Summary
Kromatin yetişkin fare iskelet kas kas lifleri gen düzenlemesi çalışmanın Kromatin immunoprecipitation tarafından uyarlanmış üzerinden hazırlanması için yeni bir protokol sunulmuştur.
Abstract
Biz Kromatin yetişkin fare iskelet kası, yapısal proteinler yüksek bir içerik ile fiziksel olarak dayanıklı bir doku üzerinden hazırlanması için verimli ve tekrarlanabilir bir protokol tanımlamak. Disseke bacak kasları yetişkin fareler üzerinden fiziksel olarak mekanik homojenizasyon veya kıyma ve douncing, önce formaldehit fiksasyon lysate hücrenin Hipotonik arabellekte bir arada tarafından bozulur. Sabit çekirdek mekanik homojenizasyon veya douncing ve hücre artıkları kaldırmak için sıralı filtrations daha fazla döngüleri tarafından saf. Arıtılmış çekirdeklerin hemen veya daha sonraki bir aşamada donma sonra sonicated. Kromatin verimli bir şekilde sonicated ve transkripsiyon faktörleri, RNA polimeraz II ve kovalent Histon değişiklikler için uygun Kromatin immunoprecipitation deneyleri için profilleri tarafından gösterildiği gibi elde edilir. Bu iletişim kuralı tarafından hazırlanan Kromatin kullanarak tespit bağlama olayları ağırlıklı olarak kas lif çekirdeği Kromatin fiber ilişkili diğer uydu ve endotel hücreleri varlığı rağmen meydana bunlar. Bu iletişim kuralı bu nedenle yetişkin fare iskelet kas gen düzenlemesi çalışmaya adapte.
Introduction
Kromatin immunoprecipitation (ChIP) kantitatif Polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) birleştiğinde ve yüksek işlem hacmi sıralama (ChIP-seq) transkripsiyon çalışmaya seçim yöntemleri ve epigenetik gen ekspresyonu çeşitli dokularda düzenlenmesi olmuştur ve hücre-tip1. Bu teknik genom çapında kovalent Kromatin değişiklikler, Histon varyant doluluk ve transkripsiyon faktörü bağlama2,3profil oluşturma sağlar.
ChIP kültürlü hücrelerden performans iyi kurulmuş olmakla birlikte, küçük parça--dan memeli dokulara daha zor kalır. Kromatin küçük parça için hazırlanıyor her doku ve hücre türü için optimize edilmiş olması gereken birkaç kritik adımları içerir. Kromatin kültürlü hücre hücresel lysates veya kendi çekirdek aşağıdaki arıtma hazırlanabilir. Memeli dokular söz konusu olduğunda, verimli lizis, formaldehit fiksasyon ve çekirdekleri arıtma Kromatin en iyi kurtarma sağlamak için önemlidir. Ayrıca, deneysel olarak belirlenecek önce veya sonra kendi arıtma çekirdeklerin düzeltmek seçeneği vardır. Bu engellerin rağmen çip başarıyla karaciğer, testis veya beyin4,5,6gibi dokularda üzerinden yapıldı. İskelet kası durumunda bozulma dokusunun yapısal proteinlerin yüksek bir içerik ve izolasyon-in onun çekirdeği sergileyen böyle bir fiziksel olarak dayanıklı, özellikle zorlu 's. Bu özgüllüğü göz önüne alındığında, diğer dokular için en iyi duruma getirilmiş iletişim kuralları tatmin edici sonuçlar iskelet kasları için vermeyin.
Burada ChIP-grade Kromatin fiziksel olarak doku, formaldehit fiksasyon ve çekirdekleri ve sonication yalıtım engellemeden içerir fare iskelet kas dokusundan izole etmek için bir protokol açıklayın. Kromatin bu dokudan küçük parça için uygun hazırlamak için bu yöntem verimliliğini çeşitli transkripsiyon faktörleri, RNA polimeraz II ve kovalent Histon değişiklikler7için ChIP-qPCR ve ChIP-seq gerçekleştirerek gösterilmiştir.
Bu yeni teknik uzun collagenase sindirim adımları hangi zaman, genomik transkripsiyon faktörleri lokalizasyonu değişimler sırasında oluşan bir daha önce raporlanmış protokolü8 ' den çok daha hızlı ve değişiklikler gen ifadesinin içinde yer alabilir. Hangi ile çekirdekleri izole ve sabit hız burada açıklanan yöntemi daha sadakatle yerli genomik doluluk durumu yakalar Kromatin hazırlamak özellikle cazip kılıyor. Ayrıca, Kromatin yalıtım veya protein kas dokusunun çıkarılması için diğer yöntemleri olmasına rağmen açıklanan8,9,10 edilmiş ve seçili genler, hiçbir çip seq üzerinde ChIP-qPCR deneyler için kullanılan veri bunları kullanarak rapor edildi. Rapor burada yöntem transkripsiyon faktörü ve Histon değişikliği için ChIP-seq uygundur ve bu nedenle de 3/4 C veya hıc Kromatin conformation yakalama uygulamaları için uygun olmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
fareler sürekli bakım ve laboratuvar hayvanlarının kullanımı ile ilgili Kurumsal yönergelere uygun olarak ve uygun olarak ulusal hayvan bakım kuralları (Avrupa Komisyonu yönergesi 86/609/CEE; Fransızca kararname no.87-848). Tüm yordamları Fransız Ulusal Etik Komitesi tarafından kabul edildi.
1. yalıtım kas dokusu
- kurban bir yetişkin 6 8 haftalık için fare ile servikal çıkığı. Sterlise % 70 etanol ile durulama tarafından bacak ve para cezası nokta makas ve forseps kullanarak arka bacak kasları (gastroknemius, Tibialis önünde, Quadriceps) teşrih.
Not: Bir fare yaklaşık 500 mg doku verim. - 2 mL içeren homojen bir hazırlık küçük buz gibi Hipotonik arabelleğe 1 mL tüp bebek kaslarında kıyma (< 2-3 mm 3) kullanarak adet ince makas ve tezgah üst karıştırıcı 5-10 dakika süreyle 4 ° C'de sallayarak tüp terk
2. Doku lizis
Not: tüm besteleri arabellek için Tablo 1 ' e bakınız.
- Homogenate 14 mL yuvarlak alt tüp aktarmak ve 5 mL soğuk Hipotonik arabellekte (EDTA ücretsiz proteaz inhibitörü kokteyl ve PMSF) resuspend.
- Homogenise 15-30 s yuvarlak alt 14 mL tüpler için gevşek dounce (3 dakika içinde 20-30 vuruş) veya mekanik doku homogenizer kullanarak kıyılmış kas dokusu.
Not: Lizis verimliliğini tarafından ışık mikroskobu bu aşamada tespit edilebilir ve gerekirse, ek kesinti yapılabilir.
- Homogenise 15-30 s yuvarlak alt 14 mL tüpler için gevşek dounce (3 dakika içinde 20-30 vuruş) veya mekanik doku homogenizer kullanarak kıyılmış kas dokusu.
- Homogenate 15 mL tüpler için transfer ve 10 mL soğuk Hipotonik arabellek kullanarak birime doldurun. Sonraki fare ile devam etmeden önce aşağıda açıklandığı gibi homogenate saptamak.
3. Fiksasyon
- formaldehit % 1 son toplama eklemek ve oda sıcaklığında 10 dakika çalkalanır.
- Glisin 0,125 M son bir konsantrasyon fiksasyon ve sallamak için oda sıcaklığında 5-10 dk durdurmak için her tüpün ekleyin.
4. Çekirdeklerin hazırlık
Not: tüm besteleri arabellek için Tablo 1 ' e bakınız.
- Sabit lysate gevşek dounce (5-10 vuruş) kullanarak Homogenise.
- 15 mL tüp ve 1000 x g, santrifüj 4 ° C'de 5 min için çekirdek ve hücresel enkaz elde etmek için transfer.
- Süpernatant kaldırmak ve Pelet taze 5 mL Hipotonik arabellekte resuspend. Lysate 70 µm hücre süzgeç aracılığıyla 50 mL tüp içine filtre. Filtrate 40 µm hücre süzgeç aracılığıyla yeniden filtre.
- Transfer filtrate 15 mL tüp ve santrifüj 1000 x g de 4 ° C'de nükleer Pelet elde etmek için 5 dakika.
Not: Bu aşamada çekirdeklerin hemen sonicated veya sıvı azot kuru bir Pelet donmuş ve-80 depolanan yaslama ° C.
5. Sonication
- nükleer Pelet (makine ve dounce homojenizasyon için yaklaşık 50 µL) hacmi değerlendirmek ve sonication tampon 3-4 kez Paketli nükleer birimin kadar resuspend ve bir sonicator kullanarak 4 ° C'de 10-15 dk için solüsyon içeren temizleyicide .
Not: Kromatin olabilir (6) aşağıda açıklandığı gibi hemen analiz veya dondurulmuş ve-80 depolanan ° C.
6. Kromatin parça boyutu Sonication takip değerlendirirken
Not: tüm besteleri arabellek için Tablo 1 ' e bakınız.
- İçin de-crosslink, Kromatin 30 µL 1,5 mL tüp içinde alıp 20 µL 5 M NaCl. 500 µL birime tamamlamak ve 65 ° C'de gecede kuluçkaya.
- Ertesi gün, bir tedavi (20 mg/mL stok), 10 µL 2 M Tris pH 6.8 ve 10 µL 0,5 M EDTA 42 ° C. gerçekleştir fenol-kloroform/kloroform ayıklama, 1 h, 1 µL İndinavir K ile gerçekleştirmek ve sodyum acetat 1 hacmi ile DNA çökelti e (3 M) ve 2 cilt % 100 etanol için bir h-80 ° C'de veya gecede -20 ° c
- DNA tarafından Santrifüjü 13.500 x g 15 dk. Decant süpernatant de cips ve Pelet soğuk % 70 etanol ve 5 dk. Decant süpernatant için tekrar santrifüj ile iyice yıkayın ve Pelet kuruması.
- Pelet TE arabellek özgün birimi (30 µL) içinde resuspend. 260 nm/280 nm Absorbans tarafından bir Spektrofotometre DNA konsantrasyon ölçmek. 500-1000 ng DNA ile birlikte ayrı bir % 1.5 özel jel hatlarının bir DNA boyutu merdiven pipette ve Elektroforez Kromatin parçası boyutunu değerlendirmek için gerçekleştirin.
Not: Parça boyutu 200-500 baz çifti arasında olmalıdır ve sigara - ya da kötü-parçalanmış için DNA karşılık gelen parçaları yok algılanabilir yüksek molekül ağırlıklı olmalıdır. Gerekirse, Kromatin çözüm (5. adım) daha uzun bir süre için yeniden sonicated olabilir ve en uygun boyutu elde edilir kadar yukarıda açıklandığı gibi yeniden analiz.
7. Kromatin Immunoprecipitation (ChIP)
Not: tüm besteleri arabellek için Tablo 1 ' e bakınız.
- Blok Protein G sepharose boncuk aliquoting 1 mL etanol içinde % 50 Bulamaç tarafından. Santrifüjü 400 x g 1 min bir benchtop için de tarafından boncuk santrifüj kapasitesi ve TE arabellek santrifüj 400 x g, 1 mL ile yıkayın ve yıkama tekrar Pelet
- Sonra ikinci Santrifüjü, yeniden askıya alma 1 ml çip seyreltme arabelleği 25 µL BSA (hisse senedi 20 mg/mL) ile ve 20 µL tRNA (hisse senedi 10 mg/mL) Maya
- . Döndürme (40-60 rpm) 4 tarafından en az 2 kullanılmadan önce s boncuk engellemek ° C.
- Seyreltik 50 µg Kromatin (5. adım), 8-10 kez çip seyreltme tampon kullanarak. Engellenen boncuk Bulamaç 50 µL ekleyin ve 4'te (40-60 rpm) dönen 2s için kuluçkaya ° C. santrifüj 400 x g 4 ° C'de önceden temizlenmiş Kromatin elde edilir ve taze bir tüp transferi de.
- İmmunoprecipitation için birincil antikor (örneğin, 1-2 µg Kromatin 10 µg başına) uygun miktarda ekleyin ve gecede 4 döndürme kuluçkaya ° C.
Not: Antikor en uygun miktarda tedarikçi tarafından tavsiye edilebilir veya ampirik olarak optimum zenginleştirme görülmektedir kadar ChIP-qPCR antikor farklı miktarlarda ile gerçekleştirerek belirlenebilir. Ayrıca Protein G sepharose Protein A sepharose alt türü kullanılan antikor bağlı olarak değiştirilebilir. - Engellenen boncuk ertesi gün eklemek ve döndürme (40-60 rpm) 4 1 h için kuluçkaya ° C. santrifüj 400 x g 20-30 s boncuk cips, süpernatant kaldırmak ve çip başlamak için de yıkar.
- ChIP yıkama: arabellekleri ile aşağıdaki yıkar gerçekleştirmek: bir kez düşük Salt arabellek ile ve sonra iki kez LiCl arabelleği, ile iki kez yüksek Salt arabellek ile ve son olarak iki kez TE arabelleği ile.
- Döndürme (40-60 rpm) 4 ° C'de 10 dakika her yıkama gerçekleştirmek ve boncuk Santrifüjü 400 x g 20-30 s bir tezgah üstü santrifüj içinde de tarafından her yıkama arasında cips.
- Elüsyon için son yıkama kaldırmak ve sallayarak süre 15 dakika oda sıcaklığında (taze hazırlanmış) 250 µL elüsyon arabelleği boncuk resuspend.
- Santrifüj 400 x g ve toplamak yeni bir tüp eluate. Bu adım iki kez ve daha sonra de-crosslink eluate gecede 20 µL NaCl 5 M ve 1 µL RNase A ile gerçekleştirmek (10 mg/mL), İndinavir K ve fenol-kloroform/kloroform NG ile tedavihareket olduğu gibi adım 6.
- TE arabellek 50 µL içinde resuspend ve aliquots ChIP-qPCR için standart protokolleri 15 göre çip kalitesini kontrol etmek için kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Çekirdeklerin izole etmek için biz disseke ve kıyılmış kas dokusunun mekanik homojenizasyon 18.000 ve 22.000 RPM ( Tablo malzemelerigörmek) 15 veya 45 s için gerçekleştirilen. Her koşulda, çekirdeği doku enkazı ayrılmış ama verimi düşük hız (şekil 1A-B) kullanarak en uygun olan. Çekirdek de hazırlıklı douncing tarafından 3-5 dk (şekil 1Ave veri gösterilmez) ama mekanik homojenizasyon olduğunu yönteminin seçimi, az 15 olarak çekirdek en iyi verimi elde s, özellikle eğer zaman önemli bir kazanç sağlayan birden çok örnekleri olmak zorunda (şekil 1B) işlenir. Bu iletişim kuralı, 2.7 x 10'a kadar kullanarak doku (1 farenin dokusu ile eşdeğer) 500 mg dan7 çekirdek Kromatin 100 µg oluşturmak için ayrılmış olabilir.
Kromatin parçalanma sabit çekirdek en iyi duruma getirmek için 5-20 dakikadır sonicated. (Bkz: Malzemeler tablo) ayarları ' nın altında bir 10 min sonication Kromatin bir ortalama parça boyutu 250 ile üretmek için en uygun olan bp (Şekil 2). Bu adım deneysel olarak kullanılan sonicator türü dikkate alarak optimize edilmelidir.
Yukarıda açıklanan protokol tarafından hazırlanan kas Kromatin kalitesini değerlendirmek için transkripsiyon faktörleri, bir Histon değiştirme ya da RNA polimeraz II (Pol II) karşı ChIP-qPCR, ChIP-seq deneyleri gerçekleştirilmiştir. ChIP-qPCR deksametazon (Dex) tedavi olup içinde glukokortikoid reseptörü (GR) karşı güçlü Dex bağımlı GR zenginleştirme Dex ve GR olarak bilinen Redd1 ve Murf1 gen düzenleyici elemanlarının, ortaya sinyal yok testis belirli Prm1 organizatörü bir negatif kontrol (şekil 3A) kullanılan görüldü iken kas lifleri11' de düzenlenir.
Lizin 27 (H3K27ac), Histon H3, etkin arttırıcılar buldum bir kovalent modifikasyon ve Organizatör, kas lifleri, bir negatif intergenic göre aktif Desmin (Des) düzenleyici, güçlü zenginleştirme gösterdi chIP-qPCR karşı acetylated kontrol bölgesi (şekil 3B). H3K27ac ChIP-seq bu işareti Des odağı, tipik bir 'süper-artırıcı' düzenlenmiş doku kimlik gen12 (şekil 4A) boyunca yüksek düzeyde saptandı. Benzer şekilde, Pol II ChIP-seq transkripsiyonu Pol II adlı bu locus yüksek düzeyde gösterdi.
ChIP-hangi önemli bir rol oynar myogenic farklılaşma13,7, qPCR transkripsiyon faktörü Tead4, için zenginleştirme, Ccnd1 ve Ifrd1 genler (yukarıda açıklanan bağlama sitelerinde ortaya Şekil 3 c). Önemlisi, zenginleştirme nerede Tead4 kas lifleri seçerek Inaktif fareler hazırlanan Kromatin kullanarak düşürüldü (Tead4skm-/-)7 (şekil 3 c). Tead4 sinyal, ama bunu Tead1, H3K27ac veya Pol II, değil ise Kromatin üzerinden kullanarak kayıp hem Tead1 hem de Tead4 için ChIP-seq veri analizleri kendi bağlama bir siteye gelen vahşi tipi kas, Kromatin kullanarak Kdm5a gen organizatörü gösterdi Tead4kaslarıskm-/- fareler (şekil 4B). Tead4 bağlama Tead4üzerinden Kromatin kullanarak Seçmeli olarak kayıp ise benzer şekilde, Tead1 ve Tead4 bağlama Adssl1 gen düzenleyici unsuru aşağı için vahşi tipi kas, Kromatin görülürskm-/- kas () Şekil 4 c). Bu gözlemler ChIP-seq verilerde görmedim Tead4 sinyal bağlama kas lifi nereden geldiğini göstermektedir.
ChIP-seq sonuçları için kas fiber ile ilişkili diğer hücre tipleri katkısını belirlemek için biz kas uydu hücreleri ve Pecam1, bir işaret, aktif Vcam1 gen, H3K27ac ve Pol II sinyalleri değerlendirildi kasları sulamak endotel hücreleri, kan damarı. Des veya Adssl1 genler görülen yüksek seviyelere göre Pol II Vcam1 ve Pecam1 genler gördün ve H3K27ac seviyesini sevdiğini daha düşük (şekil 4A ve şekil 4 c). Yukarıda açıklanan protokolü kullanılarak hazırlanan Kromatin yongasında Marnixkade sinyal ağırlıklı olarak olaylarda bağlama gelir bu ilişkili dokularda ifade göre kas lif ifade genler için sinyal büyük farklılıkları belirtilen kas lifi.
Şekil 1: çekirdeklerin yetişkin fare kas üzerinden arınma. (A) doku lysates elde edilen mekanik homojenizasyon tarafından (18.000 rpm, 45 s) ve dounce homojenizasyon (30 vuruş/3 dk) ile trypan mavi lekeli ve dijital mikroskop altında gözlenen ve görüntüleri 20 X büyütme oranında yakalanan edildi. Ölçek çubuğu = 100 µm. çekirdek sayısı (B) elde edilen doku (1 fare eşdeğeri) 500 mg 15 ila 45 s veya douncing 3 dk altında belirtilen koşulları, 18.000 ve 22.000 rpm hazırlık sonra. Hata çubukları temsil ortalama ± S.E.M. n 3 fareler için mekanik homojenizasyon ve n = 3 fareler için douncing =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: Kromatin parça boyutu doğrulanması. İzole çekirdeği belirtildiği gibi 5, 10, 15 veya 20 min için sonicated. De-çapraz ve arıtma sonra DNA parçası boyut özel Jel Elektroforez etidyum bromür huzurunda tarafından değerlendirildi. M DNA boyutu belirtecidir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: Kromatin kullanımı için ChIP-qPCR. (A) fareler için içi Periton enjeksiyonları araç veya deksametazon (10 mg/kg) ve 1,5 saat sonra tabi tutuldu, Kromatin arka bacak kasları hazırlanmıştır. ChIP zenginleştirme GR hedef genlerin Redd1 ve negatif kontrol protamine organizatörü (Prm1) göre Murf1, çöktürülmüş giriş % belirtilir. (B) ChIP H3K27ac ve IgG denetim antikorları için gerçekleştirilen ve Desmin organizatörü analiz ve bir intergenic negatif kontrol bölgesine kıyasla. (C) Tead4 çip üzerinde vahşi türü ve kas özgü Tead4 nakavt fareler elde kas Kromatin gerçekleştirildi (Tead4skm-/-) ve analiz, Tead4 bağlama göre Ccnd1 ve Ifrd1 rehberleri, sitelerdeki Denetim intergenic bölge. Tüm deneyler, Kromatin 3 fare üzerinden havuza alınmış ve hata çubukları temsil ortalama ± S.E.M bir öğrenci T-test için üç teknik çoğaltır. P değeri < 0.001* *, < 0,0001 ***; NS, önemli olmayan. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: kas lif Kromatin genomik profilleri. (A) ekran görüntüleri ÜniversitesiKaliforniya, Santa Cruz genom tarayıcı çok daha yüksek H3K27ac ve Pol II düzeylerinde kas lifi, uydu hücrelerde ifade Vcam1 ve Pecam1 genler ile karşılaştırıldığında son derece ifade Desmin gen gösteren belirtilen loci, y ve endotel hücreleri, anılan sıraya göre. (B) UCSC ekran Tead1 ve Tead4, hem de H3K27ac ve Pol II, bağlamada Kromatin vahşi-tipi (WT) kas Tead4 kıyasla düşük gösteren belirtilen lociskm-/- (MT) kas Tead4 bağlama seçici kaybının olduğu, gözlenen. Resimli ChIP-seq veriler coğrafi veritabanı GSE82193 kullanılabilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Arabellek adı | Kompozisyon | ||
| Hipotonik arabellek | 10 mM HEPES-KOH (pH 7,3) | ||
| 10 mM KCl | |||
| 5 mM MgCl2 | |||
| %0.1 NP-40 | |||
| 0,1 mM PMSF (taze ekledi) | |||
| Proteaz inhibitörü kokteyl (PIC) 1 x (taze ekledi) | |||
| Sonication arabellek | % 1 SDS | ||
| 10 mM EDTA | |||
| 20 mM Tris-HCl pH 8 | |||
| 150 mM NaCl | |||
| %0.1 sodyum Deoxycholate | |||
| % 1 Triton X-100 | |||
| Taze 0,1 mM PMSF eklendi | |||
| PIC 1 x | |||
| Çip seyreltme arabellek | % 0,01 SDS | ||
| %1.1 Triton X-100 | |||
| 1.2 mM EDTA | |||
| 16,7 mM Tris HCl pH8 | |||
| 167 mM NaCl | |||
| Taze 0,1 mM PMSF eklendi | |||
| PIC 1 x | |||
| Düşük Salt arabellek | %0.1 SDS | ||
| % 1 Triton X-100 | |||
| 500 mM EDTA | |||
| 20 mM Tris HCl pH8 | |||
| 150 mM NaCl | |||
| Yüksek Salt arabellek | %0.1 SDS | ||
| % 1 Triton X-100 | |||
| 500 mM EDTA | |||
| 20 mM Tris HCl pH8 | |||
| 500 mM NaCl | |||
| LiCl arabellek | 250 mM LiCl | ||
| % 1 NP-40 | |||
| 1 mM EDTA | |||
| 10 mM Tris HCl pH 8 | |||
| Elüsyon arabellek | % 1 SDS | ||
| 100 mM NaHCO3 | |||
| Tris-EDTA (TE) arabellek | 50 mM Tris HCl pH 8 | ||
| 1 mM EDTA | |||
Tablo 1: Arabellek kompozisyonlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada Kromatin yetişkin fare iskelet kasları ve gösteri bu Kromatin transkripsiyon faktörü bağlama ve kovalent Histon değişiklikler kas lif çekirdeği tespit çip deneyleri için uygun hazırlanması için yeni bir protokol açıklayın. Bu iletişim kuralı birkaç kritik adımları içerir. İlk dounce veya mekanik kesme tarafından gerçekleştirilen doku bozulma 's. Mekanik Kesme daha hızlı ve daha tekrarlanabilir ve bu nedenle yönteminin seçimi. Hiçbir uygun cihazı varsa, yine de, bozulma da douncing, nereye mikroskop altında lizis etkinliğinin değerlendirilmesi fiksasyon adıma geçmeden önce önerilir tarafından gerçekleştirilebilir. Bütün doku lysates fiksasyonu, tercihan--dan izole çekirdeği, fiksasyonu daha tekrarlanabilir sonication daha küçük birimler ve kısa süreler için izin. Biz de lysates bozulma sonra düzeltmek yerine doku bozulması önce düzeltmek Thomas vd tarafından açıklandığı gibi seçti 10 doku önceden tespit homojenizasyon azaltılmış verimliliğini sonuçlandı. Mekanik Kesme dayalı bu protokolü de 37 ° C8disseke dokusunun uzun süreli kuluçka dahil diğer önerilen çözümler, collagenase sindirim gibi hızlıdır. Bu dönemde, gen ifade ve transkripsiyon faktörü bağlama değişimler meydana gelebilir. Çekirdeklerin kısa sürede tamir bu nedenle daha sadakatle normal fizyolojik durumu yakalamak için esastır.
İkinci önemli adım çekirdeği sabit üzerinden lysate arıtma olduğunu. Bunun için sıralı sabit lysate çözümü, büyük enkaz ortadan kaldırmak için önce bir 70 µm hücre süzgeç ve sonra iyi enkaz kaldırmak için bir 40 µm hücre süzgeç aracılığıyla filtreleme süzgeçler tıkanmasını önler ve elde edilen çekirdeği verimi en üst düzeye çıkarır. Bir kez filtrasyon tarafından arıtılmış, çekirdeği sonicated ve de-crosslinking sonra DNA parçası boyutunu belirler. Bir fare iki arka bacaklarda gelen tipik bir hazırlık Kromatin 100 µg verir. 3 fare üzerinden lysates havuzu verim hazırlık sırasında kayıp azaltarak artırabilir. Kromatin (veri gösterilmez) kurtarma genomik DNA'ın % 75'e kadar verdiğinden bu yordamı etkilidir.
Çip deneyler transkripsiyon faktörü bağlama değerlendirmek için tasarlanmış ve gen düzenlemesi kas lif hücre çekirdeği içinde çalışmak için bu protokolü uygunluğu epigenetik değişiklikler gösterdi. Pol II ve H3K27ac için güçlü ve sağlam ChIP-seq sinyalleri kas lif tanımlaması kimlik genler kendi kendine özgü H3K27ac ve Pol II profilleri7tarafından izin Kromatin oluşturulan. Çok daha yüksek seviyede H3K27ac ve Pol II güçlü fiber çekirdeği, uydu veya endotel hücreleri, bulunan genler göre ifade genler üzerinde sinyal ağırlıklı olarak lif çekirdekleri geldiğini gösterdi. Bu da nerede bu özellikle kas lifleri inaktive Kromatin üzerinden fare kullanarak Tead4 çip sinyal kaybı tarafından doğrulandı. Yine de, zayıf, ama açıkça arka plan sinyalleri, uydu hücre işaretleri gibi Vcam1, Pax7 (veri gösterilmez) tespit edilebilir için o Kromatin bu hücrelerden gösterilen da mevcut. Biz bizim protokol formaldehit sabit Kromatin gibi 3 C/4 C kullanan diğer teknikleri ve hıc Kromatin conformation yakalama teknikleri için uygun olmalıdır tahmin. Bizim Protokolü'nün kullanılmasına ChIP-seq transkripsiyon faktörleri ve Kromatin değişiklikleri ile Kromatin conformation yakalama için gelecekte kas lif ve nasıl bunlar düzenlenmiş olabilir düzenleyici mekanizmaları gen detaylı bir anlayış izin vermelidir birleştirme veya egzersiz, oruç, bir yüksek yağlı diyet, denervation, gibi fizyolojik uyaranlar tarafından üzgün ya da hastalık, genetik olarak hazırlanan Kromatin kullanılarak değiştirilebilir X'e centronuclear myopathy14gibi hastalıklar üreyen fareler.
Özet olarak, bu düşük maliyetli ve zaman etkili iletişim kuralını hemen sonicated veya açığa vurulmamış kullanmak için-80 ° C arasında dondurulup kas lif çekirdeği yalıtım sağlar. Bu iletişim kuralı tarafından hazırlanan Kromatin kullanımı ilk genom geniş ChIP-seq veri kas lif7 sağlamıştır ve bu doku gen düzenlemesi gelecekteki çalışmaları kolaylaştıracaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.
Acknowledgments
IGBMC yüksek işlem hacmi sıralama tesis, "Fransa Génomique" Konsorsiyumu (ANR10-INBS-09-08) bir üyesi ve tüm IGBMC genel Hizmetleri tüm personel özellikle IGBMC hayvan tesis personel teşekkür ediyoruz. Bu eser CNRS, INSERM, AFM, Ligue Nationale contre le kanser gelen hibe tarafından desteklenen, Fransız Fonu aracılığıyla ANR programı ANR-10-IDEX-0002-02, Labex INRT ANR-10-IDEX-0001-02 etiketli Investissements d'Avenir altında devlet ve ANR-AR2GR-16-CE11-009-01. Fon çalışma tasarım, veri toplama ve analizi, yayımlamaya karar veya el yazması hazırlanması herhangi bir rolü yoktu. S.J Ministère de l'Enseignement tarafından desteklenen Ligue Nationale contre le kanser ve ANR-AR2GR-16-CE11-009-01 ve V.U tarafından et de la Recherche. Ligue Nationale contre le kanser bir 'équipe labellisée' kimliğidir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| T 25 digital ULTRA-TURRAX | T 18 ULTRA-TURRAX | 0009022800 | |
| PMSF | SIGMA-ALDRICH CHIMIE SARL | P7626-25G | |
| Protease Inhibitor Cocktail-EDTA Free | Roche Diagnostics | 11873580001 | |
| Protein G Sepharose beads | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | P-3296 | |
| Proteinase K | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | P-2308 | |
| Cell Strainers 70um | Corning BV | 431751 | |
| Cell Strainers 40um | Corning BV | 352340 | |
| Formaldehyde EM grade | Euromedex | 15710-S | |
| Rnase A | Fischer Scientific | 12091039 | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1 | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | P3803 | |
| BSA | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | B4287-25G | |
| yeast tRNA | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | R5636 | |
| Glycogen Blue | AMIBION | AM9516 | |
| Pol II ChIP Antibody | Santa Cruz | SC-9001 | |
| H3K27ac ChIP Antibody | Active Motif | 39133 | |
| Tead4 ChIP Antibody | Aviva Systems Biology | (ARP38276_P050) | |
| IGEPAL | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | I-3021 | |
| E220 Focused Ultrasonicator | Covaris E220 | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Additional items | |||
| Scissors | |||
| Loose Dounce | |||
| 15 ml and 50 ml falcon tubes | |||
| 14 ml round bottom tubes | |||
| 1.5 ml and 2 ml Eppendorf tubes | |||
| 70 μm and 40 μm cell strainers (Corning) |
References
- Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions. Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).
- Furey, T. S. ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions. Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).
- Wade, J. T. Mapping Transcription Regulatory Networks with ChIP-seq and RNA-seq. Adv Exp Med Biol. 883, 119-134 (2015).
- Alpern, D., et al. TAF4, a subunit of transcription factor II D, directs promoter occupancy of nuclear receptor HNF4A during post-natal hepatocyte differentiation. Elife. 3, e03613 (2014).
- Martianov, I., et al. Cell-specific occupancy of an extended repertoire of CREM and CREB binding loci in male germ cells. BMC Genomics. 11, 530 (2010).
- Achour, M., et al. Neuronal identity genes regulated by super-enhancers are preferentially down-regulated in the striatum of Huntington's disease mice. Hum Mol Genet. 24 (12), 3481-3496 (2015).
- Joshi, S., et al. TEAD transcription factors are required for normal primary myoblast differentiation in vitro and muscle regeneration in vivo. PLoS Genet. 13 (2), e1006600 (2017).
- Ohkawa, Y., Mallappa, C., Dacwag-Vallaster, C. S., Imbalzano, A. N. Myogenesis: Methods and protocols. DiMario, J. 798, Springer Science+Business Media LLC. 517-531 (2012).
- Dimauro, I., Pearson, T., Caporossi, D., Jackson, M. J. A simple protocol for the subcellular fractionation of skeletal muscle cells and tissue. BMC Res Notes. 5, 513 (2012).
- Thomas, J. L., et al. PAK1 and CtBP1 Regulate the Coupling of Neuronal Activity to Muscle Chromatin and Gene Expression. Mol Cell Biol. 35 (24), 4110-4120 (2015).
- Kuo, T., et al. Genome-wide analysis of glucocorticoid receptor-binding sites in myotubes identifies gene networks modulating insulin signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (28), 11160-11165 (2012).
- Whyte, W. A., et al. Master transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes. Cell. 153 (2), 307-319 (2013).
- Benhaddou, A., Keime, C., Ye, T., Morlon, A., Michel, I., Jost, B., Mengus, G., Davidson, I. Transcription factor TEAD4 regulates expression of myogenin and the unfolded protein response genes during C2C12 cell differentiation. Cell Death and Differentiation. 19 (2), 220-231 (2011).
- Cowling, B. S., et al. Reducing dynamin 2 expression rescues X-linked centronuclear myopathy. J Clin Invest. 124 (3), 1350-1363 (2014).
- Thermo Fisher Scientific. ChIP Analysis. , Available from: https://www.thermofisher.com/fr/fr/home/life-science/epigenetics-noncoding-rna-research/chromatin-remodeling/chromatin-immunoprecipitation-chip/chip-analysis.html (2017).
