהירות שבה הם הגרעינים מבודד ו קבוע הופך את השיטה המתוארת כאן אטרקטיביים במיוחד להכין כרומטין הלוכד יותר בנאמנות את המדינה יליד תפוסת גנומית. יתר על כן, למרות שיש שיטות נוספות כרומטין בידוד חלבון או חילוץ של רקמת שריר יש כבר מתואר8,9,10 ומשמש לניסויים שבב-qPCR את הגנים הנבחר, אין שבב-seq נתונים דווחה השימוש בהם. שיטת דיווח כאן מתאים שעתוק מקדם, היסטון השינוי שבב-seq, ולכן צריכה להיות גם מתאים 3 / 4C או היק כרומטין קונפורמציה ללכוד יישומים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
עכברים הוחזקו בהתאם להנחיות מוסדיים לגבי טיפול ו שימוש של חיות מעבדה ועל פי הנחיות טיפול החיה הלאומית (הנציבות האירופית הוראת 86/609/CEE; צרפתית פוסק no.87-848). כל ההליכים אושרו על ידי ועדת האתיקה הארצית צרפתי.
1. בידוד של רקמת שריר
- הקרבה 6 מבוגר אחד בן שבוע 8 העכבר על ידי נקע בצוואר הרחם. Sterlise האיבר על ידי שטיפה זה עם 70% אתנול ומנתחים את שרירי הגפיים האחוריות (הסובך, Anterior השוקה, הארבע ראשי) באמצעות מלקחיים ומספריים הצבע בסדר.
הערה: עכבר אחד אמור להניב בסביבות 500 מ ג של רקמת. - מינצ השרירים במבחנה 2 מ"ל המכיל 1 מ"ל של מאגר היפוטוניק קר כקרח כדי הכנה הומוגנית של קטן (< 2-3 מ מ 3) חתיכות באמצעות בסדר מספריים ולהשאיר את הצינור רועדת על מסית העליון הספסל ב 4 מעלות צלזיוס במשך 5-10 דקות
2. פירוק רקמת
הערה: נא עיין טבלה 1 עבור כל מאגר יצירות.
- להעביר את homogenate צינור עגול-התחתון 14 מ"ל, resuspend מ ל מאגר היפוטוניק קר (ללא EDTA פרוטאז מעכב קוקטיילים ו- PMSF).
- Homogenise רקמת השריר טחון באמצעות של דאונס רופף (20-30 קווים בתוך 3 דקות) או מהמגן רקמה מכנית של 15-30 s ב- mL 14 סיבוב המדרגה צינורות.
הערה: היעילות של פירוק יכול להידרש בשלב זה על ידי מיקרוסקופ אור, אם נדרש, ניתן לבצע שיבושים נוספים-
- Homogenise רקמת השריר טחון באמצעות של דאונס רופף (20-30 קווים בתוך 3 דקות) או מהמגן רקמה מכנית של 15-30 s ב- mL 14 סיבוב המדרגה צינורות.
- להעביר את homogenate 15 mL צינורות ומלא עוצמה 10 מ ל באמצעות מאגר היפוטוניק קר. לתקן את homogenate, כפי שמתואר להלן לפני שתמשיך עם העכבר הבאה.
3. קיבוע
- להוסיף פורמלדהיד הריכוז הסופי של 1%, לנענע 10 דקות בטמפרטורת החדר.
- להוסיף גליצין ריכוז סופי של 0.125 מ' כל צינור כדי לעצור את קיבוע ו- shake למשך 5-10 דקות בטמפרטורת החדר.
4. הכנה גרעינים
הערה: נא עיין טבלה 1 עבור כל מאגר יצירות.
- Homogenise קבוע lysate באמצעות של דאונס רופף (5-10 משיכות).
- העברת צינור 15 מ"ל ו צנטריפוגה ב 1,000 x g למשך 5 דקות ב 4 ° C כדי להשיג גרעינים ופסולת הסלולר.
- להסיר את תגובת שיקוע, resuspend בגדר במאגר היפוטוניק מ ל טריים. לסנן את lysate דרך מסננת תא מיקרומטר 70 לתוך צינור 50 מ. מחדש לסנן את פילטרט של דרך מסננת תא 40 µm.
- להעביר את פילטרט של שפופרת 15 מ"ל ו צנטריפוגה ב 1,000 x g למשך 5 דקות ב 4 ° C כדי להשיג בגדר גרעינית.
הערה: בשלב זה, הגרעינים יכול להיות sonicated מיד או תצמיד קפוא כמו גלולה יבש חנקן נוזלי ומאוחסנים ב-80 מעלות צלזיוס
5. Sonication
- להעריך את עוצמת הקול של בגדר גרעינית (בסביבות 50 µL עבור homogenisation מכני וגם דאונס) resuspend זה במאגר sonication עד 3-4 פעמים נפח הגרעין ארוזה ואת sonicate למשך 10-15 דקות ב 4 ° C באמצעות sonicator .
הערה: כרומטין יכול להיות מנותח מיד כמפורט להלן (6) או קפוא ומאוחסנים ב-80 מעלות צלזיוס
6. הערכת גודל המקטע כרומטין בעקבות Sonication
הערה: נא עיין טבלה 1 עבור כל מאגר יצירות.
- כדי דה-crosslink, לקחת 30 µL של כרומטין במבחנה 1.5 מ"ל ולהוסיף 20 µL 5 מ' NaCl. להשלים את אמצעי האחסון 500 µL, דגירה-65 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
- למחרת לבצע טיפול עם 1 µL proteinase K (20 מ"ג/מ"ל מלאי), 10 µL 2 מ' טריס pH 6.8 ו- 10 µL של EDTA 0.5 M עבור h 1-42 מעלות צלזיוס בצע פנול-כלורופורם/כלורופורם החילוץ, לזרז את ה-DNA עם נפח 1 של נתרן acetat e (3 מ') ו- 2 כרכים של אתנול 100% עבור h אחד ב-80 מעלות צלזיוס או ללון ב-20 מעלות צלזיוס
- גלולה ה-DNA על ידי צנטריפוגה-13,500 g x עבור 15 דקות Decant תגובת שיקוע, לשטוף את צניפה ביסודיות עם אתנול 70% קר, צנטריפוגה שוב על 5 דק Decant תגובת שיקוע, מילה נהדרת בגדר.
- Resuspend בגדר באמצעי האחסון המקורי (30 µL) טה המאגר. למדוד את ריכוז הדנ א בספקטרופוטומטר על ידי ספיגת-260 ננומטר/280 ננומטר. Pipette 500-1, 000 ng של ה-DNA יחד עם סולם גודל ה-DNA על מסלולים נפרדים של 1.5% agarose ג'ל ולבצע אלקטרופורזה כדי להעריך את גודל המקטע כרומטין.
הערה: גודל המקטע צריך להיות בין 200-500 בסיסים, צריך להיות אין שברי משקל מולקולרי גבוה לזיהוי המתאימים כדי לא או גרוע-מפוצלים הדנ א. אם נדרש, הפתרון כרומטין (שלב 5) יכול להיות מחדש sonicated למשך זמן ארוך יותר ובדקתי אז מחדש כמתואר לעיל עד גודל אופטימלי מתקבל.
7. Immunoprecipitation כרומטין (ChIP)
הערה: נא עיין טבלה 1 עבור כל מאגר יצירות.
- Sepharose לחסום חלבון G חרוזים מאת aliquoting 1 מ"ל של slurry 50% אתנול. צניפה החרוזים על ידי צנטריפוגה ב 400 x g עבור 1 דקות ב- benchtop צנטריפוגה, לשטוף עם 1 מ"ל של טה צנטריפוגה מאגר ב 400 x g וחזור לשטיפה של
- לאחר צנטריפוגה את השני, להשעות מחדש ב 1 מ"ל שבב מאגר דילול עם 25 µL של BSA (מניות 20 מ"ג/מ"ל), 20 µL שמרים tRNA (מניות 10 mg/mL). לחסום את החרוזים לפחות 2 שעות לפני השימוש על ידי סיבוב (40-60 rpm) ב-4 מעלות צלזיוס
- µG לדלל 50 של כרומטין (שלב 5) 8-10 פעמים באמצעות שבב דילול מאגר. להוסיף 50 µL של slurry חרוז חסומים ולאחר תקופת דגירה של 2 h סיבוב (40-60 rpm) ב-4 ° C. צנטריפוגה ב 400 g x ב 4 ° C כדי להשיג כרומטין מאושר מראש ואת להעביר אותו צינור טריים.
- Immunoprecipitation, להוסיף את הכמות המתאימה של נוגדן ראשוני (למשל, 1-2 µg לכל µg 10 של כרומטין), דגירה בין לילה עם סיבוב ב-4 מעלות צלזיוס
הערה: הכמות האופטימלית של נוגדן המומלצים על ידי הספק או יכול להיקבע מדעית על ידי ביצוע שבב-qPCR עם כמויות שונות של נוגדן עד העשרה האופטימלי הוא ציין. גם חלבון G sepharose עשויים להיות מוחלפים על ידי חלבון א' sepharose בהתאם סוג המשנה של הנוגדן בשימוש. - להוסיף את החרוזים חסומים ביום המחרת, תקופת דגירה של h 1 עם סיבוב (40-60 rpm) ב-4 ° C. צנטריפוגה ב 400 g x עבור 20-30 s הצניפה החרוזים, להסיר את תגובת שיקוע, ולהתחיל את השבב שוטף.
- שבב שוטף: לבצע את מנקי הבאים עם המאגרים: פעם אחת עם מאגר מלח נמוכה, ואז פעמיים עם מאגר מלח גבוהה, פעמיים עם מאגר LiCl, ולבסוף פעמיים עם מאגר טה.
- לבצע כל כביסה 10 דקות עם סיבוב (40-60 rpm) ב 4 ° C, גלולה החרוזים בין כל כביסה על ידי צנטריפוגה ב 400 g x עבור 20-30 s ומפרידה ספסל-top-
- , • תנאי להסיר בכביסה האחרונה, resuspend את החרוזים במאגר 250 µL • תנאי (הטרי) למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר תוך כדי טלטול.
- צנטריפוגה 400 x g ולאסוף eluate בשפופרת טריים. ביצוע זה צעד פעמיים ולאחר מכן דה-crosslink eluate בין לילה עם 20 µL M NaCl 5 ו- A RNase 1 µL (10 mg/mL), לטיפול עם proteinase K, פנול-כלורופורם/כלורופורם תכונות נוספלהתנהג כמו לשלב 6.
- Resuspend ב µL 50 טה המאגר ולעשות שימוש aliquots שבב-qPCR לפי פרוטוקולים סטנדרטיים 15 כדי לבדוק את האיכות של השבב.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדי לבודד גרעין האטום, ביצענו המגון מכני של רקמת שריר גזור, טחון לסופרן או 15 או 45, ב rpm 18,000, 22,000 (ראה טבלה של חומרים). בכל תנאי, יכול להיות מופרדים גרעיני רקמת הלבלב, אבל התשואה היה אופטימלי באמצעות המהירות נמוכה יותר (איור 1 א'-ב'). הגרעינים יכול גם להיות מוכנים על ידי douncing למשך 3-5 דקות (איור 1A, והנתונים לא מוצג), אבל המגון מכנית היא השיטה של בחירה, כמו תשואות אופטימלית של הגרעינים ניתן להשיג קצת כמו 15 s, המאפשר של רווח חשוב של זמן במיוחד אם מספר דוגמאות צריך להיות מעובד (איור 1B). באמצעות פרוטוקול זה, עד ל- 2.7 x 10 גרעינים7 מ- 500 מ ג של רקמות (שווה ערך לרקמות של העכבר 1) יכול להיות מבודד כדי להפיק 100 µg של כרומטין.
כדי למטב את פיצול כרומטין מן הגרעינים קבוע, אנו sonicated במשך 5 עד 20 דקות. תחת ההגדרות (ראה טבלה של חומרים), 10 דקות sonication היה אופטימלי ליצירת כרומטין עם גודל המקטע ממוצע של 250 bp (איור 2). שלב זה צריך להיות מוטבת השפעול לוקח בחשבון את סוג sonicator בשימוש.
כדי להעריך את איכות כרומטין שריר שהוכן על-ידי הפרוטוקול המתואר לעיל, שבב-qPCR וצ'יפ-seq הניסויים בוצעו נגד גורמי שעתוק, שינוי היסטון או RNA פולימראז II (Pol II). שבב-qPCR כנגד הקולטן glucocorticoid (גר), נוכחות או היעדרות של דקסאמתאזון (דקס) טיפול חשף חזקה העשרה תלויי-דקס GR-אלמנטים הרגולציה של הגנים Redd1 ו- Murf1 ידועים להיות דקס, GR מוסדר סיבי שריר11, בעוד אין אות נראתה testis ספציפי Prm1 האמרגן משמש פקד שלילי (איור 3 א).
שבב-qPCR נגד acetylated ליזין 27 של היסטון H3 (H3K27ac), שינוי קוולנטיות ב משפרי פעיל, היזמים, הראה העשרה חזקה על האמרגן Desmin (Des) הפעיל בתוך סיבי השריר, בהשוואה שלילי intergenic אזור בקרה (איור 3B). H3K27ac שבב-seq חשף רמה גבוהה של הסימן הזה לאורך כל לוקוס Des , אופייני של רקמות מוסדר 'סופר-enhancer' זהות ג'ין12 (איור 4A). באופן דומה, פול פוט II שבב-seq הראו רמות גבוהות של תעתיק II Pol-לוקוס זה.
שבב-qPCR עבור גורם שעתוק Tead4, אשר ממלא תפקיד חשוב בבידול myogenic13,7, חשף את העשרת באתרי שתואר לעיל מחייב Ccnd1 , Ifrd1 (גנים איור 3C). חשוב לציין, העשרה צומצם באמצעות כרומטין מקריסטלים של עכברים איפה Tead4 היה סלקטיבי מוחלש של סיבי שריר (Tead4יהודית דולינסקי-/-)7 (איור 3C). ניתוחים של שבב-seq נתונים הן Tead1 והן Tead4 הראו את הכריכה שלהם לאתר האמרגן של הגן Kdm5a באמצעות כרומטין מפראי-סוג שריר, ואילו האות Tead4, אבל לא את זה של Tead1, H3K27ac או Pol II, אבד באמצעות של כרומטין מ שרירי Tead4יהודית דולינסקי-/- עכברים (איור 4B). באופן דומה, איגוד Tead1 ו- Tead4 על רכיב תקינה במורד הזרם של הגן Adssl1 נתפסת עם כרומטין מפראי-סוג שריר, ואילו איגוד Tead4 אבד באופן סלקטיבי באמצעות כרומטין מ Tead4יהודית דולינסקי-/- שרירים ( איור 4C). מקרים אלה ממחישים כי האות Tead4 ראיתי את הנתונים שבב-seq באו מ מחייב בתוך סיבי השריר.
כדי לקבוע את התרומה של סוגי תאים אחרים הקשורים עם סיבי השריר על פי התוצאות שבב-seq, אנחנו העריכו את אותות H3K27ac ו- Pol II-הגן Vcam1 הפעיל תאי לוויין שריר, Pecam1, סימן תאי אנדותל של כלי הדם המשקים את השרירים. לעומת רמות גבוהות לראות את הגנים או des Adssl1 , הרמות של H3K27ac ו- II Pol לראות גנים Vcam1 וגם Pecam1 היו הרבה נמוך (איור 4A ו- 4C איור). ההבדלים גדולים שידור עבור סיבי השריר לידי ביטוי גנים בהשוואה לאלו הביע ברקמות המשויך ציינו כי האות בשבב פוגשות את כרומטין שהוכנו באמצעות פרוטוקול המתואר לעיל נובע בעיקר איגוד אירועים סיבי השריר.
איור 1: טיהור של גרעינים של העכבר למבוגרים שריר. (א) lysates רקמות מתקבל על ידי homogenisation מכני (18,000 סל ד, 45 s) ואת המגון דאונס (30 קווים/3 דקות) היו מוכתמים trypan blue והנצפית תחת מיקרוסקופ דיגיטלי תמונות נלקחו בשבי בהגדלה X 20. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. (ב') מספר גרעינים המתקבל 500 מ ג של רקמות (המקביל של העכבר 1) לאחר הכנה תחת התנאים המצוינים, סל ד 18,000, 22,000 15 ו 45 s או 3 דקות של douncing. קווי שגיאה לייצג זאת אומרת ± S.E.M. עבור n = 3 עכברים המגון מכני, n = 3 עכברים עבור douncing. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: אימות של גודל המקטע כרומטין. גרעינים בודדים היו sonicated 5, 10, 15 או 20 דקות כמצוין. לאחר דה-crosslinking, טיהור, גודל מקטע דנ א היה מוערך על ידי agarose ג'ל אלקטרופורזה בנוכחות אתידיום ברומיד. מ' הוא סמן הדנ א. גודל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: שימוש כרומטין עבור שבב-qPCR. (א) עכברים היו נתונים כדי זריקות הצפק התוך של הרכב או דקסמתזון (10 מ"ג/ק"ג), לאחר 1.5 h, כרומטין הוכן משרירי הגפיים האחוריות. העשרה בשבב ב GR היעד גנים Redd1 של Murf1, לעומת האמרגן? מה לעזאזל קרה שליטה שלילי (Prm1), מסומן כמו % של קלט זירז. (B) שבב היה לבצע עבור H3K27ac ו- IgG נוגדנים שליטה מנותח על האמרגן Desmin, לעומת אזור בקרה שלילית intergenic. (ג) Tead4 שבב בוצעה כרומטין שריר המתקבל פראי סוג ועכברים נוקאאוט ספציפיים שרירים Tead4 (Tead4יהודית דולינסקי-/-), ניתחו באתרים איגוד Tead4 ב היזמים Ccnd1 ו- Ifrd1 , בהשוואה ל- אזור intergenic הבקרה. בניסויים כל, כרומטין של עכברים 3 היה איחדו, קווי שגיאה מייצגים זאת אומרת ± S.E.M ב מבחן T של סטודנט עבור משכפל טכני 3. ערך P < 0.001* *, < 0.0001 * * *; . אן. אס, שאינם משמעותיים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: פרופילים גנומית של סיבי השריר כרומטין. (א) צילומי מסך מתוך University של קליפורניה בסנטה קרוז דפדפן הגנום של לוקוסים המצוין הממחישות את רמות גבוהות יותר H3K27ac ו- Pol II-הגן Desmin, לידי מאוד סיבי השריר, לעומת הגנים Vcam1 ו- Pecam1 הביע בתאים בלוויין ו אנדותל תאים, בהתאמה. (B) UCSC תצלומי מסך לוקוסים המצוין הממחישות קשירה של Tead1 ו Tead4, וכן H3K27ac של פול פוט השנייה, בכרומטין של פראי-סוג (WT) השריר בהשוואה לזה של Tead4יהודית דולינסקי-/- שריר (MT), איפה סלקטיבי אבדן האיגוד Tead4 נצפתה. הנתונים שבב-seq מאויר זמינה GSE82193 במסד הנתונים GEO. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| שם מאגר | קומפוזיציה | ||
| מאגר היפוטוניק | 10 מ מ HEPES-קו (pH 7.3) | ||
| 10 מ מ אשלגן כלורי | |||
| MgCl 5 מ מ2 | |||
| 0.1% NP-40 | |||
| 0.1 מ מ PMSF (טרי נוסף) | |||
| קוקטייל מעכב פרוטאז (PIC) 1 x (נוסף טריים) | |||
| Sonication מאגר | 1% מרחביות | ||
| 10 מ מ EDTA | |||
| 20 מ מ טריס-HCl pH 8 | |||
| 150 מ מ NaCl | |||
| 0.1% נתרן Deoxycholate | |||
| 1% טריטון X-100 | |||
| טרי הוסיף 0.1 מ מ PMSF | |||
| PIC 1 x | |||
| מאגר דילול צ'יפ | 0.01% מרחביות | ||
| 1.1% טריטון X-100 | |||
| 1.2 מ מ EDTA | |||
| מ מ 16.7 pH8 HCl טריס | |||
| 167 מ NaCl | |||
| טרי הוסיף 0.1 מ מ PMSF | |||
| PIC 1 x | |||
| מאגר מלח נמוכה | 0.1% מרחביות | ||
| 1% טריטון X-100 | |||
| 500 מ מ EDTA | |||
| 20 מ מ pH8 HCl טריס | |||
| 150 מ מ NaCl | |||
| מאגר מלח גבוהה | 0.1% מרחביות | ||
| 1% טריטון X-100 | |||
| 500 מ מ EDTA | |||
| 20 מ מ pH8 HCl טריס | |||
| 500 מ מ NaCl | |||
| מאגר LiCl | 250 מ מ LiCl | ||
| 1% NP-40 | |||
| 1 מ מ EDTA | |||
| 10 מ מ טריס HCl pH 8 | |||
| • תנאי מאגר | 1% מרחביות | ||
| NaHCO 100 מ מ3 | |||
| מאגר טריס-EDTA (טה) | 50 מ מ טריס HCl pH 8 | ||
| 1 מ מ EDTA | |||
טבלה 1: מאגר של יצירות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן נתאר פרוטוקול הרומן להכנת כרומטין של שרירי השלד העכבר הבוגרים ולהראות כי כרומטין הזה מתאים ניסוי שבב לזהות איגוד פקטור שעתוק והשינויים היסטון קוולנטיות גרעינים סיבי השריר. פרוטוקול זה כרוך במספר שלבים קריטיים. הראשונה היא הפרעה רקמות שניתן לבצע דאונס או באמצעות הטיית מכני. הטיית מכני יותר לשחזור ומהירה, ולכן הוא שיטת הבחירה. יחד עם זאת, אם אין מכשיר מתאים זמין, הפרעה יכול גם להתבצע על ידי douncing, שבו הערכת היעילות של פירוק תחת המיקרוסקופ מומלץ לפני שתמשיך לשלב קיבוע. קיבוע של כל רקמה lysates, יותר מאשר הקיבעון של גרעינים בודדים, מותר sonication לשחזור יותר בכמויות קטנות יותר עבור משכי זמן קצר. אנחנו גם בחר לתקן את lysates לאחר הפרעה במקום לתקן את הרקמות לפני שיבושים, כפי שתואר על ידי תומאס. et al. 10 מראש תיקון הרקמה כתוצאה יעילות מופחתת של homogenisation. פרוטוקול זה מבוסס על חיתוך מכני הוא גם מהיר יותר הצעת פתרונות אחרים, כגון עיכול collagenase, בהם מעורבים דגירה ממושך של הרקמה ביתור 37 ° C8. במהלך תקופה זו יכולה להתרחש שינויים באיגוד פקטור שעתוק וביטוי גנים. תיקון הגרעינים מהר ככל האפשר חיוני ולכן ללכוד יותר בנאמנות את מצב פיזיולוגי נורמלי.
שלב קריטי השני הוא הטיהור של גרעינים מן הקבוע lysate. בשביל זה, סינון רציפים של הפתרון lysate קבוע, תחילה דרך מסננת תא מיקרומטר 70 לסלק ההריסות גדול ולאחר מכן דרך מסננת תא 40 µm לפנות את הפסולת בסדר, מונע סתימת strainers את ומגדיל את התשואות של גרעינים שהושג. ברגע מטוהרת על-ידי סינון, הגרעינים הם sonicated, לקבוע את גודל מקטע דנ א לאחר דה-crosslinking. הכנה טיפוסי של הגפיים האחוריות שני של עכבר אחד מניבה 100 µg של כרומטין. איגוד את lysates של עכברים עד 3 עשוי לשפר את התשואה על ידי הקטנת ההפסדים במהלך ההכנה. ההליך זה יעיל, שכן היא מאפשרת ההתאוששות של עד 75% של ה-DNA גנומי כמו כרומטין (נתונים לא מוצג).
שבב ניסויים שנועדו להעריך איגוד פקטור שעתוק והפגינו שינויים epigenetic ההתאמה של פרוטוקול זה ללמוד הכונה ב גרעינים סיבי השריר. אותות שבב-seq חזק וחזק Pol II, H3K27ac נוצרו מכרומטין, המאפשר זיהוי של סיבי השריר זהות גנים על ידי שלהם ייחודי H3K27ac ו- Pol II פרופילים7. רמות גבוהות יותר של H3K27ac ו- II פול פוט את הגנים המתבטא בחום גרעינים סיבים, לעומת גנים ביטוי בלוויין או תאי אנדותל, הראה כי האות בא בעיקר גרעינים סיבים. זה אושר גם על ידי האובדן של שבב Tead4 אות באמצעות כרומטין של עכברים איפה שזה היה במפורש לא פעיל בתוך סיבי השריר. למרות זאת, חלש יותר, אבל בבירור מעל רקע אותות, עבור תא בלוויין סמנים כגון Vcam1, Pax7 (נתונים לא מוצג) יכולים להתגלות מציג את כרומטין של תאים אלה הוא גם ההווה. אנו צופים כי הפרוטוקול שלנו צריך להיות מתאים טכניקות אחרות המשתמשות כרומטין פורמלדהיד-קבוע כגון 3 C/4 C וטכניקות היק כרומטין קונפורמציה הלכידה. השימוש בפרוטוקול שלנו עבור שילוב שבב-seq עבור גורמי שעתוק והשינויים כרומטין עם כרומטין קונפורמציה לכידת אמור בעתיד לאפשר הבנה מפורטת של ג'ין מנגנוני הרגולציה סיבי השריר, איך אלה עשויים להיות מוסדרים . נסערת לגירויים פיזיולוגיים, כגון פעילות גופנית, צום, עשיר בשומן, denervation, או במחלה, על-ידי שימוש כרומטין שהוכנו גנטית שונה עכברים מתרבה מחלות כמו centronuclear X-linked מיופתיה14.
לסיכום, פרוטוקול זה בעלות נמוכה, היעילה מאפשר את ניתוקה של גרעינים סיבי השריר שניתן sonicated מיד או קפוא ב- 80 ° C לשימוש נסתר. השימוש כרומטין שהוכנו על ידי פרוטוקול זה סיפקה הראשונה הגנום רחב שבב-seq הנתונים סיבי השריר7 , יקל על מחקרים עתידיים על הכונה בתוך הרקמה הזו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.
Acknowledgments
אנו מודים כל הסגל של המתקן רצף של תפוקה גבוהה IGBMC, חבר קונסורציום "צרפת Génomique" (ANR10-INBS-09-08), כל שירותי כללית IGBMC בפרט הצוות של המתקן בעלי חיים IGBMC. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים של CNRS, INSERM של AFM, le חדר מרווח וחדיש הליגה הלאומית לסרטן, הצרפתים המדינה קרן דרך ANR תחת התוכנית d'Avenir Investissements מתויג ANR-10-IDEX-0002-02, Labex INRT ANR-10-IDEX-0001-02 ובפרמטר ANR-AR2GR-16-CE11-009-01. התורמים שחיים היה אין תפקיד תכנון המחקר, איסוף נתונים, ניתוח, ההחלטה לפרסם או אופן ההכנה של כתב היד. S. J נתמך על ידי le חדר מרווח וחדיש של הליגה הלאומית לסרטן ANR-AR2GR-16-CE11-009-01, ואת V.U על ידי l'Enseignement דה Ministère et de la Recherche. מזהה הוא "נבחרת labellisée" של לה חדר מרווח וחדיש הליגה הלאומית לסרטן.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| T 25 digital ULTRA-TURRAX | T 18 ULTRA-TURRAX | 0009022800 | |
| PMSF | SIGMA-ALDRICH CHIMIE SARL | P7626-25G | |
| Protease Inhibitor Cocktail-EDTA Free | Roche Diagnostics | 11873580001 | |
| Protein G Sepharose beads | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | P-3296 | |
| Proteinase K | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | P-2308 | |
| Cell Strainers 70um | Corning BV | 431751 | |
| Cell Strainers 40um | Corning BV | 352340 | |
| Formaldehyde EM grade | Euromedex | 15710-S | |
| Rnase A | Fischer Scientific | 12091039 | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1 | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | P3803 | |
| BSA | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | B4287-25G | |
| yeast tRNA | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | R5636 | |
| Glycogen Blue | AMIBION | AM9516 | |
| Pol II ChIP Antibody | Santa Cruz | SC-9001 | |
| H3K27ac ChIP Antibody | Active Motif | 39133 | |
| Tead4 ChIP Antibody | Aviva Systems Biology | (ARP38276_P050) | |
| IGEPAL | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | I-3021 | |
| E220 Focused Ultrasonicator | Covaris E220 | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Additional items | |||
| Scissors | |||
| Loose Dounce | |||
| 15 ml and 50 ml falcon tubes | |||
| 14 ml round bottom tubes | |||
| 1.5 ml and 2 ml Eppendorf tubes | |||
| 70 μm and 40 μm cell strainers (Corning) |
References
- Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions. Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).
- Furey, T. S. ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions. Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).
- Wade, J. T. Mapping Transcription Regulatory Networks with ChIP-seq and RNA-seq. Adv Exp Med Biol. 883, 119-134 (2015).
- Alpern, D., et al. TAF4, a subunit of transcription factor II D, directs promoter occupancy of nuclear receptor HNF4A during post-natal hepatocyte differentiation. Elife. 3, e03613 (2014).
- Martianov, I., et al. Cell-specific occupancy of an extended repertoire of CREM and CREB binding loci in male germ cells. BMC Genomics. 11, 530 (2010).
- Achour, M., et al. Neuronal identity genes regulated by super-enhancers are preferentially down-regulated in the striatum of Huntington's disease mice. Hum Mol Genet. 24 (12), 3481-3496 (2015).
- Joshi, S., et al. TEAD transcription factors are required for normal primary myoblast differentiation in vitro and muscle regeneration in vivo. PLoS Genet. 13 (2), e1006600 (2017).
- Ohkawa, Y., Mallappa, C., Dacwag-Vallaster, C. S., Imbalzano, A. N. Myogenesis: Methods and protocols. DiMario, J. 798, Springer Science+Business Media LLC. 517-531 (2012).
- Dimauro, I., Pearson, T., Caporossi, D., Jackson, M. J. A simple protocol for the subcellular fractionation of skeletal muscle cells and tissue. BMC Res Notes. 5, 513 (2012).
- Thomas, J. L., et al. PAK1 and CtBP1 Regulate the Coupling of Neuronal Activity to Muscle Chromatin and Gene Expression. Mol Cell Biol. 35 (24), 4110-4120 (2015).
- Kuo, T., et al. Genome-wide analysis of glucocorticoid receptor-binding sites in myotubes identifies gene networks modulating insulin signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (28), 11160-11165 (2012).
- Whyte, W. A., et al. Master transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes. Cell. 153 (2), 307-319 (2013).
- Benhaddou, A., Keime, C., Ye, T., Morlon, A., Michel, I., Jost, B., Mengus, G., Davidson, I. Transcription factor TEAD4 regulates expression of myogenin and the unfolded protein response genes during C2C12 cell differentiation. Cell Death and Differentiation. 19 (2), 220-231 (2011).
- Cowling, B. S., et al. Reducing dynamin 2 expression rescues X-linked centronuclear myopathy. J Clin Invest. 124 (3), 1350-1363 (2014).
- Thermo Fisher Scientific. ChIP Analysis. , Available from: https://www.thermofisher.com/fr/fr/home/life-science/epigenetics-noncoding-rna-research/chromatin-remodeling/chromatin-immunoprecipitation-chip/chip-analysis.html (2017).
