Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

En protokol til Decellularizing musen Cochleae for indre øre vævsmanipulering

Published: January 1, 2018 doi: 10.3791/56523
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 3
1Department of Otolaryngology, University of Kansas Medical Center, 2Stephenson School of Biomedical Engineering, University of Oklahoma, 3Department of Plastic Surgery, University of Kansas Medical Center

Summary

Målet med denne protokol er at påvise en effektiv metode til at decellularize og afkalke mus cochleae for udnyttelse som stilladser for væv ingeniørmæssige anvendelser.

Abstract

I pattedyr, mechanosensory hårceller, der letter hørelse manglende evne til at regenerere, som har begrænset behandlinger for høretab. Nuværende regenerativ medicin strategier har fokuseret på transplantere stamceller eller genetisk manipulation af omgivende støtte celler i det indre øre til at tilskynde til udskiftning af beskadigede stamceller til at afhjælpe tab af hørelse. Endnu, den ekstracellulære matrix (ECM) kan spille en afgørende rolle i overtalelse og bevare funktion af hårcellerne, og er ikke blevet godt undersøgt. Ved hjælp af cochlear kan ECM som et stillads at dyrke voksne stamceller give unikt indblik i hvordan sammensætning og arkitekturen i det ekstracellulære miljø aids celler med at opretholde hørelse funktion. Her vil vi præsentere en metode til at isolere og decellularizing cochleae fra mus til brug som stilladser accepterer perfunderet voksne stamceller. I den nuværende protokol er cochleae isoleret fra aflivede mus, decellularized, og kalkfattige. Bagefter, blev menneskelige Wharton's jelly celler (hWJCs), der blev isoleret fra navlestrengen omhyggeligt perfunderet ind hver cochlea. Cochleae blev brugt som bioreaktorer, og celler blev kulturperler i 30 dage før det gennemgår behandling for analyse. Decellularized cochleae beholdt identificerbare ekstracellulære strukturer, men afsløre ikke tilstedeværelsen af celler eller mærkbar fragmenter af DNA. Celler perfunderet ind i cochlea invaderede de fleste af de indvendige og udvendige af cochlea og voksede uden uheld over en varighed af 30 dage. Således er kan den nuværende metode bruges til at studere hvordan cochlear ECM påvirker celle udvikling og adfærd.

Introduction

Cochlea er en indviklet spiralstrukturen i den tidsmæssige knoglen. Det består af en ydre knoklet labyrint og en koncentrisk, indre membranøs labyrint1. Membranøs labyrint består af tre væske rum: Scala vestibuli, Scala medier og Scala tympani1. Scala media huser den sensoriske epitel, der består af en lang række celletyper, men de sensoriske hår celler (HC), som transduce mekanisk energi i lydbølger til nerveimpulser2, er af særlig interesse. Udsat for støjskader3,4,5, medicin6, sygdom7,8, og aging9 kan alle resultere i nedsat auditive funktion via HC død. Hår celletab i pattedyr er permanent, i modsætning til aviær HCs, der kan regenerere efter skade10.

En bred vifte af moderne forskningsindsats har forsøgt at gendanne tabte HCs, selv om de specifikke eksperimentelle metoder varierer. Manipulation af genekspression i sensoriske epitel og implantation af stamceller differentieret uden for kroppen er dominerende tilgange i feltet, selv om induktion metoder, der søger at differentiere stamceller i cochlear organoids har været forsøgt11,12,13. Hver af disse metoder er enten direkte afhængige stamceller, eller de udviklingsmæssige cues bruges af stamceller; dog en anden delt, og potentielt kritiske element er ECM af øresneglen selv14,15.

ECM giver ikke kun fysiske support for celler og væv, som omfatter en overflade til celle vedhæftning, spredning, overlevelse og migration, men også spiller afgørende roller i udviklingen af HCs og spiral ganglion15,16 ,17. Naturligt indeholder forekommende ECM induktive signaler, der kan guide celle fænotype bestemmelse og/eller celle vedhæftning, spredning og overlevelse18. Derfor brugen af decellularized cochlea i kombination med kulturperler hWJCs tilbyder en unik mulighed for at udforske rollen af ECM og HC regenerering. HWJCs er en let tilgængelige, ikke-kontroversielle celletype isoleret fra menneskelige umbilical snore, der opfører sig som mesenkymale stamceller19. HWJCs har vist evnen til at skelne ned neurosensory celle lineages20,21. Således, den aktuelle protokol detaljer isolering, decellularization og perfusion af cochleae fra C57BL mus slagtekroppe med hWJCs for indre øre vævsmanipulering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle procedurer, herunder animalske eutanasi, blev gennemført efter godkendte institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) protokol (BÆGERET #2014-2234) på University of Kansas Medical Center (KUMC).

NOTE: HWJCs var isolerede fra menneskets umbilical snore, der blev doneret af patienter, der givet informeret samtykke og enheder blev brugt i overensstemmelse med de protokoller, der er godkendt af University of Kansas humane fag udvalg (KU-IRB #15402).

1. mellemøret høst og Cochlea Isolation

  1. Halshugge en passende aflivede, 15 uger gamle mus ved at skære mellem kraniet og øverste halshvirvel med en skarp kirurgisk saks, og derefter sprøjte ned i hovedet med 70% ethanol desinficere (figur 1A).
  2. Gennemskære kraniet i midten af sagittal plan ved hjælp af den samme skarpe par kirurgisk saks (figur 1B-C, stiplede linjer).
  3. Fjerne hjernevæv fra kraniet ved hjælp af et par pincet (figur 1 d, pilespids).
  4. Identificere den tidsmæssige knoglen gennem tilstedeværelsen af den auditive og vestibulære nerve rødder (figur 1E-F, pilespidser) på indre af kraniet og øregangen fra ydre (figur 1F, pil). Skær forsigtigt gennem kraniet at isolere den tidsmæssige knoglen fra den resterende del af kraniet (figur 1 g).
    Bemærk: I nogle tilfælde kan det være muligt at forsigtigt lirke de omkringliggende knogler i kraniet fra den tidsmæssige knoglen uden at kræve skæring.
  5. Indsæt den fine pincet i åbningen af øregangen ca 5 mm (figur 1 H), så tips ikke risikerer punktering cochlea. Forsigtigt bryde åbne knoglen af bulla (figur 1 H, top rød skraverede område) så det frakturer (figur 1I, røde stiplede linje).
    Bemærk: Hvis det er nødvendigt, en dissektion mikroskop kan støtte i denne proces at sikre præcise placering og manipulation af instrumenter.
  6. Bruger fine pincet, lirke væk resten af bulla fra den tidsmæssige knoglen, udsætte benede labyrint af sneglen (fig. 1J, røde parenteser).
  7. Placer en stor nok til at holde den tidsmæssige knoglen petriskål (fx, 30 mm eller større) nedenunder den dissekere anvendelsesområde synsfelt og fyld den med nok phosphat bufferet saltvand (PBS) til dækning af den tidsmæssige knoglen (fx, 0,5 til 1 mL).
  8. Nedsænkes den tidsmæssige knoglen med bulla fjernet i PBS med ovale og runde vinduer i cochlea opad.
    Bemærk: Fjernelse af det vestibulære system fra cochlea er ikke nødvendigt, da det vestibulære system fungerer godt som et håndtag til at manipulere og orientere funktioner af sneglen (figur 1I og figur 2B).
  9. Bruger en ultra-fine par pincet, fjerne den stapedial arterie, der passerer gennem stapes.
  10. Indsæt en spids af den ultrafine pincet gennem buen af stapes hvor arterien passeret, og forsigtigt løfte stapes opad. Den disarticulated stapes bør ophæve ud af det ovale vindue.
  11. Bruger en spids af den ultrafine pincet, punktere ovalt og runde vinduer.
  12. Ved hjælp af en 1 x PBS fyldt 28,5-gauge sprøjte med rør (indre diameter 0,28 mm, ydre diameter 0,61 mm) vedlagt, placere slangen over det ovale vindue (figur 2A -B).
    Bemærk: Åbning af røret kan manipuleres ved hjælp af ultrafine pincet bidrager til at sikre nøjagtige placering.
    1. Brug en ny sprøjte og slanger for hver cochlea.
  13. Perfuse 2 mL 10% antibiotikum-antimykotikum (anti-anti) og 10% penicillin-streptomycin (pen-strep) i PBS gennem cochlea over 5 min at fjerne perilymph. Perfusing for hurtigt med for meget pres vil beskadige cochlea fine strukturer.
    Bemærk: Manuelt køre sprøjte i hånden til at perfuse væske gennem cochlea er effektiv, selvom en perfusion pumpe kan bruges som et alternativ.
    1. Hvis manuelt perfusing, skal du bruge et par fine, selvlukkende pincet til at stabilisere cochlea (figur 2A) under perfusion af fatte det vestibulære del af den tidsmæssige knoglen.
      Bemærk: Selvom det ikke nødvendigt, dette efterlader begge hænder fri til at håndtere instrumenter; dels kan drive sprøjte (figur 2A), mens den anden kan placere slangen korrekt (figur 2B).
    2. Fra dette skridt fremad, sørge for at undgå at udsætte cochlea unødigt til luft. At indføre luftbobler i væske rum vil blokere væske omsætning, og yderligere udtørring vil beskadige cochlea fine strukturer.
  14. Fjern og kassér eventuelle resterende muskel væv og knogler fragmenter ved hjælp af fine pincet.
  15. Hvis det er nødvendigt, gemme isolerede cochleae ved 4 ° C i 10% anti-anti og 10% pen-strep løsning i PBS for op til syv dage med regelmæssige ændringer af antibiotika løsning hver 48 timer.

2. cochlear behandling

  1. Decellularization
    1. For hver cochlea, fylde en 20-mL glas scintillation hætteglas med en 1% sodium dodecyl sulfat (SDS) løsning i afioniseret vand, (DI), som bruges til decellularize i cochlea.
    2. Skåret spidsen af plast 7 mL overførsel pipette med et barberblad, så åbningen er stort nok til en cochlea at passere igennem.
    3. Brug overførsel pipette, forsigtigt udarbejde cochlea til pipetten så det bare passerer cut-off kanten af et par millimeter.
    4. Udvise cochlea i 1% SDS løsning-fyldt scintillation hætteglas.
    5. Cirkulere 2 mL 1% SDS i afioniseret (DI) vand gennem cochlea i scintillation hætteglasset ved hjælp af en overførsel pipette.
    6. Placer scintillation hætteglasset i en rotator, og lad scintillation hætteglasset at rotere på 10 rpm i 72 timer ved stuetemperatur.
      1. Ændre 1% SDS løsning hver 24 timer over en periode på 72 h. Vær forsigtig ved skiftende SDS at Udsæt aldrig cochlea til luft.
    7. Vask cochlea tre gange i 30 min med Deioniseret vand.
Udføre vasker i samme scintillation hætteglasset anvendes til SDS afgifter; på dette stadium, er cochlea decellularized.
  • Afkalkning
    1. Fjern de resterende DI vand fra scintillation hætteglas, forlader lige nok til at holde cochlea neddykket.
    2. Til at begynde afkalkning, tilsættes 5 mL 10% ethylendiamintetra syre (EDTA) (0,02 M) i DI vand til scintillation hætteglasset indeholdende cochlea.
    3. Cirkulere 2 mL 10% EDTA i DI vand gennem cochlea i scintillation hætteglasset ved hjælp af en overførsel pipette.
    4. Placer scintillation hætteglasset tilbage i rotator, og lad scintillation hætteglasset at rotere på 10 rpm i 72 timer ved stuetemperatur. Ændre 10% EDTA-oploesning hver 24 timer over en periode på 72 h. Vær forsigtig ved skiftende løsninger, således at sneglen ikke er udsat for luft.
    5. Skyl cochlea 3 gange for 2 h med 1 x PBS; på dette stadium kalkfattige cochlea.
  • Opbevaring
    1. Opbevar cochleae i op til 72 timer i en 10% anti-anti, 10% pen-strep løsning i PBS ved 4 ° C.
      Bemærk: Længere opbevaring perioder kan være muligt med regelmæssige ændringer af antibiotika løsning; opbevaring af forarbejdede cochleae er dog ikke blevet valideret i denne protokol.

    • 3. indkøb og udvidelse af hWJCs

    1. Isolere hWJCs efter tidligere publicerede protokoller22. Kort, segment umbilical snore i sektioner, 3 cm.
    2. Omhyggeligt gøre en lavvandet snit med en skalpel på langs på hver navlestrengen segment at oprulle og afsløre Wharton's jelly af navlestrengen. Bruge pincet til at fjerne blodkarrene.
    3. Vask navlestrengen segmenter to gange med nok PBS (fx, 40 mL i en 60 mm petriskål) for at dykke i vævet. Fint hakke væv segmenter med en skalpel. Fordøje væv i en 100 mm petriskål med 50 mL af fordøjelsen medium (0,2% type 2 collagenase, 1% penicillin-streptomycin, lav-glukose Dulbeccos modificerede Eagle Medium (DMEM)).
    4. Placer væv i fordøje medium på en orbitalryster på 50 rpm natten over i en 5% CO2, 37 ° C inkubator. Den følgende dag, fortyndes fordøjelsen medium i forholdet 1:16 2% antibiotikum antimykotikum i PBS, og pellet celler ved centrifugering ved 500 x g ved stuetemperatur (~ 27 ° C) til 10 min. Fjern supernatanten.
    5. Resuspend pellets i mesenkymale stamceller vækst Medium (MSCGM) og kombinere celler. Plade celler med en tæthed på 7 x 103 celler/cm2 i vævskultur behandlet T-75 kolber. Kultur HWJCs i MSCGM, og udvide til passage 5 for eksperimenter.
      Bemærk: HWJCs kan være sub kulturperler i større T-flasker (f.eks.T-150, T-300) når passaging for at øge udbyttet af hWJCs for eksperimenter.

    4. infusion af hWJCs i Decellularized Cochleae

    1. Forberede decellularized cochleae
      1. Ved hjælp af aseptisk teknik, vaske lagrede cochleae i 1 x PBS tre gange i 30 min.
      2. Overføre cochleae til separate brønde af en 24-godt plade, og der tilsættes 1 mL af 37 ° C pre varmede MSCGM.
      3. Inkubér cochleae i en 5% CO2, 37 ° C celle kultur inkubator i mindst 1 time før infusion af celler.
    2. Adskille hWJCs og resuspend
      1. Vask hWJCs med 37 ° C varmede pre 1 x PBS to gange.
      2. Tilføje nok 37 ° C pre varmede Trypsin med 0,5% EDTA til at dække fartøj celleoverfladen.
      3. Inkubér hWJCs for op til 5 min i en 5% CO2, 37 ° C celle kultur inkubator.
        1. Kontroller, at 90% af celler er skilt fra celle kultur overflade af gennemsyn celler under en inverteret mikroskop.
          Bemærk: Celler, der flyttes, når kultur fartøj er forsigtigt aflyttet, er skilt. Celler, der holdes stille, har ikke løsrevet.
        2. Tryk forsigtigt på siderne af kolben til yderligere løsne tilknyttede celler.
      4. Ved hjælp af aseptisk teknik, anvendes overførsel hWJCs fra kultur fartøj til en 50 mL konisk rør indeholdende et tilsvarende volumen af MSCGM til mængden af Trypsin til at adskille cellerne.
      5. Pellet hWJCs ved centrifugering ved 500 x g ved stuetemperatur (~ 27 ° C) i 5 min.
      6. Opsug supernatanten, og pelleten hWJCs i MSCGM i en koncentration på 500.000 celler/mL.
    3. Perfuse cochleae
      1. Overføre cochleae til en ny 24-godt plade ved hjælp af en overførsel pipette.
      2. Tilføj en dråbe af MSCGM til hver cochlea at forhindre enhver cochlea mod udtørring.
      3. Fint orientere cochlea med ultra-fine pincet, så den ovale og runde vinduer står.
        Bemærk: Tage stor forsigtighed ved direkte håndtering hver øresneglen cochlea er let beskadiget.
      4. Ved hjælp af en steril 28,5-gauge insulin sprøjte med tilsluttede slanger, udarbejde 0,2 mL genopslemmes hWJCs (100.000 celler).
      5. Bruger steriliseret fine pincet, Placer slanger på ovale vindue.
      6. Forsigtigt og langsomt perfuse cochlea med 0,2 mL resuspenderet hWJCs ved hjælp af en 28,5-gauge insulin sprøjte forbundet med polyethylen rør (ydre Diameter: 0,61 mm, indvendig Diameter: 0,28 mm) over ca 5 min.
      7. Efter perfusion, tilføje 0,8 mL af 37 ° C pre varmede MSCGM til de godt indeholdende cochlea for at bringe den samlede mængde i brønden til 1 mL.
      8. Gentag trin 4.3.3-4.3.7 for hver cochlea, ved hjælp af en frisk sprøjte og slanger hver gang.
      9. Sted perfunderet cochleae i en 5% CO2, 37 ° C celle kultur inkubator og change media tre gange om ugen.

    5. cochlea høst og opbevaring

    Bemærk: Cochleae kan være kulturperler og høstet på ethvert tidspunkt op til 30 dage efter perfusion.

    1. For at bevare cochleae, fix i 4% PARAFORMALDEHYD i 1 x PBS natten over ved 4 ° C på en vuggende platform.
    2. Efter fiksering, vask cochleae med 1 x PBS tre gange i 5 min.
    3. Gradvist dehydrere cochlea med ethanol og klare med et alifatiske kulbrinter opløsningsmiddel før indlejring i paraffin.
    4. Afsnit prøver til en tykkelse på 10 µm ved hjælp af en mikrotom og montere på glas objektglas.
      Bemærk: Prøver er nu klar til histologisk eller immunhistokemiske behandling bruger standardprotokoller.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Ved hjælp af de metoder, der præsenteres her, vellykket decellularization af cochleae blev vurderet ved at undersøge tilstedeværelsen eller fraværet af DNA gennem 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) farvning. Cochleae blev anset for fuldt decellularized, hvis DNA ikke var identificeres inden for den decellularized cochlea. En indfødt øresneglen fra et tidligere eksperiment, der ikke undergår decellularization eller afkalkning blev brugt som positiv kontrol for at illustrere de strukturer og celler traditionelt findes i et C57BL mus cochlea. Decellularized-kalkfattige cochlea, som ikke har nogen hWJCs infunderes, blev brugt som en negativ kontrol. Ingen kvantificerbare DAPI farves cellekerner blev observeret i enhver region i afsnittet væv (figur 3). To cochleae var decellularized og kalkfattige og derefter infunderes med hWJCs for det aktuelle projekt. De decellularized-kalkfattige cochleae, der var perfunderet med hWJCs blev observeret at have talrige DAPI farves kerner i cochlea og vokser på den benede shell uden for cochlea (tabel 1). Samlede anslåede celle tætheder for cellen infunderes første cochlea var 113,759 celler/cochlea efter 30 dage af kulturen (figur 4 og figur 5) og for det andet cochlea var 118,732 celler/cochlea efter 30 dage af kulturen (figur 6 og Figur 7). Disse celle tæthed skøn omfatter Scala tympani, Scala medier, og Scala forhal og mængder af de strukturer, der findes inden for de tre væske rum, men disse skøn udelukket enhver af de resterende knoklet labyrint. Derudover prøver fra hver cochlea var plettet med hæmatoxylin og Eosin (H & E) til at vise tilstedeværelsen af celler og anatomiske funktioner inden for hver cochlea (figur 8). Brutto anatomi af de cochlear mikrostrukturer uændret overvejende hele alle farvede dele; dog blev ingen celler identificerbare i afsnittet decellularized-kalkfattige (fig. 8B). Identifikation af cellekerner var dramatisk anderledes mellem de indfødte cochlea (figur 8A) og de decellularized-kalkfattige cochleae infunderes med celler (figur 8 c-D).

    Figure 1
    Figur 1: mus tidsmæssige knoglen isolation. Når musen har været behørigt euthanized, halshugge dyret ved at skære mellem bunden af kraniet og den første halshvirvel, og spray hovedet med ethanol desinficere (A). Gennemskære kraniet i sagittale flyet del (B-C) ved hjælp af en skarp kirurgisk saks, skære igennem både hjernevæv og knogler. Gennemskæres musen hovedet (D, undernæbbet fjernet for uafhængige eksperimentelt arbejde) så skal have hjernevæv fjernes for at afsløre den tidsmæssige knoglen. De to foramina hvorigennem den auditive og vestibulære nerver pass (E, rød pilespidser) er nyttige cues til korrekt identificering af den tidsmæssige knoglen. Fjern kødet fra kraniet (F). Den ydre øregangen (F, pil, top panel) giver en nyttig eksterne cue så godt. Omhyggeligt trimme væk overskydende knoglen, indlevering bare den isolerede tidsmæssige knoglen (G). Bulla (H, toppanelet, røde fremhævede område) skal derefter forsigtigt fjernes ved hjælp af fine pincet (H, nederste panel). Bulla er tynde ben og kan let flishugges væk (jeg) indtil den benede labyrint af øresneglen er afsløret (Jørgensen, røde parenteser). Skala barer på alle billeder er 1 mm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

    Figure 2
    Figur 2: Cochlear Perfusion. Når den tidsmæssige knoglen er blevet isoleret og bulla er blevet fjernet, kan cochlea derefter sættes op for perfusion i et mikroskop. Når perfusing ved hjælp af en manuelt drevet sprøjte med slanger monteret (A, punkteret linje) kan det være nyttigt at stabilisere cochlea ved hjælp af en selvlukkende pincet. Forsigtigt lægger pincet til det vestibulære del af den tidsmæssige knoglen (B) og hvile pincet mod læbe af petriskål (A). Dette efterlader begge hænder fri til at manipulere instrumenter under perfusion. Dels kan derefter manipulere sprøjten, kontrollere flowet af væsken, mens anden side kan placere slangen over det ovale vindue ved hjælp af et andet par pincet (B). Skære den frie ende af slangen i en vinkel giver mulighed for lettere positionering, så slangen skal placeres korrekt uden at blokere synsfelt. Skalalinjen er 1 mm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

    Figure 3
    Figur 3: væv afsnit af en decellularized mus cochlea. En oprejst epi-fluorescerende mikroskop blev brugt til billede prøver ved 200 X forstørrelse (10 X okular og 20 X mål). Billeder blev syet sammen for at skabe cirka en 4 x 5 montage. DAPI nukleare farvning viser mangel af celler er vist i panelet ved hjælp af en DAPI fælles filtersæt (350 nm excitation, 470 nm emission), og en overeksponeret, gråtonebillede af autofluorescence ved hjælp af en fluorescein isothiocyanat (FITC) fælles filter sæt (490 nm excitation, 525 nm emission), som giver anatomiske landemærker, er vist i panelet B. Automatiseret celletal blev udført i tre områder af interesse, som er afgrænset på begge paneler A og B. Cellen Total tæller blev beregnet for hele væv sektion (1, solid hvid linje) og cochlea (2, stiplet linje). Disse to tal blev brugt til at beregne antallet af celler i de benede strukturer uden for cochlea, men inden for de udvendige, knoklet kanter af afsnittet væv (3, plads mellem den stiplede linje og stiplede linje). Skala barer på alle billeder er 500 µm.Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

    Figure 4
    Figur 4: en nær-modiolar del af decellularized musen cochlea 1 infunderes med hWJCs. DAPI nukleare farvning er vist i panelet A overlejret på en overeksponeret, gråtoner autofluorescence fra den grønne kanal, som indeholder anatomiske landemærker. Automatiseret celle tæller blev udført i tre områder af interesse, som er afgrænset i panelet A. Cellen Total tæller blev beregnet for hele væv sektion (1, solid hvid linje) og cochlea (2, stiplet linje). Disse to tal blev brugt til at beregne antallet af celler i de benede strukturer uden for cochlea, men inden for de udvendige, knoklet kanter af afsnittet væv (3, plads mellem den stiplede linje og stiplede linje). Isolerede DAPI farvning er vist i panelet B, og tærsklen for DAPI farvning anvendes under automatiseret kvantificering er vist i panelet C. Skala barer på alle billeder er 500 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

    Figure 5
    Figur 5: høj forstørrelse se en nær-modiolar del af decellularized musen cochlea 1 infunderes med hWJCs. DAPI nukleare farvning er vist i panelet A overlejret på en overeksponeret, gråtonebillede af autofluorescence fra den grønne kanal, som indeholder anatomiske landemærker. Isolerede DAPI farvning er vist i panelet B, og tærsklen billedet anvendes under automatiseret celle optælling er vist i panelet C. Flydende rum og finere mikrostrukturer opstaldet i cochlea bevares pænt under decellularization og celle kultur faser af forsøget. Scala Vestibuli (SV), Scala Tympani (SM), Basilar membran (BM), Tectorial Membrane (TM), Spiral Limbus (L), Rosenthal's Canal (RC), Modiolus (M), Spiral Ligament (SL) og Stria Vascularis (*). Reissners membran var ikke klart defineret i væv sektioner, og som følge heraf Scala medierne ikke var klart defineret. Skala barer på alle billeder er 250 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

    Figure 6
    Figur 6: en nær-modiolar del af decellularized musen cochlea 2 der blev infunderet med hWJCs. DAPI nukleare farvning er vist i panelet A, overlejret på gråtoneskala autofluorescence fra den grønne kanal, som indeholder anatomiske landemærker. Automatiseret celle tæller blev udført i tre områder af interesse, som er afgrænset i panelet A. Cellen Total tæller blev beregnet for hele væv sektion (1, solid hvid linje) og cochlea (2, stiplet linje). Disse to tal blev brugt til at beregne antallet af celler i de benede strukturer uden for cochlea, men inden for de udvendige, knoklet kanter af afsnittet væv (3, plads mellem den stiplede linje og stiplede linjer). Isolerede DAPI farvning er vist i panelet B, og tærsklen for DAPI farvning anvendes under automatiseret kvantificering er vist i panelet C. Skala barer på alle billeder er 500 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

    Figure 7
    Figur 7: høj forstørrelse se en nær-modiolar del af decellularized musen cochlea 2 der blev infunderet med hWJCs. DAPI nukleare farvning er vist i panelet A, overlejret på gråtoneskala autofluorescence fra den grønne kanal, som indeholder anatomiske landemærker. Isolerede DAPI farvning er vist i panelet B, og tærsklen billedet anvendes under automatiseret celle optælling er vist i panelet C. Flydende rum og finere mikrostrukturer har til huse i den cochlear bevares i de decellularization og celle kultur faser af forsøget. Scala Vestibuli (SV), Scala Tympani (SM), Basilar membran (BM), Tectorial Membrane (TM), Spiral Limbus (L), Rosenthal's Canal (RC), Modiolus (M), Spiral Ligament (SL) og Stria Vascularis (*). Reissners membran var ikke klart defineret i væv sektioner, og som følge heraf Scala medierne ikke var klart defineret. Skala barer på alle billeder er 250 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

    Figure 8
    Figur 8: hæmatoxylin og Eosin pletter af kontrol og behandlede cochleae. Hæmatoxylin og Eosin farves afsnit viser en typisk cochlea med indfødte celler nuværende er vist i panelet A. Panelet B indeholder de samme strukturer som panel A, men er fra en fuldt decellularized cochlea, hvilket efterlader den ekstracellulære matrix. De to tidligere vist cochleae infunderes med hWJCs ses i paneler C og D. Brutto cochlear anatomi er overvejende uændret gennem decellularization og celle kultur processer, selv om de specifikke cellepopulationer og steder er dramatisk ændret. Scala Vestibuli (SV), Scala Tympani (SM), Basilar membran (BM), Tectorial Membrane (TM), Spiral Limbus (L), Rosenthal's Canal (RC), Modiolus (M), Spiral Ligament (SL) og Stria Vascularis (*). Skala barer på alle billeder er 250 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

    A1 Cochlea + celler A2 Cochlea + celler B2 Neg.
    Kontrol Cochlea Udenfor benede labyrint 3,758 549 0 Bone udenfor Cochlea rum 248 586 0 I øresneglen 518 701 0 Samlede celler 4,524 1,836 0 Afsnit volumen (μl) 0.0077 0.0100 0.0147 Procent af Cochlea volumen 0,46% 0,59% 0.87% Anslået celle tæthed i øresneglen 113,759 118,732 0

    Tabel 1: celle tæller. DAPI farves cochlear sektioner var thresholded og kvantificeret med automatisk optælling værktøjer i ImageJ i 3 ikke-overlappende områder af interesse (udenfor benede labyrint tidsmæssige knoglen uden for de cochlear væske rum og i cochlea). Cochlear tværsnitsareal blev også målt i ImageJ, og denne værdi blev brugt til at beregne afsnit volumen i kombination med snittykkelse (10 µm). Ved hjælp af et estimat af samlede cochlear udgivet af Santi et al. 23, den relative cochlear volumen af et givet afsnit blev beregnet. Celle tætheden af hele cochlea blev anslået ved hjælp af den relative cochlear volumen i en bestemt sektion i kombination med den parrede celletal.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Vi har med succes demonstreret, at indfødte cochlear celler kan blive fjernet fra cochlea via en decellularization proces, som giver mulighed for brug af øresneglen som en indviklet, tre-dimensionelle væv stillads. Santi mfl. 15 udviklet den oprindelige metode til decellularizing cochleae, og har præcist anslåede mængder af mange cochlear strukturer gennem ved hjælp af lys ark mikroskopi23. Disse tidlige arbejde fungerede som et stærkt grundlag for vævsteknologi og celle kultur teknikker præsenteret her. Decellularized øresneglen kan med held være infunderes med celler og derefter kulturperler for en længere periode. Cochleae fra en bred vifte af dyr kunne teoretisk udnyttes i kombination med en tilsvarende bred vifte af celler typer. Disse kombinationer tillade de teknikker præsenteret her for at blive udnyttet i mange mulige eksperimentelle design, såsom tissue engineering andragender at undersøge sensoriske epitel udvikling14, narkotika, testning af ny apoteksagenter 24, og udvikling af cochlear reparation modeller25. Men trods bred anvendelighed af disse teknikker er de ikke uden begrænsninger.

    En af begrænsningerne i den nuværende teknik er, at perfusion er variabel baseret på enkelte. Udvikle en holder til cochlea, og ved hjælp af en sprøjte pumpe til at gennemføre perfusions kan øge nøjagtigheden og processens succes. Derudover der definitivt beviser vellykkede decellularization, kan der potentielt ske gennem flere metoder. Vi ansat DAPI farvning der blev brugt til at kvantificere resterende cellekerner, og vi observerede ingen resterende kerner post-decellularization. Derudover, udnytte standard DNA kvantificering assays reagens, grønne farvestof afsløre pikogram mængder af DNA, til at identificere nukleinsyre rester, som kan visuelt være mere følsomme end DAPI for at identificere tilstedeværelse af små fragmenter af nukleinsyre syrer i decellularized væv26. Uanset hvilke teknikker bruges til at validere vellykkede decellularization, kan det ikke være muligt at vise komplet decellularization af en individuel cochlea før udnytter det som et stillads. Ikke desto mindre har vi fundet decellularization processen at være vellykket og robust.

    De to mest kritiske trin i den nuværende protokol er isolering og håndtering af cochleae og perfusion af cochleae. Stor omhu skal tages, når cochlea er oprindeligt isoleret, da cochlea er delikate og sprøde. Hvis for meget kraft anvendes mens håndtering cochlea med pincet, kunne cochlea fragmentere. Det er således bydende nødvendigt at håndtere hver cochlea forsigtigt før decellularization og afkalkning. Det vestibulære system, fungerer selv om igen intakt, som en stor håndtag for sensationsprægede det indre øre kompleks med pincet, og orientere cochlea. På samme måde, når perfusing cochlea med celler, pres bag perfusion må ikke være for stor, ellers celler ikke kan overleve perfusion. Som bemærket i den nuværende protokol, vedhæftes i slutningen af en 1-mL insulin sprøjten slangen giver mulighed for lettere håndtering af cochlea med én hånd, og større præcision i perfusing celler gennem cochlea med anden hånden.

    Som et næste skridt, ville det være naturligt at vurdere udviklingstoksicitet og funktionelle markører til at bestemme hvis cochlear ECM inducere differentiering af stamceller, og hvis så, hvilke specifikke ECM komponenter i øresneglen overtalelse ændringer i celler. Perfusing forskellige typer af celler (f.eks., stamceller, neuroprogenitors, fibroblaster, etc.) via cochlea at overvåge Celledifferentiering og adfærd ville være en anden fascinerende opfølgende undersøgelse. Derudover kan celler, der er blevet genetisk modificeret eller udsættes for en vækstfaktor differentiering protokol give ny indsigt i hvordan cochlear ECM understøtter neurosensory udvikling, og måske endda funktion i høring. Således, den nuværende protokol er en betydelig første trin i brug af cochlear ECM for at studere indre øre neurosensory udvikling og vedligeholdelse, som måske en dag føre til udvikling af nye behandlingsformer til at gendanne høretab.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Forfatterne har ikke noget at oplyse.

    Acknowledgments

    Det aktuelle projekt blev finansieret af University of Kansas bevis for konceptet fond. Vi vil gerne takke plejepersonalet på KUMC (Kansas City, KS) for at hjælpe os med at opnå menneskelige umbilical snore og David Jørgensen bistå med cochleae kulturer.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Allegra X-14R Centrifuge Beckman-Coulter B08861
    Intramedic Semi-Rigid Tubing Becton Dickinson 427401
    New Brunswick Innova 2000 Orbital Shaler Eppendorf M1190-0002
    Surgical Scissors Fine Science Tools 14060-10
    Fine Forceps Fine Science Tools 11370-40
    Ultra-Fine Forceps Fine Science Tools 18155-13
    50-mL Conical Tubes Fisher Scientific 12565271
    Petri Dish Fisher Scientific FB087579B
    U-100 Insulin Syringe Fisher Scientific 14-829-1B
    Scintillation Vial Fisher Scientific 03-341-73
    Rotator Fisher Scientific 88-861-049
    Transfer Pipette Fisher Scientific 22-170-404
    Razor Blade Fisher Scientific 12-640
    Antibiotic-Antimycotic Fisher Scientific 15-240-062
    Penicillin-Streptomycin Fisher Scientific 15-140-122
    24-Well Plate Fisher Scientific 07-200-84
    SuperFrost PLUS Glass Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
    Transfer Pipette Fisher Scientific 22-170-404
    ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI Fisher Scientific P36935
    Clear-Rite 3 Fisher Scientific 22-046341
    Thermo Scientific Forma Series II 3110 Water-Jacekted CO2 Incubator Fisher Scientific 13-998-078
    Mesenchymal Stem Cell Growth Medium Lonza PT-3001
    Trypsin-EDTA Lonza CC-3232
    TPP T-75 Culture Flask MidSci TP90076
    TPP T-150 Culture Flask MidSci TP90151
    TPP T-300 Culture Flask MidSci TP90301
    Dissection Microscope Nikon Instruments SMZ800
    Nikon Eclipse Ts2R-FL Inverted Microscope Nikon Instruments MFA51010
    NuAire Class II, Type A2 Biosafety Cabinet NuAire NU-425-600
    1X PBS Sigma-Aldrich P5368-10PAK
    1% SDS Solution Sigma-Aldrich 436143-100G
    10% EDTA Sigma-Aldrich E9884-100G

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Raphael, Y., Altschuler, R. A. Structure and innervation of the cochlea. Brain Res Bull. 60 (5-6), 397-422 (2003).
    2. LeMasurier, M., Gillespie, P. G. Hair-Cell Mechanotransduction and Cochlear Amplification. Neuron. 48 (3), 403-415 (2005).
    3. Neal, C., et al. Hair cell counts in a rat model of sound damage: Effects of tissue preparation & identification of regions of hair cell loss. Hear Res. 328, 120-132 (2015).
    4. Ivory, R., Kane, R., Diaz, R. C. Noise-induced hearing loss: a recreational noise perspective. Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 22 (5), 394-398 (2014).
    5. Stucken, E. Z., Hong, R. S. Noise-induced hearing loss: an occupational medicine perspective. Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 22 (5), 388-393 (2014).
    6. Dille, M. F., et al. Tinnitus onset rates from chemotherapeutic agents and ototoxic antibiotics: results of a large prospective study. J Am Acad Audiol. 21 (6), 409-417 (2010).
    7. Sajjadi, H., Paparella, M. M. Meniere's disease. Lancet. 372 (9636), 406-414 (2008).
    8. House, J. W., Brackmann, D. E. Tinnitus: surgical treatment. Ciba Found Symp. 85, 204-216 (1981).
    9. Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Acceleration of age-related hearing loss by early noise exposure: evidence of a misspent youth. J Neurosci. 26 (7), 2115-2123 (2006).
    10. Ryals, B. M., et al. Avian species differences in susceptibility to noise exposure. Hear Res. 131 (1-2), 71-88 (1999).
    11. Koehler, K. R., Mikosz, A. M., Molosh, A. I., Patel, D., Hashino, E. Generation of inner ear sensory epithelia from pluripotent stem cells in 3D culture. Nature. 500 (7461), 217-221 (2013).
    12. Sekiya, T., et al. Cell transplantation to the auditory nerve and cochlear duct. Exp Neurol. 198 (1), 12-24 (2006).
    13. Shi, F., Edge, A. S. Prospects for replacement of auditory neurons by stem cells. Hear Res. 297, 106-112 (2013).
    14. Mellott, A. J., Shinogle, H. E., Nelson-Brantley, J. G., Detamore, M. S., Staecker, H. Exploiting decellularized cochleae as scaffolds for inner ear tissue engineering. Stem Cell Res Ther. 8, (2017).
    15. Santi, P. A., Johnson, S. B. Decellularized ear tissues as scaffolds for stem cell differentiation. J Assoc Res Otolaryngol. 14 (1), 3-15 (2013).
    16. Davies, D., Holley, M. C. Differential expression of alpha 3 and alpha 6 integrins in the developing mouse inner ear. J Comp Neurol. 445 (2), 122-132 (2002).
    17. Gerchman, E., Hilfer, S. R., Brown, J. W. Involvement of extracellular matrix in the formation of the inner ear. Dev Dyn. 202 (4), 421-432 (1995).
    18. Goodyear, R. J., Richardson, G. P. Extracellular matrices associated with the apical surfaces of sensory epithelia in the inner ear: molecular and structural diversity. J Neurobiol. 53 (2), 212-227 (2002).
    19. Mellott, A. J., et al. Improving Viability and Transfection Efficiency with Human Umbilical Cord Wharton's Jelly Cells Through Use of a ROCK Inhibitor. Cell Reprogram. , (2014).
    20. Mellott, A. J., Shinogle, H. E., Moore, D. S., Detamore, M. S. Fluorescent Photo-conversion: A second chance to label unique cells. Cell Mol Bioeng. 8 (1), 187-196 (2015).
    21. Mitchell, K. E., et al. Matrix cells from Wharton's jelly form neurons and glia. Stem Cells. 21 (1), 50-60 (2003).
    22. Mellott, A. J., et al. Nonviral Reprogramming of Human Wharton's Jelly Cells Reveals Differences Between ATOH1 Homologues. Tissue Eng Part A. 21 (11-12), 1795-1809 (2015).
    23. Buytaert, J. A., Johnson, S. B., Dierick, M., Salih, W. H., Santi, P. A. MicroCT versus sTSLIM 3D imaging of the mouse cochlea. J Histochem Cytochem. 61 (5), 382-395 (2013).
    24. Nonoyama, H., et al. Investigation of the ototoxicity of gadoteridol (ProHance) and gadodiamide (Omniscan) in mice. Acta Otolaryngol. 136 (11), 1091-1096 (2016).
    25. Dai, C., et al. Rhesus Cochlear and Vestibular Functions Are Preserved After Inner Ear Injection of Saline Volume Sufficient for Gene Therapy Delivery. J Assoc Res Otolaryngol. , (2017).
    26. Sutherland, A. J., Converse, G. L., Hopkins, R. A., Detamore, M. S. The bioactivity of cartilage extracellular matrix in articular cartilage regeneration. Adv Healthc Mater. 4 (1), 29-39 (2015).

    Tags

    Bioteknologi sag 131,: Cochlea hår celle stillads decellularize Wharton's jelly celler vævsmanipulering cellekultur
    En protokol til Decellularizing musen Cochleae for indre øre vævsmanipulering
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Neal, C. A., Nelson-Brantley, J. G., … More

    Neal, C. A., Nelson-Brantley, J. G., Detamore, M. S., Staecker, H., Mellott, A. J. A Protocol for Decellularizing Mouse Cochleae for Inner Ear Tissue Engineering. J. Vis. Exp. (131), e56523, doi:10.3791/56523 (2018).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter