Summary
É apresentado um novo protocolo para a preparação da cromatina do músculo esquelético de rato adulto adaptado para o estudo da regulação gênica em fibras musculares por imunoprecipitação da cromatina.
Abstract
Descreveremos um protocolo eficiente e reproduzível para a preparação da cromatina do músculo esquelético de rato adulto, um tecido resistente fisicamente com um alto teor de proteínas estruturais. Músculos de membros dissecados de ratos adultos fisicamente são rompidos por homogeneização mecânica, ou uma combinação de picagem e douncing, em um buffer hipotônica antes da fixação de formaldeído do lisado celular. Os núcleos fixos são purificados por mais ciclos de homogeneização mecânica ou douncing e filtrações sequenciais para remover os resíduos de célula. Os núcleos purificados podem ser sonicated imediatamente ou posteriormente após congelamento. A cromatina pode ser sonicated com eficiência e é apropriado para experimentos de imunoprecipitação da cromatina, conforme ilustrado pelos perfis obtido por fatores de transcrição, RNA polimerase II e modificações do histone covalente. Os eventos de ligação detectados usando cromatina preparada pelo presente protocolo predominantemente são aqueles que ocorrem no núcleo da fibra muscular apesar da presença de cromatina de outro satélite de fibra-associado e células endoteliais. Este protocolo, portanto, é adaptado para estudar a regulação gênica no músculo esquelético rato adulto.
Introduction
Imunoprecipitação da cromatina (ChIP) acoplado a reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) e sequenciamento de alto throughput (ChIP-seq) tornaram-se os métodos de escolha para estudar a transcrição e epigenética regulação da expressão gênica em diversos tecidos e tipos de células1. Esta técnica permite a criação de perfil de todo o genoma de modificações covalentes cromatina, ocupação variante de histona e32,ligação do fator da transcrição.
Enquanto executando o ChIP de células cultivadas está bem estabelecida, ChIP de tecidos de mamíferos permanece mais desafiador. Preparação da cromatina para ChIP envolve várias etapas críticas que precisam ser otimizados para cada tipo de tecidos e células. Cromatina pode ser preparada do lisado celular de células cultivadas ou seguir a purificação de seus núcleos. No caso de tecidos de mamíferos, Lise eficiente, fixação de formaldeído e purificação dos núcleos são críticos para garantir ótima recuperação da cromatina. Além disso, a escolha de se corrigir os núcleos antes ou depois da sua purificação tem de ser determinado experimentalmente. Apesar destes obstáculos, ChIP tem sido realizado com sucesso de tecidos como o fígado, testículo ou cérebro4,5,6. No caso de músculo esquelético, o rompimento de um tecido tão fisicamente resistente, que apresenta um alto teor de proteínas estruturais e isolamento de seus núcleos é particularmente desafiadora. Tendo em conta esta especificidade, protocolos otimizados para outros tecidos não dão resultados satisfatórios para os músculos esqueléticos.
Aqui descrevemos um protocolo para isolar a cromatina ChIP-grau de tecido de músculo esquelético de rato que envolve fisicamente, rompendo o tecido, fixação de formaldeído e então o isolamento dos núcleos e sonication. A eficiência deste método para preparar a cromatina apropriada para ChIP deste tecido foi demonstrada por realização de ChIP-qPCR e ChIP-seq para vários fatores de transcrição, RNA polimerase II e de modificações do histone covalente7.
Esta nova técnica é muito mais rápida do que um protocolo relatado anteriormente8 composto por etapas de digestão tempo colagenase durante esse tempo, mudanças na localização de genômica de factores de transcrição e alterações na expressão do gene podem ter lugar. A rapidez com que os núcleos são isolados e fixa faz com que o método descrito aqui particularmente atraente para preparar a cromatina que capta mais fielmente o estado de ocupação genômica nativo. Além disso, apesar de tem outros métodos de extração de isolamento ou proteínas da cromatina de tecido muscular foram descritas8,9,10 e usado para experiências de ChIP-qPCR genes selecionados, sem ChIP-seq dados tem sido relatados como usá-los. O método relatado aqui é apropriado para transcrição fator e histona modificação ChIP-seq e, portanto, deve ser também apropriado para aplicações de captura do HiC cromatina conformação ou 3 / 4C.
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Protocol
os ratos foram mantidos em conformidade com as diretrizes institucionais em matéria de cuidados e uso de animais de laboratório e em conformidade com as diretrizes nacionais de cuidado Animal (Comissão Europeia a Directiva 86/609/CEE; Francês o decreto 848-87). Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de ética nacional francês.
1. isolamento de tecido muscular
rato- sacrifício um adulto 6 a 8 semanas de idade por deslocamento cervical. Sterlise o membro lavando-o com 70% de etanol e dissecar os músculos do membro posterior (gastrocnêmio, tibial Anterior, quadríceps) usando uma tesoura de ponta fina e pinças.
Nota: Um rato deve render cerca de 500 mg de tecido. - Picar os músculos num tubo de ensaio 2 mL contendo 1 mL de tampão de hipotônica gelada para uma preparação homogênea de pequeno (< 2-3 mm 3) peças usando muito bem a tesoura e deixe o tubo tremendo em um agitador de bancada superior a 4 ° C, durante 5-10 min.
2. Lise do tecido
Nota: consulte a tabela 1 para todas composições de buffer.
- Transferir o homogeneizado para um tubo de fundo redondo de 14 mL e Resuspenda em 5 mL frio hipotônica buffer (EDTA-free inibidor da protease cocktail e PMSF).
- Homogenise tecido do músculo picada usando um solto homogenizacao (20-30 traços dentro 3min) ou um homogeneizador mecânico por 15 a 30 s em tubos de fundo redondo 14 mL.
Nota: A eficiência de Lise pode ser avaliada nesta fase, por microscopia de luz, e se necessário, perturbações adicionais podem ser realizadas.
- Homogenise tecido do músculo picada usando um solto homogenizacao (20-30 traços dentro 3min) ou um homogeneizador mecânico por 15 a 30 s em tubos de fundo redondo 14 mL.
- Transferir o homogeneizado para os tubos de 15 mL e encher o volume de 10 mL com tampão hipotônica frio. Corrigir o homogenate conforme descrito abaixo antes de prosseguir com o próximo mouse.
3. Fixação
- Adicionar formol a concentração final de 1% e agitar durante 10 min à temperatura ambiente.
- Adicionar glicina a uma concentração final de 0,125 M em cada tubo de parar a fixação e agitar durante 5-10 min à temperatura ambiente.
4. Preparação de núcleos
Nota: consulte a tabela 1 para todas composições de buffer.
- Homogenise a fixo usando lisado um solto homogenizacao (traços de 5-10).
- Transferência para um tubo de 15 mL e centrifugar a 1.000 x g por 5 min a 4 ° C para obter núcleos e restos celulares.
- Remover o sobrenadante e ressuspender o precipitado no buffer hipotônica fresco 5ml. Filtre o lisado através de um filtro de célula de 70 µm em um tubo de 50 mL. Re-filtro filtrado através de um filtro de célula de 40 µm.
- Transferir o filtrado para um tubo de 15 mL e centrifugar a 1.000 x g por 5 minutos a 4 ° C para obter a pelota nuclear.
Nota: Nesta fase, os núcleos podem ser imediatamente sonicated, ou partir congelado como um sedimento seco em nitrogênio líquido e armazenado a -80 ° C.
5. Sonication
- avaliar o volume da pelota nuclear (cerca de 50 µ l para homogeneização mecânico e homogenizacao) e ressuspender-no buffer sonication até 3 a 4 vezes do volume nuclear embalado e proceda à sonicação durante 10-15 min a 4 ° C, usando um sonicador .
Nota: A cromatina pode ser analisada imediatamente, conforme descrito abaixo (6) ou congelada e armazenada a -80 ° C.
6. Avaliar o tamanho do fragmento de cromatina seguindo Sonication
Nota: consulte a tabela 1 para todas composições de buffer.
- De-crosslink, tomar 30 µ l de cromatina em um tubo de ensaio de 1,5 mL e adicionar 20 µ l 5 M NaCl. Completar o volume a 500 µ l e incubar a 65 ° C durante a noite.
- No dia seguinte, realizar um tratamento com 1 µ l da protease K (20 mg/mL de caldo), 10 µ l 2 M Tris pH 6,8 e 10 µ l de EDTA 0,5 M para 1 h, a extração de executar um fenol-clorofórmio clorofórmio/42 ° C. e precipitar o DNA com 1 volume de sódio acetat e (3 M) e 2 volumes de etanol 100% para um h-80 ° c, ou durante a noite em -20 ° C.
- O DNA de pelotas por centrifugação a 13.500 x g, durante 15 min. decantar o sobrenadante e lavar o sedimento completamente com álcool etílico 70% frio e centrifugar novamente por 5 min. decantar o sobrenadante e secar o sedimento.
- Resuspenda o pellet no volume original (30 µ l) de tampão TE. Medir a concentração de DNA em um Espectrofotômetro de absorvância a 260 nm/280 nm. Pipetar 500-1.000 ng de DNA juntamente com uma escada de tamanho de DNA em corredores separados de um gel de agarose 1,5% e executar eletroforese para avaliar o tamanho do fragmento da cromatina.
Nota: Tamanho do fragmento deve estar entre 200-500 pares de bases e não deve haver nenhum fragmento detectável de alto peso molecular correspondente à não - ou mal-fragmentado DNA. Se necessário, a solução de cromatina (etapa 5) pode ser re-lisada por mais tempo e então re-analisada conforme descrito acima, até o tamanho ideal é obtido.
7. Imunoprecipitação da cromatina (ChIP)
Nota: consulte a tabela 1 para todas composições de buffer.
- Contas de sepharose bloco a proteína G por alíquotas de 1 mL do chorume em etanol a 50%. Pelota as contas por centrifugacao a 400 x g por 1 min em uma bancada centrífuga e lavagem com 1 mL de 400g de x de centrifugar TE reserva e repita o Wash.
- Após a segunda centrifugação, re-suspender em 1 mL de tampão de diluição de ChIP com 25 µ l de BSA (estoque 20 mg/mL) e 20 µ l do fermento tRNA (estoque 10 mg/mL). Bloquear as contas pelo menos 2 h antes da sua utilização por rotação (40-60 rpm) em 4 ° C.
- Diluir 50 µ g de cromatina (etapa 5) 8 a 10 vezes com tampão de diluição do ChIP. Adicionar 50 µ l de chorume bloqueados do grânulo e incubar durante 2 h (40-60 rpm) de giro a 4 ° C. centrifugar a 400 x g a 4 ° C para obter previamente limpo da cromatina e transferi-lo para um tubo novo.
- Para a imunoprecipitação, adicionar a quantidade apropriada de anticorpo primário (por exemplo, 1-2 µ g por 10 µ g de cromatina) e incubar durante uma noite com rotação em 4 ° C.
Nota: A quantidade ideal de anticorpo pode ser recomendada pelo fornecedor, ou pode ser determinada empiricamente através da realização de ChIP-qPCR com diferentes quantidades de anticorpos até enriquecimento ideal é observado. Também sepharose proteína G pode ser substituída pela proteína um sepharose dependendo do subtipo de anticorpo usado. - Adicionar as contas bloqueadas no dia seguinte e incubar durante 1 h com rotação (40-60 rpm) em 4 ° C. centrifugar a 400 x g por 20-30 s para granular os grânulos, remover o sobrenadante e começar o ChIP lava.
- ChIP lavagens: executar as lavagens seguintes com os buffers: uma vez com baixa reserva de sal e depois duas vezes com tampão de sal alta, duas vezes com LiCl Buffer e finalmente duas vezes com tampão TE.
- Pelota os grânulos entre cada lavagem por centrifugação a 400 x g, durante 20-30 s em uma centrífuga de bancada e executar cada lavagem durante 10 min com rotação (40-60 rpm) a 4 ° C.
- Para a eluição, retire a última lavagem e ressuspender os grânulos em tampão de eluição 250 µ l (preparadas) durante 15 minutos à temperatura ambiente e agitando.
- Centrífuga em 400 x g e recolher o eluato num tubo de fresco. Realizar essa etapa duas vezes e, em seguida, de-crosslink o eluído durante a noite com 20 µ l M de NaCl 5 e 1 µ l do RNase A (10 mg/mL), tratar com proteinase K e fenol-clorofórmio/clorofórmio extragir como na etapa 6.
- Resuspenda em 50 µ l de tampão TE e usar alíquotas para ChIP-qPCR conforme protocolos padrão 15, para verificar a qualidade do ChIP.
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Representative Results
Para isolar núcleos, realizamos a homogeneização mecânica do tecido muscular dissecado e picada para 15 ou 45 s, 18.000 e 22.000 rpm (ver Tabela de materiais). Em todas as condições, núcleos poderiam separar os restos de tecido, mas o rendimento foi otimizado usando a velocidade mais baixa (figura 1A-B). Núcleos também podem ser preparados por douncing por 3-5 min (figura 1Ae dados não mostrados), mas a homogeneização mecânica é o método de escolha, como rendimento ideal dos núcleos pode ser alcançado em menos de 15 s, permitindo que um importante ganho de tempo, especialmente se várias amostras precisam ser processado (figura 1B). Usando este protocolo, até a 2.7 x 107 núcleos de 500 mg de tecido (equivalente ao tecido do 1 rato) podem ser isolados para gerar 100 µ g de cromatina.
Para otimizar a fragmentação da cromatina de núcleos fixos, nós lisados por 5 a 20 min. Sob as configurações (veja a Tabela de materiais), um sonication 10 min foi otimizada para gerar a cromatina com um tamanho médio de fragmento de 250 bp (Figura 2). Esta etapa deve ser otimizada experimentalmente, tendo em conta o tipo de sonicador usado.
Para avaliar a qualidade da cromatina de músculo preparada pelo protocolo descrito acima, foram realizados experimentos de ChIP-qPCR e ChIP-seq contra fatores de transcrição, uma modificação de histona ou RNA polimerase II (Pol II). ChIP-qPCR contra o receptor de glicocorticoides (GR) na presença ou ausência de tratamento de dexametasona (Dex) revelou forte enriquecimento GR Dex-dependente em elementos reguladores dos genes Redd1 e Murf1 que são conhecidos por serem Dex e GR regulamentada em fibras musculares11, enquanto o sinal não foi visto no promotor Prm1 testículo específico usado como um controle negativo (Figura 3A).
ChIP-qPCR contra acetilado lisina 27 de histona H3 (H3K27ac), uma modificação covalente encontrada em potenciadores de ativos e promotores, mostrou forte enriquecimento no promotor Desmin (Des) que está ativo em fibras de músculo, em comparação com um negativo intergênica região de controle (Figura 3B). H3K27ac ChIP-seq revelou um elevado nível desta marca em todo o locus de Des , típico de um tecido regulamentado 'super-realçador' identidade gene12 (Figura 4A). Da mesma forma, Pol II ChIP-seq mostrou níveis elevados de transcrever Pol II neste locus.
ChIP-qPCR para fator de transcrição Tead4, que desempenha um papel importante na diferenciação miogênico13,7, revelou seu enriquecimento em sites de ligação descrito anteriormente no Ccnd1 e Ifrd1 (de genes A Figura 3). Importante, enriquecimento foi reduzido usando cromatina preparada a partir de ratos onde Tead4 foi seletivamente inactivada em fibras musculares (Tead4skm-/-)7 (Figura 3). Análises de dados do ChIP-seq para Tead1 e Tead4 mostraram sua ligação a um site no promotor do gene da Kdm5a usando a cromatina do selvagem-tipo muscular, Considerando que o sinal de Tead4, mas não a dos Tead1, H3K27ac ou Pol II, foi perdido usando a cromatina de músculos do Tead4skm-/- ratos (Figura 4B). Da mesma forma, a ligação Tead1 e Tead4 para um elemento regulamentar a jusante do gene Adssl1 é vista com cromatina do selvagem-tipo muscular, Considerando que Tead4 ligação perdera seletivamente usando cromatina do Tead4skm-/- (do músculo A Figura 4). Essas observações demonstram que o sinal de Tead4 visto nos dados do ChIP-seq veio de vinculação na fibra muscular.
Para determinar a contribuição de outros tipos de células associadas com a fibra muscular para os resultados de ChIP-seq, avaliamos os sinais H3K27ac e Pol II no gene da Vcam1 que está ativo em células satélite de músculo e Pecam1, um marcador de células endoteliais dos vasos sanguíneos que irrigam os músculos. Em comparação com os níveis elevados de visto nos genes do Des ou Adssl1 , os níveis de H3K27ac e Pol II visto em genes de ambos os Vcam1 e Pecam1 foram muito menor (Figura 4A e Figura 4). As grandes diferenças no sinal por fibra muscular expressada genes comparados àqueles expressos em tecidos associados indicaram que o sinal visto no ChIP da cromatina preparada usando o protocolo descrito acima vem predominantemente de vinculação eventos na fibra muscular.
Figura 1: purificação dos núcleos do músculo de rato adulto. (A) lysates do tecido obtido pela homogeneização mecânica (18.000 rpm, 45 s) homogeneização homogenizacao (30 min de traços/3) foram corados com azul de trypan e observada sob um microscópio digital e imagens foram capturadas na ampliação de 20 X. Barra de escala = 100 µm. (B) número de núcleos obtidos de 500 mg de tecido (equivalente a 1 rato) após a preparação, sob as condições indicadas, 18.000 e 22.000 rpm para 15 e 45 s ou 3 min de douncing. Barras de erro representam média ± no MEV mostrou para n = 3 ratos para homogeneização mecânica e n = 3 ratos para douncing. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: verificação da cromatina do tamanho do fragmento. Núcleos isolados foram lisados por 5, 10, 15 ou 20 min como indicado. Depois de reticulação e purificação, o tamanho do fragmento de DNA foi avaliado por eletroforese em gel de agarose na presença de brometo de etídio. M é marcador de tamanho de DNA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: uso da cromatina para ChIP-qPCR. (A) ratos foram submetidos a injeções intra peritoneais de veículo ou dexametasona (10 mg/kg) e após 1,5 h, cromatina foi preparada a partir os músculos dos membros posteriores. O enriquecimento em ChIP em genes-alvo GR Redd1 e Murf1, em comparação com o promotor de protamina de controlo negativo (Prm1), é indicado como um % da entrada do precipitado. (B) ChIP foi realizada por H3K27ac e IgG anticorpos controle e analisado no Desmin promotor e comparada com uma região intergênica controlo negativo. (C) Tead4 ChIP foi realizada na cromatina muscular Obtida de tipo selvagem e ratos do músculo específico Tead4 KO (Tead4skm-/-) foram analisados em locais de ligação Tead4 nos promotores Ccnd1 e Ifrd1 , em comparação com o região intergênica de controle. Em todos os experimentos, cromatina de 3 ratos foi agrupada e barras de erro representam média ± S.E.M em um de T-Student para três repetições de técnicas. Valor de P < 0.001* *, < 0,0001 * * *; NS, não significativo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: perfis Genomic da fibra muscular cromatina. (A) Screenshots do University da Califórnia em Santa Cruz navegador de genoma dos loci indicado ilustrando os níveis muito mais altos H3K27ac e Pol II no gene da Desmin, altamente expressado na fibra muscular, em comparação com os genes Vcam1 e Pecam1 , expressados em células satélites e endoteliais células, respectivamente. (B) UCSC screenshots dos loci indicado ilustrando a vinculação de Tead1 e Tead4, bem como H3K27ac e Pol II, na cromatina do selvagem-tipo (WT) muscular comparada com a de Tead4skm-/- muscular (MT), onde é a perda seletiva de ligação Tead4 observada. Os dados do ChIP-seq ilustrados estão disponíveis como GSE82193 no banco de dados GEO. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Reserva de nome | Composição | ||
| Buffer de hipotônica | 10 mM HEPES-KOH (pH 7,3) | ||
| 10 mM KCl | |||
| 5 mM MgCl2 | |||
| 0,1% NP-40 | |||
| 0.1 mM PMSF (recém adicionada) | |||
| Coquetel de inibidor de protease (PIC) 1 x (recém adicionada) | |||
| Buffer de sonication | 1% SDS | ||
| 10 mM de EDTA | |||
| pH de 20 mM Tris-HCl 8 | |||
| 150 mM NaCl | |||
| 0,1% de sódio Deoxycholate do | |||
| 1% Triton X-100 | |||
| Recentemente adicionado 0.1 mM PMSF | |||
| FOTO 1 x | |||
| Tampão de diluição da microplaqueta | 0,01% SDS | ||
| 1,1% Triton X-100 | |||
| 1.2 mM EDTA | |||
| 16,7 mM Tris HCl pH8 | |||
| 167 mM NaCl | |||
| Recentemente adicionado 0.1 mM PMSF | |||
| FOTO 1 x | |||
| Buffer de sal baixo | 0,1% SDS | ||
| 1% Triton X-100 | |||
| 500 mM EDTA | |||
| 20 mM Tris HCl pH8 | |||
| 150 mM NaCl | |||
| Buffer de sal elevado | 0,1% SDS | ||
| 1% Triton X-100 | |||
| 500 mM EDTA | |||
| 20 mM Tris HCl pH8 | |||
| 500 mM NaCl | |||
| LiCl Buffer | 250 mM LiCl | ||
| 1% NP-40 | |||
| 1 mM EDTA | |||
| 10 mM Tris HCl pH 8 | |||
| Tampão de eluição | 1% SDS | ||
| 100 mM NaHCO3 | |||
| Tampão Tris-EDTA (TE) | 50 mM Tris HCl pH 8 | ||
| 1 mM EDTA | |||
Tabela 1: Composições de Buffer.
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Discussion
Aqui nós descrevemos um novo protocolo para a preparação de cromatina de músculos esqueléticos de rato adulto e mostrar que este cromatina é adequada para experimentos de ChIP que detectar a ligação do fator de transcrição e modificações do histone covalente no núcleo da fibra muscular. Este protocolo envolve várias etapas críticas. O primeiro é rompimento de tecido que pode ser executado por homogenizacao ou por cisalhamento mecânico. O corte mecânico é mais rápido e mais reprodutíveis e é, portanto, o método de escolha. No entanto, se nenhum aparelho apropriado estiver disponível, perturbação também pode ser realizada por douncing, onde a avaliação da eficiência do lysis sob o microscópio é recomendada antes de prosseguir para a etapa de fixação. Fixação de lisados de todo tecido, ao invés de fixação de núcleos isolados, permitiu mais sonication reprodutível em volumes menores e para durações curtas. Também escolhemos corrigir os lysates após interrupção ao invés de corrigir o tecido antes de interrupção, como descrito por Thomas et al . 10 pré-fixação do tecido resultou em redução da eficiência da homogeneização. Este protocolo baseado em mecânica de corte também é mais rápido que outras soluções propostas, tais como digestão de colagenase, que envolvem a incubação prolongada do tecido dissecado em 37 ° C8. Durante este período, podem ocorrer alterações na ligação de fator de expressão e transcrição de gene. Fixação dos núcleos mais rápido possível, portanto, é essencial para capturar mais fielmente o estado fisiológico normal.
Um segundo passo crítico é a purificação dos núcleos do fixo lisados. Para isso, filtragem sequencial da solução fixa lisada, primeiro através de um filtro de célula de 70 µm para eliminar os detritos maiores e, em seguida, através de um filtro de célula de 40 µm para remover os detritos bem, evita o entupimento de filtros e maximiza o rendimento dos núcleos obtidos. Uma vez purificados por filtração, núcleos são lisados e o tamanho do fragmento de DNA determinado depois de reticulação. Uma preparação típica de dois membros posteriores de um rato rende 100 µ g de cromatina. Reunindo os lysates de até 3 ratos pode melhorar o rendimento, reduzindo as perdas durante a preparação. Este procedimento é eficiente, pois permite a recuperação de até 75% do DNA genômico como cromatina (dados não mostrados).
Experimentos de microplaqueta destinado a avaliar a ligação do fator de transcrição e modificações epigenéticas demonstraram a adequação do presente protocolo para o estudo de regulação dos genes no núcleo da fibra muscular. Sinais de ChIP-seq fortes e robustos para Pol II e H3K27ac foram gerados desde a cromatina, permitindo a identificação de fibras musculares genes de identidade por sua distinta H3K27ac e Pol II perfis7. Os níveis muito mais altos de H3K27ac e Pol II genes fortemente expressado em núcleos de fibra, em comparação com os genes expressados em satélite ou células endoteliais, mostraram que o sinal veio predominantemente os núcleos de fibra. Isto foi também confirmado pela perda de sinal Tead4 ChIP usando cromatina de ratos onde ele foi especificamente inativado nas fibras musculares. No entanto, mais fraca, mas claramente acima sinais de fundo, para marcadores de célula satélite, tais como Vcam1, Pax7 (dados não mostrados) podem ser detectadas mostrar que cromatina destas células também está presente. Esperamos que nosso protocolo deve ser apropriado para outras técnicas que usam formol-corrigido cromatina como C de 3/4 C e técnicas de captura de conformação de cromatina HiC. Uso do nosso protocolo para combinar que chip-seq para fatores de transcrição e modificações de cromatina com captura de conformação da cromatina no futuro deverá permitir uma compreensão detalhada do gene mecanismos reguladores na fibra muscular e como estas podem ser regulamentadas ou chateado por estímulos fisiológicos, tais como exercício, jejum, uma dieta de alta gordura, denervação, ou na doença, por meio de cromatina geneticamente preparada a partir de modificado ratos reprodução doenças como de miopatia centronuclear ligada ao X14.
Em resumo, este protocolo tempo-eficiente e de baixo custo permite o isolamento dos núcleos de fibra muscular que pode ser imediatamente lisados ou congelado a-80 ° C para uso ulterior. Uso da cromatina preparado pelo presente protocolo apresentou os primeiro genoma ampla ChIP-seq dados de fibra muscular7 e facilitará futuros estudos sobre regulação gênica neste tecido.
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Disclosures
Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.
Acknowledgments
Agradecemos a todos os funcionários da facilidade de sequenciamento de alta taxa de transferência IGBMC, um membro do consórcio "França Génomique" (ANR10-INBS-09-08) e todos os serviços IGBMC gerais em particular os funcionários do centro de animais IGBMC. Este trabalho foi apoiado por concessões do CNRS, o INSERM, o AFM, a Ligue Nationale contre le Cancer, do Estado francês fundo através da ANR no âmbito do programa d'Avenir Investissements rotulados ANR-10-IDEX-0002-02, o Labex INRT ANR-10-IDEX-0001-02 e a ANR-AR2GR-16-CE11-009-01. Os financiadores não tinham qualquer papel no projeto de estudo, coleta de dados e análise, a decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Sambakana foi suportada pelo Ligue Nationale contre le Cancer e o ANR-AR2GR-16-CE11-009-01 e V.U o Ministère de l'Enseignement et de la Recherche. ID é uma 'équipe labellisée' da Ligue Nationale contre le Cancer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| T 25 digital ULTRA-TURRAX | T 18 ULTRA-TURRAX | 0009022800 | |
| PMSF | SIGMA-ALDRICH CHIMIE SARL | P7626-25G | |
| Protease Inhibitor Cocktail-EDTA Free | Roche Diagnostics | 11873580001 | |
| Protein G Sepharose beads | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | P-3296 | |
| Proteinase K | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | P-2308 | |
| Cell Strainers 70um | Corning BV | 431751 | |
| Cell Strainers 40um | Corning BV | 352340 | |
| Formaldehyde EM grade | Euromedex | 15710-S | |
| Rnase A | Fischer Scientific | 12091039 | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1 | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | P3803 | |
| BSA | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | B4287-25G | |
| yeast tRNA | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | R5636 | |
| Glycogen Blue | AMIBION | AM9516 | |
| Pol II ChIP Antibody | Santa Cruz | SC-9001 | |
| H3K27ac ChIP Antibody | Active Motif | 39133 | |
| Tead4 ChIP Antibody | Aviva Systems Biology | (ARP38276_P050) | |
| IGEPAL | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | I-3021 | |
| E220 Focused Ultrasonicator | Covaris E220 | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Additional items | |||
| Scissors | |||
| Loose Dounce | |||
| 15 ml and 50 ml falcon tubes | |||
| 14 ml round bottom tubes | |||
| 1.5 ml and 2 ml Eppendorf tubes | |||
| 70 μm and 40 μm cell strainers (Corning) |
References
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