Summary
वयस्क माउस कंकाल मांसपेशी से क्रोमेटिन की तैयारी के लिए एक उपंयास प्रोटोकॉल क्रोमेटिन immunoprecipitation द्वारा मांसपेशी तंतुओं में जीन विनियमन के अध्ययन के लिए अनुकूलित प्रस्तुत किया है ।
Abstract
हम वयस्क माउस कंकाल मांसपेशी, संरचनात्मक प्रोटीन की एक उच्च सामग्री के साथ एक शारीरिक रूप से प्रतिरोधी ऊतक से क्रोमेटिन की तैयारी के लिए एक कुशल और प्रतिलिपि प्रोटोकॉल का वर्णन । वयस्क चूहों से विच्छेदित अंगों की मांसपेशियों को शारीरिक रूप से यांत्रिक homogenisation द्वारा बाधित कर रहे हैं, या नख़रेबाज़ और douncing का एक संयोजन, एक hypotonic बफर में formaldehyde निर्धारण के पहले सेल lysate. फिक्स्ड नाभिक कोशिका मलबे को दूर करने के लिए यांत्रिक homogenisation या douncing और अनुक्रमिक निस्पंदन के आगे चक्र द्वारा शुद्ध कर रहे हैं । शुद्ध नाभिक को तुरंत या बाद में अवस्था में जमने के बाद sonicated जा सकता है । क्रोमेटिन कुशलता से sonicated किया जा सकता है और क्रोमेटिन immunoprecipitation प्रयोगों के लिए उपयुक्त है, के रूप में प्रतिलेखन कारकों के लिए प्राप्त प्रोफाइल द्वारा सचित्र, आरएनए पोलीमरेज़ द्वितीय, और आबंध citrullinated संशोधनों । इस प्रोटोकॉल द्वारा तैयार क्रोमेटिन का उपयोग कर पाया बंधन घटनाओं मुख्य रूप से अन्य फाइबर से क्रोमेटिन की उपस्थिति के बावजूद मांसपेशी फाइबर नाभिक में जगह ले जा रहे हैं-संबंधित उपग्रह और endothelial कोशिकाओं. इस प्रोटोकॉल इसलिए वयस्क माउस कंकाल की मांसपेशी में जीन विनियमन अध्ययन के लिए अनुकूलित है ।
Introduction
क्रोमेटिन immunoprecipitation (चिप) मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (qPCR) और उच्च प्रवाह अनुक्रमण (चिप-seq) के लिए युग्मित विभिन्न ऊतकों में प्रतिलेखन और epigenetic जीन अभिव्यक्ति के नियमन का अध्ययन करने के लिए पसंद के तरीके बन गए हैं और कक्ष-प्रकार1। इस तकनीक आबंध क्रोमेटिन संशोधनों के जीनोम व्यापक रूपरेखा, citrullinated संस्करण अधिभोग, और प्रतिलेखन कारक2,3बंधन की अनुमति देता है ।
जबकि प्रसंस्कृत कोशिकाओं से चिप प्रदर्शन अच्छी तरह से स्थापित है, स्तनधारी ऊतकों से चिप अधिक चुनौतीपूर्ण रहता है । चिप के लिए क्रोमेटिन की तैयारी कई महत्वपूर्ण कदम है कि हर ऊतक और कोशिका प्रकार के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता शामिल है । क्रोमेटिन प्रसंस्कृत कोशिकाओं के सेलुलर lysates या उनके नाभिक की शुद्धि के बाद से तैयार किया जा सकता है. स्तनधारी ऊतकों, कुशल lysis, formaldehyde निर्धारण, और नाभिक के शुद्धिकरण के मामले में क्रोमेटिन की इष्टतम वसूली सुनिश्चित करने के क्रम में महत्वपूर्ण हैं । इसके अलावा, कि नाभिक को ठीक करने से पहले या उनके शुद्धिकरण के बाद के चुनाव के लिए प्रयोगात्मक निर्धारित किया जाना है । इन बाधाओं के बावजूद, चिप सफलतापूर्वक ऐसे जिगर, वृषण, या मस्तिष्क4,5,6के रूप में ऊतकों से किया गया है । कंकाल की मांसपेशी के मामले में, इस तरह के एक शारीरिक रूप से प्रतिरोधी ऊतक, जो संरचनात्मक प्रोटीन की एक उच्च सामग्री प्रदर्शित की विघटन, और इसके नाभिक के अलगाव विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण है । इस विशिष्टता को देखते हुए, अंय ऊतकों के लिए अनुकूलित प्रोटोकॉल कंकाल की मांसपेशियों के लिए संतोषजनक परिणाम नहीं देते ।
यहां हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए माउस कंकाल मांसपेशी ऊतक है कि शारीरिक रूप से ऊतक, formaldehyde निर्धारण बाधित शामिल है, और फिर नाभिक और sonication के अलगाव से चिप ग्रेड क्रोमेटिन अलग । इस विधि की दक्षता इस ऊतक से चिप के लिए उपयुक्त क्रोमेटिन तैयार करने के लिए चिप-qPCR और चिप-seq विभिन्न प्रतिलेखन कारकों के लिए प्रदर्शन करके प्रदर्शन किया गया था, आरएनए पोलीमरेज़ द्वितीय, और आबंध citrullinated संशोधन7.
इस नई तकनीक बहुत तेजी से है एक पहले रिपोर्ट प्रोटोकॉल8 लंबे समय collagenase पाचन चरणों के दौरान जिसके दौरान, प्रतिलेखन कारकों और जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन के जीनोमिक स्थानीकरण में परिवर्तन जगह ले सकते हैं । तेजी के साथ जो नाभिक अलग और तय कर रहे है विधि यहां विशेष रूप से क्रोमेटिन तैयार है कि अधिक ईमानदारी से देशी जीनोमिक अधिभोग राज्य कब्जा आकर्षक बताया जाता है । इसके अलावा, हालांकि क्रोमेटिन अलगाव या मांसपेशी ऊतक से प्रोटीन निष्कर्षण के लिए अंय तरीकों8,9,10 वर्णित किया गया है और चिप के लिए इस्तेमाल किया चयनित जीन पर qPCR प्रयोगों, कोई चिप-seq डेटा का उपयोग कर उंहें सूचित किया गया है । विधि यहां की रिपोर्ट प्रतिलेखन कारक और citrullinated संशोधन चिप seq के लिए उपयुक्त है, और इसलिए भी 3/4c या HiC क्रोमेटिन अनुरूप कब्जा अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त होना चाहिए ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
- बलिदान एक वयस्क 6 करने के लिए 8 सप्ताह पुरानी ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा माउस । Sterlise को ७०% इथेनॉल के साथ धोना और हिंद अंग की मांसपेशियों (Gastrocnemius, Tibialis पूर्वकाल, Quadriceps) ठीक बिंदु कैंची और संदंश का उपयोग करके अंग को टुकड़े ।
नोट: एक माउस ऊतक के आसपास ५०० मिलीग्राम उपज चाहिए । - एक 2 मिलीलीटर टेस्ट ट्यूब में मांसपेशियों को एक समरूप की तैयारी करने के लिए बर्फ शीत hypotonic बफर के 1 मिलीलीटर कीमा (& #60; 2-3 mm 3 ) महीन कैंची का प्रयोग टुकड़े और एक बेंच शीर्ष आंदोलनकारी पर 4 & #176 पर मिलाते हुए ट्यूब छोड़ दो; C for 5-10 min.
- एक 14 मिलीलीटर गोल नीचे ट्यूब करने के लिए homogenate हस्तांतरण और 5 मिलीलीटर ठंड hypotonic बफर (EDTA मुक्त छेड़ने अवरोधक कॉकटेल और PMSF) में reसस्पैंड ।
- Homogenise एक ढीला dounce (3 मिनट के भीतर 20-30 स्ट्रोक) या एक यांत्रिक ऊतक homogenizer के लिए 15-30 एस दौर में नीचे 14 मिलीलीटर ट्यूबों का उपयोग कर कीमा बनाया हुआ मांसपेशी ऊतक ।
नोट: lysis की दक्षता प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा इस स्तर पर मूल्यांकन किया जा सकता है, और यदि आवश्यक हो, अतिरिक्त व्यवधान प्रदर्शन किया जा सकता है ।
- Homogenise एक ढीला dounce (3 मिनट के भीतर 20-30 स्ट्रोक) या एक यांत्रिक ऊतक homogenizer के लिए 15-30 एस दौर में नीचे 14 मिलीलीटर ट्यूबों का उपयोग कर कीमा बनाया हुआ मांसपेशी ऊतक ।
- 15 मिलीलीटर ट्यूबों को homogenate स्थानांतरण और कोल्ड hypotonic बफर का उपयोग कर 10 मिलीलीटर की मात्रा भरें । अगले माउस के साथ आगे बढ़ने से पहले नीचे बताए अनुसार homogenate को ठीक करें ।
- 1% अंतिम एकाग्रता के लिए formaldehyde जोड़ें और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए हिला ।
- एक ट्यूब में ०.१२५ मीटर के अंतिम एकाग्रता के लिए glycine जोड़ने के लिए निर्धारण को रोकने और & #160 के लिए शेक, कमरे के तापमान पर 5-10 मिनट.
- Homogenise एक ढीला lysate (5-10 स्ट्रोक) का प्रयोग तय dounce ।
- स्थानांतरण करने के लिए एक 15 मिलीलीटर ट्यूब और केंद्रापसारक पर 5 मिनट के लिए १,००० x g पर 4 & #176; नाभिक और सेलुलर मलबे को प्राप्त करने के लिए सी.
- supernatant निकालें और ताजा 5 मिलीलीटर hypotonic बफर में गोली reसस्पेंड । एक ७० & #181 के माध्यम से lysate को फ़िल्टर करें; m सेल छलनी एक ५० मिलीलीटर ट्यूब में । एक ४० & #181 के माध्यम से निस्पंदन को पुन: फ़िल्टर करें; मी सेल छलनी.
- एक 15 मिलीलीटर ट्यूब करने के लिए छानने का हस्तांतरण और १,००० x g पर 5 मिनट के लिए 4 & #176 पर केंद्रापसारक; परमाणु गोली प्राप्त करने के लिए सी.
नोट: इस स्तर पर, नाभिक तुरंत sonicated हो सकता है, या तरल नाइट्रोजन में एक सूखी गोली के रूप में जमे हुए स्नैप और पर संग्रहित-८० & #176; C.
- परमाणु गोली की मात्रा का आकलन (चारों ओर ५० & #181; एल दोनों यांत्रिक और dounce homogenisation के लिए) और sonication बफर में यह पैक परमाणु मात्रा के 3 से 4 बार करने के लिए और sonicate पर 10-15 मिनट के लिए 4 & #176; C का उपयोग कर एक sonicator .
नोट: क्रोमेटिन नीचे वर्णित के रूप में तुरंत विश्लेषण किया जा सकता है (6) या जमे हुए और पर संग्रहित-८० & #176; ग.
- को डे-crosslink, कग 30 & #181; ल के क्रोमेटिन ए १.५ एमएल टेस् ट ट्यूब और जोड़ 20 & #181; l 5 M NaCl. ५०० को पूरा करने के लिए मात्रा & #181; एल और मशीन पर ६५ & #176; सी रात भर.
- अगले दिन, 1 & #181 के साथ एक उपचार करते हैं; L proteinase K (20 mg/एमएल स्टॉक), 10 & #181; l 2 M Tris pH ६.८, व 10 & #181; l के ०.५ M EDTA के लिए 1 ज पर ४२ & #176; ग. प्रदर्शन एक phenol-क्लोरोफॉर्म/क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण और 1 सोडियम की मात्रा के साथ डीएनए हाला acetat e (3 M) और 2 खंड के १००% इथेनॉल के लिए एक ज पर-८० & #176; c या रात भर पर-20 & #176; c.
- गोली १३,५०० एक्स जी पर केंद्रापसारक द्वारा डीएनए 15 मिनट के लिए supernatant और ठंड ७०% इथेनॉल के साथ अच्छी तरह से गोली धोने और 5 मिनट के लिए फिर से केंद्रापसारक । supernatant और हवा से गोली-सूखी नहीं कर सकते ।
- मूल मात्रा में गोली reसस्पेंड (30 & #181; L) ते बफर की. २६० एनएम/280 एनएम पर अवशोषक द्वारा एक spectrophotometer में डीएनए एकाग्रता उपाय । पिपेट ५००-१,००० डीएनए के एनजी एक एक डीएनए आकार सीढ़ी के साथ एक १.५% agarose जेल के अलग लेन पर और प्रदर्शन ट्रो क्रोमेटिन के टुकड़े आकार का आकलन करने के लिए.
नोट: टुकड़ा आकार २००-५०० आधार जोड़े के बीच होना चाहिए, और कोई detectable उच्च आणविक भार गैर या खराब खंडित डीएनए इसी टुकड़े होना चाहिए । यदि आवश्यक हो, क्रोमेटिन समाधान (चरण 5) एक लंबे समय के लिए फिर से sonicated जा सकता है और फिर पुनः विश्लेषण के रूप में इष्टतम आकार प्राप्त किया है जब तक ऊपर वर्णित है ।
- इथेनॉल में ५०% घोल की 1 मिलीलीटर aliquoting द्वारा प्रोटीन जी sepharose मोती ब्लॉक । एक benchtop में 1 मिनट के लिए ४०० x g पर केंद्रापसारक द्वारा मोतियों की गोली केंद्रापसारक और ४०० x जी में ते बफर केंद्रापसारक के 1 मिलीलीटर के साथ धोने और धो दोहराएं ।
- दूसरे केंद्रापसारक के बाद, फिर से 1 मिलीलीटर चिप कमजोर पड़ने बफर के 25 & #181 के साथ में निलंबित; BSA के एल (स्टॉक 20 मिलीग्राम/एमएल) और 20 & #181; l खमीर tRNA (शेयर 10 मिलीग्राम/एमएल) । 4 & #176 पर घुमाव (४०-६० rpm) द्वारा उपयोग करने से पूर्व कम से 2 h के लिए मोतियों को ब्लॉक करें; C.
- पतला ५० & #181; क्रोमेटिन के जी (चरण 5) 8 से 10 बार चिप कमजोर पड़ने बफर का उपयोग कर । Add ५० & #181; ग्री मनका घोल के एल और 2 एच रोटेटिंग के लिए (40-60 rpm) पर 4 & #176; c. केंद्रापसारक पर ४०० x g पर 4 & #176; c पूर्व-द्वाा क्रोमेटिन प्राप्त करने के लिए और यह एक ताजा ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण ।
- For immunoprecipitation, प्राथमिक एंटीबॉडी की उपयुक्त मात्रा में जोड़ें ( उदा. , 1-2 & #181; g प्रति 10 & #181; g of क्रोमेटिन) और 4 & #176 पर घुमाव के साथ रातोंरात मशीन; C.
नोट: एंटीबॉडी की इष्टतम राशि आपूर्तिकर्ता द्वारा सिफारिश की जा सकती है या एंटीबॉडी के विभिंन मात्रा के साथ चिप-qPCR प्रदर्शन द्वारा empirically निर्धारित किया जा सकता है जब तक इष्टतम संवर्धन मनाया जाता है । इसके अलावा प्रोटीन जी sepharose प्रोटीन द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है एक sepharose एंटीबॉडी के उपप्रकार के आधार पर इस्तेमाल किया । - ब्लॉक मोतियों को अगले दिन जोड़ें और रोटेशन के साथ 1 ज के लिए गर्मी (४०-६० rpm) पर 4 & #176; C. के लिए ४०० x g पर $20-30 एस के लिए मोतियों की गोली, supernatant निकालें, और शुरू चिप बहाकर ।
- चिप बहाकर: बफ़र्स के साथ निम्न बहाकर निष्पादित करें: एक बार कम नमक बफ़र के साथ, और फिर दो बार उच्च नमक बफ़र के साथ, LiCl बफ़र के साथ दो बार, और अंत में दो बार ते बफ़र के साथ.
- 4 & #176 पर रोटेशन के साथ 10 मिनट के लिए प्रत्येक धोने प्रदर्शन (४०-६० rpm); सी और एक बेंच-टॉप केंद्रापसारक में 20-30 एस के लिए ४०० x जी में केंद्रापसारक द्वारा प्रत्येक धोने के बीच मोतियों की गोली ।
- रेफरेंस के लिए, आखिरी वाश निकालें और २५० & #181 में मोतियों को फिर से सस्पेंड करें; एल रेफरेंस बफर (हौसले से तैयार) 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर जबकि मिलाते हुए ।
- ४०० x जी पर केंद्रापसारक और एक ताजा ट्यूब में eluate इकट्ठा । इस चरण को दो बार करें और फिर de-crosslink 20 & #181 के साथ रात भर eluate; l NaCl 5 M र 1 & #181; l RNase A (10 mg/एमएल), proteinase K के साथ इलाज, और phenol-क्लोरोफॉर्म/क्लोरोफॉर्म extrचरण 6. के रूप में कार्य
- reसस्पैंड in ५० & #181; L ते का बफर और उपयोग aliquots के लिए चिप-qPCR मानक प्रोटोकॉल के अनुसार < सुप वर्ग = "xref" > 15 चिप की गुणवत्ता की जांच के लिए ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
नाभिक को अलग करने के लिए, हम या तो 15 या ४५ एस के लिए विच्छेदित और कीमा बनाया हुआ मांसपेशी ऊतक के यांत्रिक homogenization प्रदर्शन किया, १८,००० और २२,००० rpm पर ( सामग्री की तालिकादेखें) । सभी स्थितियों में, नाभिक ऊतक मलबे से अलग किया जा सकता है, लेकिन उपज कम गति (चित्र 1a-B) का उपयोग कर इष्टतम था । नाभिक भी 3-5 मिनट के लिए douncing द्वारा तैयार किया जा सकता है(चित्र 1a, और नहीं दिखाया गया डेटा), लेकिन यांत्रिक homogenization पसंद की विधि है, नाभिक के इष्टतम पैदावार के रूप में कम के रूप में 15 एस में प्राप्त किया जा सकता है, समय का एक महत्वपूर्ण लाभ की अनुमति विशेष रूप से अगर एकाधिक नमूनों को संसाधित किया जाना है (चित्र 1b) । इस प्रोटोकॉल का प्रयोग, अप करने के लिए २.७ x 107 नाभिक से ५०० मिलीग्राम ऊतक के (समकक्ष के लिए 1 है माउस ऊतक) क्रोमेटिन के १०० µ जी उत्पन्न करने के लिए अलग किया जा सकता.
तय नाभिक से क्रोमेटिन विखंडन का अनुकूलन करने के लिए, हम 5 से 20 मिनट के लिए sonicated । सेटिंग्स ( सामग्री की तालिकादेखें) के अंतर्गत, एक 10 मिनट sonication २५० bp (चित्रा 2) के एक औसत अंश आकार के साथ क्रोमेटिन उत्पन्न करने के लिए इष्टतम था । इस कदम को प्रयोग में sonicator के प्रकार के खाते में ले अनुकूलित किया जाना चाहिए ।
ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल द्वारा तैयार की मांसपेशी क्रोमेटिन की गुणवत्ता का आकलन करने के लिए, चिप-qPCR और चिप-seq प्रयोगों प्रतिलेखन कारकों के खिलाफ प्रदर्शन किया गया, एक citrullinated संशोधन या आरएनए पोलीमरेज़ द्वितीय (पोल द्वितीय). चिप-qPCR glucocorticoid रिसेप्टर (जीआर) के खिलाफ उपस्थिति या डेक्समेतएसॉनी (Dex) के अभाव में उपचार के नियामक तत्वों पर मजबूत Dex निर्भर जीआर संवर्धन से पता चला Redd1 और Murf1 जीन है कि Dex और जीआर जाना जाता है 11मांसपेशी फाइबर में विनियमित है, जबकि कोई संकेत वृषण विशिष्ट Prm1 प्रमोटर एक नकारात्मक नियंत्रण (चित्रा 3) के रूप में इस्तेमाल किया पर देखा गया था ।
चिप-qPCR के खिलाफ acetylated lysine 27 citrullinated H3 (H3K27ac), एक आबंध संशोधन सक्रिय बढ़ाने और प्रमोटरों में पाया, Desmin (Des) प्रमोटर में मजबूत संवर्धन दिखाया है कि मांसपेशी फाइबर में सक्रिय है, एक नकारात्मक की तुलना में intergenic नियंत्रण क्षेत्र (चित्र बी) । H3K27ac चिप-seq डेस लोकस, एक ' सुपर बढ़ाने ' विनियमित ऊतक पहचान जीन12 (चित्रा 4a) की खासियत भर में इस निशान के एक उच्च स्तर से पता चला । इसी प्रकार, पॉल द्वितीय चिप-seq इस लोकस पर लिखित पोल द्वितीय के उच्च स्तर दिखाया ।
चिप प्रतिलेखन कारक Tead4, जो myogenic भेदभाव13,7में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है के लिए qPCR, पहले Ccnd1 और Ifrd1 जीन में वर्णित बंधन साइटों पर अपने संवर्धन से पता चला ( चित्र 3सी) । महत्वपूर्ण बात, संवर्धन चूहों जहां Tead4 चुनिंदा मांसपेशी तंतुओं (Tead4एसकेएम-/)7 (आंकड़ा 3सी) में निष्क्रिय था से तैयार क्रोमेटिन का उपयोग कम हो गया था । दोनों Tead1 और Tead4 के लिए चिप-seq डेटा का विश्लेषण के प्रवर्तक में एक साइट के लिए उनके बंधन दिखाया Kdm5a जीन जंगली प्रकार की मांसपेशी से क्रोमेटिन का उपयोग कर, जबकि Tead4 संकेत है, लेकिन नहीं है कि Tead1, H3K27ac, या पोल द्वितीय के, से क्रोमेटिन का उपयोग कर खो गया था Tead4एसकेएम-/ चूहों (चित्रा 4B) की मांसपेशियां. इसी प्रकार, Tead1 और Tead4 Adssl1 जीन के एक विनियामक तत्व बहाव के लिए बाध्यकारी जंगली प्रकार की मांसपेशी से क्रोमेटिन के साथ देखा जाता है, जबकि Tead4 बंधन चुनिंदा क्रोमेटिनTead4-/ मांसपेशी से एसकेएम का उपयोग कर खो गया था ( चित्र 4c) । इन टिप्पणियों का प्रदर्शन है कि चिप में देखा Tead4 संकेत-seq डेटा मांसपेशी फाइबर में बाध्यकारी से आया है ।
चिप-seq परिणाम के लिए मांसपेशी फाइबर के साथ जुड़े अन्य सेल प्रकार के योगदान का निर्धारण करने के लिए, हम Vcam1 जीन है कि मांसपेशी उपग्रह कोशिकाओं और Pecam1, के एक मार्कर में सक्रिय है पर H3K27ac और पॉल द्वितीय संकेतों का आकलन रक्त वाहिनियों की endothelial कोशिकाएं जो मांसपेशियों को सिंचित करते हैं । उच्च डेस या Adssl1 जीन पर देखा स्तर की तुलना में, H3K27ac और पॉल दोनों Vcam1 और Pecam1 जीन पर देखा द्वितीय के स्तर बहुत कम थे (आंकड़ा 4a और आंकड़ा 4c) । मांसपेशी फाइबर के लिए संकेत में बड़े अंतर जीन व्यक्त की तुलना में संबंधित ऊतकों में व्यक्त की उन से संकेत मिलता है कि संकेत चिप में देखा प्रोटोकॉल का उपयोग कर तैयार क्रोमेटिन से ऊपर मुख्य रूप से आता है में बाध्यकारी घटनाओं मांसपेशी फाइबर ।
चित्रा 1: वयस्क माउस मांसपेशी से नाभिक का शुद्धिकरण. (क) ऊतक यांत्रिक homogenisation द्वारा प्राप्त lysates (१८,००० rpm, ४५ एस) और dounce homogenization (30 स्ट्रोक/trypan नीले रंग के साथ दाग थे और एक डिजिटल माइक्रोस्कोप के तहत मनाया और छवियों 20X आवर्धन पर कब्जा कर लिया गया । स्केल बार = १०० µm. (B) से प्राप्त नाभिक की संख्या ५०० मिलीग्राम ऊतक (1 माउस के बराबर) के लिए संकेत शर्तों, १८,००० और २२,००० rpm के तहत तैयार करने के बाद 15 और ४५ एस या douncing के 3 मिनट । त्रुटि पट्टियां माध्य ± S.E.M. के लिए n = 3 चूहों के लिए यांत्रिक homogenization, और n = 3 douncing के लिए चूहों का प्रतिनिधित्व करते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 2: क्रोमेटिन अंश आकार का सत्यापन. अलग नाभिक 5, 10, 15 या 20 मिनट के लिए sonicated के रूप में संकेत दिया गया । de-crosslinking और शुद्धि के बाद, डीएनए टुकड़ा आकार ethidium ब्रोमाइड की उपस्थिति में agarose जेल ट्रो द्वारा मूल्यांकन किया गया था । एम डीएनए आकार मार्कर है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 3: चिप-qPCR के लिए क्रोमेटिन का उपयोग करें । (क) चूहों वाहन या डेक्समेतएसॉनी के इंट्रा पेरिटोनियल इंजेक्शन के अधीन थे (10 मिलीग्राम/और १.५ ज के बाद, क्रोमेटिन हिंद अंग की मांसपेशियों से तैयार किया गया था । जीआर लक्ष्य जीन Redd1 और Murf1, नकारात्मक नियंत्रण protamine प्रवर्तक (Prm1) की तुलना में चिप में संवर्धन, इनपुट के एक% के रूप में संकेत दिया है उपजी है । (ख) चिप H3K27ac और आईजीजी नियंत्रण एंटीबॉडी के लिए प्रदर्शन किया और Desmin प्रमोटर पर विश्लेषण और एक intergenic नकारात्मक नियंत्रण क्षेत्र की तुलना में किया गया था । (ग) Tead4 चिप मांसपेशी जंगली प्रकार और मांसपेशी विशेष Tead4 नॉकआउट चूहों (Tead4एसकेएम-/) से प्राप्त क्रोमेटिन पर प्रदर्शन किया और Tead4 और Ccnd1 प्रवर्तकों में Ifrd1 बंधन साइटों पर विश्लेषण किया गया था, की तुलना में नियंत्रण intergenic क्षेत्र । सभी प्रयोगों में, 3 चूहों से क्रोमेटिन परित किया गया था और त्रुटि पट्टियां एक छात्र के टी में तीन तकनीकी दोहराने के लिए परीक्षण में मतलब ± एस. ई. एम का प्रतिनिधित्व करते हैं । P मान & #60; ०.००१ * *, & #60; ०.०००१ * * *; एन एस, गैर महत्वपूर्ण । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 4: मांसपेशी फाइबर क्रोमेटिन के जीनोमिक प्रोफाइल. (क) Universit से स्क्रीनशॉटसंकेत loci के सांता Cruz जीनोम ब्राउज़र में कैलिफोर्निया के वाई बहुत उच्च H3K27ac और Desmin जीन में पॉल द्वितीय स्तर illustrating, अत्यधिक मांसपेशी फाइबर में व्यक्त की, Vcam1 और Pecam1 जीन उपग्रह कोशिकाओं में व्यक्त की तुलना में और endothelial कोशिकाओं, क्रमशः । (ख) संकेत loci के UCSC स्क्रीनशॉट Tead1 और Tead4 के बंधन illustrating, साथ ही H3K27ac और पोल द्वितीय, जंगली से क्रोमेटिन में प्रकार (WT) मांसपेशी की तुलना में Tead4एसकेएम-/ (मीट्रिक टन) मांसपेशी, जहां Tead4 बंधन के चयनात्मक नुकसान है मनाया. चिप-seq डाटा सचित्र भू डाटाबेस में GSE82193 के रूप में उपलब्ध है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
| बफ़र नाम | संयोजन | ||
| Hypotonic बफर | 10 मिमी HEPES-कोह (पीएच ७.३) | ||
| 10 एमएम KCl | |||
| 5 मिमी MgCl2 | |||
| ०.१% NP-४० | |||
| ०.१ mM PMSF (हौसले से जोड़ा) | |||
| छेड़ने वाला अवरोधक कॉकटेल (PIC) 1x (हौसले से जोड़ा) | |||
| Sonication बफ़र | 1% एसडीएस | ||
| 10 एमएम EDTA | |||
| 20 एमएम Tris-एचसीएल नं० 8 | |||
| १५० मिमी NaCl | |||
| ०.१% सोडियम Deoxycholate | |||
| 1% ट्राइटन एक्स-१०० | |||
| हौसले से जुड़ेंगे ०.१ एमएम के PMSF | |||
| PIC 1x | |||
| चिप कमजोर पड़ने बफर | ०.०१% एसडीएस | ||
| १.१% ट्राइटन एक्स-१०० | |||
| १.२ मिमी EDTA | |||
| १६.७ एमएम Tris एचसीएल pH8 | |||
| १६७ मिमी NaCl | |||
| हौसले से जुड़ेंगे ०.१ एमएम के PMSF | |||
| PIC 1x | |||
| कम नमक बफर | ०.१% एसडीएस | ||
| 1% ट्राइटन एक्स-१०० | |||
| ५०० मिमी EDTA | |||
| 20 एमएम Tris एचसीएल pH8 | |||
| १५० मिमी NaCl | |||
| उच्च नमक बफर | ०.१% एसडीएस | ||
| 1% ट्राइटन एक्स-१०० | |||
| ५०० मिमी EDTA | |||
| 20 एमएम Tris एचसीएल pH8 | |||
| ५०० मिमी NaCl | |||
| LiCl बफर | २५० मिमी LiCl | ||
| 1% NP-४० | |||
| 1 मिमी EDTA | |||
| 10 एमएम Tris एचसीएल नं० 8 | |||
| रेफरेंस बफर | 1% एसडीएस | ||
| १०० मिमी NaHCO3 | |||
| Tris-EDTA (ते) बफर | ५० एमएम Tris एचसीएल नं० 8 | ||
| 1 मिमी EDTA | |||
तालिका 1: बफ़र रचनाएं ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
यहां हम वयस्क माउस कंकाल की मांसपेशियों और शो से क्रोमेटिन तैयारी के लिए एक उपंयास प्रोटोकॉल का वर्णन है कि इस क्रोमेटिन चिप प्रयोगों कि प्रतिलेखन कारक बाध्यकारी और आबंध मांसपेशी फाइबर नाभिक में citrullinated संशोधनों का पता लगाने के लिए उपयुक्त है । इस प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण चरण शामिल हैं । पहली ऊतक व्यवधान है कि या तो dounce द्वारा या यांत्रिक बाल काटना द्वारा प्रदर्शन किया जा सकता है । यांत्रिक बाल काटना तेजी से और अधिक प्रतिलिपि है, और इसलिए पसंद की विधि है । फिर भी, यदि कोई उपयुक्त उपकरण उपलब्ध नहीं है, व्यवधान douncing, द्वारा किया जा सकता है, जहां माइक्रोस्कोप के तहत lysis की दक्षता का मूल्यांकन निर्धारण कदम पर आगे बढ़ने से पहले की सिफारिश की है । पृथक नाभिक के निर्धारण के बजाय पूरे ऊतक lysates के निर्धारण, छोटे मात्रा में और कम अवधि के लिए अधिक प्रतिलिपि sonication की अनुमति दी । हम भी व्यवधान के बाद lysates ठीक करने के बजाय व्यवधान से पहले ऊतक तय चुना है, के रूप में थॉमस एट अल द्वारा वर्णित है । 10 पूर्व फिक्सिंग ऊतक homogenisation की कम क्षमता के परिणामस्वरूप । यांत्रिक बाल काटना पर आधारित इस प्रोटोकॉल collagenase पाचन के रूप में अन्य प्रस्तावित समाधान, की तुलना में भी तेजी से है, जो ३७ डिग्री सेल्सियस पर विच्छेदित ऊतक के लंबे समय तक मशीन शामिल8. इस अवधि के दौरान, जीन अभिव्यक्ति और प्रतिलेखन कारक बंधन में परिवर्तन हो सकता है । के रूप में संभव के रूप में तेजी से नाभिक फिक्सिंग इसलिए अधिक ईमानदारी से सामांय शारीरिक राज्य पर कब्जा करने के लिए आवश्यक है ।
एक दूसरा महत्वपूर्ण कदम तय lysate से नाभिक की शुद्धि है. इस के लिए, निश्चित lysate समाधान के अनुक्रमिक फ़िल्टरिंग, पहले एक ७० µm सेल छलनी के माध्यम से बड़ा मलबे को खत्म करने और फिर एक ४० µm सेल छलनी के माध्यम से ठीक मलबे को हटाने के लिए, उपभेदों कॉलेस्ट्रॉल से बचा जाता है और नाभिक प्राप्त की पैदावार अधिकतम । एक बार निस्पंदन द्वारा शुद्ध, नाभिक sonicated और डीएनए टुकड़ा आकार de-crosslinking के बाद निर्धारित कर रहे हैं । एक चूहे की पैदावार के दो हिंद अंग से एक ठेठ तैयारी क्रोमेटिन के १०० µ जी । 3 चूहों को lysates से तैयार करने के दौरान नुकसान को कम करने से उपज में सुधार हो सकता है । इस प्रक्रिया के रूप में यह क्रोमेटिन के रूप में जीनोमिक डीएनए के ७५% तक की वसूली की अनुमति देता है कुशल है (नहीं दिखाया डेटा) ।
चिप प्रयोग प्रतिलेखन कारक बाध्यकारी और epigenetic संशोधनों का आकलन डिजाइन मांसपेशी फाइबर नाभिक में जीन विनियमन अध्ययन के लिए इस प्रोटोकॉल की उपयुक्तता का प्रदर्शन किया । मजबूत और मजबूत चिप-seq पॉल द्वितीय और H3K27ac के लिए संकेत क्रोमेटिन से उत्पंन किया गया, उनकी विशिष्ट H3K27ac और पॉल द्वितीय प्रोफाइल द्वारा मांसपेशी फाइबर पहचान जीन की पहचान की अनुमति7। H3K27ac और पोल द्वितीय के बहुत उच्च स्तर जीन पर दृढ़ता से फाइबर नाभिक में व्यक्त की, उपग्रह या endothelial कोशिकाओं में व्यक्त जीन की तुलना में, पता चला है कि संकेत मुख्य रूप से फाइबर नाभिक से आया था । यह भी Tead4 चिप संकेत के नुकसान से जहां यह विशेष रूप से मांसपेशी फाइबर में निष्क्रिय किया गया था चूहों से क्रोमेटिन का उपयोग करने की पुष्टि की थी । फिर भी, कमजोर है, लेकिन स्पष्ट रूप से ऊपर पृष्ठभूमि संकेतों, ऐसे Vcam1, Pax7 (डेटा नहीं दिखाया गया है) के रूप में उपग्रह सेल मार्करों के लिए दिखा पता लगाया जा सकता है कि इन कोशिकाओं से क्रोमेटिन भी मौजूद है । हमें आशा है कि हमारे प्रोटोकॉल अंय तकनीकों कि 3 सी/4c और HiC क्रोमेटिन अनुरूप कब्जा तकनीकों के रूप में formaldehyde-फिक्स्ड क्रोमेटिन का उपयोग करने के लिए उपयुक्त होना चाहिए । चिप के संयोजन के लिए हमारे प्रोटोकॉल का प्रयोग-प्रतिलेखन कारकों और क्रोमेटिन अनुरूप कब्जा के साथ क्रोमेटिन संशोधनों के लिए seq भविष्य में चाहिए मांसपेशी फाइबर में जीन विनियामक तंत्र की एक विस्तृत समझ की अनुमति है और कैसे इन विनियमित किया जा सकता है या इस तरह के व्यायाम, उपवास, एक उच्च वसा आहार, निस्तेजन, या रोग के रूप में शारीरिक उत्तेजनाओं से परेशान, आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों से तैयार क्रोमेटिन का उपयोग करके एक्स-लिंक्ड centronuclear मायोपथी की तरह रोगों reproducing14।
संक्षेप में, इस कम लागत और समय कुशल प्रोटोकॉल मांसपेशी फाइबर नाभिक के अलगाव कि तुरंत या sonicated जा सकता है पर जमे हुए गुप्त उपयोग के लिए-८० डिग्री सेल्सियस की अनुमति देता है । इस प्रोटोकॉल द्वारा तैयार क्रोमेटिन का उपयोग मांसपेशी फाइबर से पहले जीनोम व्यापक चिप seq डेटा प्रदान की गई है7 और इस ऊतक में जीन विनियमन पर भविष्य के अध्ययन की सुविधा होगी ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है ।
Acknowledgments
हम IGBMC उच्च प्रवाह अनुक्रमण सुविधा, "फ्रांस Génomique" कंसोर्टियम (ANR10-INBS-09-08) और विशेष रूप से IGBMC पशु सुविधा के कर्मचारियों में सभी IGBMC सामांय सेवाओं के एक सदस्य के सभी कर्मचारियों को धंयवाद । इस कार्य को CNRS, द INSERM, द AFM, द Ligue राष्ट्रीयकृत contre le Cancer, फ्रेंच स्टेट फंड के माध्यम से ANR के माध्यम से अनुदान का समर्थन किया गया Investissements d'Avenir बला ANR-10-IDEX-0002-02, द Labex INRT ANR-10-IDEX-0001-02 और ANR-AR2GR-16-CE11-009-01. funders अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशित करने का निर्णय, या पांडुलिपि की तैयारी में कोई भूमिका नहीं थी । एस जे Ligue राष्ट्रीयकृत contre le कैंसर और ANR-AR2GR-16-CE11-009-01, और वी. यू द्वारा Ministère de l'Enseignement एट डे ला सूक्ष्म द्वारा समर्थित किया गया था । ID एक ' équipe labellisée ' का Ligue राष्ट्रीयकृत contre le Cancer है ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| T 25 digital ULTRA-TURRAX | T 18 ULTRA-TURRAX | 0009022800 | |
| PMSF | SIGMA-ALDRICH CHIMIE SARL | P7626-25G | |
| Protease Inhibitor Cocktail-EDTA Free | Roche Diagnostics | 11873580001 | |
| Protein G Sepharose beads | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | P-3296 | |
| Proteinase K | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | P-2308 | |
| Cell Strainers 70um | Corning BV | 431751 | |
| Cell Strainers 40um | Corning BV | 352340 | |
| Formaldehyde EM grade | Euromedex | 15710-S | |
| Rnase A | Fischer Scientific | 12091039 | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1 | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | P3803 | |
| BSA | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | B4287-25G | |
| yeast tRNA | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | R5636 | |
| Glycogen Blue | AMIBION | AM9516 | |
| Pol II ChIP Antibody | Santa Cruz | SC-9001 | |
| H3K27ac ChIP Antibody | Active Motif | 39133 | |
| Tead4 ChIP Antibody | Aviva Systems Biology | (ARP38276_P050) | |
| IGEPAL | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | I-3021 | |
| E220 Focused Ultrasonicator | Covaris E220 | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Additional items | |||
| Scissors | |||
| Loose Dounce | |||
| 15 ml and 50 ml falcon tubes | |||
| 14 ml round bottom tubes | |||
| 1.5 ml and 2 ml Eppendorf tubes | |||
| 70 μm and 40 μm cell strainers (Corning) |
References
- Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions. Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).
- Furey, T. S. ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions. Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).
- Wade, J. T. Mapping Transcription Regulatory Networks with ChIP-seq and RNA-seq. Adv Exp Med Biol. 883, 119-134 (2015).
- Alpern, D., et al. TAF4, a subunit of transcription factor II D, directs promoter occupancy of nuclear receptor HNF4A during post-natal hepatocyte differentiation. Elife. 3, e03613 (2014).
- Martianov, I., et al. Cell-specific occupancy of an extended repertoire of CREM and CREB binding loci in male germ cells. BMC Genomics. 11, 530 (2010).
- Achour, M., et al. Neuronal identity genes regulated by super-enhancers are preferentially down-regulated in the striatum of Huntington's disease mice. Hum Mol Genet. 24 (12), 3481-3496 (2015).
- Joshi, S., et al. TEAD transcription factors are required for normal primary myoblast differentiation in vitro and muscle regeneration in vivo. PLoS Genet. 13 (2), e1006600 (2017).
- Ohkawa, Y., Mallappa, C., Dacwag-Vallaster, C. S., Imbalzano, A. N. Myogenesis: Methods and protocols. DiMario, J. 798, Springer Science+Business Media LLC. 517-531 (2012).
- Dimauro, I., Pearson, T., Caporossi, D., Jackson, M. J. A simple protocol for the subcellular fractionation of skeletal muscle cells and tissue. BMC Res Notes. 5, 513 (2012).
- Thomas, J. L., et al. PAK1 and CtBP1 Regulate the Coupling of Neuronal Activity to Muscle Chromatin and Gene Expression. Mol Cell Biol. 35 (24), 4110-4120 (2015).
- Kuo, T., et al. Genome-wide analysis of glucocorticoid receptor-binding sites in myotubes identifies gene networks modulating insulin signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (28), 11160-11165 (2012).
- Whyte, W. A., et al. Master transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes. Cell. 153 (2), 307-319 (2013).
- Benhaddou, A., Keime, C., Ye, T., Morlon, A., Michel, I., Jost, B., Mengus, G., Davidson, I. Transcription factor TEAD4 regulates expression of myogenin and the unfolded protein response genes during C2C12 cell differentiation. Cell Death and Differentiation. 19 (2), 220-231 (2011).
- Cowling, B. S., et al. Reducing dynamin 2 expression rescues X-linked centronuclear myopathy. J Clin Invest. 124 (3), 1350-1363 (2014).
- Thermo Fisher Scientific. ChIP Analysis. , Available from: https://www.thermofisher.com/fr/fr/home/life-science/epigenetics-noncoding-rna-research/chromatin-remodeling/chromatin-immunoprecipitation-chip/chip-analysis.html (2017).
