Summary
このプロトコルの目的は、decellularize し、めしマウス蝸牛組織工学用の足場として利用する効果的な方法を示すことです。
Abstract
哺乳類のヒアリング不足を再生する能力を促進する機械刺激受容の有毛細胞では、難聴の治療法を限られています。現在の再生医療戦略は、移植幹細胞や内耳難聴を修正する損傷した幹細胞の交換を奨励するためにサポート細胞を周囲の遺伝子操作に焦点を当てています。しかし、細胞外マトリックス (ECM) は誘導と有毛細胞の機能を維持する重要な役割を果たすこと、十分に調査されていません。人工内耳を使用して成体幹細胞を成長する足場として ECM 方法、組成と細胞外の環境のアーキテクチャにエイズ聴覚機能の維持の細胞に独特な洞察力があります。分離し、成体幹細胞灌流を受け入れる足場として使用するマウスからの蝸牛を decellularizing する方法をご紹介します。現在のプロトコルの蝸牛は安楽死させたマウス、脱と脱灰から分離されます。その後、臍帯から隔離された人間の Wharton のゼリー細胞 (hWJCs) は、各蝸牛に慎重に灌。バイオリアクター, として、蝸牛を用い、解析の処理を受ける前に 30 日間培養します。脱の蝸牛は個人の細胞外構造を保持が、細胞の存在や DNA の顕著なフラグメントを明らかにしなかった。蝸牛に灌流セルは蝸牛の内外面のほとんどを侵略し、30 日間の期間にわたって問題なく育った。したがって、どのように人工内耳の ECM の影響細胞発達や行動を研究する現在のメソッドを使用することができます。
Introduction
蝸牛は、側頭骨は、複雑なスパイラル構造です。外側の骨迷路と、同心の内側の膜迷路1から成り立っています。膜迷路は、流体の 3 つのスペースで構成されています: Scala スカラー座 vestibuli メディア、およびスカラー座索1。Scala メディア住宅感覚の上皮細胞の種類の多数で構成されているが、感覚有毛細胞 (HC)、神経インパルス2音波の機械的エネルギーを変換、特に重要です。音響外傷3,4、5薬6疾患7,8、および高齢化9への暴露は、すべての HC の死を介して聴覚機能障害で起因できます。哺乳類の毛細胞損失は傷害10後再生することができます鳥の HCs とは異なり、永続的なです。
様々 な現代的な研究努力を失われた HCs を復元する特定の実験的アプローチは異なるが求めています。感覚上皮における遺伝子発現の操作と体の外分化した幹細胞の注入、支配的なアプローチにおいて、蝸牛オルガノイドの幹細胞の分化を誘導方法がされているが11,12,13を試みた。それぞれのアプローチは、直接幹細胞や幹細胞の発達の手がかりに依存ただし、2 番目は共有で、潜在的に重要な要素はそれ自体蝸牛の ECM14,15。
ECM だけでなく細胞と細胞の接着、増殖、生存、および移行の面を含んでいますが、また HCs やらせん神経節報15,16 の開発に重要な役割を果たしている組織の物理的なサポートを提供します ,17。自然発生する ECM は、細胞の表現型決定および/または細胞の接着・増殖・生存の18のガイドが誘導信号を提供します。その結果、脱蝸牛培養 hWJCs との組み合わせでの使用は、ECM と HC の再生の役割を探検するユニークな機会を提供しています。HWJCs は、間葉系幹細胞の19のように振る舞うひと臍帯由来容易に利用できる、非論争の携帯タイプです。HWJCs は、麻痺細胞系統20,21を区別する能力を示しています。したがって、現在のプロトコル詳細分離、decellularization、および内耳組織工学用 hWJCs と C57BL マウスの死骸から蝸牛の血流を示します。
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Protocol
カンザス大学医療センター (院長) で承認された機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) のプロトコル (御急ぎでなかったら、#2014-2234) によると、動物の安楽死を含めたすべての処理を行った。
注: HWJCs は、インフォームド コンセントを提供される患者が寄贈したひと臍帯から分離した、標本 (区 IRB #15402) カンザス大学人間科目委員会によって承認されたプロトコルに従って使用されました。
1. 側頭骨収穫と蝸牛の分離
- 外科はさみの鋭いペアで頭蓋骨と第一頚椎の間に切断によって適切に安楽死させた、15 週齢マウスの首をはねるし、(図 1 a) を消毒する 70% エタノールで頭をスプレーします。
- 外科はさみ (図 1 bの-C破線) の同じシャープな対を用いた正中面で頭蓋骨を二等分します。
- 鉗子 (図 1の矢印) のペアを使用して頭蓋骨から脳組織を削除します。
- 存在の聴覚と前庭神経根 (図 1E-F矢印) 頭蓋骨と (図の矢印 1f) 外から外耳道の奥の頭骨を識別します。頭蓋骨 (図 1) の残りの部分から側頭骨を分離する頭蓋骨を慎重にカットします。
注: いくつかのインスタンス可能性があります可能である繊細な加工を必要とせず頭骨から頭蓋骨の周囲の骨を詮索します。 - ヒントは蝸牛に穴をあけるリスクはないので、外耳道 (図 1 H)、約 5 mm の開口部に微細鉗子を挿入します。優しくこじ開ける胞 (図 1 H、トップの赤斜線領域) の骨骨折 (1I を図、赤い点線線) ので。
注: 必要に応じて、解剖顕微鏡役立つ可能性がありますこのプロセスの正確な配置や楽器の操作を確保するため。 - 微細鉗子を使用すると、(図 1 j, 赤いブラケット) 蝸牛の骨迷路の公開側頭骨からブラの残りの部分で詮索離れて。
- シャーレの頭骨を保持するために十分な大きさの場所 (例えば、30 mm 以上)、解離性の下にあるビューのフィールドを対象範囲し、満タンで十分なリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 側頭骨 (例えば1、0.5 mL) をカバーします。
- ブラ直面している蝸牛の楕円形や円形の窓が PBS で削除と側頭骨が水没します。
注: 前庭系を操作して定位 (1I を図と図 2 b) 蝸牛の機能のためのハンドルとしても優れていますと、蝸牛から前庭系の除去する、必要はありません。 - 鉗子の超微細のペアを使用して、あぶみ骨を通過するアブミ骨動脈を削除します。
- 動脈渡される、アブミ骨のアーチを超微細鉗子の先端を挿入し、繊細な上向きあぶみ骨を持ち上げます。縫合のアブミ骨は卵円窓から持ち上げる必要があります。
- 超微細鉗子の先端を使用して、楕円の穴をあけるし、windows のラウンドします。
- 28.5 ゲージ注射器とチューブを充填 1 × PBS を使用する (内側直径 0.28 mm、外径 0.61 mm) 管の楕円形の窓を置きます、接続されている (図 2 a -B)。
注: 管の開口部は、正確な配置を確保するため支援超微細鉗子を使用して操作できます。- 各蝸牛に新鮮な注射器とチューブを使用します。
- 2 mL の 10% 抗生物質抗真菌薬 (対策) と 10% ペニシリン-ストレプトマイシン (ペン-連鎖球菌) PBS で蝸牛の 5 分以上を外リンパを削除するを灌流します。あまりにも多くの圧力で速すぎる灌蝸牛内微細構造に損傷を与えます。
注: 蝸牛を介して流体を灌流して手で注射器を手動で運転が効果的な灌流ポンプを代替として使用できます。- 灌手動で場合は、側頭骨の前庭部分をつかんで灌蝸牛 (図 2 a) を安定させるために鉗子を自己終了の罰金ペアを使用します。
注意: 必須ではありませんが、これは両手を自由に楽器を処理を残します1 つの手はチューブを配置できる他、注射器 (図 2 a) を運転できる適切に (図 2 b)。 - このステップから転送、空気に不必要に蝸牛を公開しないように注意してください。流体の循環をブロック流体の空間に空気の泡を導入、蝸牛内の微細損傷さらに乾燥します。
- 灌手動で場合は、側頭骨の前庭部分をつかんで灌蝸牛 (図 2 a) を安定させるために鉗子を自己終了の罰金ペアを使用します。
- 削除し、残った微細鉗子を用いた筋肉組織や骨フラグメントを破棄します。
- 必要に応じて、抗生物質溶液ごと 48 時間の定期的な変更で 7 日まで 10% 対策で PBS で 10% ペン連鎖球菌性ソリューション 4 ° C で分離の蝸牛を格納します。
2. 蝸牛処理
- Decellularization
- 各蝸牛の塗りつぶし 1% ナトリウム ドデシルと 20 mL ガラス シンチレーション バイアルの硫酸塩 (SDS) 水溶液のイオン (DI) の水があり、蝸牛を decellularize するために使用。
- 開口部は十分な大きさを通過する蝸牛のかみそりの刃を使用してプラスチック製の 7 mL 転送ピペットの先端をカットします。
- 転送ピペットを使用して、ゆっくりと引いて、蝸牛ピペットにのでそれは数ミリでカットオフ端を渡します。
- 1 %sds ソリューションいっぱいシンチレーション バイアルに蝸牛を追放します。
- 転送ピペットを用いたシンチレーション バイアルに蝸牛 (DI) 脱イオン水に 1 %sds の 2 mL を循環します。
- 、ローテーターにシンチレーション バイアルを置き、部屋の温度で 72 時間 10 rpm で回転するシンチレーション バイアルを許可します。
- 72 時間の期間にわたって、1 %sds ソリューションすべての 24 h を変更します。決して空気に蝸牛を公開する SDS を変更するとき注意してください。
- 3 回の DI 水で各 30 分の蝸牛を洗います。
- 蝸牛を維持するのに十分なだけを残して水没、シンチレーション バイアルから残りの DI 水を削除します。
- 脱灰を開始するには、蝸牛を含むシンチレーション バイアルに DI 水で 10% エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) (0.02 M) 5 mL を追加します。
- 転送ピペットを用いたシンチレーション バイアルに蝸牛を純水で 10 %edta の 2 mL を循環します。
- 回転子に戻るシンチレーション バイアルを置き、部屋の温度で 72 時間 10 rpm で回転するシンチレーション バイアルを許可します。72 時間の期間にわたって 10 %edta 溶液のすべての 24 h を変更します。蝸牛が空気にさらされないようにソリューションを変更するときに注意します。
- すすぎ 3 回 1 × PBS です。 で、2 h の蝸牛この段階では、蝸牛が脱灰します。
- 72 h までの蝸牛溶液中で保存、10%、反反 10% ペン連鎖球菌 PBS で 4 ° C で
注: ストレージ期間を長く可能性があります抗生物質溶液; の定期的な変更が可能ただし、加工の蝸牛の拡張記憶域は、このプロトコルでは検証されていません。
3. 調達と hWJCs の拡大
- 以前に発行されたプロトコル22によると hWJCs を分離します。簡単に言えば、3 cm のセクションにへその緒を分割します。
- 慎重には、メスで浅い切開縦各臍帯のセグメントを広げるし、臍帯ワルトンを公開します。血管を削除するのに鉗子を使用します。
- 組織が水没する (例えば、40 mL で 60 mm のペトリ皿) 十分な PBS で 2 回臍帯セグメントを洗います。メスで組織のセグメントを細かくみじん切り。100 mm ペトリ皿消化中の 50 mL の組織を消化 (0.2 %2 型コラゲナーゼ、低グルコース環境における 1% ペニシリン-ストレプトマイシン、ダルベッコ変更されたワシの媒体 (DMEM))。
- 5% CO2、37 ° C のインキュベーターで一晩 50 回転軌道シェーカーの中の消化に組織を配置します。次の日、1:16 pbs は、抗生物質抗真菌 2% の割合で消化中を希釈し、室温で 500 × g で遠心分離によって細胞をペレット (~ 27 ° C) 10 分破棄上清の。
- 細胞と間葉系幹細胞成長培地 (MSCGM) にペレットを再懸濁します。プレート細胞培養の 7 x 103セル/cm2の密度では、T-75 フラスコを扱われます。文化の MSCGM、HWJCs、通路 5 実験用に展開します。
注: HWJCs がサブ培養される大きい T フラスコに (例えば、T-150、T-300) 継 hWJCs 実験のための収穫を増加するとき。
4. 脱蝸牛への hWJCs の注入
- 脱の蝸牛を準備します。
- 無菌技術を使用して、3 回の 30 分の 1 × PBS でストアドの蝸牛を洗浄します。
- 24 ウェル プレートの別の井戸に蝸牛を転送し、37 ° C の 1 つの mL を追加 MSCGM で加温します。
- 蝸牛 5% CO2セルの注入の前に 1 時間の最小値の 37 ° C 細胞文化インキュベーターで孵化させなさい。
- HWJCs を切り離して、再懸濁します
- 37 ° C と洗浄 hWJCs 前回 1x PBS を温めた。
- 十分な 37 ° C を追加セル容器表面に 0.5 %edta でトリプシンで加温します。
- HWJCs 5% CO2、37 ° C 細胞文化のインキュベーターで最大 5 分間インキュベートします。
- 細胞の 90% が倒立顕微鏡の下のセルを表示することによって表層文化から切り離されることを確認します。
注: 移動文化容器を軽くタップすると、細胞をデタッチします。静止したとき、細胞が分離されていません。 - さらに添付された細胞を取り除くためフラスコの側面が軽きます。
- 細胞の 90% が倒立顕微鏡の下のセルを表示することによって表層文化から切り離されることを確認します。
- 無菌技術を使用して、トリプシンのボリュームに MSCGM の同等のボリュームを含む 50 mL の円錐管に培養器から転送 hWJCs はセルを分離するに使用されます。
- 常温 500 × g で遠心分離によって、hWJCs をペレット (~ 27 ° C) 5 分。
- 上清を吸引し、500,000 細胞/ml の濃度で MSCGM で hWJCs を再懸濁します。
- 蝸牛を灌流します。
- 転送ピペットを使用して新しい 24 ウェル プレートに蝸牛を転送します。
- 任意の蝸牛が乾燥するを防ぐために各の蝸牛に MSCGM のドロップを追加します。
- 繊細な楕円形や円形の窓を向いているように超微細鉗子を使用して蝸牛に合わせます。
注: は、際は蝸牛が簡単に破損している各蝸牛を直接取り扱いに細心の注意を取る。 - 接続チューブ、滅菌 28.5 ゲージ インスリン注射器の使用を再停止される 0.2 mL hWJCs (100,000 細胞) を描画します。
- 滅菌微細鉗子を使用して、楕円形の窓にチューブを置きます。
- 繊細かつゆっくり 0.2 ml ポリエチレン チューブに接続されている 28.5 ゲージ インスリン注射器を使用して再懸濁の hWJCs の蝸牛を灌流 (外径: 0.61 mm、内径: 0.28 mm) で約 5 分。
- 後、0.8 mL 37 ° C の追加も 1 mL に井戸の総容積をもたらすに蝸牛を含む、MSCGM で加温します。
- 各蝸牛、新鮮な注射器を使用して、各時間をチューブの 4.3.3-4.3.7 の手順を繰り返します。
- 5% CO2、37 ° C 細胞文化のインキュベーターで灌流の蝸牛を置き、週 3 回のメディアを変更します。
5. 蝸牛収穫と保存
注: 蝸牛培養があります、任意の時点で収穫まで 30 日後灌流。
- 蝸牛を保持するには、ロッキング プラットフォーム上の 4 ° C で一晩 1x PBS で 4% パラホルムアルデヒドで修正します。
- 固定後、3 回各 5 分の 1 × PBS と蝸牛を洗います。
- 徐々 に脱水エタノールと蝸牛とのパラフィン包埋する前に脂肪族炭化水素溶剤でクリアします。
- セクションは、ミクロトームを使用して 10 μ m の厚さにサンプル、ガラス顕微鏡スライドをマウントします。
注: サンプルはする準備が整いました組織学的や免疫組織化学的処理の標準プロトコルを使用して。
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Representative Results
ここに提示されたメソッドを使用すると、蝸牛の成功した decellularization は、4' を介して DNA の存在有無を調べることで評価された 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 染色します。Decellularized 蝸牛内 DNA が識別されなかった場合、蝸牛を完全に decellularized と考えられていた。Decellularization または脱灰を受けていない以前の実験からネイティブ蝸牛は、構造と伝統的 C57BL マウス蝸牛に存在する細胞を示すために肯定的な制御として使用されました。任意の hWJCs の注入はありませんでした、脱脱蝸牛は、ネガティブ コントロールとして使用されました。任意組織切片 (図 3) の領域で定量化可能な DAPI 染色細胞核は認められなかった。2 つの蝸牛脱脱灰, し、現在のプロジェクトの hWJCs を注入します。HWJCs と灌流脱脱灰の蝸牛が多数 DAPI 染色蝸牛および蝸牛 (表 1) の外骨殻に成長している内核を観察されました。セルの細胞密度は注入後 30 日文化 (図 4および図 5) と 2 番目の蝸牛の 118,732 細胞/蝸牛文化の 30 日後に 113,759 細胞/蝸牛をされた最初の蝸牛の推定合計 (図 6図 7)。これらの細胞密度の推定値は、スカラー座索、スカラー メディアとスカラー前庭、圏内に 3 つの流体の空間構造のボリュームが、これらの見積もりは、残りの骨迷路のいずれかを除外しました。さらに、各蝸牛からサンプルはヘマトキシリンとエオシンで染色した (H & E) 細胞と (図 8) 各蝸牛内の解剖学的特徴の存在を示した。蝸牛組織の肉眼解剖学は主にすべての汚されたセクション; 中変わらずに残ったしかし、細胞識別になかった脱脱セクション (図 8 b)。細胞核の同定は劇的にネイティブ蝸牛 (図 8 a) と脱脱灰の蝸牛の細胞 (図 8-D) を注入します。
図 1: マウスの側頭骨分離します。マウスが適切に安楽死させた頭蓋底と第一頚椎の間の切断することによって、動物の首をはねるし、(A) の消毒にエタノールと頭をスプレーします。外科はさみ、脳組織と骨の両方を切断のシャープなペアを使用してセクション (B-C) の矢状面で頭蓋骨を二等分します。切断 2 分離マウスの頭 (D、下の顎が関係のない実験的な作品の削除) 脳頭骨を明らかに削除する必要がありますし。聴覚と前庭神経のパス (E、赤矢印) が役に立つ、2 つの孔は頭骨を正しく特定するの手がかり。頭蓋骨 (F) から肉を削除します。外耳道 (F矢印、上部パネル) は、同様に役に立つ外部キューを提供します。慎重に分離の側頭骨 (G) だけを残して、余分な骨をトリムします。ブラ (Hトップパネル、赤の強調表示されている領域) する必要があります、繊細な削除微細鉗子 (H、下部のパネル) を使用します。ブラは薄い骨をことができます容易に欠け離れて (私) 蝸牛の骨迷路が明らかに (J、赤い括弧) まで。すべてのイメージのスケール バーは、1 ミリメートルこの図の拡大版を表示するにはここをクリックしてください。 。
図 2: 人工内耳血流します。側頭骨が孤立するいるし、ブラが取り外されて、蝸牛、設定できます顕微鏡で灌流の。(の点線) 接続チューブで手動で駆動の注射器を使用して灌自己終了ピンセットのペアを使用して蝸牛を安定させるためにそれがあります。軽く側頭骨 (B) の前庭部分に鉗子を添付、ペトリ皿 (A) の唇に対して鉗子を休ませます。これは、両手が血流中に楽器を操作するフリーを残します。1 つの手は、一方、他の手は、鉗子 (B) の 2 番目のペアを使用して楕円形の窓にチューブを合わせることにより、流体の流量を制御する注射器を操作できます。角度で管の自由端を切断を可能に簡単に位置決めのための視野をブロックすることがなく正しく配置するチューブ。スケール バーは 1 mm ですこの図の拡大版を表示するにはここをクリックしてください。 。
図 3: 脱マウス蝸牛のティッシュ セクション。直立のエピ蛍光顕微鏡 (10 X 接眼レンズと 20 × 対物) 200 X の倍率で試料を画像に使用されました。画像は約 4 x 5 のモンタージュを作成する一緒にステッチされました。DAPI 染色細胞の不在を示す原子力はパネルA DAPI 共通フィルター セット (350 nm 励起、470 nm 発光) と露出オーバー、フルオレセイン イソチオ シアン酸 (FITC) 共通フィルターを用いた蛍光のグレースケール画像に示すようにセット (490 nm 励起、525 nm 発光)、パネルBに示すように、解剖学的ランドマークを提供します。自動細胞数は、 AとBの両方のパネルに線引きされている関心の 3 つの地域で行われました。総細胞数全体の組織切片 (1、白実線) と蝸牛 (2, 破線) を求めた。これらの 2 つの数字は、蝸牛の外はティッシュ セクション (3点線と破線の間のスペース) の外装、骨端、骨の構造内のセルの数を計算する使用されました。すべてのイメージのスケール バーは、500 μ m です。この図の拡大版を表示するのには、ここをクリックしてください。
図 4: 脱マウス蝸牛 1 の近く modiolar セクションを流し込んで hWJCs.DAPI 染色性が核の解剖学的ランドマークを提供します緑のチャネルから露出オーバー、グレースケール蛍光にオーバーレイ パネルで表示されます。カウント パネルAで区切られるが、関心の 3 つの地域で行ったセルを自動化しました。総細胞数全体の組織切片 (1、白実線) と蝸牛 (2, 破線) を求めた。これらの 2 つの数字は、蝸牛の外はティッシュ セクション (3点線と破線の間のスペース) の外装、骨端、骨の構造内のセルの数を計算する使用されました。パネルBに表示されます分離 DAPI 染色とパネルCに自動定量評価中に使用される DAPI 染色のしきい値が表示されます。すべてのイメージのスケール バーは、500 μ mこの図の拡大版を表示するにはここをクリックしてください。 。
図 5: 脱マウス蝸牛 1 の近く modiolar セクションの高倍率表示注入 hWJCs.DAPI 染色性が核の解剖学的ランドマークを提供します緑のチャネルから蛍光の露出オーバー、グレースケール画像にオーバーレイ パネルで表示されます。パネルBに表示されます分離 DAPI 染色、自動セルを数える時に使用されるしきい値画像パネルCで表示されます。流体のスペースと蝸牛内に収容され細かい微細構造の decellularization の中に保持される素敵な細胞培養実験のフェーズ。スカラー座 Vestibuli (SV)、スカラー座索 (SM)、基底膜 (BM)、Tectorial Membrane (TM)、スパイラル角膜 (L)、ローゼン タールの運河 (RC)、蝸牛軸 (M)、ラセン靭帯 (SL)、耳用 (*)。ライスナーの膜がティッシュ セクションで明確に定義されていません、結果としてスカラー メディアははっきり定義されません。すべてのイメージのスケール バーは、250 μ mこの図の拡大版を表示するにはここをクリックしてください。 。
図 6: hWJCs を注入した脱マウス蝸牛 2 の近く modiolar セクション。DAPI 染色性が核は、パネルは、解剖学的ランドマークを提供します緑のチャネルから蛍光がグレースケールにオーバーレイで表示されます。カウント パネルAで区切られるが、関心の 3 つの地域で行ったセルを自動化しました。総細胞数全体の組織切片 (1、白実線) と蝸牛 (2, 破線) を求めた。これらの 2 つの数字は、蝸牛の外はティッシュ セクション (3点線と破線の間のスペース) の外装、骨端、骨の構造内のセルの数を計算する使用されました。パネルBに表示されます分離 DAPI 染色とパネルCに自動定量評価中に使用される DAPI 染色のしきい値が表示されます。すべてのイメージのスケール バーは、500 μ mこの図の拡大版を表示するにはここをクリックしてください。 。
図 7: hWJCs を注入した脱マウス蝸牛 2 の近く modiolar セクションの高倍率表示します。DAPI 染色性が核は、パネルは、解剖学的ランドマークを提供します緑のチャネルから蛍光がグレースケールにオーバーレイで表示されます。パネルBに表示されます分離 DAPI 染色、自動セルを数える時に使用されるしきい値画像パネルCで表示されます。流体のスペースと、蝸牛内に収容され細かい微細構造は、実験の decellularization および細胞文化段階に保持されます。スカラー座 Vestibuli (SV)、スカラー座索 (SM)、基底膜 (BM)、Tectorial Membrane (TM)、スパイラル角膜 (L)、ローゼン タールの運河 (RC)、蝸牛軸 (M)、ラセン靭帯 (SL)、耳用 (*)。ライスナーの膜がティッシュ セクションで明確に定義されていません、結果としてスカラー メディアははっきり定義されません。すべてのイメージのスケール バーは、250 μ mこの図の拡大版を表示するにはここをクリックしてください。 。
図 8: コントロールと処理の蝸牛のヘマトキシリンとエオシン染色します。ヘマトキシリンとエオシン染色標本をネイティブ細胞存在と典型的な蝸牛の表示がパネルに表示されます。パネルBは、細胞外マトリックスの背後にある葉を完全に decellularized 蝸牛からパネルAと同じ構造が含まれています。HWJCs が封じ込められた 2 つの示した蝸牛はCとDのパネルで見られています。総蝸牛神経解剖学は変わりません主に decellularization と細胞培養プロセスを通じて特定の細胞集団や場所は大幅に変更。スカラー座 Vestibuli (SV)、スカラー座索 (SM)、基底膜 (BM)、Tectorial Membrane (TM)、スパイラル角膜 (L)、ローゼン タールの運河 (RC)、蝸牛軸 (M)、ラセン靭帯 (SL)、耳用 (*)。すべてのイメージのスケール バーは、250 μ mこの図の拡大版を表示するにはここをクリックしてください。 。
| A1 蝸牛 + 細胞 | A2 蝸牛 + 細胞 | B2 ネガティブ |
表 1: セルのカウントします。蝸牛のセクションを染色 DAPI はどちらられると (骨迷路、頭骨内耳の流体スペース外と蝸牛内) の外の興味の 3 つの非重複領域で ImageJ で自動カウント ツールを使用して定量化.ImageJ、蝸牛の断面積を測定したも、この値はセクション厚さ (10 μ m) セクションの組み合わせでボリュームを計算する使用されました。サンティらによって公開された蝸牛総量の予測値を使用23、与えられたセクションの相対的な蝸牛量を算出しました。全体の蝸牛の細胞密度は、一対の細胞数との組み合わせで指定したセクションの相対的な蝸牛ボリュームを用いて推定しました。
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Discussion
我々 は正常に蝸牛の複雑な三次元組織足場としての使用を可能にする decellularization プロセスを介して蝸牛からネイティブ蝸牛細胞を削除できることを実証しました。サンティら。15 decellularizing の蝸牛の最初のメソッドを開発し、光シート顕微鏡23の助けを借りてを通じて多くの人工内耳構造のボリュームを正確に推定しています。このような初期の作品は、組織エンジニア リングと細胞培養の技術がここに提示のための強固な基盤として提供しています。脱蝸牛は正常に、細胞融合とすることができ、培養期間を延長。動物の広い配列からの蝸牛は、細胞の種類の同様に広い配列との組み合わせで理論的に利用できます。これらの組み合わせにより組織工学感覚上皮の開発14を調べて、薬の新規医薬品薬のテスト アプリケーションなど多数の可能な実験設計に活用するここでテクニック24、25モデルの蝸牛神経修復の開発と。しかし、これらの技術の広範な適用にもかかわらず彼らはありません制限なしです。
現在の技術の限界の 1 つは個人に基づく変数である灌流です。蝸牛、用のホルダーを開発し、シリンジ ポンプを使用して perfusions を行うは、精度と、プロセスの成功を高める可能性があります。さらに、決定的に成功した decellularization を証明可能性があります潜在的達成するいくつかのメソッドを介して。DAPI 染色残りの細胞核を定量化に使用されたを用いて、残留核の記事 decellularization は認められなかった。また、標準的な DNA 定量アッセイを利用して試薬、緑染料核酸の残党は、視覚的に核酸の小さな断片の存在を識別するため DAPI よりも敏感であることを識別するために DNA の picogram 量を検出酸脱組織26。どの手法を使用して成功した decellularization を検証するに関係なく、足場として利用する前に個々 の蝸牛の完全な decellularization を表示できない場合があります。それにもかかわらず、我々 は、成功と堅牢な decellularization プロセスを発見しました。
現在のプロトコルの 2 つの最も重要なステップは、分離と、蝸牛の処理と、蝸牛の血流です。蝸牛は、蝸牛は繊細で脆性最初に分離されたときに、十分な注意が必要があります。鉗子で蝸牛を処理しながらあまりにも多くの力を適用すると、蝸牛がフラグメントことができます。したがって、decellularization と脱灰の前に軽く各蝸牛を処理することが不可欠です。前庭系、そのままでは、鉗子、複雑な内側の耳をつかんで、蝸牛の方向付けのための偉大なハンドルとして機能します。同様に、細胞と蝸牛を灌灌流の背後の圧力はあまりにも偉大なならない、それ以外のセルは、灌流を生き残ることはできません。前述の現在のプロトコルでは、1 mL インスリン注射器末にチューブを取り付ける一方、灌一方、蝸牛を介して細胞のより高い精度と蝸牛の取り扱いを簡単にことができます。
次のステップとして、蝸牛の ECM は、幹細胞の分化を誘導し、蝸牛の特定 ECM コンポーネントは細胞の変化を誘発するので場合を決定するための発達と機能のマーカーを評価するは当然でしょう。灌モニター細胞分化と動作する蝸牛を介して細胞(例えば、幹細胞、neuroprogenitors、線維芽細胞等)の種類別の魅惑的なフォロー アップ調査になります。さらに、遺伝的に変更されている、またはプロトコル分化成長因子にさらされている細胞が蝸牛の ECM が麻痺の開発をサポートする方法に新しい洞察力を提供して可能性も、公聴会の関数。したがって、現在のプロトコルは、蝸牛の ECM を使用して内耳麻痺の開発とメンテナンス、5 月 1 日は聴力損失を復元する新しい治療法の開発につながる研究で重要な第一歩です。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
現在のプロジェクトは、概念資金のカンザス大学証明書によって賄われていた。我々 感謝したい看護スタッフ院長 (カンザスシティ、カンザス) で取得の蝸牛文化を支援するためひと臍帯やデビッド ・ ヨルゲンセンのことで私たちを支援のため。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Allegra X-14R Centrifuge | Beckman-Coulter | B08861 | |
| Intramedic Semi-Rigid Tubing | Becton Dickinson | 427401 | |
| New Brunswick Innova 2000 Orbital Shaler | Eppendorf | M1190-0002 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14060-10 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11370-40 | |
| Ultra-Fine Forceps | Fine Science Tools | 18155-13 | |
| 50-mL Conical Tubes | Fisher Scientific | 12565271 | |
| Petri Dish | Fisher Scientific | FB087579B | |
| U-100 Insulin Syringe | Fisher Scientific | 14-829-1B | |
| Scintillation Vial | Fisher Scientific | 03-341-73 | |
| Rotator | Fisher Scientific | 88-861-049 | |
| Transfer Pipette | Fisher Scientific | 22-170-404 | |
| Razor Blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Fisher Scientific | 15-240-062 | |
| Penicillin-Streptomycin | Fisher Scientific | 15-140-122 | |
| 24-Well Plate | Fisher Scientific | 07-200-84 | |
| SuperFrost PLUS Glass Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Transfer Pipette | Fisher Scientific | 22-170-404 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Fisher Scientific | P36935 | |
| Clear-Rite 3 | Fisher Scientific | 22-046341 | |
| Thermo Scientific Forma Series II 3110 Water-Jacekted CO2 Incubator | Fisher Scientific | 13-998-078 | |
| Mesenchymal Stem Cell Growth Medium | Lonza | PT-3001 | |
| Trypsin-EDTA | Lonza | CC-3232 | |
| TPP T-75 Culture Flask | MidSci | TP90076 | |
| TPP T-150 Culture Flask | MidSci | TP90151 | |
| TPP T-300 Culture Flask | MidSci | TP90301 | |
| Dissection Microscope | Nikon Instruments | SMZ800 | |
| Nikon Eclipse Ts2R-FL Inverted Microscope | Nikon Instruments | MFA51010 | |
| NuAire Class II, Type A2 Biosafety Cabinet | NuAire | NU-425-600 | |
| 1X PBS | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | |
| 1% SDS Solution | Sigma-Aldrich | 436143-100G | |
| 10% EDTA | Sigma-Aldrich | E9884-100G |
References
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